技术领域
[0001] 本
发明属于化学药物分析技术领域，具体涉及一种定量测定血浆中尼美舒利的方法及应用。
背景技术
[0002] 尼美舒利(NMSL)属于非甾体类抗炎
镇痛药，适用于类
风湿性关节炎、骨关节炎等慢性关节
炎症；手术和急性创伤后的
疼痛；
耳鼻咽部炎症引起的疼痛；痛经；上
呼吸道感染引起的发热症状等。服用尼美舒利后可产生胃灼热、恶心、胃痛等不良反应，但症状轻微、短暂，很少需要中断
治疗。极少情况下，患者出现过敏性皮疹。尼美舒利同其它非甾体抗炎药一样，可能产生头晕、嗜睡、消化道溃疡、肠道出血或史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-JohnsonSyndrome)等。尼美舒利的禁忌为：(1)对本品或其它非甾体抗炎药过敏者；(2)胃肠道出血或消化性溃疡活动期患者；(3)严重肾功能不全患者。因此，服用尼美舒利需格外注意剂量、
疗程，以减少药品不良反应的发生。
[0003] 尼美舒利血浆蛋白结合率高，可能会置换其它蛋白结合药物。
[0004] 2010-2011年的尼美舒利事件，“尼美舒利用于儿童退热时，对中枢神经及肝脏造成损伤的案例频频出现”，使得尼美舒利的安全性受各方关注，2008年和2011年国家药监部
门对尼美舒利的药品
说明书进行了更改，对适应症、用法用量等事项进行了严格的限制。
[0005] 国内关于尼美舒利在血浆中检测方法的报道较少，大部分都需要使用易挥发的弱极性有机
试剂如乙醚作为萃取剂进行液液萃取，液液萃取法步骤繁琐，需要加入内标、萃取剂，离心，取有机层吹干浓缩，再进行复溶方可进样，同时萃取剂毒性大，不利于工作人员健康，提取回收率低。已有文献方法仍旧存在样本使用量大、分析时间较长、定量下限较高等不足。
[0006] 尼美舒利的检测和控制关系到药品的安全性和实效性，基于以上剂量调整、不良反应监测、血浆蛋白结合率相关的药物与药物间的相互作用等的研究，建立高效、快速、准确、灵敏的尼美舒利浓度检测方法十分必要。
发明内容
[0007] 为解决
现有技术中存在的问题，本发明提供了一种定量测定血浆中尼美舒利的方法及应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术手段为：
[0009] 一种定量测定血浆中尼美舒利的方法，包括如下步骤：
[0010] S1：样品前处理
[0011] 取血浆或血清样品，加入
酸溶液，涡旋振荡，再加入内标工作液，涡旋振荡，随后离心5～20min，取上清液进样至液质联用仪中；
[0012] S2：分别按照设定的色谱条件和质谱条件测定步骤S1所得上清液，得色谱图和质谱图，根据尼美舒利的标准曲线得出血浆中尼美舒利的含量；
[0013] 步骤S2中，通过尼美舒利标准曲线工作液制备尼美舒利标准曲线样品，按照步骤S1进样，记录分析物和内标峰面积，计算分析物和内标峰面积比值，对尼美舒利的理论浓度进行线性回归，获得尼美舒利的标准曲线。
[0014] 进一步的，步骤S1中，取血浆或血清样品，以1:0.5～1:5的体积比加入含酸
水溶液，涡旋振荡，再加入3～20倍样品体积的尼美舒利D5乙腈溶液，涡旋振荡后进行离心，取离心后的上清液进样分析。
[0015] 进一步的，步骤S1中，所述内标工作液采用以下步骤制备得到：将尼美舒利D5固体以甲醇溶解并定容，获得内标储备液；取内标储备液，以乙腈为
溶剂，逐级稀释得到内标工作液。
[0016] 进一步的，步骤S2中，色谱条件为：
[0017] 色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-CN色谱柱，Narrow Bore RR，规格2.1×100mm，3.5μm；柱温：10～40℃；流动相A：20mM
甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；等度洗脱比例：
30～60％，B相；流速为0.1～1.0mL/min；自动进样
温度：0～30℃；进样量：0.50～20.0μL；分析时间：2.50～10.0min。
[0018] 进一步的，步骤S2中，质谱条件为：
[0019]
离子化模式：电喷雾离子化，负离子模式；
[0020] 尼美舒利的离子对为307.0→229.1，小数点后数值可在-0.9～0.9之间摆动；
[0021] 尼美舒利D5的离子对为：312.4→234.2，小数点后数值可在-0.9～0.9之间摆动；
[0022] 离子源参数：GS1＝10～60psig，GS2＝10～60psig，CAD＝1～20psig，CUR＝10～50psig，TEM＝100～550℃，IS＝-1000～-4500V，EP＝-1～-15V，CXP＝-1～-16V。
