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GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用

阅读：1037发布：2020-05-17

专利汇可以提供GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了GmU3-19g-1和GmU6-16g-1的启动子序列，及其在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑载体系统中的应用，包括GmU3-19g-1和GmU6-16g-1的启动子的使用，及载体构建过程，并结合具体示例阐述该系统的使用。利用该系统可以同时编辑多个基因，为研究大豆中多基因家族以及基因直接的相互作用关系提供有力工具，同时可以大大缩短大豆中涉及多个性状(或者多个基因)的育种进程。，下面是GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.GmU3-19g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。
2.GmU3-19g-1启动子联合GmU6-16g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是GmU3-19g-1联合GmU6-16g-1启动子能够同时调控多个sgRNA的表达，实现靶向2～4个不同的靶标。
4.一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体pU3-sgR，其特征在于含有GmU3-19g-1启动子，其中,U3pro-sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体组合，其特征在于包含权利要求4所述的载体pU3-sgR，以及含有GmU6-16g-1启动子序列的骨架载体pU6-sgR；所述的pU6-sgR中GmU6pro-gRNA序列如SEQ ID NO.4所示。
6.权利要求5所述的载体组合在CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统中的应用。
7.一种CRISPR/Cas9介导的多基因编辑载体的构建方法,其特征在于包含以下步骤:
(1)将每个靶序列分别构建到sgRNA骨架载体中：根据基因打靶位点通过网站在线设计靶序列,合成引物，引物通过退火形成二聚体；将二聚体通过酶切位点BsmB I连接到含有GmU3-19g-1启动子或GmU6-16g-1启动子序列的骨架载体上；含有GmU3-19g-1启动子的骨架载体命名为pU3-sgR，其中U3pro-sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；含有GmU6-16g-1启动子序列的骨架载体命名为pU6-sgR，其中GmU6pro-gRNA序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)将靶序列两两构建到pGmUbi-Cas9载体中；从pU3-sgR和pU6-sgR载体中PCR扩增出完整的表达框GmU6pro/GmU3pro+sgRNA骨架，引物为pU3-F/pU3-R和pU6-F/pU6-R；pGmUbi-Cas9载体使用Nco I和Xba I双酶切回收；通过T4连接酶将4个sgRNA骨架两两组合；连接到pSC-GmUbi3载体中，得到2个中间载体pGmUbi-Cas9-2×sgR；
(3)将四个靶序列构建到同一pGmUbi-Cas9载体中：通过引物F/R从第二个pSC-GmUbi3-
2×sgR载体中PCR扩增出来GmU3pro+sgRNA3骨架+GmU6pro+sgRNA4骨架,第一个pGmUbi-Cas9-
2×sgR载体用BstE II酶切回收，通过同源重组的方式将片段GmU3pro+sgRNA3骨架+GmU6pro+sgRNA4骨架连接到第一个pGmUbi-Cas9-2×sgR，得到最终的载体pGmUbi-Cas9-4×sgR。
8.按照权利要求7所述的方法构建的CRISPR/Cas9介导的多基因编辑载体。
9.一种CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑方法，其特征在于包括将权利要求8所述的多基因编辑载体转入宿主大豆。

说明书全文

GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

[0002] 大豆[Glycine Max(L.)Merr.]起源于中国，是重要的油料和高蛋白作物，含有多种对人类有益的生理活性物质,如异黄酮等，此外大豆也是农业生产体系中重要的养地作物。基因打靶现象很早就被发现，但基因打靶技术在真核生物中的应用却较为缓慢，TALENs技术的出现加快真核生物基因打靶的研究，而CRISPR/Cas9技术的出现则掀起真核生物基因打靶研究的热潮，CRISPR/Cas9技术简便性和低成本等特点使得技术的普及性非常高。

