一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球
的制备方法及应用
技术领域
[0001] 本
发明属于化学分析测试领域，尤其涉及一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法和应用。
背景技术
[0002] 酱油是我国传统的
酿造制品，是老百姓日常生活中不可或缺的
调味品。独特的色、香、味使其成为深受我国人民喜爱的传统调味品。而鲜味是酱油中最重要的评价指标。人们发现酿造酱油中存在一类分子量在500Da以下的小分子多肽，这些小分子多肽能够显著提高食品整体鲜味强度，是酿造酱油中的
风味物质，人们称这些小分子多肽为呈鲜多肽。经研究发现，大多数的呈鲜多肽是端基氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸的二肽和三肽。借此，人们可以通过检测和分析酿造酱油中的呈鲜多肽的种类和含量，进一步揭示和掌握酱油的呈鲜机理。
[0003] 目前，对于呈鲜多肽的分析方法主要为液相色谱法和液相色谱/质谱法。此两种方法均需先对样品溶液，即酱油进行预处理。而针对氨基酸、小分子多肽和
蛋白质的分离和检测的样品预处理技术中，表面印迹技术作为一种新型的样品预处理技术，受到愈来愈广泛地关注。表面印迹技术的作用原理类似于酶-底物的“钥匙-
锁”相互作用原理，以硅胶等材料作为
支撑固相，以目标分子作为模板分子，通过化学反应生成相应地化学键将模板分子结合在支撑固相上，然后通过洗脱等手段将模板分子脱去，从而在支撑固相表面留出一个空位用于结合目标分子。由于模板分子与目标分子相同，因此，支撑固相表面留出的结合空位，只能特异性
吸附结合目标分子，从而大大地提高了对样品溶液中目标分子的选择性，降低了与样品溶液中其他分子结合的概率，从而大大提高了检测的准确率。在该项技术中，我们将已经洗脱掉模板分子，留有支撑固相和表面目标分子结合空位的结构称为表面分子印迹聚合物。可以看出，表面印迹技术只需将样品溶液与表面分子印迹聚合物
接触，即可完成样品溶液中目标分子的结合分离，操作十分简便且耗时少。
[0004] 但
现有技术中，用于检测氨基酸和多肽的表面分子印迹聚合物存在包覆不均匀、厚度不均一、性能不稳定等缺点。并且，现有的表面分子印迹聚合物的制备方法中，主要通过分子间作用
力将模板分子结合到支撑固相上，由于分子间作用力十分微弱，因此结合到支撑固相上的模板分子数量有限，相应地所形成的结合空位数量也有限，使得所制得表面分子印迹聚合物不能够尽量多的或者完全吸附结合样品溶液中的目标分子，从而影响了检测的准确性。另外，现有技术中尚未将表面印迹技术应用于呈鲜多肽的检测和分析。
发明内容
[0005] 基于此，本发明提供一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，以制备得到包覆均匀、厚度均一、性能稳定、能够同时特异性吸附多种端基为L-谷氨酸的呈鲜多肽分子、以及硅胶微球与模板分子之间的化学键更加牢固的表面分子印迹聚合物。
[0006] 本发明的端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，包括以下步骤：
[0007] S1：采用稀
盐酸浸泡法，对硅胶微球表面进行除杂处理，得到活化硅胶微球；
[0008] S2：采用硅烷化
试剂对活化硅胶微球进行表面硅烷化改性，得到硅烷化硅胶微球；
[0009] S3：采用RAFT试剂对硅烷化硅胶微球进行RAFT功能化处理，得到表面接枝双硫酯键的RAFT功能化硅胶微球；
[0010] S4：将替代模板分子、
金属离子和功能
单体于混合
溶剂中充分混匀使替代模板分子、金属离子和功能单体自组装，然后加入交联剂、引发剂以及RAFT功能化硅胶微球，通过RAFT聚合反应，得到表面包覆有替代模板分子的分子印迹涂层微球；
[0011] S5：洗脱步骤S4所得硅胶微球，除去其表面包覆的替代模板分子后，干燥得到表面分子印迹聚合物硅胶微球；
[0012] 其中，所述替代模板分子为L-谷氨酸，所述金属离子为Cu2+，所述功能单体为1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油。
[0013] 相对于现有技术，利用本发明所述方法制备的表面分子印迹聚合物硅胶微球包覆均匀、印迹物分子量分布窄、性能稳定的优点。并且，由于多种呈鲜多肽的端基为L-谷氨酸，因此，一次性实现在
