[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种硝磺草酮硝基还原酶Xhnr、其编码基因及用途。

[0002] 抗除草剂转基因工程的应用在保证农作物安全前提下高效低成本地控制农田杂草，开创了一个全新的农田杂草控制时代。目前推广种植的绝大部分是抗草甘膦转基因作物，在2017年，全球抗草甘膦转基因作物面积已达1.5亿公顷，占全球转基因作物种植面积的80%以上。但是，长期使用草甘膦带来了严重的杂草抗性问题，全世界迄今已报道40多种主要农田杂草对草甘膦产生了抗药性，导致杂草无法防治。解决这一问题的有效措施之一就是同时使用不同杀草机制的除草剂，并与之配套构建相应的抗除草剂转基因作物。因此，需要广泛发掘各种除草剂的抗性基因，为构建抗各种除草剂的转基因作物提供基因资源。

[0003] 对羟基苯丙酮酸双加氧酶（4‑Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD EC1.13.11.27）是植物和部分细菌体内中参与酪氨酸代谢的关键酶，酪氨酸在酪氨酸氨基转移酶（tyrosine aminotransferase，TAT）的作用下生成对羟基苯丙酮酸（4‑hydroxyphenylpyruvic acid，4‑HPP），随后在HPPD催化下转化为尿黑酸（homogentisic acid，HGA），HGA是植物中质体醌和生育酚生物合成的一个关键前体，而质体醌是光合电子传递链组成部分，生育酚则是植物体内重要的抗氧化物质。HPPD抑制剂类除草剂竞争抑制HPPD的活性，使HGA的合成受阻，进而无法合成质体醌和生育酚，导致植物产生白化症状而死亡。因此这一催化反应也使得HPPD被开发为重要的除草剂靶标酶。

[0004] HPPD抑制剂类除草剂按照化学结构主要分为三酮类、异恶唑类和苯吡唑类。硝磺草酮（mesotrione）又名甲基磺草酮，是由先正达（Syngenta）公司于1984年开发的三酮类除草剂，能防治大多数阔叶杂草及少数禾本科杂草。自2001年上市以来，硝磺草酮现已成为全球第一大HPPD抑制剂类除草剂，在2016年全球的销售额为6.50亿美元。硝磺草酮具有高效、低毒、作物安全性高、相对环境相容性好等优点，同时由于杂草对该类除草剂抗性发展缓慢，被认为是理想的抗除草剂转基因靶标除草剂。因此，获得新的性能优良的硝磺草酮降解脱毒/抗性基因对研发硝磺草酮污染生物修复技术及构建能够使硝磺草酮降解脱毒的转基因作物具有非常重要的理论和实际应用价值。

[0005] 本发明的目的是提供一种硝磺草酮硝基还原酶Xhnr、其编码基因及用途，以解决现有技术的不足。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明第一方面提供了一种硝磺草酮硝基还原酶Xhnr，其氨基酸序列如SEQ ID 
NO.2所示。

[0007] 本发明第二方面提供了上述硝磺草酮硝基还原酶Xhnr的编码基因xhnr。

[0008] 进一步地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 本发明第三方面提供了上述编码基因xhnr的重组表达载体。

[0010] 进一步地，是将上述编码基因xhnr重组到原始载体所得，所述的原始载体包括pET‑28a（+）。

[0011] 本发明第四方面提供了上述编码基因xhnr的基因工程菌。

[0012] 进一步地，所述的基因工程菌的表达菌株包括大肠杆菌BL21（DE3）。

[0013] 本发明第五方面提供了上述硝磺草酮硝基还原酶Xhnr在硝磺草酮生物降解脱毒、生物修复中的应用。

[0014] 本发明第六方面提供了上述编码基因xhnr在硝磺草酮生物降解脱毒、生物修复中的应用。

[0015] 本发明的有益效果：本发明提供了一个硝磺草酮硝基还原酶Xhnr，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因xhnr核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。硝磺草酮硝基还原酶Xhnr与已报道的硝基还原酶同源性最高仅为53.1%，因此是一个新的硝基还原酶。硝磺草酮硝基还原酶Xhnr能够将硝磺草酮降解为产物AMBA而失去除草活性。本发明硝磺草酮硝基还原酶Xhnr及其编码基因在硝磺草酮生物降解脱毒和生物修复中具有潜在应用价值。
附图说明

