【技术领域】
[0001] 本
发明属于
生物工程技术领域，具体涉及高产奶性能娟姗
奶牛选育方法。【背景技术】
[0002] 娟姗牛是源自英吉利海峡杰茜岛的进口奶牛，是英国政府颁布法令保护的珍贵牛种，其 最大的优点就是乳质浓厚，乳脂、
乳蛋白含量均明显高于普通奶牛，乳脂率平均为5.5-6％， 是乳牛著名的品种。该品种在血统上与瑞士褐牛、德温牛和凯瑞牛有关系，而与荷斯坦牛没 有关系。在该品种的早期娟姗牛培育过程中，曾被称为奥尔德尼牛
(Alderney)。娟姗牛是主要 乳用牛品种中最小的品种之一(凯瑞牛和德克斯特牛更小)。该品种与其他品种相比，耐热性 强并以其采食性好，乳脂、乳蛋白率较高而著称。
[0003] 随着人民生活
水平的提高，人们对牛奶的需求量日益增加，如何提高产奶量也一直被畜 牧研究者广泛关注。影响奶奶牛产奶量的因素很多，其中遗传因素是主要因素之一。因此从 基因水平上对奶牛的产奶量性状进行研究，寻找与产奶量紧密连
锁的分子标记或克隆出控制 产奶量的基因，对于进行标记辅助选择及培育高产娟姗牛，具有十分重要的意义。随机扩增 多态性(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)是由Williams和Welsh在1990年发 现的一种DNA多态检测技术。该技术操作简便、快捷，结果准确且灵敏度高。此外RAPD 技术在无须事先了解物种的相关分子生物学信息情况下也可以进行相关标记，因此在品种鉴 定、系谱分析、突变体检测、基因
定位和遗传育种等方面领域得到广泛应用。已有研究者应 用RAPD技术筛选中国荷斯坦牛产奶量性状遗传标记，中国荷斯坦牛的乳脂率是3.5％，相 比较娟姗牛乳脂率低很多，并且体型与中国荷斯坦牛相比，娟姗牛会小很多，若是能够选育 出高产奶的娟姗牛，在同等的养殖面积条件下，将远远提高养殖的经济效益。但是迄今在娟 姗牛产奶性能目前未见报道。本研究应用RAPD技术分别对高产娟姗奶牛组和低产娟姗奶牛 组的基因组DNA进行了多态性分析，并对筛选出的与产奶量相关的标记进行克隆测序及生 物信息学分析，以期找到与娟姗奶牛产奶量性状相关的分子标记，为我国南方培育高产娟姗 奶牛提供科学依据。【发明内容】
[0004] 鉴于上述内容，有必要提供高产奶性能娟姗奶牛选育方法。
[0005] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0006] 高产奶性能娟姗奶牛选育方法，
[0007] 用标记引物S11，序列为GTAGACCCGT，扩增娟姗奶牛血液中的线粒体DNA，如果能 够扩增出929bp
片段或478bp片段，则标志着该娟姗奶牛为高产奶的娟姗奶牛；或
[0008] 用标记引物S1110，序列为CAGACCGACC扩增娟姗奶牛血液中的线粒体DNA，如果能 够扩增出458bp片段，则标志着该娟姗奶牛为低产奶的娟姗奶牛；或
[0009] 用标记引物S1120，序列为ACCAACCAGG扩增娟姗奶牛血液中的线粒体DNA，如果 能够扩增出669bp片段，则标志着该娟姗奶牛为低产奶的娟姗奶牛。
[0010] 进一步说明，所述标记引物的是由以下方法筛选得到的：
[0011] (1)、取20头高产(305d产奶量>4000kg)和20头低产(305d产奶量<3200kg娟姗 牛，颈静脉
采血10mL，EDTA-k2抗凝，-20℃保存；
[0012] (2)、用DNA提取
试剂盒提取奶牛血液总DNA进行
电泳检测，并用紫外分光光度 计检测奶牛个体的DNA浓度，稀释到同一浓度；取每个个体等量DNA分别混成高产奶牛 DNA池和低产奶牛DNA池；
[0013] (3)、用250条S系列10bp随机引物，分别以高产和低产DNA池为模板进行PCR 扩增，2
PCR扩增反应体系为Template(基因组DNA 20-50ng/μl)0.5μl，其中，10×Buffer(with Mg+)2.5μl，dNTP(各2.5mM)1μl，酶0.2μl，引物1μl，加双蒸H2O至25μl；
[0014] PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s；36℃
退火45s；72℃延伸 1min，35循环后，72℃延伸10min；
[0015] PCR扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳，
电压为5V/cm，电泳缓冲液为0.5×TBE， 电泳1～2h后在凝胶成像系统上检测并拍照，从中筛选扩增条带多、重复性好、
分辨率高且 扩增条带在高、低产DNA池间有显著差异的3个引物；经DNA片段的回收、连接、感受 态的制备、转化、质粒DNA的提取及重组质粒的酶切鉴定后，进行测序；
[0016] 其中，929bp片段的RAPD标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示或478bp的RAPD 标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
[0017] 458bp片段的RAPD标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
[0018] 669bp片段的RAPD标记片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