[0023] 进一步的，步骤S2中，称取尼美舒利，以二甲亚砜溶解并定容，配制成尼美舒利储备液；以甲醇为溶剂，将尼美舒利储备液逐级稀释得到尼美舒利标准曲线工作液；以空白血浆为空白基质，制备不同浓度的尼美舒利标准曲线样品，按照步骤S1进样，通过测定获得尼美舒利的标准曲线。
[0024] 进一步的，步骤S2中，称取尼美舒利，以二甲亚砜溶解并定容，配制尼美舒利储备液；以甲醇为溶剂，将尼美舒利储备液逐级稀释得到质控工作液；以空白血浆为空白基质，制备不同浓度的质控样品，按照步骤S1进样，以质控确保分析批的可靠性。
[0025] 一种定量测定血浆中尼美舒利的方法在尼美舒利治疗药物监测中的应用。
[0026] 一种定量测定血浆中尼美舒利的方法在尼美舒利合成中的应用。
[0027] 一种定量测定血浆中尼美舒利的方法在尼美舒利制剂开发中的应用。
[0028] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0029] 本发明提供了一种定量测定血浆中尼美舒利的方法及应用，包括如下步骤：S1：取血浆样品，加入酸溶液，涡旋振荡，再加入内标工作液，涡旋振荡，随后离心，取上清液进样至液质联用仪中；S2：分别按照设定的色谱条件和质谱条件测定步骤S1所得上清液，得色谱图、分析物及内标的峰面积，根据尼美舒利的标准曲线得出血浆中尼美舒利的含量，步骤S2中，通过尼美舒利标准曲线工作液制备尼美舒利标准曲线样品，按照步骤S1进样，记录分析物和内标峰面积，计算分析物和内标峰面积比值，对尼美舒利的理论浓度进行线性回归，获得尼美舒利的标准曲线。本发明提供的定量测定血浆中尼美舒利的方法及应用，使用血浆样本量少，灵敏度高，采用蛋白直接沉淀法，前处理简便、经济、快速，解决了普通蛋白沉淀法提取回收率低的问题，分析时间短，无残留，无基质干扰，适合高通量、快速检测人血浆中微量尼美舒利的浓度或含量，为尼美舒利新制剂开发、尼美舒利的治疗药物监测、尼美舒利的药物间的相互作用的研究、尼美舒利临床研究等提供有
力的技术支持。
附图说明
[0030] 图1为本发明尼美舒利准分子离子的典型质谱图
[0031] 图2为本发明尼美舒利产物离子的典型质谱图；
[0032] 图3为本发明内标尼美舒利D5准分子离子的典型质谱图；
[0033] 图4为本发明内标尼美舒利D5产物离子的典型质谱图；
[0034] 图5为本发明空白人血浆中尼美舒利的典型色谱图；
[0035] 图6为本发明空白人血浆中尼美舒利D5的典型色谱图；
[0036] 图7为本发明LLOQ样品中尼美舒利的典型色谱图；
[0037] 图8为本发明LLOQ样品中尼美舒利D5的典型色谱图；
[0038] 图9为本发明的尼美舒利的典型标准曲线图。
具体实施方式
[0039] 以下结合具体
实施例对本发明的技术方案做进一步说明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，具体数值为典型值，而非以任何方式限制本发明的范围。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0040] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程、方法和试剂是本领域中公知的常规方法和产品。
[0041] 名词解释：
[0042] Ai：内标峰面积；
[0043] As：样品峰面积；
[0044] BQL：低于定量下限；
[0045] CAD：喷撞气
[0046] CUR：气帘气
[0047] CV：变异系数；
[0049] DMSO：二甲亚砜；
[0050] DP：去簇电压；
[0051] Dwell：离子驻留时间；
[0053] EP：射入电压；
[0054] ESI：电喷雾离子化；
[0056] GS2：辅助加热气；
[0057] IS：离子化电压；
[0058] LC-MS/MS(HPLC-MS/MS)：高效液相色谱-质谱联用；
[0059] LLOQ：Lower Limit of Quantification，定量下限；
[0060] ULOQ：定量上限；
[0061] ME：基质效应；
[0062] NA或N/A：不适用；
[0063] R2：决定系数；
[0064] RE/Bias：Relative Error，相对误差；
[0065] RSD(CV)：相对标准差，或变异系数；
[0066] SD/S.D.：标准差；
[0067] TEM：离子源加热温度。
[0068] 实施例1
[0069] 如图1-9所示，一种定量测定血浆中尼美舒利的方法，包括以下步骤：
[0070] S1：样品前处理
