官能化β折叠肽稳定的膜蛋白、包含其的构建体以及形成和使用其的方法
阅读：1018发布：2020-08-07
专利汇可以提供官能化β折叠肽稳定的膜蛋白、包含其的构建体以及形成和使用其的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了具有通过官能化β折叠肽稳定的膜蛋白的构建体。所述构建体可以与支持物缔合或共价连接。所述支持物可以是膜。所述膜可用于选择性地使期望颗粒从膜的一侧移动到另一侧，同时阻止不期望颗粒通过膜。提供了制备和使用这样的构建体和膜的方法。，下面是官能化β折叠肽稳定的膜蛋白、包含其的构建体以及形成和使用其的方法专利的具体信息内容。
1.一种膜，其被配置成用于选择性地使期望颗粒穿过所述膜，其包含：
支持物；和
与所述支持物缔合的多个膜蛋白分子，所述膜蛋白分子中的每一个通过多个官能化β折叠肽稳定。
2.根据权利要求1所述的膜，其中所述官能化β折叠肽中的至少一些与所述支持物共价连接。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的膜，其中所述膜蛋白分子选自水通道蛋白、
ChIEF、F0F1-ATP酶、OmpG、NaChBAc、细菌视紫红质、丙甲甘肽、溶血素、NADH还原酶、OmpF、RC、NtAPQ1、NtPIP2：1、AQP0、AQP10、SoPIP2、TsX、短杆菌肽A、MloK1、LamB、FhuA、BR、ATP酶、血凝素、CcO、多粘菌素B、溶血素、天蚕素A和变形菌视紫红质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的膜，其中所述膜蛋白分子在所述膜中形成通道，以选择性地允许所述期望颗粒从其中通过。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的膜，其中所述膜蛋白分子适于选择性地运输所述期望颗粒穿过所述膜。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的膜，其中所述膜被配置为阻止一种或多种污染物通过所述膜。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的膜，其中所述期望颗粒是选自以下的分子或离子：水分子、电子、质子、钙、钙黄绿素、二氧化碳、核苷、吖啶橙、百草枯、绿脓菌素、乙酰硫代胆碱、烯酮、ELF97、7-ADCA、PGME、氨苄青霉素、L-抗坏血酸、CO、Na2S2O4、ONOO-、一价阳离子、钾、二糖、DNA、RNA、磺酰罗丹明B、TMB和NAD。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的膜，其中所述支持物是用于固定所述膜蛋白分子的基质。
9.根据权利要求1所述的膜，其中所述膜蛋白分子包含水通道蛋白，并且所述期望颗粒包含水分子。
10.根据权利要求1所述的膜，其中：
所述膜蛋白分子包含ChIEF，并且所述期望颗粒包含质子、钠离子或钙离子；或
所述膜蛋白分子包含F0F1-ATP酶，并且所述期望颗粒包含ATP或质子；或
所述膜蛋白分子包含OmpG，并且所述期望颗粒包含二糖；或
所述膜蛋白分子包含NaChBAc，并且所述期望颗粒包含钠离子；或
所述膜蛋白分子包含α-溶血素、MspA、OmpF或OmpG，并且所述期望颗粒包含多核苷酸，包括DNA或RNA；或
所述膜蛋白分子包含丙甲甘肽、溶血素、NADH还原酶、OmpG、OmpF或RC，并且所述期望颗粒包含电子；或
所述膜蛋白分子包含丙甲甘肽，并且所述期望颗粒包含钙或钙黄绿素；或
所述膜蛋白包含NtAPQ1或NtPIP2：1，并且所述期望颗粒包含二氧化碳；或
所述膜蛋白包含AQP0、AQP10或SoPIP2；1，并且所述期望颗粒包含水；或
所述膜蛋白包含TsX，并且所述期望颗粒包含核苷；或
所述膜蛋白包含OmpF，并且所述期望颗粒包含吖啶橙、百草枯、绿脓菌素、乙酰硫代胆碱、烯酮、ELF97、7-ADCA、PGME、核苷、氨苄青霉素、L-抗坏血酸、CO、Na2S2O4或ONOO-；或所述膜蛋白包含短杆菌肽A，并且所述期望颗粒包含一价阳离子；或
所述膜蛋白包含LamB，并且所述期望颗粒包含糖或DNA；或
所述膜蛋白包含FhuA，并且所述期望颗粒包含磺酰罗丹明B、TMB、NAD、DNA或钙黄绿素；
或
所述膜蛋白包含细菌视紫红质、PR或细菌视紫红质和CcO两者，并且所述期望颗粒包含H+；或
所述膜蛋白包含细菌视紫红质和ATP酶两者，并且所述期望颗粒包含H+和电子；或所述膜蛋白包含Cco，并且所述期望颗粒包含电子、多粘菌素B或溶血素；或
所述膜蛋白包含天蚕素A，并且所述期望颗粒包含钙黄绿素。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的膜，其中所述支持物包含聚合物，其中所述聚合物任选地包含聚砜、聚碳酸酯或聚内酯。
12.根据权利要求11所述的膜，其中所述支持物包含聚砜膜，并且其中在所述聚砜膜形成期间引入成孔剂。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的膜，其中所述支持物包含碳纳米管网。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的膜，其中所述支持物包含纳米晶体纤维素。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的膜，其中所述膜被配置为阻止钠离子、氯离子、氨、尿素、染料、农药、药物废物和其他有机化合物通过，同时选择性地允许水通过所述膜。
16.一种复合物，其包含通过多个官能化β折叠肽稳定的膜蛋白。
17.根据权利要求16所述的复合物，其中所述膜蛋白包含水通道蛋白、CHIEF、F0F1-ATP酶、OmpG、NaChBAc、细菌视紫红质、丙甲甘肽、溶血素、NADH还原酶、OmpF、RC、NtAPQ1、NtPIP2：1、AQP0、AQP10、SoPIP2、TsX、短杆菌肽A、MloK1、LamB、FhuA、BR、ATP酶、血凝素、CcO、多粘菌素B、溶血素、天蚕素A、变形菌视紫红质或MspA。
18.根据权利要求16或17中任一项所述的复合物，其中通过将所述多个官能化β折叠肽中的至少一个上的官能团与所述固体支持物缀合，来将所述复合物固定在固体支持物上。
19.根据权利要求18所述的复合物，其中所述固体支持物包含聚合物、碳纳米管网或纳米晶体纤维素，并且其中所述聚合物任选地包含聚砜、聚碳酸酯或聚内酯。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的膜或复合物，其中所述官能化β折叠肽包含通用序列(辛基)Gly-Ser-Leu-Ser-Leu-Asp-(辛基)Gly-Asp(SEQ ID NO：1)，其中任选地一个或更多个氨基酸包含N-甲基氨基酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的膜或复合物，其中所述官能化β折叠肽包含炔官能化β折叠肽，其中所述炔官能团任选地提供在所述官能化β折叠肽的末端处或所述官能化β折叠肽的中间部分中。
22.根据权利要求21所述的膜或复合物，其中通过在所述官能化β折叠肽中引入炔丙基修饰的氨基酸来提供所述炔官能团。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的膜或复合物，其中所述官能化β折叠肽包含烯官能化β折叠肽，其中所述烯官能团任选地提供在所述官能化β折叠肽的末端处或所述官能化β折叠肽的中间部分中。
24.根据权利要求23所述的膜或复合物，其中通过在所述官能化β折叠肽中引入乙烯基修饰的氨基酸来提供所述烯官能团。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的膜或复合物，其中所述官能化β折叠肽包含叠氮基官能化β折叠肽，其中所述叠氮基任选地提供在所述官能化β折叠肽的末端处或所述官能化β折叠肽的中间部分中。
26.根据权利要求25所述的膜或复合物，其中通过在所述官能化β折叠肽中引入叠氮基修饰的氨基酸来提供所述叠氮基官能团。
27.根据权利要求1至20中任一项所述的膜或复合物，其中所述官能化β折叠肽上的官能团包括叠氮基、炔基、烯基、乙烯基、叠氮基苯基或巯基。
