技术领域
[0001] 本
发明涉及一株海洋细菌，尤其是涉及一株海洋细菌及其产生的胞外多糖。
背景技术
[0002] 细菌普遍合成分泌胞外多糖。胞外多糖是细菌的
次级代谢产物,是细菌生长过程中分泌到细胞壁外形成与菌体分离的可溶性多糖复合物。海洋细菌因其独特的生活环境,分泌的胞外多糖常常具有特殊结构，因此，海洋细菌生产的胞外多糖在
生物技术领域中具有极大的潜在应用价值。已有一些胞外多糖生产菌从不同的海洋环境中被分离，例如从深海热液泉口，海洋火山和热液区，以及浅海海底
温泉发现了丰富的胞外多糖生产菌(Poli，2010)。从浅海热泉分离出的Bacillus属的菌株产生的多糖可以抗病毒(Gugliandolo，
2014)。从北极海
冰中分离的Pseudoalteromonas细菌合成的多糖具有抗冻特性(Gugliandolo C,SpanòA,Lentini V,Arena A,Maugeri TL.2014，Antiviral and immunomodulatory effects of a novel bacterial exopolysaccharide of shallow marine vent origin.J Appl Microbiol.116(4):1028-34)。
[0003] 近几年,随着对
微生物多糖研究的深入,世界上微生物多糖产量的年增长量在10％以上,而一些新型多糖年增长量在30％以上,现在世界上每年多糖总需求量在100万吨以上,总价值50～100亿美元。因此,多糖的生产具有巨大的市场价值。然而，当前被应用于实际生产中的细菌多糖非常有限。因此,有必要筛选、分离新的多糖产生菌,并对它们所产多糖的结构、物理化学特性进行深入探究,以进一步拓展它们的应用领域。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一株海洋细菌Alteromonase marina P2-B12。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一株海洋细菌Alteromonase marina P2-B12制备具有新颖结构并安全无毒的胞外多糖的方法。
[0006] 所述一株海洋细菌Alteromonase marina P2-B12，已于2015年08月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.11180。
[0007] 本发明的海洋细菌Alteromonase marina P2-B12是从
海水样品中分离得到的，
海水采集于2012年8月，经度115°E,纬度18°N，水深75m；将采集的海水100μL吸取涂布于平板，放置室温培养。待培养3天后，随机从平板上挑取形态大小不同的菌落进行纯化培养。纯化时用接种环挑取菌落，在平板表面进行划线，观察平板上菌株的
颜色、大小、形态是否相同.挑取不同的菌落划线分离，直到分离出单一形态的菌落为止。通过
苯酚-
硫酸法对所得菌株培养上清液是否产多糖进行检测,初筛多糖产量超过100mg/L,得到该产多糖菌株。该菌株的特征为：Alteromonase marina P2-B12为革兰氏阴性菌,长杆状,在2216E固体培养基菌落较大(直径2mm)，乳白色，圆形，隆起，边缘较圆整,不透明,无
迁移性。
[0008] 本发明通过DNA序列分析确定了其种属关系,属于交替单胞菌属Alteromonase。该菌株16S rRNA序列见
说明书最后部分。
[0009] 所述一株海洋细菌Alteromonase marina P2-B12制备胞外多糖的方法，具体步骤如下：
[0010] 1)菌株培养
[0011] 以工业
葡萄糖为单一
碳源添加到人工海水里进行培养，培养基的具体配方为(1L)：葡萄糖10.0g/L、
氯化钠19.0g/L、氯化
氨0.3g/L、
磷酸氢二
钾0.4g/L、
氯化钾0.3g/L、七水合
硫酸镁0.5g/L、七水合氯化
钙0.03g/L，pH 7.6；
[0012] 将Alteromonase marina P2-B12接种到培养基摇床培养，得
种子培养液；
[0013] 另配制培养基，放入
发酵罐中，灭菌，待
温度降到25℃，接入种子培养液培养,得发酵液；
[0014] 2)多糖的提取及脱盐
[0015] 将发酵液离心,取上清液，上清液过滤，滤液中加入无水
乙醇，静置过夜,然后将粘稠的菌多糖移入离心管中，加入冰冻无水乙醇浸洗，将沉淀收集，冻干，即得菌多糖的提取物，再溶解到水中，移入
透析袋，将透析袋悬挂到水中，透析过夜，透析过的菌多糖溶液加入冰冻乙醇再沉淀，冻干，透析除盐后的菌多糖样品即为多糖粗提物；
[0016] 3)分离纯化
[0017] 利用离子交换层析对多糖粗提物进行纯化，收集主峰，将收集到的主峰浓缩脱盐、
冷冻干燥，即得海洋细菌胞外多糖。
[0018] 在步骤1)中，所述摇床培养的条件可为25℃，180rpm，摇床培养过夜；所述灭菌的条件可为120℃灭菌30min；所述种子培养液的接种量按体积百分数可为1％；所述接入种子培养液培养可为25℃，500rpm/min培养94h。