[0071] 取30.0μL血浆样品，加入30.0μL、体积分数为1％的甲酸水溶液，涡旋振荡2min，加入240μL内标沉淀剂(含50ng/mL尼美舒利D5的乙腈溶液)，涡旋振荡5min，于4℃、4000rpm条件下离心10min，取上清200μL，进样至液质联用仪进行测定和分析。
[0072] S2：设定参数
[0073] 1)设定色谱条件，洗脱参数如表1所示。
[0074] 表1
[0075]
[0076]
[0077] 色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-CN，Narrow Bore RR色谱柱，规格为2.1×100mm×3.5μm。
[0078] 保护柱：Phenomenex Security Guard Cartridges Kit C18保护柱，规格为4×2.0mm。
[0079] 柱温：室温。
[0080] 自动进样器温度：4℃。
[0081] 进样量：2.0μL。
[0082] 分析时间：4.0min。
[0083] 洗针程序：吸样前后各清洗4s。
[0084] 洗针液：50％甲醇水溶液。
[0085] 典型保留时间：尼美舒利1.4～1.8min；尼美舒利D51.4～1.8min。
[0086] 2)设定质谱条件
[0087] 离子化模式：ESI，负离子模式。
[0088] 分析物质谱参数见表2所示。
[0089] 表2
[0090]
[0091]
[0092] 离子源参数见表3所示。
[0093] 表3
[0094]
[0095] S3：制备储备液
[0096] 精密称取尼美舒利标准品10mg，置于10mL容量瓶中，以DMSO溶解并定容，按纯度计算浓度，获得浓度为1mg/mL的储备液，以1.5mL离心管分装，于≤-15℃条件保存备用。每次至少制备2份储备液，并进行储备液检查，检查合格的储备液用于工作液的制备。
[0097] S4：制备工作液
[0098] 取尼美舒利储备液适量(以1mg/mL为例)，以甲醇为溶剂，按表4的标准曲线工作液制备表配制尼美舒利标准曲线工作溶液，按表5的质控工作液制备表配制尼美舒利质控工作溶液，于2～8℃保存备用。
[0099] 表4
[0100]
[0101]
[0102] 表5
[0103] 上级溶液浓 取用体积(μL) 溶剂 取用溶剂体积 所得工作液浓度1000000 200 甲醇 800 200000
200000 160 甲醇 840 32000
200000 80.0 甲醇 920 16000
16000 36.0 甲醇 604 900
900 40.0 甲醇 680 50.0
50.0 400 甲醇 600 20.0
[0104] S5：制备内标沉淀剂
[0105] 将尼美舒利D5固体以甲醇溶解并转移至5mL容量瓶中溶解定容，按纯度计算浓度，获得浓度为0.3mg/kg的内标储备液，并以0.6mL离心管分装，于≤-65℃保存备用。本发明采用共用的储备液制备内标工作液。
[0106] 取尼美舒利D5储备液适量，以0.3mg/mL为例，以乙腈为溶剂，按表6的内标工作液制备表制备内标工作液，于2～8℃保存备用。
[0107] 表6
[0108]
[0109]
[0110] S6：制备标准曲线和质控样品
[0111] 取不同浓度的尼美舒利标准曲线工作液按表7的标准曲线样品制备浓度分别为1.00、2.00、10.0、50.0、100、500、1800、2000ng/mL的尼美舒利标准曲线样品，每个样品分别取30.0μL，平行2份，按步骤S1进样分析，一份于分析批开始时分析，一份于分析批结束时分析，记录分析物和内标峰面积，计算分析物和内标峰面积比值，对理论浓度进行线性回归(加权最小二乘法，权重系数1/C2，C为浓度)，获得的回归方程即为尼美舒利的标准曲线，线性范围1.00～2000ng/mL，标准曲线的公式为y＝a+bx，其中，y为分析物和内标峰面积比值，x为分析物浓度。
[0112] 取不同浓度的尼美舒利质控工作液按表8的质控样品制备表制备浓度分别为1.00、2.50、45.0、800、1600ng/mL的尼美舒利质控样品，每个样品分别取30.0μL，平行6份，按步骤S1进样分析。
[0113] 表7
[0114] 工作溶液浓 取用体积 加入基质 取用溶剂体积 所得工作液浓度20.0 5.00 人血浆 95.0 1.00
40.0 5.00 人血浆 95.0 2.00
200 5.00 人血浆 95.0 10.0
1000 5.00 人血浆 95.0 50.0
2000 5.00 人血浆 95.0 100
10000 5.00 人血浆 95.0 500
36000 5.00 人血浆 95.0 1800
40000 5.00 人血浆 95.0 2000
[0115] 表8
[0116] 工作溶液浓 取用体积 加入基质 取用溶剂体积 所得工作液浓度20.0 12.0 人血浆 228 1.00