[0016] 图1为菌株EMD‑1菌落照片。

[0017] 图2为菌株EMD‑1基于16S rRNA基因构建的系统发育树。

[0018] 图3为菌株EMD‑1降解硝磺草酮的紫外扫描检测结果图。蓝色箭头所示为硝磺草酮的特征吸收峰（270nm）。

[0019] 图4为外源表达的Xhnr SDS‑PAGE检测结果图。泳道1，蛋白Maker；泳道2，100mM咪唑洗脱的Xhnr蛋白；泳道3，200mM咪唑洗脱的Xhnr蛋白。

[0020] 图5为Xhnr降解硝磺草酮的HPLC检测。A，硝磺草酮标准品；B，AMBA标准品；C，反应0 h；D，反应1 h。

[0021] 图6为Xhnr‑6降解硝磺草酮的产物对水稻HPPD（OsHPPD）的抑制效果图。A，阴性对照，加入BL21（pET‑29a‑OsHPPD），不加入底物酪氨酸，没有HPPD活性；B，阳性对照，加入BL21（pET‑29a‑OsHPPD）和底物酪氨酸，有HPPD活性；C，加入BL21（pET‑29a‑OsHPPD）、底物酪氨酸和硝磺草酮，HPPD活性完全被硝磺草酮抑制；D，加入BL21（pET‑29a‑OsHPPD）、底物酪氨酸和Xhnr降解硝磺草酮的产物，有HPPD活性，跟阳性对照没有显著差异，说明该产物不抑制HPPD活性。

[0022] 下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

[0023] 以下实施例涉及的培养基配方如下：基础盐液体培养基（1L体系）：0.5 g KH2PO4，1.5 g K2HPO4•3H2O，1.0 g NH4NO3，
0.5 g NaCl，0.2 g MgSO4•7H2O，pH7.0。

[0024] LB液体培养基（1L体系）：5 g 酵母提取物，10 g蛋白胨，10 g氯化钠， pH7.0。LB培养基在此基础上加15g琼脂粉。

[0025] 实施例1 硝磺草酮降解菌株的分离及其硝基还原酶基因的查找1.1 硝磺草酮降解菌株的富集分离和分类鉴定
从某生产硝磺草酮的农药厂下水道采集污泥样品，将5 g污泥样品加入100 mL含
有50 mg/L硝磺草酮的基础盐液体培养基中，30°C、160 rpm振荡培养约10 d后，以10v/v%的接种量转接到含有100 mg/L硝磺草酮的基础盐液体培养基中，再30°C、160 rpm振荡培养约
10d。这样连续转接培养4次，利用紫外扫描检测硝磺草酮的降解情况（硝磺草酮在紫外区‑4 ‑5
270 nm有特征吸收峰）。将有明显降解效果的富集液进行梯度稀释，吸取1 mL 10 、10 和‑6
10 的稀释液涂布LB培养基平板，30℃培养3‑4 d。挑取平板上的不同形态的单菌落，进一步在LB培养基平板上划线纯化，将得到的纯菌株接种于加有100 mg/L硝磺草酮的基础盐液体培养基中，30℃、150 rpm 培养5 d，利用紫外扫描检测各纯菌株是否有硝磺草酮降解功能。

[0026] 通过富集驯化分离筛选得到一株硝磺草酮降解菌，命名为EMD‑1。菌株EMD‑1在LB培养基平板上于30℃生长4 d后，如图1所示，菌落呈白色、湿润、光滑、边缘圆整，直径约为3 mm；菌体细胞杆状（0.6–0.8×2.0–3.5 µm）；革兰氏染色阴性，不产芽孢。以菌株EMD‑1的基因组DNA为模板，细菌16S rRNA基因序列通用引物（27F（SEQ ID NO.4）：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’ 和1492R（SEQ ID NO.5）：5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’）进行PCR扩增，得到长度为1450 bp的16S rRNA基因序列（其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示）。在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和EZtaxon数据库(http://eztaxon‑e.ezbiocloud.net/ezt)中进行Blast，结果表明菌株EMD‑1与鞘鞍醇杆菌属（Sphingobacterium）菌株亲缘关系最近，与模式菌株Sphingobacterium
T
psychroaquaticum MOL‑1 的同源性最高（98.9%）。在基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树上，菌株EMD‑1也聚类在Sphingobacterium属（图1），因此将菌株EMD‑1鉴定为 Sphingobacterium属。