[0003] CRISPR/Cas9系统的打靶效率依赖于sgRNA的高效表达，而sgRNA属于非编码RNA，需要有合适的启动子调控其表达，真核生物snRNA是一类非编码RNA，组成型表达，适合于调控sgRNA的表达。我们从大豆基因组中克隆了2个snRNA(GmU3-19g-1和GmU6-16g-1)的启动子序列，设计一套可用于多基因打靶的CRISPR/Cas9载体系统，可以在同一个植物表达载体组装4个，乃至更多的sgRNA。选择苯丙烷代谢途径中2个编码黄烷酮-3-羟化酶的GmF3H1和GmF3H2，以及1个编码黄酮合酶II的GmFNSII-1为靶标构建3个多基因敲除载体，通过大豆毛状根转化，发现该多基因编辑系统可以在大豆中发挥作用。这个系统可以为研究大豆中多基因家族以及基因直接的相互作用关系提供有力工具，同时可以大大缩短大豆中涉及多个性状的育种进程。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供GmU3-19g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。

[0005] 本发明的另一目的是提供一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体组合。

[0006] 本发明的又一目的是提供一种CRISPR/Cas9介导的多基因编辑载体的构建方法。

[0007] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0008] GmU3-19g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。

[0009] GmU3-19g-1启动子联合GmU6-16g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。

[0010] GmU3-19g-1联合GmU6-16g-1启动子能够同时调控多个sgRNA的表达，实现靶向2～4个不同的靶标。

[0011] 一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体pU3-sgR，含有GmU3-19g-1启动子，其中,U3pro-sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0012] 一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体组合，包含所述的载体pU3-sgR，以及含有GmU6-16g-1启动子序列的骨架载体pU6-sgR；所述的pU6-sgR中GmU6pro-gRNA序列如SEQ ID NO.4所示。

[0013] 本发明所述的载体组合在CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统中的应用。

[0014] 一种CRISPR/Cas9介导的多基因编辑载体的构建方法,包含以下步骤:

[0015] (1)将每个靶序列分别构建到sgRNA骨架载体中：根据基因打靶位点通过网站在线设计靶序列,合成引物，引物通过退火形成二聚体；将二聚体通过酶切位点BsmB I连接到含有GmU3-19g-1启动子或GmU6-16g-1启动子序列的骨架载体上；含有GmU3-19g-1启动子的骨架载体pU3-sgR中U3pro-sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；含有GmU6-16g-1启动子序列的骨架载中GmU6pro-gRNA序列如SEQ ID NO.4所示；

[0016] (2)将靶序列两两构建到pGmUbi-Cas9载体中；从pU3-sgR和pU6-sgR载体中PCR扩增出完整的表达框GmU6pro/GmU3pro+sgRNA骨架，引物为pU3-F/pU3-R和pU6-F/pU6-R；pGmUbi-Cas9载体使用Nco I和Xba I双酶切回收；通过T4连接酶将4个sgRNA骨架两两组合；
连接到pSC-GmUbi3载体中，得到2个中间载体pGmUbi-Cas9-2×sgR；

[0017] (3)将四个靶序列构建到同一pGmUbi-Cas9载体中：通过引物F/R从第二个pSC-GmUbi3-2×sgR载体中PCR扩增出来GmU3pro+sgRNA3骨架+GmU6pro+sgRNA4骨架。第一个pGmUbi-Cas9-2×sgR载体用BstE II酶切回收，通过同源重组的方式将片段GmU3pro+sgRNA3骨架+GmU6pro+sgRNA4骨架连接到第一个pGmUbi-Cas9-2×sgR，得到最终的载体pGmUbi-Cas9-4×sgR。

[0018] 按照上述的方法构建的CRISPR/Cas9介导的多基因编辑载体。

[0019] 一种CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑方法，包括将所述的多基因编辑载体转入宿主大豆。

[0020] 有益效果

[0021] CRISPR/Cas9技术的出现使得基因打靶在真核生物很容易实现，关于该技术的改进及延伸应用也越来越多，其中一方面改进就是多基因编辑。本发明旨在克隆GmU3-19g-1和GmU6-16g-1的启动子，并将其应用于CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统，为大豆中涉及多基因的基础理论研究，代谢工程及分子育种提供有力工具。本发明选择GmF3H1，GmF3H2和GmFNSII-1为靶标基因，通过毛状根转化发现存在3个基因同时突变的毛状根，证明了GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在CRISPR/Cas9载体系统中的有效性。附图说明