水环境下对多种呈鲜多肽的选择性吸附，大大降低了工作量。另外，传统的表面分子印迹技术，功能单体与替代模板分子之间通过分子间作用力结合，本发明的制备方法中，金属离子Cu2+和功能单体1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油通过金属螯合作用力连接替代模板分子L-谷氨酸，相对于分子间作用力，L-谷氨酸与Cu2+的结合力更强，能够更加稳定聚合物的表面，也能够结合更多的替代模板分子，从而得到更多的L-谷氨酸结合空位，以尽量多地甚至是全部结合酿造酱油中的端基为谷氨酸的呈鲜多肽，提高检测的准确性。
[0014] 进一步地，所述替代模板分子与功能单体的摩尔比为7:1～1:15；所述功能单体与金属离子的摩尔比为9:1～1:12。
[0015] 进一步地，所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述引发剂的用量为交联剂
质量的0.1％～5％。
[0016] 进一步地，所述硅烷化试剂为4-氯甲基苯基三甲
氧基硅烷；所述的硅烷化试剂与活化硅胶微球的摩尔比为8:1～1:12。
[0017] 进一步地，步骤S1中，将硅胶微球置于质量分数为5％～20％的盐酸中，超声3～20min，并加热至50～200℃保持12～48h；然后用去离子水洗涤抽滤直至中性，干燥，在50～
200℃下活化12～48h，得到活化硅胶微球。通过使用稀盐酸对硅胶微球表面进行活化，使得SiO2微球表面含有丰富的羟基，有利于后续的表面改性。
[0018] 进一步地，步骤S2中，将活化硅胶微球超声分散于无水
甲苯中，通入氮气除氧，然后加入4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷，于30～150℃反应12～48h；用甲苯、
乙醇分别洗涤后，干燥，得到硅烷化硅胶微球。使用硅烷化试剂对SiO2微球进行硅烷化处理，使得微球表面连接活性硅烷基，而后续的RAFT试剂与功能单体-金属离子-替代模板分子自组装结构的替换，都是通过活性硅烷基连接在固相SiO2微球的表面。
[0019] 进一步地，步骤S3中，对四氢呋喃进行干燥和通氮除氧预处理后，将苯基溴化镁加入预处理的四氢呋喃中，然后逐滴加入CS2，在20～80℃条件下反应0.2～3h；之后加入硅烷化硅胶微球，超声均匀分散，通入氮气除氧3～30min，加热至30～80℃反应24～60h；反应结束，依次用四氢呋喃、甲醇、丙
酮多次洗涤后，干燥，得到RAFT功能化硅胶微球。采用苯基溴化镁和二硫化
碳在无氧条件下合成具有活性自由基的RAFT试剂，RAFT试剂能够结合到活性硅烷基团上，从而实现微球表面聚合物自主生长；且由于苯基溴化镁和二硫化碳均为小分子，其两者结合生成的RAFT试剂也为小分子，因此，所形成的印迹膜层厚度较薄；且由于是小分子，体积和长度较小，使得所占空间较小，不会
挤压相邻活性硅烷基位点结合RAFT试剂的空间，因此，所形成的印迹膜层厚度较为均一；从而克服了常规自由基聚合法制备的MIP膜层厚度较薄且厚度的问题。
[0020] 进一步地，步骤S4中，将L-谷氨酸超声溶解于混合溶剂中，加入1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油和Cu2+后，在10～80℃
温度下震荡4～14h；之后向其中加入RAFT功能化硅胶微球、交联剂，超声分散后加入引发剂，振荡超声混匀后通入氮气除氧，在30～90℃条件下反应4～12h，得到包覆有替代模板分子的硅胶微球；其中，所述混合溶剂为乙醇和水的混合溶剂，乙醇和水的体积比为3:1～1:6。将替代模板分子、金属离子和功能单体在混合溶剂中进行孵育，形成功能单体-金属离子-替代模板分子复合物。其中，功能单体替换掉RAFT试剂，将功能单体-金属离子-替代模板分子复合物结合到活性硅烷基团上，并且，与金属离子共同构成L-谷氨酸的结合位点；而替代模板分子L-谷氨酸为形成识别和结合目标分子端基为谷氨酸的呈鲜多肽的空穴的形成提供
基础。相对于现有技术，功能单体与替代模板分子之间通过较弱的分子间作用力结合来说，在本发明中，功能单体。金属离子与替代模板分子之间通过较强的金属螯合力作用。具体地，由于Cu2+缺
电子，在水溶液中，其会与水分子或阴离子结合，然而，在1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油的作用下，L-谷氨酸的供电