[0019] 与
现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
[0020] 本发明发现了娟姗牛中KX592814.1可以作为娟珊奶牛高产基因的标记基因。通过基因选 择可实现快速开展种牛育种，省去种牛配种与产奶测定时间，将育种时间缩短到原来的1/2 左右。利用该基因检测，还可直接判断该头种牛预计的产奶情况，极大的提高娟姗种牛的育 种效率，具有重要的市场价值和意义。【
附图说明】
[0021] 图1为奶牛血样总DNA的提取电泳图，其中M是DNA Maker SM0331分子量标准，条带 从上至下依次为10000bp、3000bp、1000bp、500bp；编号1-12分别是提取12头奶牛血 液总DNA琼脂糖凝胶电泳图；
[0022] 图2为引物S11、引物S1110和S1120以高、低产牛血液总DNA为模板的扩增结果，其 中M是DNA Maker SM0331分子量标准，条带从上至下依次为10000bp、3000bp、1000bp、 500bp；箭头所指为差异带是S11、S1110和S1120。
【具体实施方式】
[0023] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体 实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是 本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明 内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0025] 1材料与方法
[0026] 1.1试验材料
[0027] 20头高产(305d产奶量>4000kg)和20头低产(305d产奶量<3200kg娟姗牛均由广 西壮族自治区畜牧研究提供，颈静脉采血10mL，EDTA-k2抗凝，-20℃保存。
[0028] 引物及主要试剂：250条S系列随机引物；Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、DNA Marker DL2 000、dNTP及DNA回收试剂盒均由日本TaKaRa公司提供。
[0029] 1.2试验方法
[0030] 1.2.1 DNA提取
[0031] 用DNA提取试剂盒提取奶牛血液总DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测奶牛 个体的DNA浓度，稀释到同一浓度备用。取每个个体等量DNA分别混成高产奶牛DNA池 和低产奶牛DNA池。
[0032] 1.2.2 RAPD反应体系的优化
[0033] 对RAPD反应体系的摸索，设计了模板、引物、dNTPs、Mg 2+、Taq酶、退火
温度、反 应时间等7个不同参数，设置了4～10个浓度梯度。循环参数为：94℃预变性4min；94℃ 变性45s，36℃退火45s，72℃延伸1min，35循环后，72℃延伸10min。扩增产物在1.2％ 的琼脂糖凝胶电泳，电压为5V/cm，电泳缓冲液为0.5×TBE。电泳1～2h后在凝胶成像系 统上检测并拍照。
[0034] PCR反应体系：
[0035]试剂 体积(μl)
Template(基因组DNA 20-50ng/μl) 0.5
10×Buffer(with Mg2+) 2.5
dNTP(各2.5mM) 1
酶 0.2
引物(10uM) 1
加双蒸H2O至 25
[0036] PCR循环条件：
[0037]
[0038] 1.2.3引物的筛选及RAPD-PCR
[0039] 用250条S系列10bp随机引物，分别以高产和低产DNA池为模板进行PCR扩增，扩 增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，从中筛选扩增条带多、重复性好、分辨率高且扩增条带 在高、低产DNA池间有显著差异的引物。经DNA片段的回收、连接、感受态的制备、转 化、质粒DNA的提取及重组质粒的酶切鉴定等环节后，提交上海生工生物工程(上海)股 份有限公司进行测序。
[0040] 1.2.4图谱分析及数据统计处理
[0041] 对扩增图谱观察记录，结果中条带的有和无、强和弱用“1”，“2”，“3”，“4”表示。统计特 异条带并分析。
[0042] 1.2.5生物信息学分析
[0043] 对测序成功的RAPD标记在美国国立卫生研究院(NIH)国家生物学信息中心(NCBI， http：//www.ncbi.nih.nlm.gov/Blast)进行序列同源性分析。
[0044] 2结果与分析
[0045] 2.1 DNA的提取
[0046] 通过采用动物DNA提取试剂盒分别对每个奶样进行总DNA提取，电泳检测总DNA纯 度(图1)，紫外分光光度计检测总DNA浓度。将高产DNA和低产DNA混成高产DNA 池和低产DNA池，并稀释至同一浓度备用。
[0047] 2.2 RAPD多态性分析
[0048] 采用优化后的反应体系对250条S系列随机引物进行PCR扩增。筛选出
稳定性较好、 带型清晰的引物200条。对筛选出的引物在10头奶牛血液总DNA中进行RAPD-PCR， 筛选出在不同个体间有明显差异的RAPD引物3条，分别为S11，S1110和S1120(图2)。