[0022] 图1大豆GmU3-19g-1snRNA和其它U3 snRNA的序列比对

[0023] 图2大豆GmU6-16g-1snRNA和其它U6 snRNA的序列比对

[0024] 图3用于大豆中多基因编辑的CRISPR/Cas9系统组装流程图

[0025] 简要流程：(1)首先将4个打靶序列构建到sgRNA骨架载体中；(2)通过PCR的方法扩增出完整的表达框(U6/3启动子+sgRNA)，利用酶切连接的方法将4个sgRNA骨架两两组合(如1和2连，3和4连)连接到pGmUbi-Cas9载体中；(3)从构建好的第二个载体中PCR扩增出来U3pro+sgRNA3+U6pro+sgRNA4，通过重组的方法连接到第一个载体即可。通过这种多基因编辑的思路可以设计1～4个靶位点。

[0026] 图4pGmUbi-Cas9-4×sgR载体示意图

[0027] 图5GmF3H1，GmF3H2和GmFNSII-1靶位点设计及组装载体示意图

[0028] (a)GmF3H1，GmF3H2和GmFNSII-1靶位点设计，黄色：外显子1；红色下划线：PAM。(b)组装的3个多基因编辑载体示意图。Bar，草丁膦筛选基因；GmUbi3pro，GmUbi3启动子；GmU6，GmU6-16g-1启动子；GmU3，GmU3-19g-1启动子；CaMV-T，终止子；dpCas9,双子叶植物密码子优化的Cas9基因。

[0029] 图6毛状根中CRISPR/Cas9诱导的突变类型及其频率

[0030] (a)代表性的毛状根突变序列，绿色表示PAM；(b)突变类型及其频率，左侧表格：缺失(d)，插入(i)，插入和缺失并存(c)；左侧表格：不同插入碱基的频率；右侧表格：不同突变长度的频率。x轴:d#，缺失碱基#；i#,插入碱基#；c，插入和缺失并存.

具体实施方式

[0031] 下面结合图及实施例对本发明做进一步说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0032] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

[0033] 实施例1.GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子的克隆

[0034] 通过拟南芥AtU3B序列在大豆基因组中比对到9个U3 snRNA(图1)，设计特异性引物克隆GmU3-19g-1的启动子序列；通过拟南芥AtU6-26序列在大豆基因组中比对到11个U6snRNA(图2)，设计特异性引物克隆GmU6-16g-1的启动子序列。GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子均包含保守的USE元件和TATA-box，GmU3-19g-1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，GmU6-16g-1启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0035] 表1 克隆GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子的引物

[0036]

[0037] 实施例2.CRISPR/Cas9系统载体设计

[0038] 在本专利中使用的是双子叶植物密码子优化的dpCas9，GmUbi3启动子调控Cas9的转录；GmU3-19g-1(GmU3)启动子选取467 bp，GmU6-16g-1(GmU6)启动子选取350 bp序列，调控sgRNA的转录。pU3-sgR载体的U3pro-sgRNA序列如SEQ ID NO.3所示，其中,1～467 bp为GmU3-19g-1启动子,498～575 bp为sgRNA骨架，576～581bp为转录终止信号；pU6-sgR载体的GmU6pro-gRNA序列如SEQ ID NO.4所示；其中105～454 bp为GmU6-16g-1启动子；466～552 bp为sgRNA骨架；553～558bp为转录终止信号。

[0039] 2.1 CRISPR/Cas9打靶位点的设计

[0040] 基因打靶位点通过网站在线设计，比如CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)等。

[0041] GmU6骨架:GmU6pro-GATTGGAAGAGCATCGGCTCTTCTGTTTTA-sgRNA

[0042] 下划线为BsmB I酶切位点，酶切后产生黏性末端：引物设计：

[0043] 5'-GATTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'

[0044] 3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'

[0045] U6 snRNA启动子的转录起始碱基为G。在设计时靶向序列第一个是G，则选择20个碱基；如果第一个不是G，则在前面补上一个碱基G。示例如下

[0046] 靶标序列1：底灰表示PAM，设计引物

[0047] F

[0048] R

[0049] 靶标序列2：底灰表示PAM，设计引物

[0050] F

[0051] R

[0052] GmU3骨架:GmU3pro-GTCAGGAGACGATGTACTCGTCTCAGTTTTA-sgRNA

[0053] 下划线为BsmB I酶切位点，酶切后产生黏性末端：

[0054] sgRNA设计

[0055] 5'-GTCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'

