技术领域
[0001] 本
发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种基于激光诱导
荧光(Laser Induced Fluorescence，LIF)法的航天器总装环境空气
真菌、细菌含量实时检测方法。
背景技术
[0002] 目前，微生物检测比较常用的手段为现场
采样后使用培养基进行培养计数(GB 4789.2-2010)。该方法需要将样品采集到培养基上，经恒温培养数日，然后人工计数获得细菌、真菌菌落总数。采用这种方式耗时长，时效性差，无法及时的反应微生物真、细菌含量，且当空气中微生物含量较大时，如采样量过大，由于培养基的限制，会出现生长出的菌落数量过密无法统计的情况。
[0003] 除国标法外，目前微生物检测还有一种光学检测方法——激光诱导荧光法(参考文献：《激光诱导荧光技术及其在生物仪器中的应用》)，激光诱导荧光法原理是用特定
波长的
激光束照射待检测空气中的颗粒物，所有的活性、非活性粒子均发生米氏散射，散射光束经光学聚焦后由散射检测器检出并转换为电
信号，经过后续的
算法处理后，获得颗粒物的大小和浓度信息。同时激光光束激发空气中活性颗粒(微生物体)内所含的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen，NADH)，核黄素和吡啶二
羧酸(孢子)等发出荧光，经光学聚焦后被荧光检测器检出并转换为
电信号，经后续处理后获得微生物的含量信息，此技术已得到较为成熟的应用，但存在一定的
缺陷，无法区分微生物中真菌、细菌含量。
[0004] 上述两种方法均存在一定的局限性，无法实现空气中的真菌、细菌含量的实时检测(国标法可检测真菌、细菌数量，但检测周期很长，激光诱导荧光法只能得到微生物总数，无法区分真菌、细菌)。细菌和真菌虽同属微生物，但在形态和特性上却有着很大的不同。其中最重要的区别是细菌没有核膜包围形成的细胞核，属于原核生物；真菌有核膜包围形成的细胞核，属于真核生物。一般来说，原核细胞尺寸较小，直径一般为1μm-10μm；真核细胞较大，直径一般为10μm-100μm。由此从微生物大小尺寸的
角度，寻找真菌、细菌的比例与微生物大小的比例之间的相关关系，可通过设置不同的
开关值(如10μm)来区分真菌、细菌。本发明提出一种基于激光诱导荧光技术的航天器总装环境空气真菌、细菌含量实时检测方法，该方法通过基于激光诱导荧光法和培养法两种检测方法在同一地点同时采样分析，分别获得微生物数据，对两组数据比对获得函数对应关系，应用该函数关系，可直接应用激光诱导荧光技术实时获得空气微生物中真、细菌含量，为制定微生物控制方案及采取控制措施提供实时数据支持。
发明内容
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于激光诱导荧光法的航天器总装环境空气真菌、细菌实时检测方法，解决了现有采集方法不能实时获得真菌、细菌数量的问题。
[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] 航天器总装环境空气微生物中细菌、真菌含量的实时检测方法，包括如下步骤：
[0008] 1)利用基于激光诱导荧光法的检测设备，检测获得微生物的直径大小和数量信息，微生物不区分真菌和细菌；
[0009] 2)进行步骤1)的同时，在同一时间、相同地点利用国标法对空气采样，封装后到实验室进行培养，得到真菌和细菌含量；
[0010] 3)在多个地点进行步骤1)、步骤2)两种方法检测工作，分别获得数据；
[0011] 4)将步骤2)培养获得的数据按微生物直径大小区分出真菌及细菌两组数据，并与步骤1)获得的对应真菌和细菌数据进行对比，基于激光诱导荧光法检测的真菌、细菌数量与国标法中培养采集获得的细菌和真菌数值在各次检测中应一致或接近；
[0012] 5)将步骤4)获得的基于激光诱导荧光法的检测设备采集的细菌和真菌数量与国标法中培养采集获得的细菌和真菌数量数据形成对应关系，分别利用插值方法获得两种采集方法细菌和真菌各自对应的函数关系并存储；
[0013] 6)当需要实时检测空气中细菌、真菌含量时，利用基于激光诱导荧光法的检测设备实时采集空气微生物总数及粒径数据，通过步骤4)获得的细菌和真菌的
临界点10μm和步骤5)获得的函数关系，根据需要计算得到国标法中培养获得的细菌和真菌含量参考值。
[0014] 上述技术方案中，基于激光诱导荧光法的检测设备为利用激光诱导荧光法和米氏散射原理，获得微生物的大小和浓度信息的实时监测设备。
[0015] 上述技术方案中，基于激光诱导荧光法的检测设备采集和国标法采集应尽量确保采集状态的一致性(采集环境、采集时间、地点等)。
[0016] 上述技术方案中，为确保得到的数据具有统计学意义，采样比对次数应尽可能大，采样状态应尽可能多。
[0017] 其中，利用插值方法获得两种采集方法细菌、真菌各自对应的函数关系可随着比对数据的增多而进行修正。
[0018] 本发明提出的基于激光诱导荧光法的航天器总装环境空气真菌、细菌实时检测方法可达到以下效果：
[0019] 1)可实时获取航天器总装环境空气真菌、细菌各自含量；
[0020] 2)检测过程自动化，无需人工参与，数据可靠，效率高；
附图说明
[0021] 图1是国标法(即传统培养法)和荧光法检测到的微生物总数对比图；