[0049] 2.5高产奶分子遗传标记的测序与分析
[0050] 从图2中可以看出，高产奶组中，S11在478bp和929bp处分别扩增出特异性亮带，S11 在低产奶组中并未扩增出特异性条带。此外在高产奶组中，S1120在669bp处也扩增出一条亮 带，而在低产奶组中并未扩增出特异性条带。在低产奶组中，S1110在458bp处扩增出一条亮 带。从以上结果可以分析，S11所扩增的亮带可以作为高产娟姗牛品种的1遗传标记，S1110 和S1120扩增出的弱带可以作为低产娟姗牛品种的一个遗传标记。
[0051] 2.1.3 RAPD标记检测及其与产奶量相关性分析
[0052] 用筛选到的RAPD引物对所有个体进行PCR检测，根据扩增图谱统计分析后，得到了 3个与奶牛产奶量性状相关的RAPD标记，分别命名为S11，S1110和S1120。其中，S11在 高产奶牛个体中出现，与产奶量呈正相关。标记S1110和S1120在低产奶牛个体中出现，与 产奶量呈负相关。
[0053] 2.1.5生物信息学分析
[0054] 对扩增出的RAPD标记S11，S1110和S1120进行了测序，S11为929bp和478bp，S1110 为458bp，S1120为669bp。同源性分析工作在美国国立卫生研究院(NIH)国家生物学信息 中心(NCBI，http：//www.ncbi.nih.nlm.gov/Blast)完成。经Blast对比分析(表1-4)，结果 发现，在牛的基因中，S11与KX592814.1基因同源性为82％，因此可以推测S11可以作为 一个重要的高产奶分子标记。
[0055] 表1 S11为929bp标记片段与NCBI中基因的同源性对比
[0056]
[0057] 表2 S11为478bp标记片段与NCBI中基因的同源性对比
[0058]
[0059] 表3 S1110为458bp标记片段与NCBI中基因的同源性对比
[0060]
[0061]
[0062] 表4 S1120为669bp标记片段与NCBI中基因的同源性对比
[0063]
[0064] 3讨论与结论
[0065] 娟姗牛乳脂率高和乳蛋白高，
风味醇厚，受到广大群众的喜爱。面对市场上娟姗牛 奶供不应求的情况，如何提高产奶量一直也是娟姗牛育种工作中比较关注的问题。影响产奶 量的因素有很多，其中主要包括遗传、营养、健康水平和环境等[8]。本试验主要从分子水平 上探索与娟姗牛产奶量性状相关的DNA序列并做相应的生物学分析。为此本试验在挑选试 验动物时，确保所选的奶牛的年龄、产奶胎次、产奶时间及在产奶期间的生理健康情况都 大致相同，并给于同一饲养水平和同一饲养环境条件及饲养管理。通过这些试验设计，尽量 较少其他因素的干扰，确保试验能准确可靠的反应DNA水平的差异。本试验用了200条 RAPD引物，共扩出2000多条带，即大约对基因组的近2000多个位点进行了分析，所得 结果可在一定程度上反映基因组的异同。试验结果显示，有S11、S1110和S120这三条带在 高产、低产群体出现差异，因此我们推测这3个DNA片段与产奶量有关，其中S11与产奶 量性状正相关，S1110和S120与产奶量性状呈负相关。因此在研究高产娟姗牛培育的过程中， 这三个基因片段可作为产奶量辅助选择的遗传标记。
[0066] 4验证试验
[0067] 在广西畜牧研究所试验牛场中，分出6
块面积为1亩的养殖牛场，养殖场的条件相同， 喂养的
饲料均为本研究所购买的膨化大豆、辅料、大豆皮、苜蓿甘草、玉米秸秆、象草配合 后的饲料，饲料由专人饲喂和管理；分别设立6个组，1-3试验组为采用本
申请的技术方案选 育出的高产奶的娟姗牛母牛，每个试验组30头，1-3对照组为未经过选育的娟姗牛母牛，每 个对照组30头；
[0068] 试验对比为娟姗牛的年龄相同，胎次相同，体重相同(偏差±50g)，对试验组和对照组 进行养殖至泌乳期，检测产奶量和乳成分指标；
[0069] 泌乳高峰期采奶60天(保证泌乳期存活30头奶牛)，每日两次
挤奶各采一次，凌晨2:00 和下午2:00，记录每天两次的产奶量之和，将1-6组检测70天的总和/中头数＝每头的产奶量； 并将每组在采奶的第15、30、60天的奶取样后送到牛奶分析实验室，由专人进行检测分析。 通常测定牛奶中的乳脂肪、乳蛋白、乳糖含量，具体数据见表5、6：
[0070] 表5
[0071]组别 60d产奶量总和/kg 头数/只 产奶量/(kg/只)
试验组1 32412.2 30 1080.4
试验组2 32310.4 30 1077.0
试验组3 32248.9 30 1075.0
对照组1 25310.2 30 843.7
对照组2 23540.2 30 784.7
对照组3 21896.5 30 729.9
[0072] 由上表可知，采用本申请选育后能准确的确定娟姗牛为高产奶娟姗牛，这也就是为什么 同样条件下，试验组1-3产奶量要高于对照组1-3。
[0073] 表6
[0074]
[0075]
[0076] 由上表可知，采用本申请选育后的高产奶的娟姗牛的产奶品质相比较对照组1-3的产奶 品质优异。
[0077] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此， 本发明的保护范围应以所附
权利要求为准。
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