[0056] 3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'

[0057] U3 snRNA启动子的转录起始碱基为A。在设计时20个靶向序列第一个不是A，则保留20个碱基；如果第一个是A，则保留后面19个碱基。示例如下

[0058] 靶标序列1：底灰表示PAM，设计引物

[0059] F

[0060] R

[0061] 靶标序列2：底灰表示PAM，设计引物

[0062] F

[0063] R

[0064] 2.2 CRISPR/Cas9载体构建

[0065] 本专利设计的CRISPR/Cas9载体可以搭载2个及以上sgRNA骨架，在此以构建4个sgRNA为例，详细说明载体的构建过程(图3)。

[0066] (1)首先将4个靶序列构建到sgRNA骨架载体中

[0067] 靶序列设计好后合成引物，引物通过退火，形成二聚体，体系：F和R(10μM)各12.5μL，再补上25μL ddH2O，共计50μL。混匀后按照如下程序处理：95℃3min，95℃到25℃缓慢冷却，例如-1℃/20S或者将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，再16℃5min。pU3-sgR和pU6-sgR骨架载体用NEB的BsmB I酶切回收。通过T4连接酶将引物二聚体连接到骨架载体上。

[0068] (2)将4个靶序列两两构建到pGmUbi-Cas9载体中

[0069] 从pU3-sgR和pU6-sgR载体中PCR扩增出完整的表达框GmU6pro/GmU3pro+sgRNA骨架，引物为pU3-F/pU3-R和pU6-F/pU6-R。pGmUbi-Cas9载体(SEQ ID NO.5)使用Nco I和Xba I双酶切回收。通过T4连接酶将4个sgRNA骨架两两组合(如1和2连，3和4连)连接到pGmUbi-Cas9载体中，得到2个中间载体pGmUbi-Cas9-2×sgR。测序引物是Seq-F/R。

[0070] (3)将4个靶序列构建到同一pGmUbi-Cas9载体中

[0071] 通过引物F/R从第二个pGmUbi-Cas9-2×sgR载体中PCR扩增出来GmU3pro+sgRNA3骨架+GmU6pro+sgRNA4骨架。第一个pGmUbi-Cas9-2×sgR载体用BstE II酶切回收。通过同源重组的方式将片段(GmU3pro+sgRNA3骨架+GmU6pro+sgRNA4骨架)连接到第一个pGmUbi-Cas9-2×sgR，得到最终的载体pGmUbi-Cas9-4×sgR(图4)。测序引物是Seq2-F/R。

[0072] 表2 构建载体使用的引物

[0073]

[0074] 3.利用CRISPR/Cas9系统同时敲除GmF3H1、GmF3H2和GmFNSII-1

[0075] 本发明专利设计了一套CRISPR/Cas9系统可以编辑多个基因，为了验证该系统的有效性，选择大豆中的GmF3H1(Glyma.02G048400)、GmF3H2(Glyma.02G048600)和GmFNSII-1(Glyma.12G067000)作为靶基因。

[0076] (1)CRISPR/Cas9打靶位点的设计及载体构建

[0077] GmF3H1和GmF3H2之间高度同源，设计靶位点sg1，同时靶向2个基因的第一个外显子；另外设计靶位点sg2特异靶向GmF3H1，靶位点sg3特异靶向GmF3H2(图5a)。sg1、sg2和sg3都是使用GmU6启动子。针对GmFNSII-1的第一个外显子，设计了3个不同的靶位点sg4、sg5和sg6(图5a)。sg4使用GmU3启动子，sg5和sg6使用GmU6启动子。靶位点设计好后合成引物，引物序列见序列表。通过2.2部分描述的实验方法将靶序列插入到对应的sgRNA骨架载体中。