28.根据权利要求1至20中任一项所述的膜或复合物，其中所述官能化β折叠肽包含结构(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)：
其中R4和R5独立地为叠氮基、炔基、烯基、巯基、叠氮基苯基或乙烯基。
29.根据权利要求28所述的膜或复合物，其中所述官能化β折叠肽在所述肽的N末端和/或C末端处包含一个或更多个额外的氨基酸。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的膜或复合物，其中所述官能化β折叠肽包含双官能交联剂。
31.根据权利要求30所述的膜或复合物，其中所述双官能交联剂包含光反应性官能团。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的膜或复合物，其中所述水通道蛋白包含AqpZ。
33.一种选择性地使一种或更多种期望颗粒通过膜而同时限制一种或更多种污染物通过所述膜的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含通过多个官能化β折叠肽稳定之膜蛋白的复合物；
进行与所述膜缔合的所述β折叠肽的界面聚合，以提供复合聚酰胺-膜构建体；以及使包含期望颗粒和一种或更多种污染物的溶液通过所述复合聚酰胺-膜构建体，使得所述膜蛋白选择性地使所述期望颗粒通过所述膜。
34.一种选择性地使一种或更多种期望颗粒通过膜而同时限制一种或更多种污染物通过所述膜的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含通过多个官能化β折叠肽稳定之膜蛋白的复合物；
通过使所述多个官能化β折叠肽中的至少一个上的至少一个官能团与所述膜反应，将所述膜蛋白偶联至所述膜；以及
使包含期望颗粒和一种或更多种污染物的溶液通过所述膜，使得所述膜蛋白选择性地使所述期望颗粒通过所述膜。
35.根据权利要求33或34中任一项所述的方法，其中：
所述膜蛋白包含ChIEF，并且所述期望颗粒包含质子、钠离子或钙离子；
所述膜蛋白包含F0F1-ATP酶，并且所述期望颗粒包含质子或ATP；
所述膜蛋白包含OmpG，并且所述期望颗粒包含二糖；或
所述膜蛋白包含NaChBAc，并且所述期望颗粒包含钠离子；或
所述膜蛋白包含α-溶血素、MspA、OmpF或OmpG，并且所述期望颗粒包含多核苷酸，包括DNA或RNA。
36.根据权利要求33或34中任一项所述的方法，其中所述膜蛋白包含水通道蛋白，并且所述期望颗粒包含水分子。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述包含期望颗粒和一种或更多种污染物的溶液包括海水，并且所述方法用于使所述海水脱盐。
38.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述包含期望颗粒和一种或更多种污染物的溶液包括农业废物流，其中所述一种或更多种污染物任选地包含氨，尿素，农药，合成肥料，重金属，包括铅、砷、硒或汞，来自药物和个人护理产品的有机污染物，或微生物。
39.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述包含期望颗粒和一种或更多种污染物的溶液包括工业废物流，并且其中所述一种或更多种污染物任选地包含磷酸盐、硝酸盐、石棉、多氯联苯、汞、铅、苛性钠或其他钠化合物、硫、硫酸、油或石油化学品。
40.根据权利要求33或34中任一项所述的方法，其中所述方法用于浓缩所述一种或更多种污染物中的至少一种。
41.一种形成包含固定化膜蛋白的复合结构的方法，其包括：
(a)提供多个官能化β折叠肽；
(b)形成包含所述膜蛋白和所述官能化β折叠肽的稳定复合物；以及
(c)通过使所述多个官能化β折叠肽中的至少一个上的至少一个官能团与支持物反应将所述膜蛋白偶联至所述支持物，以将所述膜蛋白固定到所述支持物上。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述反应包括在所述多个官能化β折叠肽中的至少一个与所述支持物之间形成共价键。
43.根据权利要求41或42中任一项所述的方法，其中所述多个官能化β折叠肽中的至少一个包含光反应性官能团。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述偶联包括在预定位置将所述膜蛋白固定在所述支持物上。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述偶联是光活化的。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其中所述形成包括产生所述稳定复合物的多个单元并将所述单元交联在一起，同时保持所述膜蛋白的功能。
47.根据权利要求41至46中任一项所述的方法，其中所述膜蛋白是水通道蛋白。
48.通过权利要求47所述的方法形成的复合结构用于过滤水的用途。
官能化β折叠肽稳定的膜蛋白、包含其的构建体以及形成和使
用其的方法
[0001] 相关申请的引用
技术领域
[0003] 本发明的一些实施方案涉及官能化β折叠肽(functionalized β-sheet peptide)和官能化β折叠肽介导的膜蛋白的固定化。本发明的一些实施方案涉及通过这种官能化β折叠肽稳定的膜蛋白及其用途。本发明的一些实施方案涉及包含通过这种官能化β折叠肽稳定的蛋白质水通道蛋白(aquaporin)的构建体(construct)及其用途。
背景技术
[0004] 膜蛋白(membrane protein，MP)包括三分之一的基因组编码蛋白质，并且执行作为受体、转运蛋白和通道的基本功能。然而，由于其疏水性质，膜蛋白的分离和纯化具有挑战性。常规地，使用洗涤剂从其天然脂质环境中溶解MP并使其在水性缓冲液中稳定(1)。然而，取决于浓度、离子强度和其他脂质和蛋白质的存在，大多数洗涤剂表现出复杂的相行为。因此，成功重建膜蛋白的方法依赖于洗涤剂的独特行为。受膜蛋白研究重要性的驱动，过去几十年里已开发了多种两亲性试剂来促进膜蛋白的功能和结构研究，这些两亲性试剂包括两亲性聚合物(2)、基于蛋白质的纳米盘(3)、基于肽的洗涤剂(4)、麦芽糖新戊二醇洗涤剂(5)等。
[0005] 在早期的工作中，Tao和同事报道了对三种β折叠肽(β-sheet peptide，BP)(即BP1、BP2和BP3)工程化以稳定膜蛋白(6)。Tao参考文献通过引用整体并入本文。这些β折叠肽是具有交替的极性和非极性残基以及每个末端处的辛基侧链的8氨基酸肽。Tao等的β折叠肽具有核心结构乙酰基-(辛基)Gly-Ser-Leu-Ser-Leu-Asp-(辛基)Gly-Asp-NH2(SEQ ID NO：1)，并具有不同数目的N-甲基氨基酸，如结构(1)所示：
[0006]
[0007] Tao等公开的三种构建体BP1、BP2和BP3之间的N-甲基氨基酸的区别如下：对于BP1(称为结构(2))，R1＝R3＝H，R2＝Me。对于BP2(称为结构(3))，R1＝R2＝Me，R3＝H。对于BP3(称为结构(4))，R1＝R2＝R3＝Me。
[0008] 由于特殊的序列设计，这些β折叠肽在溶液中自组装成细丝，并在与膜蛋白(MP)缔合后重建为β桶(β-barrel)。所述肽长度为八个氨基酸以跨越脂质双层的疏水区(约3nm的距离)，并且不受理论限制，认为通过形成有序、稳定的β-桶状结构来隔离膜蛋白的疏水表面。当在无洗涤剂的缓冲液中稀释时，所得BP：MP复合物阻止膜蛋白聚集。由于链间氢键相互作用，一旦形成BP：MP复合物，β折叠肽就更不可能从膜蛋白解离。
[0009] 水通道蛋白是以优异的选择性和渗透性使水通过细胞膜的一组整合膜蛋白。更具体地，水通道蛋白选择性地使水分子进出细胞，同时阻止离子和其他溶质通过。水分子成纵队穿过通道的孔。水通道的存在提高了膜对水的渗透性，而孔对于带电物质是不可渗透的，这有助于保持膜相对于周围环境的电化学电势差。
[0010] 如图1A所示，水通道蛋白使用两种不同机制的组合来确保仅水分子通过蛋白质。首先，水通道蛋白具有在其中间变窄的沙漏形通道。通道的窄尺寸提供了尺寸限制以帮助控制可以通过通道的分子尺寸。其次，通道内正电荷的存在有助于阻止质子通过通道。水通道蛋白由排列成右旋束的六个跨膜α-螺旋组成。有五个螺旋间环区域(A-E)。环B和E是疏水环，其含有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)基序，所述基序与膜的脂质双层的中间重叠，形成三维沙漏结构，水从其中流过孔。水通道蛋白在细胞膜中形成四聚体，每个单体充当水通道。水可以例如由于水压或渗透压沿任一方向流过水通道蛋白的孔。