原子能够与缺电子的Cu2+结合形成复合物，取代原先结合的水分子或阴离子，这样就能使替代模板分子L-谷氨酸牢固地结合在1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油和Cu2+上。由于结合力强，且受水相的影响较小，大大较少了功能单体与替代模板分子间的非特异性吸附，使得更多的替代模板分子结合到功能单体和金属离子上，从而提供更多的L-谷氨酸结合空位，以更多地萃取结合样品溶液中的端基为谷氨酸的呈鲜多肽，从而保障酿造酱油中呈鲜多肽检测的准确性。另外，通过加入交联剂和引发剂与功能单体-金属离子-替代模板分子复合物进行自由基聚合反应，使之形成牢固的交联骨架结构，能够提高功能单体-金属离子-替代模板分子复合物的
稳定性。
[0021] 进一步地，步骤S5中，分别用去离子水、乙醇洗涤包覆有替代模板分子的硅胶微球，干燥；然后置于浓度为0.1～0.5mol/L
乙二胺四乙酸二钠洗脱液中连续多次洗脱，之后干燥得到表面分子印迹聚合物硅胶微球。
[0022] 本发明还保护按照上述制备方法所制得的端基为谷氨酸的呈鲜多肽的表面分子印迹聚合物硅胶微球在分离和检测呈鲜多肽中的应用。
[0023] 为了更好地理解和实施，下面结合
附图详细说明本发明。
附图说明
[0024] 图1是本发明端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备过程示意图。
[0025] 图2是本发明空白硅胶微球(a)和端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球(b)的扫描电镜照片(放大倍率均为30000)。
[0026] 图3是本发明空白硅胶微球(a)，RAFT功能化硅胶微球(b)，NIP/SiO2(c)和端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球(d：MIP/SiO2)的热重曲线图和一次微分曲线图(其中，NIP/SiO2除在制备过程中不添加模板分子以外，其余步骤与端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备完全相同)。
[0027] 图4是本发明的MIP/SiO2吸附萃取样品溶液中的端基为谷氨酸的呈鲜多肽的原理图。
[0028] 图5是本发明NIP/SiO2与MIP/SiO2分别对不同呈鲜多肽的选择性萃取容量图。
[0029] 图6是本发明的功能单体与金属离子和现有技术中的功能单体对L-谷氨酸的萃取容量图；其中，本发明中的功能单体为1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油(AGE/IDA)，金2+
属离子为Cu ，现有技术中的功能单体为2-丙烯酰胺-2甲基
丙烯酸(AMPS)。
[0030] 图7是采用本发明制备的端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球对酱油进行预处理，和不采用上述微球对酱油进行预处理的液相色谱图。
具体实施方式
[0031] 一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备方法，包括以下步骤：
[0032] S1：采用稀盐酸浸泡法，对硅胶微球表面进行除杂处理，得到活化硅胶微球；
[0033] S2：采用硅烷化试剂对活化硅胶微球进行表面硅烷化改性，得到硅烷化硅胶微球；
[0034] S3：采用RAFT试剂对硅烷化硅胶微球进行RAFT功能化处理，得到表面接枝双硫酯键的RAFT功能化硅胶微球；
[0035] S4：将替代模板分子、金属离子和功能单体于混合溶剂中充分混匀使替代模板分子、金属离子和功能单体自组装，然后加入交联剂、引发剂以及RAFT功能化硅胶微球，通过RAFT聚合反应，得到表面包覆有替代模板分子的分子印迹涂层微球；
[0036] S5：洗脱步骤S4所得硅胶微球，除去其表面包覆的替代模板分子后，干燥得到表面分子印迹聚合物硅胶微球；
[0037] 其中，所述替代模板分子为L-谷氨酸，所述金属离子为Cu2+，所述功能单体为1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油。
[0038] 以下详述本发明的一种端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的制备过程。请参阅图1，其是本发明中端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球(MIP/SiO2)的制备过程示意图。所述制备方法包括以下步骤：
[0039] S1硅胶微球的活化
[0040] 准确称取5g的硅胶微球加入到250mL的圆底烧瓶中，再加入150mL的质量分数为5％～20％的盐
酸溶液，超声3～20min，然后将圆底烧瓶置于50～200℃的油浴锅中并保持