[0027] 1.2 菌株EMD‑1对硝磺草酮的降解降解特性的研究：将EMD‑1接种至LB液体培养基，30℃、150 rpm培养至对数中期，
6000 g离心10 min，收集菌体，菌体用新鲜、无菌基础盐液体培养基洗涤2遍，重悬于基础盐
9
液体培养基中，用基础盐液体培养基调节细胞浓度约为1.0×10 cfu/mL，按1%（v/v）接种量，接种到20 mL含有100 mg/L硝磺草酮的基础盐液体培养基中，30℃、150 rpm培养72 h。
取样用紫外扫描测定菌株对硝磺草酮的降解情况。

[0028] 紫外扫描结果表明硝磺草酮在270 nm处有特征吸收峰，随着培养时间的延长，样品中的硝磺草酮特征吸收峰逐渐下降，表明菌株EMD‑1能够降解硝磺草酮（图3）。培养72 h后的取样测定结果表明，菌株EMD‑1能够降解72.9%的硝磺草酮。

[0029] 实施例2 硝磺草酮硝基还原酶基因xhnr克隆2.1 菌株EMD‑1基因组测序和硝基还原酶查找
微生物降解硝磺草酮的起始步骤为硝基还原，本研究拟通过对菌株EMD‑1基因组
分析来确定疑似的硝磺草酮硝基还原酶基因。利用高通量测序技术（HiSeq 4000 sequencer system，Illumina）对菌株EMD‑1进行基因组测序，利用RAST（Rapid Annotation with Subsystem Technology）对该基因组进行基因注释。该菌基因组大小为6.5 Mb，编码
5210个ORF，通过对这些ORF的可能的功能分析，发现一个疑似的硝基还原酶基因，命名为xhnr，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，大小为 675 bp，编码一个224个氨基酸的蛋白（Xhnr），如SEQ ID NO.2 所示。在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）的swissprot数据库比对结果表明，与Xhnr相似性最高的为硝基还原酶Bacillus subtilis oxygen‑insensitive NADPH nitroreductase YfkO，同源性仅为53.1%。

[0030] 2.2 构建硝磺草酮硝基还原酶基因xhnr重组表达载体xhnr基因重组表达载体pET‑28a‑xhnr，由北京擎科生物科技股份有限公司按下表的要求合成得到。其中，xhnr基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0031]目的基因 xhnr
目标载体（原始载体） pET‑28a（+）
目标载体5’端酶切位点 NdeI
目标载体3’端酶切位点 XhoI
将上述合成的xhnr基因重组表达载体pET‑28a‑xhnr转入大肠杆菌表达菌株大肠
杆菌BL21（DE3）中。挑取转化子至含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180 rpm振荡培养，测序验证是否正确，将获得的测序正确的重组表达菌株命名为BL21（pet‑28a‑xhnr）。

[0032] 实施例3 硝磺草酮硝基还原酶Xhnr的功能验证3.1 Xhnr的表达与纯化
BL21（pet‑28a‑xhnr）在100 mL LB液体培养基中，37℃、150 rpm摇床培养至OD600为0.4‑0.6，然后加异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至浓度0.05 mM，16°C、150 rpm诱导培养8 h。将诱导培养得到的菌液6000 g离心10 min，收集菌体，采用PBS缓冲液（50 mM、pH 7.4）将菌体洗两遍，用10  mL的PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎(Auto Science，UH‑650B ultrasonic processor，30% intensity) 5‑10 min，12000 rpm 离心30 min，收集上清，用
2+
Co 离子亲和层析柱对Xhnr进行纯化，纯化的Xhnr蛋白进行SDS‑PAGE电泳（100mM咪唑、
200mM咪唑洗脱蛋白）以检测其纯度。SDS‑PAGE电泳结果见图4，表明纯化的蛋白在25‑35kDa处有清晰的条带，与Xhnr的理论大小一致（Xhnr加上20个载体重组氨基酸和6个组氨酸标签理论大小为26.8kDa），泳道中未见其它明显的杂带，说明获得了纯的Xhnr蛋白。