[0011] 水通道蛋白是高度保守的。参见，例如，Erbakan，M.等(2014)。在该论文中进行的序列比对示出在图1B中，显示了不同物种中的水通道蛋白之间的高度保守性，包括球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)ATCC 17023(RsAqpZ，ABA78939.1，SEQ ID NO：2)、大肠杆菌(Escherichia coli)K12(EcAqpZ，BAA08441.1，SEQ ID NO：3和GlpF，AFH13815.1，SEQ ID NO：4)、Methanobacter marburgensis(AqpM，ADL58146.1，SEQ ID NO：5)、Synecoccocus elongatus(SsAqpZ，AAM82672.1SEQ ID NO：6)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(AQY1，CCA39392.1，SEQ ID NO：7)、菠菜(Spinacia oleracea)(SOPIP2；l，AAA99274.2，SEQ ID NO：8)和智人(Homo sapiens)(AQP1，NP_932766.1，SEQ ID NO：9；AQP4，AAH22286.1SEQ ID NO：10；AQP9，NP_066190.2，SEQ ID NO：11)。
[0013] 水通道蛋白天然嵌入在疏水性脂质双层环境中，并且通常是不能充当膜外部游离分子的不稳定蛋白。以前尝试使用水通道蛋白来净化水。例如，设计了一种Langmuir-Blodgett膜，其试图在薄单层中使用水通道蛋白来净化水，但是这样的构造不稳定并且难以规模化(参见例如Sun等，2012)。为了提高稳定性，将单层束缚到支持物基底上并且使用聚合物垫来抑制振动(参见例如Sun等，2013)；然而，这些构建体也被证明是不稳定的并且难以生产。
发明内容
[0015] 结合系统、工具和方法来描述和示出以下实施方案及其方面，这些系统、工具和方法意在是示例性和说明性的，而不限制范围。在多个实施方案中，上述问题中的一个或更多个已被减少或消除，而其他实施方案涉及其他改进。
[0016] 本发明的一个方面提供了一种膜，其被配置为用于选择性地使期望颗粒穿过所述膜。所述膜具有支持物和与所述支持物缔合的多个膜蛋白分子。每个膜蛋白分子通过多个官能化β折叠肽稳定。官能化β折叠肽中的至少一些可以共价连接到支持物上。膜蛋白分子可在膜中形成通道，以选择性地允许所述期望颗粒从其中通过。膜蛋白分子可适于选择性地运输期望颗粒穿过膜。在一个示例性实施方案中，膜蛋白分子是水通道蛋白，并且水通道蛋白分子选择性地运输水分子穿过膜。支持物可以是聚砜聚合物膜。
[0017] 本发明的一个方面提供了具有通过多个官能化β折叠肽稳定之膜蛋白的复合物。可以通过将多个官能化β折叠肽中的至少一个上的官能团与固体支持物的缀合来将复合物固定在固体支持物上。
[0018] 在一些方面，官能化β折叠肽具有通用序列(辛基)Gly-Ser-Leu-Ser-Leu-Asp-(辛基)Gly-Asp(SEQ ID NO：1)。氨基酸中的一个或更多个可以是N-甲基氨基酸。官能化β折叠肽可以具有任何合适的官能团，在一些方面，所述官能团可以是叠氮基、炔基、烯基、乙烯基、叠氮基苯基或巯基。官能化β折叠肽可以提供有双官能交联剂，所述双官能交联剂可以含有光反应性官能团。
[0019] 本发明的一个方面提供了一种选择性地使一种或更多种期望颗粒通过膜而同时限制一种或更多种污染物通过膜的方法。提供包含通过多个官能化β折叠肽稳定之膜蛋白的复合物。通过使多个官能化β折叠肽中的至少一个上的至少一个官能团与膜反应，将膜蛋白偶联至膜。使包含期望颗粒和一种或更多种污染物的溶液通过膜，以使得膜蛋白选择性地使期望颗粒通过膜。在一些方面，膜蛋白是水通道蛋白，并且期望颗粒是水分子。在一些方面，所述方法包括浓缩一种或更多种污染物，其通过使包含一种或更多种污染物的溶液从膜的第一侧通过膜到膜的第二侧，从而将一种或更多种污染物浓缩在膜的第一侧。在一些这样的实施方案中，污染物是期望产物。
[0020] 本发明的一个方面提供了形成具有固定的膜蛋白和支持物的复合结构的方法。提供多个官能化β折叠肽。形成膜蛋白和官能化β折叠肽的稳定复合物。通过使多个官能化β折叠肽中的至少一个上的至少一个官能团与支持物反应以将膜蛋白固定在支持物上，将膜蛋白与支持物偶联。
[0021] 除了上述示例性方面和实施方案之外，通过参考附图并研究以下详细描述，另外的方面和实施方案将变得明显。
[0022] 附图简要说明
[0023] 在附图所引用的图中示出了示例性实施方案。本文公开的实施方案和图旨在被认为是说明性的而不是限制性的。
[0024] 图1A示出了通过水通道蛋白分子的水分子的示意图。图1B示出了显示来自不同物种的水通道蛋白的高度保守性的序列比对。
[0025] 图2A示出了由官能化β折叠肽介导的示例性膜蛋白的固定的示意图。图2B示出了由官能化β折叠肽介导的AqpZ与聚合物缀合的示意图。图2C示意性地示出了当稳定膜蛋白时提出的β折叠肽的结构。
[0026] 图3示出了制备具有通过官能化β折叠肽束缚的水通道蛋白的聚砜膜的方法的一个示例性实施方案。
[0027] 图4A和4B示出了在肽的C末端处具有炔官能团之官能化β折叠肽的表征。图4A示出了这种构建体在磷酸盐缓冲盐水中的TEM(透射电子显微镜)图像。比例尺为10nm。图4B示出了对应于图4A所示图像的构建体的质谱图。图4C示出了本发明人合成的叠氮基官能化β折叠肽的质谱图。
[0028] 图5示出了HPLC结果，证明了官能化β折叠肽上炔基的反应。上图示出了与Click-iT试剂反应的炔-FBP的荧光HPLC洗脱曲线。中间图示出了仅Click-iT缓冲液的HPLC洗脱曲线。下图示出了仅Click-iT染料的HPLC洗脱曲线。红色箭头表示在炔-FBP和Click-iT染料之间的点击反应(click reaction)中形成的产物。
[0029] 图6示意性地示出了本发明人在一个示例性实施方案中用于表达AqpZ的pET28a-6His-AqpZ质粒构建体。
[0030] 图7A和7B示出了证明BP1：AqpZ的复合物形成及其稳定性的实验。图7A示出了4周中AqpZ/DDM和BP1：AqpZ的圆二色性(即，-1，第1周；-2，第2周；-3，第3周以及-4，第4周)。图7B示出了3周中AqpZ/DDM和BP1：AqpZ的伪天然12％SDS-PAGE。泳道：D：AqpZ/DDM；P：BP1：
AqpZ；L：蛋白质梯。箭头表示四聚体AqpZ(计算的MW：98kDa)。
AqpZ；L：蛋白质梯。箭头表示四聚体AqpZ(计算的MW：98kDa)。
[0031] 图8A-8C示出了通过CD表征的AqpZ/DDM和BP1：AqpZ的热稳定性。图8A示出了在20-90℃的温度下的AqpZ/DDM的CD光谱。图8B示出了在温度20-90℃下BP1：AqpZ的CD光谱。图8C示出了在192nm下相对于温度绘制的归一化椭圆率。
[0032] 图9A-9E示出了通过三种不同的官能化β折叠肽稳定各种蛋白质。蛋白质是AqpZ(图9A)、F0F1-ATP酶(图9B)、NaChBac(图9C)、ChIEF-mCitrine(图9D)和OmpG(图9E)。
[0033] 图10A显示当通过β折叠肽稳定时，F0F1-ATP酶保持其功能性，图10B显示当通过官能化β折叠肽稳定时，F0F1-ATP酶保持其功能性。
[0034] 图11A示出了在具有和不具有AqpZ的情况下，通过用于从水中除去氯化钠的膜的水的通量。图11B示出了在具有和不具有AqpZ的情况下，用于从水中除去氯化钠的膜的脱盐率(salt rejection)。图11C图示了在250PSI的操作压力下，与引入AqpZ的膜相比，不含蛋白质的膜构建体(“原始”)实现的通量和脱盐率。
发明内容
[0035]
[0036] 在下面的说明书中，阐述了具体细节以便为本领域技术人员提供更透彻的理解。然而，可能没有详细地示出或描述周知的元件，以避免不必要地模糊本公开内容。因此，说明书和附图被认为是说明性的，而不是限制性的。