12～48h。结束后用去离子水洗涤抽滤直至中性。然后将硅胶微球置于鼓风干燥箱中，在50～200℃下活化12～48h，得到活化硅胶微球。
[0041] S2硅烷化硅胶微球的制备
[0042] 将2g活化硅胶微球加入到50mL的锥形瓶中，再加入20mL的无水甲苯，超声作用使活化硅胶微球均匀分散于甲苯中，并通氮气10min。随后向锥形瓶中加入2mL的4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷，于30～150℃反应12～48h。反应结束后，分别用甲苯、乙醇各洗涤5次，然后置于
真空干燥箱中室温下干燥12～48h，得到硅烷化硅胶微球。
[0043] S3RAFT功能化硅胶微球的制备
[0044] 取40mL的干燥预处理的四氢呋喃加入100mL的锥形瓶中，通氮气除氧10min后，注入8～30mL的苯基溴化镁。然后以
注射器逐滴加入1～5mL的CS2，滴加完毕后，在20～80℃条件下反应0.2～3h。反应结束后，加入300～1000mg的硅烷化硅胶微球(即所述RAFT试剂与活化硅胶微球的摩尔比为8:1～1:12)，超声作用5min，通氮气3～30min除氧后置于30～80℃油浴锅中反应24～60h。反应结束后，依次用四氢呋喃、甲醇、丙酮各洗涤三次，最后置于真空干燥箱中室温下干燥12～48h，得到RAFT功能化硅胶微球。
[0045] S4表面包覆有模板分子的硅胶微球的制备
[0046] 称取3～15mg的L-谷氨酸，超声溶解于10mL乙醇和水的混合溶剂中，加入300～600mg的1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油和50～200mg CuSO4·5H2O(即替代模板分子与功能单体的摩尔比为7:1～1:15，功能单体与金属离子的摩尔比为9:1～1:12)，10～80℃下于摇床中震荡4～14h，使L-谷氨酸、Cu2+与1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油通过金属螯合作用进行自组装。随后，向其中加入80mg的RAFT功能化硅胶微球、370mg的N,N-亚甲基双丙烯胺，超声作用10min。然后加入500μL浓度为0.6mg/mL的偶氮二异丁腈(AIBN)溶液(所述引发剂的用量为交联剂质量的0.1％～5％)，振荡30min，超声作用10min，再通氮气
15min，密封反应体系。在30～90℃下于摇床中振荡反应4～12h，得到包覆有模板分子L-谷氨酸的硅胶微球。
[0047] S5洗脱模板分子
[0048] 将包覆有模板分子的硅胶微球分别用去离子水、乙醇洗涤抽滤，然后置于真空干燥箱中于80℃干燥24h。将其置于洗脱液中进行洗脱，连续多次后离心得到除去模板分子的硅胶微球；将除去模板分子的硅胶微球干燥，制得具有特异性识别空穴的分子印迹聚合物硅胶微球。然后用去离子水洗涤至中性，置于真空干燥箱中于60℃干燥10h，制得L-谷氨酸表面分子印迹聚合物硅胶微球。
[0049] 按照上述制备过程，进行以下具体
实施例。
[0050]
[0051]
[0052] 通过此种方法制备的端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球分析如下：
[0053] 为方便对比说明，除在制备过程中不添加替代模板分子L-谷氨酸以外，采用同样的方法制备得到非印迹聚合物硅胶微球(NIP/SiO2)，用于与本实施例中制得的端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球(MIP/SiO2)对比分析。
[0054] 请参阅图2，其是是本发明空白硅胶微球(a)和端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球(b)的扫描电镜照片。从图中可知，未聚合前，硅胶微球呈规则球形，其表面粗糙度较大(a)；MIP/SiO2呈规则球形，其表面有一层明显的分子印迹聚合物，表面粗糙度比空白硅胶微球小。
[0055] 请参阅图3，其是本发明的空白硅胶微球(a)、RAFT功能化硅胶微球(b)、NIP/SiO2(c)与MIP/SiO2(d)的热重曲线图和一次微分曲线图。从图中可知，空白硅胶质量损失约4.2％，主要是硅胶微球表面吸附的水分和部分杂质的失重。RAFT功能化硅胶微球失重约
8.3％，在450℃和650℃左右的失重速率最大，这是由于功能化硅胶微球表面接枝的硅烷化物质和苯基溴化镁随温度的升高而发生降解，说明已成功对硅胶微球进行改性处理。与RAFT功能化硅胶微球相比，NIP/SiO2和MIP/SiO2有更大的失重，分别为9.6％和11.2％，在