50.0 12.0 人血浆 228 2.50
900 12.0 人血浆 228 45.0
16000 12.0 人血浆 228 800
32000 12.0 人血浆 228 1600
[0117] 本发明采用以下方法进行结果验证：
[0118] 根据中国药典对本方法进行方法学验证，内容包括选择性和特异性、标准曲线、精
密度和准确度、残留、提取回收率、基质效应，包括以下步骤：
[0119] 1)选择性和特异性
[0120] 在6个不同来源的空白人血浆中考察特异性，空白基质不干扰尼美舒利和内标的测定，空白中尼美舒利和尼美舒利D5的峰面积分别不超过LLOQ的20％和5％。
[0121] 表9为空白血浆对尼美舒利和尼美舒利D5的干扰率。
[0122] 表9
[0123]
[0124]
[0125] 向空白人血浆中加入内标和ULOQ浓度的尼美舒利，考察尼美舒利和尼美舒利D5的相互干扰，结果表明分析物和内标无相互干扰。
[0126] 表10为尼美舒利和尼美舒利D5的相互干扰表。
[0127] 表10
[0128]
[0129]
[0130] 2)标准曲线
[0131] 以尼美舒利理论浓度为横坐标，尼美舒利与内标峰面积比值为纵坐标，以加权最小二乘法[权重系数(1/C2)]进行权重线性回归，获得尼美舒利的标准曲线，如表11所示，结果表明在1～2000ng/mL范围内线性良好。
[0132] 表11
[0133]
[0134]
[0135] 3)残留
[0136] 在分析ULOQ样品后立刻分析一个空白样品以考察残留，结果表明残留样品的尼美舒利和尼美舒利D5峰面积分别小于LLOQ样品的20％和5％。残留不干扰测定。
[0137] 4)精密度和准确度(含灵敏度)
[0138] 制备1.00、2.50、45.0、800和1600ng/mL质控样品，连续三天，每天一个分析批，每批每个浓度平行6份，计算准确度、批间、批内精密度。结果表明所述5个浓度的准确度均为85％～115％，其中LLOQ在80％～120％之间；精密度CV小于15％，其中LLOQ小于20％，如表
12的尼美舒利的精密度和准确度表所示。
[0139] 表12
[0140]
[0141]
[0142]
[0143] 续表12：
[0144]
[0145]
[0146] 5)提取回收率
[0147] 表13为尼美舒利的提取回收率，表14为尼美舒利D5的提取回收率，在2.50、800和1600ng/mL三个浓度考察提取回收率，结果表明尼美舒利的提取回收率为83.5％～86.1％，尼美舒利D5的提取回收率为86.1％。
[0148] 表13
[0149]
[0150]
[0151] 表14
[0152]
[0153]
[0154] 6)基质效应
[0155] 在6个不同来源的空白人血浆中考察尼美舒利和尼美舒利D5的基质效应，表15为尼美舒利的基质效应，表16为不同来源血浆中内标均一化后尼美舒利响应的CV，结果表明2.50、800和1600ng/mL三个浓度水平下，尼美舒利的基质效应在96.2％～97.2％之间，内标均一化后的CV％均小于15％。表17为尼美舒利D5的基质效应，尼美舒利D5的基质效应为
96.6％。
[0156] 表15
[0157]
[0158]
[0159] 表16
[0160]
[0161] 表17
[0162]
[0163]
[0164]
[0165] 本发明取得的有益效果为：
[0166] 1)本方法使用血浆样本量少(30μL)，意味着临床试验
采样量减少，可加强对受试者的保护；
[0167] 2)灵敏度高，下限低，定量范围1～2000ng/mL，本发明的定量下限为1ng/mL，可以满足常规分析的需要，且2000倍的定量范围可以
覆盖不同剂量用药后的样品测定；
[0168] 3)前处理简便经济快速，直接蛋白沉淀法是前处理中最快捷高效的方法，使用的试剂耗材仅有价格低廉的甲酸、水和乙腈，前处理过程只有加入酸提取剂、加入内标沉淀剂、离心三个步骤，与现有技术的液液萃取法或固相萃取法等相比，检测成本大幅降低，前处理过程大幅简化，前处理效率大幅提高；
[0169] 4)本发明公开的1％甲酸水溶液的加入，解决了普通蛋白沉淀法提取回收率低的问题；
[0170] 5)分析时间短(4min)，使得单位时间内分析样品数量增加，节省时间成本和仪器试剂成本；
[0171] 6)特别适合高通量检测人血浆中微量尼美舒利的浓度。
[0172] 本发明未详细说明的部分采用现有技术可实现，在此不做赘述。
[0173] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的
专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