[0037] 许多膜蛋白的固有功能包括识别和/或操纵特异性靶标。这些识别和/或操纵事件通常是高度灵敏和高度选择性的。因此，这样的膜蛋白是用于产生利用特定蛋白质的特定功能的生物传感器或纳米机器的良好候选物。产生这种生物传感器或纳米机器的关键步骤是将膜蛋白有效固定在固体支持物上，如聚合物表面、无机固态表面等。然而，在水性缓冲液中将疏水性脆性膜蛋白以其天然状态固定在固体支持物上仍然是一个主要的挑战。
[0038] 本发明人现在认为，官能化β折叠肽(functionalized β-sheet peptide，FBP)可以用作稳定剂和交联剂以介导膜蛋白在固体支持物上的固定，从而产生有用的生物传感器和/或纳米机器。在一些实施方案中，膜蛋白被固定在膜上以提供复合结构，其中膜蛋白选择性地转移或允许一种或更多种期望颗粒从膜的第一侧通过到膜的第二侧。在一些这样的实施方案中，膜阻止或阻碍其他颗粒从膜的第一侧通过到膜的第二侧。在一些实施方案中，其他颗粒包含一种或更多种污染物。在一些实施方案中，其他颗粒包含期望浓缩的组分，并且通过使含有这些颗粒的溶液通过膜来浓缩期望浓缩的组分，使得这些颗粒集中在膜的第一侧，而溶液的其他组分通过到膜的第二侧。
[0039] 如本文所用，术语“颗粒”被广泛使用并且是指期望选择性地穿过膜的任何元素或物质。例如，在一些实施方案中，颗粒是分子，例如水、甘油、二氧化碳、糖、有机化合物、DNA、RNA等。在一些实施方案中，颗粒是离子，例如钙、镁等，或离子物质例如盐。在一些实施方案中，颗粒可以是原子或亚原子颗粒，例如电子。
[0040] 如本文所用，术语“污染物”是指期望不允许通过膜的任何元素或物质。例如，在一些实施方案中，污染物是不期望的颗粒，例如特定离子、有机分子、废产物等。例如，在期望提供净化水的实施方案中，污染物可以是在海水中发现的氯化钠，或期望从水中除去的工业过程或农业操作的副产物。在一些实施方案中，污染物是期望浓缩的颗粒，例如通过允许水从溶液中出来，而将待浓缩颗粒包含在膜的第一侧，从而浓缩待浓缩颗粒。因此，本文所使用的词“污染物”不限于不期望的颗粒，而是可以包括期望防止通过膜以浓缩和/或收获该颗粒的颗粒。
[0041] 本发明的一个方面提供了官能化β折叠肽(FBP)。在一些实施方案中，官能化β折叠肽(FBP)包含β折叠肽(BP)和连接于所述β折叠肽(BP)的官能团。例如，可以通过将官能团连接到β折叠肽上来产生这种官能化β折叠肽。在一些实施方案中，官能团可以连接到β折叠肽的C末端或β折叠肽的N末端。在其他实施方案中，官能团可以连接到位于肽末端之间的部分。在一些实施方案中，多个官能团可以连接到β折叠肽。例如，官能团可以包括叠氮基、炔基、烯基、乙烯基、叠氮基苯基、巯基或一些其他合适的官能团。在一些实施方案中，通过常规固相肽合成，在肽序列中的期望位点引入具有期望官能团的经修饰氨基酸来合成官能化β折叠肽。
[0042] 在一些实施方案中，官能化β折叠肽可以包含与Tao参考文献中公开的三种β折叠肽不同的β折叠肽。β折叠肽可以是例如具有交替的疏水和亲水残基的任何合适长度的任何合适的β折叠肽。
[0043] 本发明的一个方面提供了由官能化β折叠肽(FBP)和膜蛋白(MP)形成的复合物。一旦官能化β折叠肽与膜蛋白形成稳定的复合物，官能化β折叠肽上的官能团将允许FBP：MP复合物固定在固体支持物上。例如，如图2A所示，通过肽修饰将β折叠肽20官能化(例如，用叠氮基官能团，如所示将N3添加到肽的C末端)以提供官能化β折叠肽22。将官能化β折叠肽22与膜蛋白(示出为条带图)组合，并且不受理论束缚，认为在膜蛋白的疏水性外表面上组装成β折叠桶，以提供官能化β折叠肽-膜蛋白(FBP：MP)复合物24。然后将叠氮基-FBP：MP复合物24固定在用炔端基预官能化的固体支持物26上。叠氮基和炔基之间的共价键形成将FBP：MP共价固定在固体支持物表面上以提供固定的FBP：MP复合物28。在一些实施方案中，可以进行进一步的研究，例如使用荧光标记的底物或抗体30进行结合表征。
[0044] 如上所述，固体支持物不限于炔官能化固体支持物26，并且可以是任何合适的聚合物表面(例如在膜中浇铸的聚合物链)、无机表面如金表面、一些其他固态表面或任何其他合适的支持物。如图2B所示，在一些实施方案中，官能化β折叠肽稳定的膜蛋白可以与膜中浇铸的聚合物链缀合。
[0045] 图2C示意性地示出了官能化β折叠肽可以如何相互作用以形成β折叠结构以稳定膜蛋白。不受理论的约束，认为交替的疏水-亲水肽序列的疏水残基与跨膜蛋白的疏水区相互作用。因此，膜蛋白被官能化β折叠肽稳定化并与其形成稳定的复合物。所得复合物可以通过使官能化β折叠肽的官能团与支持物上的合适官能团反应而共价锚定于合适的支持物。
[0046] 在一些实施方案中，官能化β折叠肽包含定制序列。例如，肽内的个别氨基酸可以具有不同的官能团，其可以用于调节FBP：MP复合物的物理化学行为。这些官能团可以用于使FBP：MP复合物彼此交联，同时保持蛋白质的功能。在一个示例性实施方案中，这可以进行以产生紧密堆积和高度有序的蛋白质阵列，或者在另一个示例性实施方案中使用长接头分子来实现松散的网状结构。例如，在一个示例性实施方案中，将乙烯基官能团引入肽序列内以产生乙烯基官能化β折叠肽。在一个示例性实施方案中，乙烯基官能化β折叠肽具有以下所示的结构(8)。在膜蛋白：乙烯基-BP1复合物形成后，官能化β折叠肽上的乙烯基官能团可以被活化以进行交联。这导致形成通过乙烯基官能团交联的蛋白质复合物。
[0047] 在一个示例性实施方案中，官能化β折叠肽包含序列乙酰基-(辛基)Gly-Ser-Leu-Ser-Leu-Asp-(辛基)Gly-Asp-NH2(SEQ ID NO：l)，其具有通式结构(2)并具有任何合适的官能团。
[0048]
[0049] 在替选示例性实施方案中，官能化β折叠肽可以具有具交替的极性和非极性残基和每个末端处的疏水部分的任何合适的序列。在示例的实施方案中在第二个亮氨酸上提供的结构(2)的N-甲基氨基酸在替选实施方案中可以置于不同位置，以任何期望数量组合，或者省略。在一些实施方案中，在特定位置使用的氨基酸可以用具有类似性质的不同的天然存在的氨基酸或经修饰的氨基酸代替。例如，在一些实施方案中，官能化β折叠肽可以具有这样的序列：其在第一个位置处包含下表1第1栏中列出的任一氨基酸，在第二个位置处包含下表1第2栏中列出的任一氨基酸等等，以提供具有交替的极性和非极性残基和在肽的每个末端处或附近的疏水部分的β折叠肽。在一些实施方案中，额外的氨基酸可以存在于β折叠肽的C末端或N末端处。例如，在一些实施方案中，可以在β折叠肽的C末端或N末端中的任一者或两者处提供额外的氨基酸，并且可以选择这些额外的氨基酸的序列以形成特定的二级结构而不干扰官能化β折叠肽对膜蛋白的稳定，和/或可以选择该序列以包含特定的官能团，例如以促进由官能化β折叠肽稳定的膜蛋白的交联或表面附着。
[0050] 表1.用于构建官能化β折叠肽的潜在氨基酸序列。
[0051]
[0052] 在一些实施方案中，通过将表1中所列序列中的氨基酸之一替换成可以更容易官能化的不同氨基酸来在官能化β折叠肽上提供官能团，例如，由于Cys含有可容易修饰的游离巯基，所以将位置2的Ser替换成Cys，或将位置4的Ser替换成Cys。
[0053] 在一些实施方案中，通过在合成期间在多肽中引入具有合适的官能团的经修饰氨基酸残基来在官能化β折叠肽上提供官能团。表2示出了在一些示例性实施方案中如何使用经修饰氨基酸修饰官能化β折叠肽的序列。表2中所示的示例性修饰氨基酸仅仅是说明性的，并且本领域技术人员将清楚，可以替代地使用其他经修饰氨基酸。
[0054] 表2.用于构建官能化β折叠肽的示例性的潜在经修饰氨基酸序列。
[0055]
[0056] 在一些实施方案中，通过在合成期间将具有例如结构(2)、(3)或(4)的肽的氨基酸单体替换成期望的氨基酸单体，实现序列替换，包括上述示例性序列替换，因为相同的反应化学适用于各种不同的氨基酸(即，在例如使用常规固相肽合成仪的肽合成期间，肽的氨基和进入的氨基酸单体的羧酸基之间形成肽键)。在一些实施方案中，使待修饰氨基酸的选择合理化，使得官能化氨基酸处于溶剂暴露的位置。在一些实施方案中，官能化氨基酸提供在表1所列示例性潜在氨基酸序列的位置2、位置4、位置6或位置8处。在替选实施方案中，多于一个官能化氨基酸可以提供在肽序列内。