[0078] 设计了3个不同的sgRNA组合形式，载体Tri-KO1为含有1个sg1、1个sg5和2个sg4的pGmUbi-Cas9载体；载体Tri-KO2为含有1个sg1、1个sg6和2个sg4的pGmUbi-Cas9载体；载体Tri-KO3为含有1个sg2、1个sg3和2个sg4的pGmUbi-Cas9载体(图5b)。通过2.2部分描述的实验方法将sgRNA骨架按照上述设计方案组装起来。

[0079] 表3 GmF3H1，GmF3H2和GmFNSII-1靶位点引物

[0080]

[0081]

[0082] (2)毛状根转化实验

[0083] 构建成功的载体转化发根农杆菌K599，侵染大豆子叶。大豆毛状根的诱导参考发表的方法并做适当修改。第一步，挑选表面无病斑、无褶皱和饱满的成熟豆子，然后置于通风橱中的干燥器，使用Cl2灭菌6～8h，灭菌后的豆子萌发于SG4(1/2MS)培养基中，培养6天(25℃，16h光照/8h黑暗)。第二步，将萌发的子叶保留，弃掉下胚轴和真叶基部，在子叶的背侧挖一个小伤口，然后将子叶平铺在White(含500μg/mL carbenicillin disodium,50μg/mL cefotaxime disodium)培养基上，农杆菌菌液28℃、200r/min振荡培养至OD600＝0.8～0.9左右，4000r/min离心10min收集菌体，然后重悬于MgCl2(含50μmol/L乙酰丁香酮AS)溶液至OD600＝0.5。将悬浮好的菌液滴在子叶伤口处，然后25℃黑暗培养14d。第三步，将有毛状根诱导出来的子叶转移到新的White培养基上，继续25℃黑暗培养7～14d，直到根生长的足够长后取样保存于-20℃。

[0084] (3)毛状根突变效率的检测

[0085] 3个多基因编辑载体(Tri-KO1、Tri-KO2和Tri-KO3)分别转化大豆毛状根，每个载体取48个样品，共计144个。提起毛状根DNA，利用bar进行转基因检测，发现检测的样品均携带转基因成分。

[0086] 对于基因打靶效率的定义：每个载体检测的毛状根DNA样品中，基因打靶位点呈现突变的比例。所有的样品均经过PCR和测序检测，通过测序的峰值图即可判断是否存在基因突变。少部分PCR产物通过T克隆的方法获取精确的突变序列，然后分析突变的类型——碱基缺失、增加或替换。

[0087] 利用特异性引物(表4)，将包含打靶位点的一段DNA扩增出来，直接测序。经过检测，对于单独的靶标，突变效率在10.42％～31.25％(表1)。对于每一个毛状根样品，单基因突变效率在4.17％～12.50％；双基因突变效率在8.33％～16.67％；三基因突变效率在6.25％～12.50％(表5)。为了确定不同位点的突变是否相互独立还是存在联系，我们分析理论的突变效率，并与实际的观测值做比较。通过Tri-KO1载体打靶效率的卡方检验(表6)，发现实际观测的多基因突变效率显著偏离期望值，即不同位点的突变倾向于同时发生。挑选部分突变样品，将PCR产物连接T载体进行测序，精确获得突变序列。在打靶位点处，存在广泛的突变类型，包括插入、缺失以及插入和缺失同时出现(图6)。综合所有的样品发现，插入突变的概率是13.64％；缺失出现的概率是68.18％；还有18.18％同时出现插入和缺失。
在插入类型中，大部分是1bp的插入，并且插入A碱基的频率是53.85％(7/13)，T碱基的频率是15.38％(2/13)，C碱基的频率是7.69％(1/13)，G碱基的频率是23.08％(3/13)。73.86％(65/88)的突变序列变异的长度是少于10bp的缺失,剩下的26.14％(23/88)是大片段的缺失(>10bp)。有个突变是缺失了294bp，是因为在同一条序列上sg5和sg4靶位点都发生了突变，并且突变后两端的序列连接上了，导致中间的294个碱基缺失。

[0088] 表4 用于突变检测的引物

[0089]

[0090] 表5 毛状根中CRISPR/Cas9介导的多基因编辑效率

[0091]

[0092]

[0093] 1括号里的数字表示携带相应突变的毛状根个数。

[0094] 表6 Tri-KO1载体打靶效率的卡方检验

[0095]

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