[0019] 在步骤2)中，所述离心的条件可在8000rpm离心20min；所述过滤可采用0.45μm滤膜(Millipore HAWP04700)过滤；所述滤液中加入无水乙醇可加入按体积比3倍滤液的无水乙醇；所述静置过夜的温度可为4℃；所述将粘稠的菌多糖移入离心管可采用玻璃棒缠取粘稠的菌多糖移入50mL离心管中；所述浸洗可加入
质量百分浓度为75％的冰冻无水乙醇浸洗3次；所述透析袋可采用直径16mm，截留分子量3500道尔顿的透析袋；所述加入冰冻乙醇再沉淀可加入按体积比3倍菌多糖溶液体积的冰冻乙醇再沉淀。
[0020] 在步骤3)中，所述离子交换层析的条件可为：层析柱规格为1.6cm×30cm，凝胶类型为DEAE-Sepharose Fast Flow，用0～2M NaCl进行梯度洗脱，流速为1mL/min。
[0021] 本发明制备所得的海洋细菌胞外多糖的分子量大于167kDa，海洋细菌胞外多糖由鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)和半乳糖
醛酸(GalA)以α-1，3和α-1，4键结合构成结构单元([-3]-α-Rhap-(1→3)-α-Manp-(1→4)-α-GalAp-(1→))。该海洋细菌胞外多糖的糖基组成和糖苷键连接方式与其它已报道的多糖都不相同,是一种新颖的胞外多糖。
附图说明
[0022] 图1为Alteromonase marina P2-B12透射电镜图。在图1中，a的标尺为200nm，b的标尺为0.2μm。
[0023] 图2为基于16S rRNA的P2-B12进化树分析。
[0024] 图3为梯度洗脱收集得到的主峰示意图。
[0025] 图4为洗脱得到的洗脱峰示意图。
具体实施方式
[0026] 下面结合
实施例对本发明作进一步的说明。
[0027] 实施例1菌株的获得
[0028] 本发明的菌株是通过以下方法筛选得到的:海水采集于2012年8月，经度115°E,纬度18°N，水深75m。将采集的海水100μL吸取涂布于2216E平板。2216E培养基:蛋白胨5.0g,
酵母膏1.0g,磷酸
铁0.01g,琼脂20.0g,人工海水1000ml,调ph至7.6。放置室温培养。待培养3天后，随机从平板上挑取形态大小不同的菌落进行纯化培养。纯化时用接种环挑取菌落，在平板表面进行划线，观察平板上菌株的颜色、大小、形态是否相同.挑取不同的菌落划线分离，直到分离出单一形态的菌落为止。通过苯酚-硫酸法对所得菌株培养上清液是否产多糖进行检测,初筛多糖产量超过100mg/L,得到该产多糖菌株。
[0029] 该菌株的特征为:Alteromonase marina P2-B12为革兰氏阴性菌,长杆状(图1),在2216E固体培养基菌落较大(直径2mm),乳白色,圆形,隆起,边缘较圆整,不透明,无迁移性。16S rRNA基因分析。
[0030] 提取Alteromonase marina P2-B12基因组DNA，进行16S rRNA基因扩增。16S rRNA基因序列扩增引物为：正向引物27f(5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)，反向引物1492r(5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)。16S rRNA基因扩增的PCR反应体系(50μL)：Premix Ex Taq酶(5U/μL)25μL、正向引物1μL(10μmol/L)、反向引物1μL(10μmol/L)、模板DNA 1μL和无菌水22μL。PCR目标序列扩增程序设置为：95℃预变性5min；95℃变性45s，55℃
退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
[0031] 此PCR产物后进行测序。通过对菌株P2-B12的16S rRNA基因序列比对分析发现，该菌株与Alteromonas marina SW-47T(AF529060)相似性最高。因此，此菌株命名为Alteromonas marina P2-B12。该菌株16S rRNA序列见说明书最后部分。
[0032] 实施例2多糖的提取
[0033] 多糖分子量的测定
[0034] 利用高效液相色谱对多糖的分子量进行测定。采用分子排阻色谱柱对多糖进行分析。色谱柱色谱柱由TSK Gel GS3000SWXL凝胶层析柱(7.8mmID×30cm)和TSK Gel G2000SWXL凝胶层析柱(7.8mm ID×30cm)
串联而成，检测器为折射检测器。流动相是含有0.2‰叠氮化钠的0.1M的
醋酸铵。柱体温度设为30℃，流速设为0.6mL/min。标准溶液包括不同分子量的葡聚糖(511，167，67，40，10，5，1kDa)和麦芽四糖(666.6Da)。不同分子量的多糖在分子排阻色谱柱的保留时间不同(见表1)。根据标准多糖的分子量与在柱中的保留时间的相关关系，计算出P2-B12多糖的分子量大于167kDa。
[0035] 表1
[0036]
[0037] 多糖的结构分析
[0038] 通过一系列的
核磁共振分析，明确P2-B12胞外多糖由三种单糖鼠李糖(Rha),甘露糖(Man)和半乳糖醛酸(GalA)组成，这三种糖以α-1，3和α-1，4键结合构成a[-3]-α-Rhap-(1→3)-α-Manp-(1→4)-α-3OAc-GalAp-(1→)结构单元。