[0057] 在一些实施方案中，在肽的N末端或C末端的任一者或两者处添加经修饰的或非天然存在的氨基酸。在这样的实施方案中，官能化β折叠肽具有长于八个氨基酸的序列，例如九个氨基酸或十个氨基酸。例如，在一个示例性实施方案中，通过常规肽合成方法将炔丙基甘氨酸(市售)添加到具有BP1序列的β折叠肽的C末端，以制备具有结构(5)的9氨基酸序列，其具有肽序列乙酰基-(辛基)Gly-Ser-Leu-Ser-Leu-Asp-(辛基)Gly-Asp-(炔丙基)Gly-NH2(SEQ ID NO：12)。结构(5)的N-甲基氨基酸提供在序列内的第二个亮氨酸上，但是在替选实施方案中可以提供在任何期望的氨基酸残基上或被省略。在替选实施方案中，可以存在多于一个N-甲基氨基酸。
[0058]
[0059] 所得序列具有炔丙基官能团并且可以组装成如图4A所示的原纤维结构，其指示了β折叠的形成。类似地，可以使用相同的策略引入甘氨酸衍生物和其他经修饰氨基酸，例如烯丙基甘氨酸、环丙基甘氨酸、叠氮基戊酸氨基酸等。
[0060] 在一些实施方案中，将经修饰的或非天然存在的氨基酸插入肽序列内。在一些这样的实施方案中，经修饰的或非天然存在的氨基酸是炔丙基甘氨酸、烯丙基甘氨酸、环丙基甘氨酸、叠氮基-戊酸氨基酸等。在替选实施方案中，除了甘氨酸之外的其他氨基酸也可以被修饰并插入肽中。在一些这样的实施方案中，可以将一个或更多个额外的氨基酸添加到肽的N末端或C末端中任一者或两者中。在一些这样的实施方案中，添加一个或更多个额外的氨基酸以保持肽的交替的极性残基-非极性残基序列。在这样的实施方案中，由于在肽序列中插入至少两个额外的氨基酸，官能化β折叠肽具有比八个氨基酸长的序列，例如十个氨基酸。
[0061] 在另一个示例性实施方案中，β折叠肽包含叠氮基末端官能化β折叠肽。在一个这样的示例性实施方案中，β折叠肽包含具有结构(6)的叠氮基末端官能化β折叠肽。结构(6)具有通用肽序列乙酰基-叠氮高丙氨酸-(辛基)Gly-Ser-Leu-Ser-Leu-Asp-(辛基)Gly-Asp-NH2(SEQ ID NO：13)。结构(6)包含九个氨基酸。结构(6)的N末端氨基酸是示例性经修饰氨基酸叠氮高丙氨酸(azidohomoalanine)，其是本发明人根据报道的方法合成的。在结构(6)中，N-甲基提供在第二个亮氨酸上。在替选实施方案中，额外的N-甲基可以提供在肽内，或者一个或更多个N-甲基可以提供在第二个亮氨酸以外的氨基酸上，或者N-甲基可以全部省略。
[0062]
[0063] 在另一个示例性实施方案中，β折叠肽包含炔末端官能化β折叠肽。在一个这样的示例性实施方案中，β折叠肽包含具有结构(7)的炔末端官能化β折叠肽，其中炔末端官能团提供在肽的N末端处。结构(7)具有通用肽序列乙酰基-(炔丙基)Gly-(辛基)Gly-Ser-Leu-Ser-Leu-Asp-(辛基)Gly-Asp-NH2(SEQ ID NO：14)。结构(7)包含九个氨基酸。在结构(7)中，N-甲基提供在在第二个亮氨酸上。在替选实施方案中，额外的N-甲基可以提供在肽内，或者一个或更多个N-甲基可以提供在第二个亮氨酸以外的氨基酸上，或者N-甲基可以全部省略。
[0064]
[0065] 在另一个示例性实施方案中，β折叠肽包含烯中间官能化β折叠肽。在一个这样的示例性实施方案中，β折叠肽包含具有结构(8)的烯中间官能化β折叠肽。结构(8)具有通用肽序列乙酰基-(辛基)Gly-Ser-Leu-Ser-氨基己烯酸-Leu-Asp-(辛基)Gly-Asp-Gly-Leu-NH2(SEQ ID NO：15)。结构(8)包含11个氨基酸。在结构(8)中，在第二亮氨酸上提供N-甲基。在替选实施方案中，额外的N-甲基可以提供在肽内，或者一个或更多个N-甲基可以提供在第二个亮氨酸以外的氨基酸上，或者N-甲基可以全部省略。
[0066]
[0067] 在替选实施方案中，通过将用于提供烯中间官能化β折叠肽的乙烯基修饰的氨基酸替换成相应炔丙基修饰的氨基酸，提供炔中间官能化β折叠肽。因此，通过在肽序列内的期望位置处引入相应的经修饰氨基酸，可以使任何合适的官能团位于官能化β折叠肽中的任何期望位置。
[0068] 在一些实施方案中，在通过任何合适的化学反应合成之后将β折叠肽官能化。例如，在一些实施方案中，可以将β折叠肽官能化，使得其将通过其氨基和/或羧基形成共价键。在一个这样的示例性实施方案中，β折叠肽中的游离氨基与间苯二胺(MPD)和均苯三甲酰氯(TMC)反应以提供酰胺官能团。酰胺官能团可以与主链羰基反应以将β折叠肽共价偶联在一起。在另一个这样的示例性实施方案中，β折叠肽的游离羧基可以与间苯二胺(MPD)反应以形成酰胺官能团，其可以类似地与肽主链的羰基共价连接以将β折叠肽共价连接在一起。在一个这样的实施方案中，共价连接的β折叠肽-膜蛋白复合物形成界面聚合物层，其可以通过氢键相互作用偶联至膜(例如聚砜膜)以形成聚酰胺-聚砜界面复合膜(参见例如，Ghosh等，2009)。复合膜的聚酰胺和聚砜层之间的氢键相互作用可以例如通过在浇铸膜或调节聚砜膜的表面粗糙度期间添加诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的成孔剂来调节，其他因素如将聚酰胺层吸附在聚砜上的孔上等也可以增强两层复合膜之间的相互作用。
[0069] 在一些实施方案中，官能化β折叠肽在任何合适的位置具有官能团。在一些实施方案中，官能团是交联官能团。在一些实施方案中，交联官能团是叠氮基、炔基、烯基、巯基、叠氮基苯基、乙烯基等。
[0070] 在一些实施方案中，官能团提供在肽的N末端。例如，在具有核心β折叠肽结构(2)的一个示例性实施方案中，官能团提供在肽的乙酰基上，使得肽具有通用结构(9)：
[0071]
[0072] 其中R4可以是任何合适的官能团，包括例如叠氮基、炔基、烯基、巯基、叠氮基苯基、乙烯基等。
[0073] 在一些实施方案中，官能团提供在肽的C末端。例如，在具有核心β折叠肽结构(2)的一个示例性实施方案中，官能团提供在肽的氨基上，使得肽具有通用结构(10)：
[0074]
[0075] 其中R5可以是任何合适的官能团，包括例如叠氮基、炔基、烯基、巯基、叠氮基苯基、乙烯基等。
[0076] 除了通过在肽合成期间引入具有特定官能团的侧链来官能化β折叠肽之外，还可以通过使β折叠肽在其脱乙酰形式下在N末端的α-胺处与双官能交联剂反应来官能化。多种这样的双官能交联剂是市售的或可以容易地合成，例如6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-NHS-SANPAH，ThermoFisher Scientific)、4，4′-azipentanoate磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-NHS-双吖丙啶(Diazirine)，ThermoFisher Scientific)、2-((4，4′-azipentanamido)乙基)-1，3′-二硫代丙酸琥珀酰亚胺酯(NHS-SS-双吖丙啶，ThermoFisher Scientific)等。例如，使脱乙酰基β折叠肽与NHS-双吖丙啶基(SDA)双官能化交联剂(Thermo Scientific Pierce)反应将产生在N末端具有光反应性双吖丙啶官能团的官能化β折叠肽。在与目标膜蛋白形成复合物后，双吖丙啶-FBP：MP可以通过双吖丙啶官能团交联到固体支持物上。此外，由于该具体实例中的官能团(即双吖丙啶官能团)是光反应性的，所以可以通过光掩模将双吖丙啶-FPB：MP固定成期望的图案。
[0077] 使脱乙酰基β折叠肽(其在一个示例性实施方案中具有BP1的序列)与N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺(ANB-NOS)(Thermo Scientific Pierce)反应将得到ANB修饰的β折叠肽(例如，方案1中所示ANB-BP1)，其在N末端具有光反应性芳基-叠氮基官能团。
在与目标膜蛋白形成复合物后，ANB-BP：MP可以通过芳基-叠氮基官能团交联到固体支持物上。此外，由于该具体实例中的官能团(即ANB)是光反应性的，因此可以通过光掩模将ANB-BP：MP复合物固定化成任何期望的图案。
在与目标膜蛋白形成复合物后，ANB-BP：MP可以通过芳基-叠氮基官能团交联到固体支持物上。此外，由于该具体实例中的官能团(即ANB)是光反应性的，因此可以通过光掩模将ANB-BP：MP复合物固定化成任何期望的图案。
[0078] 方案1.非乙酰基BP1与ANB-NOS产生可光活化的官能化β折叠肽(FBP1)的反应方案。