350℃左右失重速率最大，说明硅胶微球表面形成了印迹薄层，且印迹薄层在350℃高温条件下发生了分解。另外，MIP/SiO2失重比NIP/SiO2多，说明在MIP/SiO2的表面相比NIP/SiO2的表面，印迹聚合物的百分比更高。
[0056] 请参阅图4，其实本发明的MIP/SiO2吸附萃取样品溶液中的端基为谷氨酸的呈鲜多肽的原理图。端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球的表面具有L-谷氨酸的特异性结合空位，能够吸附样品溶液中的端基为谷氨酸的呈鲜多肽将其上的谷氨酸插入微球表面的结合空位中，从而完成对样品溶液中端基为谷氨酸的呈鲜多肽的吸附萃取。
[0057] 请参阅图5，其是MIP/SiO2与NIP/SiO2分别对不同呈鲜多肽的选择性萃取容量图，其中，选取的多肽依次为天
门冬氨酸-甘氨酸(Asp-Gly)、谷氨酸-甘氨酸(Glu-Gly)、谷氨酸-谷氨酸(Glu-Glu)、丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸(Ser-Gly-Ser)、谷氨酸-甘氨酸-丝氨酸(Glu-Gly-Ser)、谷氨酸-甘氨酸-谷氨酸(Glu-Gly-Glu)。六种多肽分别配成10^-2mg/mL的标准溶液。从图中可知，MIP/SiO2对Glu-Gly的萃取量为0.0082mmol，而NIP/SiO2对Glu-Gly的萃取量为0.0026mmol；且MIP/SiO2对Glu-Gly、Glu-Glu、Glu-Gly-Ser和Glu-Gly-Glu相较于对Ser-Gly-Ser的萃取量更大。说明MIP/SiO2对端基含谷氨酸的呈鲜多肽都具有一定的选择性，而对端基不含谷氨酸的多肽选择性都较差，说明了相对于其他多肽，采用本发明的方法制得的MIP/SiO2对端基含谷氨酸的呈鲜多肽具有较好的选择性。
[0058] 请参阅图6，其是本发明的功能单体与金属离子和现有技术中的功能单体对L-谷氨酸的萃取容量图；其中，本发明中的功能单体为1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油(AGE/IDA)，金属离子为Cu2+，现有技术中的功能单体为2-丙烯酰胺-2甲基丙烯酸(AMPS)。由图中可知，相比于AMPS，本发明的AGE/IDA对L-谷氨酸具有更高的萃取量。这是由于，AMPS与L-谷氨酸之间通过H和O之间的范德华力连接，十分薄弱；而AGE/IDA与Cu2+的结构为L-谷氨酸的两个羧基H提供电子轨道，结合力更强，从而能够萃取更多的L-谷氨酸。
[0059] 请参阅图7，其是采用本发明制备的端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球对酱油进行预处理(a)，和不采用上述微球对酱油进行预处理(b)以及不采用上述微球对参照溶液(非酱油)进行预处理(c)的液相色谱图。经对比发现，经MIP/SiO2分离后，可在酱油中检测到端基为谷氨酸的两种呈鲜多肽Glu-Gly和Glu-Gly-Ser，而不经MIP/SiO2分离，在酱油中没有检测到上述两种呈鲜多肽。可见，本发明所制得的端基为谷氨酸的呈鲜多肽表面分子印迹聚合物硅胶微球能够有效吸附萃取酱油中的端基为谷氨酸的呈鲜多肽，从而提升酱油中呈鲜多肽检测的准确性。
[0060] 相对于现有技术，利用本发明所述方法制备的表面分子印迹聚合物硅胶微球包覆均匀、印迹物分子量分布窄、性能稳定的优点。并且，由于多种呈鲜多肽的端基为L-谷氨酸，因此，一次性实现在水环境下对多种呈鲜多肽的选择性吸附，大大降低了工作量。另外，传统的表面分子印迹技术，功能单体与替代模板分子之间通过分子间作用力结合，本发明的2+
制备方法中，金属离子Cu 和功能单体1-(N，N-双羧甲基)氨基-3-烯丙基甘油通过金属螯合作用力连接替代模板分子L-谷氨酸，相对于分子间作用力，L-谷氨酸与Cu2+的结合力更强，能够更加稳定聚合物的表面，也能够结合更多的替代模板分子，从而得到更多的L-谷氨酸结合空位，以尽量多地甚至是全部结合酿造酱油中的端基为谷氨酸的呈鲜多肽，提高检测的准确性。
[0061] 本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或
变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的
权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。