[0033] 3.2 Xhnr的酶活检测酶活反应体系（3 mL）：20 mM Tris‑HCl缓冲液（pH 7.5），100 μM硝磺草酮，1 mM 
2+
NADH，25 mM Mg ，反应酶量100 μL（含1 μg纯化的Xhnr），30℃反应1 h。每个反应以加入酶开始计时，1 h后于沸水中放置1 min，终止反应。反应液冷冻干燥（‑30℃、0.2 mbar、24 h）后加入200 μl甲醇以溶解冻干物。HPLC检测底物（硝磺草酮）的减少量。一个酶活力单位（U）定义为：在pH 7.5、30℃条件下，每min催化减少1 μM硝磺草酮所需的酶量。Xhnr对硝磺草酮降解的HPLC分析结果如图5所示，结果表明，硝磺草酮在10 min有特征吸收峰，而2‑氨基‑4‑甲磺酰基苯甲酸（AMBA）在4 min有特征吸收峰；酶反应1 h后，硝磺草酮的吸收峰显著下降，同时，出现了AMBA的特征吸收峰，说明Xhnr能够将硝基磺草酮还原为AMBA，具有硝磺草酮硝基还原酶活性，对硝磺草酮的比酶活为1.02 U/μg protein。

[0034] 实施例4 Xhnr对硝磺草酮降解脱毒效果实验原理：大肠杆菌BL21（DE3）自身有酪氨酸转移酶活性，可以将酪氨酸转化为4‑HPP，导入了外源HPPD的重组表达菌株在含有酪氨酸的LB液体培养基能够将酪氨酸转化为
4‑HPP，并继续将4‑HPP转化为HGA，生成的HGA自发氧化和聚合后产生红褐色物质，因此，可以通过颜色的深浅判断HPPD的活性。重组表达菌株BL21（pET‑29a‑OsHPPD），其导入了对硝磺草酮极敏感的水稻HPPD（OsHPPD）（重组表达菌株BL21（pET‑29a‑OsHPPD）的构建参考
2.2），因此在本试验中用其来检测硝磺草酮及其降解产物对OsHPPD的抑制活性。

[0035] 在100 mL酶反应体系中，加入硝磺草酮使终浓度为16 μM，然后加入60 μg纯化的Xhnr，于30℃水浴锅中反应5‑6 h，以使硝磺草酮完全降解，于沸水中放置1 min，终止反应。酶反应液冷冻干燥后加入2 mL甲醇溶解冻干物，然后甲醇溶解液自然挥发，残留物用去离子水溶解得到Xhnr降解硝磺草酮的产物AMBA。

[0036] 将重组表达菌株BL21（pET‑29a‑OsHPPD）培养至对数生长期（OD600约1.0），取20 μL接种于添加了200 μL含有0.1w/v%酪氨酸的LB液体培养基的96孔板中同时加入终浓度为10 mM的诱导剂IPTG，然后加入终浓度为16 μM的硝磺草酮或终浓度为16 μM的Xhnr降解硝磺草酮的产物，30℃、150 rpm振荡培养36 h后观察不同处理下的颜色变化情况。同时设置加入BL21（pET‑29a‑OsHPPD）、不加入底物酪氨酸的阴性对照，和加入BL21（pET‑29a‑OsHPPD）、底物酪氨酸的阳性对照。结果如图6所示，未加入硝磺草酮的阳性对照颜色呈红色，表明OsHPPD正常表达且具有活性（图6B）；而加入16 μM硝磺草酮的处理跟阴性对照（图6A）一样呈淡黄色，表明OsHPPD活性已经完全被抑制（图6C）；而加入Xhnr降解硝磺草酮的产物的处理呈现红色（图6D），和未加入硝磺草酮的阳性对照（图6B）没有显著差异，表明Xhnr降解硝磺草酮的产物对OsHPPD无抑制效果。因此，Xhnr可以将硝磺草酮完全转化为对OsHPPD没有抑制效果的产物，实现对硝磺草酮的降解脱毒。

[0037] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。