[0079]
[0080] 在一个实施方案中，上述官能化β折叠肽和FBP：MP复合物用于产生区室化反应器，其基于具有特定功能的膜蛋白(即水通道蛋白)阵列以净化水。
[0081] 在一个实施方案中，上述官能化β折叠肽和FBP：MP复合物可用于基于膜的过滤器中。这样的过滤器可以用于水脱盐(例如，使用FBP：水通道蛋白复合物)，或用于特殊化学品的受控分离，或者可以是使用pH和/或压力的主动控制的过滤器/阀。
[0082] 在一些实施方案中，使用通过官能化β折叠肽稳定的水通道蛋白提供了表面固定的可能性，允许构建用于水净化应用的新型膜。
[0083] 其上固定有官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的基质或支持物应当选择为与固定的肽-蛋白质复合物相容并促进其固有的功能。在一些实施方案中，其上固定有官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的基质是经改性的聚合物(例如聚砜、聚碳酸酯、聚内酯等。在一些实施方案中，其上固定有官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的基质是碳纳米管网或碳纳米管网的复合物。在一些实施方案中，其上固定有官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的基质是纳米晶体纤维素或纳米晶体纤维素的复合物。
[0084] 在一个示例性实施方案中，其上固定有官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的基质是聚合物。在一个这样的示例性实施方案中，聚合物是聚砜。聚砜由于其化学相容性和耐久性而在膜工业中是众所周知的，并且其为用于结构改性的良好候选。最初将聚砜官能化以形成叠氮基团，然后与特定比例的天然聚砜浇铸成膜。使用液相诱导相转化技术(liquid-induced phase inversion technique)进行浇铸。在一些实施方案中，在浇铸过程中加入成孔剂以形成具有受控尺寸的孔的膜。在一些实施方案中，成孔剂(pore developing agent)是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(N，N-甲基丙烯酸二甲氨乙酯(PDMAEMA)等。任何合适的成孔剂(pore forming agent)均可以使用。在一些实施方案中，孔的直径尺寸为约5nm至若干μm，例如10μm，包括其间的任何值。在一些实施方案中，所形成的孔的直径尺寸为约20nm至约200nm，包括其间的任何值，例如，直径为30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190nm。
[0085] 在这样的实施方案中，孔周围的叠氮基官能团提供了官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的特异性连接的起始点。在一些这样的实施方案中，孔周围的叠氮基官能团提供了用于连接用于稳定水通道蛋白分子的炔丙基修饰的官能化β折叠肽的起始点。因此，水通道蛋白-官能化β折叠肽复合物可以通过温和点击化学经由官能化β折叠肽共价交联至聚砜底物，得到强健且可扩展的载有蛋白质的仿生反渗透膜。
[0086] 在引入孔的一个示例性实施方案中，在官能化β折叠肽稳定的水通道蛋白已经交联到聚砜底物之后，进行界面聚合以使通过膜中孔的水(或携带一种或更多种污染物的水)的任何泄漏最小化。
[0087] 在一个示例性实施方案中，用于制备叠氮基官能化聚砜膜的PSU-CH2N3溶液根据方案2中所述的通用反应制备，例如Evram等中所述。
[0088] 方案2.用于制作叠氮基官能化聚砜膜的溶液的制备。
[0089]
[0090] 在制备PSU-CH2N3溶液后，根据图3所示的通用方法制备聚砜膜。在所示实施方案中，将PSU-CH2N3与合适的成孔剂(例如在所示实施方案中的PVP)在合适的溶剂(例如N-甲基-2-吡咯烷酮，NMP)中组合，并搅拌合适的时间(例如在所示实施方案中24小时)。将溶液脱气，以任何合适的方式(例如通过在所示实施方案中通过自动制膜器)浇铸成膜，并冲洗以除去过量的反应物(例如在所示的实施方案中通过浸渍在去离子水浴中24小时)。在一些实施方案中，省略了成孔剂。
[0091] 在一个示例性实施方案中，将通过具有BP1的通用结构并具有炔丙基官能团(即具有结构(5))的官能化β折叠肽稳定的水通道蛋白分子通过点击化学偶联到叠氮基官能化的聚砜膜，如方案3所示。使用点击化学进行这种反应在本领域普通技术人员的预期能力范围内。在本发明人进行的一个实例中，使用硫酸铜(CuSO4·5H2O)和抗坏血酸钠进行聚砜膜和官能化β-肽之间的点击化学。将1∶3当量的该催化剂与13当量的炔丙基官能化β折叠肽在二氯甲烷溶剂中混合。将混合物在氩气氛下在室温下搅拌12小时。通过溶剂蒸发回收产物。
[0092] 方案3.炔丙基官能化β折叠肽与叠氮基官能化聚砜膜的反应。
[0093]
[0094] 在一个示例性实施方案中，其上固定有官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的基质是碳纳米管(CNT)网。天然碳纳米管在性质上是疏水的，并且可以通过自身或与复合材料形成网状物而组装成膜，或者可以通过适当的交联组装。为了利用碳纳米管网作为用于蛋白质引入的基质，首先进行表面化学以促进缀合反应。在一个示例性实施方案中，通过酸解或等离子体氧化(plasmoxidation)进行氧化以在碳纳米管网的表面上提供游离羧基，其可以与具有烯基的胺反应以促进对碳纳米管基质的UV交联。该策略将在碳纳米管网上提供乙烯基官能化，以促进与各种官能团的UV交联。碳纳米管网与官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的交联可以通过使用具有乙烯基官能团的官能化β折叠肽使用适当的UV辐射来实现。例如，在一些实施方案中，可以使用具有结构(8)的官能化β折叠肽。在一些实施方案中，所使用的UV辐射波长为300至400nm或其间的任何值，例如310、320、330、340、350、360、370、380或390nm。在一些实施方案中，在官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白已经偶联到碳纳米管网之后，可以通过紧密包装碳纳米管纤维来使网致密化，以避免水通道蛋白周围的任何水泄漏。
在一些这样的实施方案中，可以通过将构建体浸泡在甲醇中并且真空干燥来进行致密化，注意不要使稳定化水通道蛋白分子的功能破坏的条件。
在一些这样的实施方案中，可以通过将构建体浸泡在甲醇中并且真空干燥来进行致密化，注意不要使稳定化水通道蛋白分子的功能破坏的条件。
[0095] 在一个示例性实施方案中，其上固定有官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的基质是纳米晶体纤维素。类似于使用碳纳米管作为基质，可以使用已建立的技术如Fisher酯化对表面上具有大量羟基的纳米晶体纤维素基质进行表面活化，以引入羧酸酯官能团，然后引入胺-烯双官能接头以提供具有乙烯基官能团的表面(参见例如，Habibi，Y.(2014))。乙烯基官能团可以使用已建立的化学技术与官能化β折叠肽上提供的合适的官能团进一步反应。
[0096] 根据一些实施方案通过利用膜的表面官能团制备膜并使用具有某些修饰的β折叠肽进行蛋白质稳定化可以使得能够产生能够再现自然选择性的仿生膜，从而选择性地使特定颗粒通过或移动穿过膜。在一些实施方案中，特定颗粒是离子或分子。可以选择膜蛋白以选择性地通过或运输特定颗粒，所述特定颗粒可以是期望的离子、分子例如水、RNA、DNA等。例如，Habel等(2015)中表1中列出的已经使用二嵌段或三嵌段聚合物体系研究过的任何膜蛋白均可以使用官能化β折叠肽而稳定在膜上，并用于运输其相应的运输物。因此，丙甲甘肽(alamethicin)、溶血素、NADH还原酶、OmpG、OmpF或RC可用于运输电子；丙甲甘肽可用于运输钙或钙黄绿素；NtAPQ1或NtPIP2：1可用于运输二氧化碳，AQP0、AQP10或SoPIP2；1可以用于以与本说明书中已经证明的AqpZ运输水的相同方式运输水；TsX可用于运输核苷；OmpF可用于运输大的有机分子，例如吖啶橙、百草枯、绿脓菌素、乙酰硫代胆碱