[0022] 图2是传统培养法和荧光法检测到的细菌结果对比图；
[0023] 图3是传统培养法和荧光法检测到的真菌结果对比图；
[0024] 图4是传统培养法、荧光法对微生物总量检测结果的线性拟合曲线；
[0025] 图5是传统培养法、荧光法对细菌含量检测结果的线性拟合曲线；
[0026] 图6是传统培养法、荧光法对真菌含量检测结果的多项式函数拟合曲线；
[0027] 图7是传统培养法与荧光法对细菌测量结果的标准差对比图；
[0028] 图8是传统培养法与荧光法对真菌测量结果的标准差对比图。
具体实施方式
[0029] 以下结合附图对本发明作进一步详细说明，但这仅仅是示例性的，并不旨在对本发明的保护范围进行任何限制。
[0030] 本发明的航天器总装环境空气微生物中细菌、真菌含量的实时检测方法，首先利用基于激光诱导荧光法的检测设备，检测获得微生物的直径大小和数量信息，微生物不区分真菌和细菌；同时，在同一时间、相同地点利用国标法对空气采样，封装后到实验室进行培养，得到真菌和细菌含量；接着在多个地点进行上述两种方法检测工作，分别获得数据；将传统培养法培养获得的数据按微生物直径大小区分出真菌及细菌两组数据，并与荧光法获得的对应真菌和细菌数据进行对比，得出结果如下表6-1、6-2所示。
[0031] 表6-1培养法检测结果
[0032]
[0033] 注：表中AM、PM、N分别代表测试时间上午、下午、晚上，地点1-6代表6个不同测试地点，下同。
[0034] 表6-2荧光法检测结果
[0035]
[0036] 在数据分析前，将所有无效数据删除，最终结果如下表：
[0037] 表6-3培养法、荧光法以及空气尘埃粒子数检测结果
[0038]
[0039] 注：表中AM、PM、N分别代表测试时间上午、下午、晚上，地点1-6代表6个不同测试地点，AM1即代表上午在采样点1进行的采样，下同。将表格6-3中的数据绘制成图表，分别对培养法和荧光法测量的微生物总数、细菌数、真菌数进行对比，结果如图1、2、3所示。
[0040] 从图1中可以看出两种方法具有良好的对应关系。各测试点的差值均较小，变化趋势保持一致，基本说明两种检测方法对于微生物总数的检测结果的一致性。
[0041] 从图2可以看出，两种测试方法对于细菌总数的测量也具有很好的一致性。其中AM1点(地点1，上午测)的差别较其他点更加显著。对此点的测试过程进行分析发现，地点1为AIT厂房A区中部，在所有测试点中属于洁净度高，微生物含量低的采样点，PM1、N1点的测试结果也证明了这一点。所以推断该点处培养法测试结果存在较大误差的可能性更高。
[0042] 从图3中可以看出，相比于微生物总数对比和细菌数量对比而言，真菌的一致性稍差，但变化趋势仍然保持一致。无论培养法还是荧光法，检测到的真菌数量都远小于微生物总量和细菌数量，甚至培养法在N1、PM1点出现检测结果为零的情况，AM2、PM2点的检测结果也小于1，这说明AIT场房环境下的真菌含量接近培养法检测的下极限，会出现检测不出的情况。与此相比，荧光法在真菌含量较低的条件下灵敏度较高。
[0043] 为方便根据荧光法的检测数据给出符合国标法计量单位的检测结果。对两种检测方法所测量的结果进行函数关系拟合，找出两种检测方法之间的映射关系，微生物总量和细菌数量采用了线性拟合，真菌含量采用了幂函数拟合(y代表培养法的检测值，x代表荧光法的检测值)，结果如图4、5、6所示。
[0044] 从图4可以看出，微生物总量检测值：
[0045] y＝0.0039x-0.846
[0046] R2＝0.9721
[0047] 从图5可以看出，细菌检测值：
[0048] y＝0.0033x-5.481
[0049] R2＝0.913
[0050] 从图6可以看出，真菌检测值：
[0051] y＝4×10-10×x3+3×10-6×x2+0.0104×x-5.3959
[0052] R2＝0.8735
[0053] 通过以上拟合函数，可以很好地建立两种检测方法的对应关系。
[0054] 前面介绍的测量值均为每点平行测量三次取平均的值，为探究培养法和荧光法的重复性特性，就每点的三次测量结果的标准差进行分析，得出结果如表6-4、6-5。
[0055] 表6-4培养法与荧光法对细菌测量结果的标准差
[0056]
[0057] 注：表中平板1、2、3是指同一采样点进行的三次重复采样不同培养皿编号，下同。
[0058] 表6-5培养法与荧光法对真菌测量结果的标准差
[0059]
[0060]
[0061] 将上述两个表格数据绘制成图，得到图7、8。
[0062] 由图7、图8可以看出，两种检测方法的重复性特性相近，并且随着真细菌含量的增加，测量值的标准差增大，标准差与均值的比值降低。两种方法区别不大。
[0063] 本发明提出的方法可以解决现有采集方法不能实时获得真菌、细菌数量的问题，从而在空气中真菌、细菌数量指标超标时，能够采取有针对性的措施，及时进行控制。
[0064] 本具体
实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，相关技术人员在阅读完本
说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的
修改，但只要在使用发明的
权利要求范围内都受到
专利法的保护。