[0039] 16S rRNA序列：
[0040] GAGTTTGATCCTGGCTCAGGTTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCA
[0041] AGTCGAACGGTAACATTTCTAGCTTGCTAGAAGATGACGAGTGGCGGACG
[0042] GGTGAGTAATGCTTGGGAACTTGCCTTTGCGAGGGGGATAACAGTTGGAA
[0043] ACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTTCGGACCAAACGGGGCTTCGGCTC
[0044] CGGCGCAAAGAGAGGCCCAAGTGAGATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGC
[0045] TTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGTTCTGAGAGGAAGATCAGCCACACT
[0046] GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT
[0047] TGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGG
[0048] CCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGTGAGGAAAAGTTAGTAGTTAAT
[0049] ACCTGCTAGCTGTGACGTTAACAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG
[0050] CCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGG
[0051] GCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGCTAGATGTGAAAGCCCCGGG
[0052] CTCAACCTGGGATGGTCATTTAGAACTGGCAGACTAGAGTCTTGGAGAGG
[0053] GGAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAAC
[0054] ATCAGTGGCGAAGGCGACTCCCTGGCCAAAGACTGACGCTCATGTGCGAA
[0055] AGTGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAAC
[0056] GCTGTCTACTAGCTGTGTGTGCCTTTAAGGCGTGCGTAGCGAAGCTAACG
[0057] CGCTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG
[0058] AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC
[0059] AACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATGCTGAGAAGTTACTAGAGAT
[0060] AGTTTCGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCA
[0061] GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG
[0062] TCCTTAGTTGCCAGCCTTAAGTTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGAC
[0063] AAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGT
[0064] AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATTTACAGAGGGAAGCGAGACAGTG
[0065] ATGTGGAGCGGACCCCTTAAAGAATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCA
[0066] ACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGAATACTG
[0067] CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGA
[0068] GTGGGATGCAAAAGAAGTAGTTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGATTACCA
[0069] CTTTGTGTTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCA。