(actylthiocholine)、烯酮、ELF97、7-ADCA、PGME、核苷、氨苄青霉素、L-抗坏血酸、CO、Na2S2O4、ONOO-；短杆菌肽A可用于运输一价阳离子；MloK1可用于运输钾；LamB可用于运输糖，包括麦芽六糖或DNA；FhuA可用于运输较大分子，如磺酰罗丹明B、TMB、NAD、DNA、钙黄绿素；BR、PR或BR&ATP酶可用于运输H+；BR&CcO可用于运输H+和电子；CcO可用于运输电子，多粘菌素B、溶血素或天蚕抗菌肽A可用于运输钙黄绿素。在一些实施方案中，诸如α-溶血素、MspA、OmpF或OmpG的蛋白质可用于运输多核苷酸，包括DNA和RNA。如实施例3.0所述，发明人已经证明可以使用官能化β折叠肽来稳定多种膜蛋白，包括AqpZ、ChIEF-mCitrine、NaChBac、F0F1-ATP酶和OmpG。ChIEF-mCitrine与BR具有非常相似的结构。OmpG与OmpF和FhuA具有非常相似的结构(即，所有三种蛋白质均具有β折叠桶跨膜结构域)。因此，从本文所述的实验数据并基于与上面列出的其他膜蛋白的结构相似性，可以可靠地预测，除了AqpZ之外，上文列出的蛋白和包括其他水通道蛋白的其他膜蛋白可以使用官能化β折叠肽稳定并连接至例如任何合适的膜构建体，用于运输或引导蛋白质的相应运输物穿过膜。
(actylthiocholine)、烯酮、ELF97、7-ADCA、PGME、核苷、氨苄青霉素、L-抗坏血酸、CO、Na2S2O4、ONOO-；短杆菌肽A可用于运输一价阳离子；MloK1可用于运输钾；LamB可用于运输糖，包括麦芽六糖或DNA；FhuA可用于运输较大分子，如磺酰罗丹明B、TMB、NAD、DNA、钙黄绿素；BR、PR或BR&ATP酶可用于运输H+；BR&CcO可用于运输H+和电子；CcO可用于运输电子，多粘菌素B、溶血素或天蚕抗菌肽A可用于运输钙黄绿素。在一些实施方案中，诸如α-溶血素、MspA、OmpF或OmpG的蛋白质可用于运输多核苷酸，包括DNA和RNA。如实施例3.0所述，发明人已经证明可以使用官能化β折叠肽来稳定多种膜蛋白，包括AqpZ、ChIEF-mCitrine、NaChBac、F0F1-ATP酶和OmpG。ChIEF-mCitrine与BR具有非常相似的结构。OmpG与OmpF和FhuA具有非常相似的结构(即，所有三种蛋白质均具有β折叠桶跨膜结构域)。因此，从本文所述的实验数据并基于与上面列出的其他膜蛋白的结构相似性，可以可靠地预测，除了AqpZ之外，上文列出的蛋白和包括其他水通道蛋白的其他膜蛋白可以使用官能化β折叠肽稳定并连接至例如任何合适的膜构建体，用于运输或引导蛋白质的相应运输物穿过膜。
[0097] 引入官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的膜在许多不同的环境中具有潜在的应用。例如，在一些实施方案中，引入官能化β折叠肽稳定之水通道蛋白的膜可以用于诸如废水处理，油气部门中的水净化，水的脱盐(例如从盐水源提供饮用水)的应用，以及在生物技术和食品饮料部门中的应用，例如在乳品工业中除去细菌或乳清浓缩，水果和蔬菜汁的澄清和浓缩，用于产生淀粉和甜味剂，以及所有行业中的工艺水回收。
[0099] 在一些实施方案中，使用引入官能化β折叠稳定之水通道蛋白的膜处理污染的水。在一些实施方案中，污染的水是农业废物流。在一些这样的实施方案中，膜用于除去一种或更多种污染物，包括氨、尿素、农药、合成肥料、重金属(包括铅、砷、硒或汞)，来自药物和个人护理产品的有机污染物，或来自废物流的微生物。在一些实施方案中，污染的水是工业废物流。在一些这样的实施方案中，膜用于从废物流中除去一种或更多种污染物，包括磷酸盐、硝酸盐、石棉、多氯联苯、汞、铅、苛性钠或其他钠化合物、硫、硫酸、油或石油化学品。
[0100] 参考以下实施例进一步描述了本发明的一些实施方案，这些实施例旨在是说明性的而不是限制性的。
[0101] 实施例1.0-官能化β折叠肽(FBP)的制备
[0102] 实施例1.1-固相肽合成仪上FBP的化学合成
[0103] 使用具有炔丙基侧链的氨基酸，本发明人能够在固相肽合成仪上合成在C末端具有炔官能团的官能化β折叠肽。当在磷酸盐缓冲盐水中稀释时，炔-FBP自组装成丝状结构，这表明炔-FBP保留了β折叠肽的β折叠形成倾向。合成的炔-官能化β折叠肽具有BP1的结构，但具有C末端炔丙基甘氨酸，即具有结构(5)的乙酰基-(辛基)Gly-Ser-Leu-Ser-Leu-Asp-(辛基)Gly-Asp-(炔丙基)Gly-NH2，(SEQ ID NO：12)。炔官能化β折叠肽的自组装示出在图4A中。图4B示出了显示高纯度的炔丙基-BP1的正确分子质量的质谱图。
[0104] 本发明人还使用类似的策略合成了具有结构(6)的叠氮基-FBP1(SEQ ID NO：13)。显示叠氮基-BP1的正确分子质量的质谱图示于图4C中。
[0105] 实施例1.2-确认FBP1上的炔官能团
[0106] 为了证实在实施例1.1中合成的炔-BP1上的炔基的存在和活性功能，本发明人进行反应以使肽上的炔基与荧光tetrathyrhodamine叠氮化物(Click-iT试剂盒，Life Technology)进行点击反应。然后，发明人在装备有荧光检测器的HPLC上运行反应产物。如预期的，不属于试剂盒组分的另外的荧光峰出现在洗脱曲线上(在图5的上图中用箭头指示的；单独试剂盒和单独染料的HPLC谱分别显示在图5的中间图和下图)。因此，本发明人可以将该峰归属于染料标记的炔官能化β折叠肽。
[0107] 实施例2.0-膜蛋白纯化和BP：MP复合物的形成
[0108] 发明人已纯化了水通道蛋白(AqpZ)并验证了其功能。AqpZ是大肠杆菌周质膜上的水通道。AqpZ选择性地以高速率并基于跨细胞膜的渗透梯度转移水。如上所述，在水净化应用中使用水通道蛋白的现有尝试尚未完全成功。然而，相信根据本公开内容的FBP：AqpZ复合物将克服与先前尝试有关的至少一些缺点。
[0109] 根据标准分子生物学程序，本发明人已经根据之前的文献(7)使用正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)作为增溶性洗涤剂优化了大肠杆菌中重组AqpZ的过表达和纯化。使用文献(7)中所述的质粒pTrc10HisAqpZ作为模板克隆AqpZ编码基因。向编码基因中引入一个小的修饰，即编码Arg3的密码子从aga改变为cgt，以提高翻译效率。在大肠杆菌中，密码子cgt的使用频率比aga高10倍。将编码基因克隆到市售质粒(即Novagen的pET28a)中，并将所得质粒构建体pET28a-AqpZ用于蛋白质表达。质粒的细节可以在图6中找到，并且质粒的全序列提供为SEQ ID NO.：16。
[0110] 本发明人首次证实，可以使用对应于由Tao等公开的BP1(即，结构(2))的β折叠肽来用β折叠肽稳定纯化的AqpZ。AqpZ的结构由六个跨膜螺旋和两个跨半膜螺旋构成(8)。对应于该螺旋束结构，DDM溶解的AqpZ的圆二色性(CD)光谱显示特征α-螺旋吸收带，即在198nm的强正带和在210nm和224nm的负带(图7A)(9)，它们是α-螺旋结构的特征。类似地，BP1：AqpZ也在其具有蓝移峰的CD谱上显示出特征α-螺旋吸收带。不受理论的束缚，认为吸收峰的蓝移可归因于影响局部光学环境的BP1的结合。此外，在4℃下储存的BP1：AqpZ和AqpZ/DDM保持四周的二级结构(图7A)和至少3周的寡聚状态(图7B，示出伪天然12％SDS-PAGE的结果)。
[0111] 本发明人通过在不同温度下在CD光谱仪上监测其二级结构进一步研究了AqpZ/DDM和BP：AqpZ的热稳定性。如图8A-8C所示，与DDM溶解的AqpZ类似(图8A)，BP：AqpZ在高达90℃的温度下保持其二级结构的大部分(约70％)(图8B；图8C所示的DDM稳定的和β折叠肽稳定的AqpZ在192nm的归一化椭圆率)。这种非凡的热稳定性表明BPI：AqpZ或FBP1：AqpZ将是用于制造仿生水净化膜的良好候选物，其可暴露于苛刻条件的温度或环境污染物(例如盐、洗涤剂、重金属等)。
[0112] 实施例3.0-使用官能化β折叠肽稳定膜蛋白
[0113] 发明人已经证明，可以使用官能化β折叠肽稳定膜蛋白。所测试的额外膜蛋白包括具有螺旋束整合膜蛋白的三种膜蛋白(ChIEF-mCitrine、NaChBac和F0F1-ATP酶)以及具有β折叠整合膜蛋白的一种膜蛋白(OmpG)。AqpZ是螺旋束整合膜蛋白。
[0114] ChIEF是实验室设计的光门控阳离子通道，其在用光刺激时运输质子、钠离子、钙离子等。在该具体实施例中，将荧光标签mCitrine遗传学地连接于所述蛋白质的C末端以促进纯化，产生ChIEF-mCitrine构建体。NaChBac是受膜电位调节的运输钠离子的细菌(耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans))膜蛋白。F0F1-ATP酶是当通过跨细胞膜的质子梯度驱动时合成ATP的ATP合酶(来自芽孢杆菌PS3)。OmpG是能够跨膜运输大的溶质(如二糖)的细菌孔蛋白(大肠杆菌K12)。
[0115] 每种蛋白质的稳定结果分别示于图9A-9E中。通过分别对应于结构(6)、(7)和(8)的具有BP1序列的三种不同的官能化β折叠肽(叠氮基、炔丙基和乙烯基)稳定上述每种蛋白质。示出了每一种蛋白质的CD谱，未进行蛋白质稳定化(分别对于AqpQ和OmpG的不含DDM或不含OG)或用DDM稳定蛋白质(F0F1-ATP酶、NaChBac和ChIEF-mCitrine)。
[0116] 本发明人通过测量其ATP水解活性进一步证明当通过官能化β折叠肽稳定时，F0F1-ATP酶保持其功能。酶促反应中无机磷酸(Pi)的产生作为酶活性的指示剂。使用PiColorLockTM磷酸检测试剂盒(Innova Biosciences)按照制造商的说明书进行ATP酶水解活性。
[0117] 如图10A所示，当用BP1或DDM稳定时，F0F1-ATP酶的酶活性(通过水解活性表征)类似。如图10B所示，当通过具有结构(6)的官能化β折叠肽叠氮基-BP1稳定时，F0F1-ATP酶也保持水解活性。因此，可以可靠地预测，通过官能化β折叠肽稳定化并通过官能化β折叠肽的官能团与膜的反应并入膜中的FoF1-ATP酶可用于产生人工ATP产生系统。当跨容纳F0F1-ATP酶的膜存在质子梯度时，所述酶将从ADP和无机磷酸合成ATP，导致在膜的一侧产生ATP。还可以使酶逆向起作用以从ATP的水解产生质子梯度。因此，F0F1-ATP酶可以用于合成ATP，或者替代地将质子从具有其中并入F0F1-ATP酶的膜的一侧泵送到膜的另一侧。
[0118] AqpZ、NaChBac、ChIEF和ATP酶都是具有由螺旋束形成的类似跨膜结构域结构的蛋白质。OmpG代表不同跨膜结构域结构的实例：β-折叠桶。基于这样多组的膜蛋白(包括AqpZ)都被官能化β折叠肽成功稳定的事实，并且基于不同水通道蛋白之间的高度保守性(例如如图1B所示)，可以可靠地预测，除AqpZ之外的其他水通道蛋白也可以用官能化β折叠肽稳定并偶联到膜以从水中去除污染物。还可以进一步可靠地预测，官能化β折叠肽可以用于稳定和束缚多种膜蛋白以制备有用的蛋白质构建体。如下文实施例4.0所讨论的，根据表明当通过官能化β折叠肽稳定时F0F1-ATP酶保持其活性以及表明可以使用官能化β折叠肽将水通道蛋白并入膜中并且用于提高通过膜的水的通量同时限制盐通过膜的结果，可以可靠地预测，当通过官能化β折叠肽稳定时，其他膜蛋白将保持其功能。
[0119] 例如4.0-评估水通过含水通道蛋白膜的运输
[0120] 实施例4.1-聚砜膜酶合成
[0121] 按照文献(Yilmaz等，2011)中所述的方案2中所述的通用反应制备叠氮基官能化聚砜膜。在步骤1中，首先在装配有磁力搅拌器、回流冷凝器和温度计的圆底烧瓶中，通过溶解在氯仿中完成聚砜的氯甲基化。将溶液在氮气氛下在50℃下加热，然后将对甲醛(10g)、三甲基氯硅烷(42.50mL)和氯化锡(IV)(1.75g)加入到聚合物溶液中。一旦反应完成(在50℃下50小时)，在搅拌下将混合物倒入甲醇中，过滤聚合物沉淀，然后用甲醇充分洗涤，最后在真空烘箱中在60-65℃干燥24小时。
[0122] 在步骤2中，然后在置于热浴的圆底烧瓶中，将氯化聚砜与NaN3一起溶解在DMF中，并将反应混合物在65℃下搅拌10小时。将反应混合物冷却至室温并在搅拌下倒入甲醇中，过滤分离的聚合物，并用甲醇洗涤。加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为成孔剂，之后真空烘箱中在60℃干燥24小时。
[0123] 实施例4.2-合成的仿生膜的分离性质
[0124] 使用根据实施例4.1制备的聚砜膜和具有结构(2)的β折叠肽制备并入β折叠肽稳定之AqpZ的膜。为了官能化β折叠肽以形成聚酰胺-聚砜复合膜结构，将间苯二胺浓度(MPD)(2重量％)与均苯三甲酰氯(TMC)(0.15重量％)以及AqpZ和聚砜膜合并，以在聚砜膜上产生互锁的界面聚合的聚酰胺层。反应时间(在膜上官能化β折叠肽稳定之蛋白质的界面聚合)为15秒，AqpZ浓度(存在于用于进行界面聚合的蛋白质溶液中)为0.033mg/mL，具有0.064mg/mL的β折叠肽。除了不存在AqpZ之外，在没有AqpZ的情况下测试的膜的条件相同。
[0125] 在标准交叉流反渗透装置中表征合成的仿生膜的分离性质。简言之，将具有42cm2的活性表面积的膜试样安装在测试池(CF42 Membrane Cell，Sterlitech)中。以0.8加仑/分钟的恒定交叉流量泵送进料溶液(25℃下1g/L NaCl)(1000ppm)。在样品收集用于水通量和排除测量之前，在期望的测试压力下将膜压紧2小时。使用重量法测定膜渗透通量(Jv)，并且基于渗液和给水的电导率测量获得NaCl脱除率(R)。
[0126] 如表3(具有AqpZ)和表4(不具有AqpZ)中所总结的，并如图11A、11B和11C所示(图11C仅示出了250PSI操作压力下的数据)，并入水通道蛋白的构建体中通量(升/平方米/小时，或LMH)(即，通过膜的水的流速)增加，并且在较高的操作压力下，当存在水通道蛋白时实现更大的脱盐率。这些结果证明，并入水通道蛋白的膜可用于通过增加通量(即通过膜的水的流速)来增强水与不期望的溶液组分例如氯化钠的分离，同时保持膜对氯化钠的排斥(即，同时继续阻止氯化钠通过膜)。
[0127] 表3.并入AqpZ的膜构建体的通量和脱盐率。
[0128]压强(PSI) 通量(LMH) 脱盐率(％)
200 15.35 80
250 19.33 85
300 22.99 90
350 26.52 90
400 29.92 90
200 15.35 80
250 19.33 85
300 22.99 90
350 26.52 90
400 29.92 90
[0129] 表4.没有AqpZ的对照膜构建体的通量和脱盐率。
[0130]压强(PSI) 通量(LMH) 脱盐率(％)
200 3.74 85
250 4.86 85
300 6.33 85
350 7.52 85
400 8.05 85
200 3.74 85
250 4.86 85
300 6.33 85
350 7.52 85
400 8.05 85
[0131] 虽然上面已经讨论了多个示例性方面和实施方案，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、置换、添加和子组合。因此，与作为整体的说明书的最宽解释一致，旨在将以下所附权利要求和之后引入的权利要求解释为包括的所有这样的修改、置换、添加和子组合。
[0132] 参考文献
[0133] 以下参考文献对于本文所描述的主题可能是有意义的。为了所有目的，以下参考文献中的每一个明确通过引用整体并入本文。
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[0152] 本说明书包括电子序列表，其作为本说明书的一部分而明确并入。此序列表包括如下的自由文本：
[0153] ·SEQ ID NO：1-BP1-合成肽
[0154] ·SEQ ID NO：12-C-炔丙基-BP1-合成肽
[0155] ·SEQ ID NO：13-N-叠氮基-BP1-合成肽
[0156] ·SEQ ID NO：14-N-炔丙基-BP1-合成肽
[0157] ·SEQ ID NO：15-乙烯基-BP1-合成肽
[0158] ·SEQ ID NO：16-pET28a-ApqZ-质粒，用于在大肠杆菌中表达AqpZ
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