一种抗菌肽复合水凝胶及其制备方法和应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202410418276.5 | 申请日 | 2024-04-09 |
| 公开(公告)号 | CN118185081A | 公开(公告)日 | 2024-06-14 |
| 申请人 | 宁波大学; 宁波市产品食品质量检验研究院(宁波市纤维检验所); | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 刘亚楠; 斯沙; 赵丹; 罗小虎; 于世娇; 桑尚源; 张鑫; 贾玲玲; | 第一发明人 | 刘亚楠 |
| 权利人 | 宁波大学,宁波市产品食品质量检验研究院(宁波市纤维检验所) | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 宁波大学,宁波市产品食品质量检验研究院(宁波市纤维检验所) | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：浙江省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：浙江省宁波市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：浙江省宁波市江北区风华路818号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：315211 |
| 主IPC国际分类 | C08J3/24 | 所有IPC国际分类 | C08J3/24 ; C08J3/075 ; C08L29/04 ; C08L1/02 ; C08K5/45 ; C08K3/38 |
| 专利引用数量 | 4 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 9 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京万胜达专利代理事务所 | 专利代理人 | 罗伟伟; |
| 摘要 | 本 发明 涉及食品保鲜技术领域，尤其涉及一种抗菌肽复合 水 凝胶及其制备方法和应用。本发明将聚乙烯醇溶液、细菌 纤维 素悬液和抗菌肽FengycinA‑M3水溶液混合，得到水凝胶的前体溶液；然后将水凝胶的前体溶液和 硼 砂溶液混合后形成抗菌肽复合水凝胶；该抗菌肽 复合材料 具有优良机械性能、 生物 相容性 和抗菌性能，可以作为 食品 包装 材料用于食品保鲜中。 | ||
| 权利要求 | 1.一种抗菌肽复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包含如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种抗菌肽复合水凝胶及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及食品保鲜技术领域，尤其涉及一种抗菌肽复合水凝胶及其制备方法和应用。 背景技术[0002] 水凝胶是由亲水性物质的物理或化学交联形成的三维(3D)聚合物网络。由于其独特的结构，它被广泛用于许多应用，例如伤口愈合敷料、药物递送载体和食品包装材料。其特有的溶胀特性、机械阻力和生物降解性使水凝胶成为传统包装的绝佳替代品，可有效阻隔氧气、控制食品水分甚至提供抗菌活性。聚乙烯醇(PVA)是一种水溶性新型环保材料，近年来已成功用作水凝胶的基体。微生物实验证实，PVA不能抑制微生物的生长，可以完全降解。PVA水凝胶力学性能欠佳，不能很好地保护食品，通常需引入第二种聚合物基体进行复合。细菌纤维素(BC)作为一种理想的增强纳米填料，由于其优异的机械强度、超细原纤维3D网络、高纵横比和大表面积而被用于增强水凝胶。与常规纤维素或纤维素纳米纤维相比，细菌纤维素的高纯度和良好的生物相容性使得其更适用于食品包装材料。但是，BC水凝胶与PVA水凝胶一样，缺乏抗菌能力，这限制了它们作为食品抗菌保鲜的应用。抗菌肽(AMP)是小阳离子肽，已被公认为是有广泛应用前景的抗菌化合物，用于新鲜食品保鲜以抑制微生物生长。研究表明AMP对细菌、真菌、病毒和寄生虫具有广谱抗菌活性。与微生物中靶标数量有限的传统抗菌剂相比，AMP具有广泛的靶标，这是避免耐药性发展问题的有力策略。 [0003] 抗菌肽水凝胶的物理化学性质高度依赖于交联方法。制备水凝胶的关键是交联法。根据聚合物链之间交联形成的键类型，水凝胶的制备技术可分为物理交联法和化学交联法。物理交联抗菌肽水凝胶具有生物医学安全性，从而避免了未反应的化学交联剂的潜在细胞毒性，同时其在室温下具有自愈和可注射特性，但其机械性能较差。在化学交联抗菌肽水凝胶的聚合物链之间通常形成共价键，与物理交联水凝胶相比，它们的大部分键都是强而持久的。化学交联水凝胶通常在生理条件下表现出更强的稳定性、优异的机械性能以及可调节的降解行为。但由于化学交联水凝胶可能会用到一些有毒的化学交联剂，可能存在潜在的毒性。 [0004] 因此，如何利用物理‑化学双交联的方法，制备一种具有优良机械性能、生物相容性和抗菌性能的抗菌肽复合水凝胶，并将其应用于食品保鲜材料中成为本领域亟待解决的技术问题。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种抗菌肽复合水凝胶及其制备方法和应用，以解决现有技术中存在的问题。 [0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0007] 本发明提供了一种抗菌肽复合水凝胶的制备方法，包含如下步骤： [0008] 步骤1)将聚乙烯醇溶液、细菌纤维素悬液和抗菌肽FengycinA‑M3水溶液混合，得到水凝胶的前体溶液； [0009] 步骤2)将水凝胶的前体溶液和硼砂溶液混合后形成抗菌肽复合水凝胶； [0010] 所述抗菌肽FengycinA‑M3的序列为(CH2)16‑Arg‑Arg‑Tyr‑Thr‑Arg‑Ala‑Pro‑Arg‑Tyr‑Ile。 [0011] 优选的，所述聚乙烯醇溶液的浓度为5～15wt％。 [0012] 优选的，所述细菌纤维素悬液的固含量为0.75％。 [0013] 优选的，所述抗菌肽FengycinA‑M3水溶液的浓度为256～1024μg/mL。 [0014] 优选的，所述聚乙烯醇溶液、细菌纤维素悬液和抗菌肽FengycinA‑M3水溶液的体积比为1～3:1:1。 [0015] 优选的，所述硼砂溶液的浓度为0.05～0.2mol/mL。 [0016] 优选的，所述硼砂溶液和水凝胶的前体溶液的体积比为1:4～5。 [0017] 本发明还提供了上述的抗菌肽复合水凝胶的制备方法制备得到的抗菌肽复合水凝胶。 [0018] 本发明还提供了上述的抗菌肽复合水凝胶在食品保鲜材料中的应用。 [0019] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： [0020] 本发明利用物理和化学双交联策略相结合所形成的双网络抗菌肽水凝胶将有利于获得水凝胶的平衡性质，通过物理‑化学双交联策略，结合抗菌肽FengycinA‑M3、细菌纤维素(BC)及聚乙烯醇(PVA)，并用十水四硼酸钠作为交联剂，制备一种FengycinA‑M3@细菌纤维素@聚乙烯醇复合水凝胶。聚乙烯醇作为水凝胶基体，细菌纤维素用于改善水凝胶机械性能，FengycinA‑M3作为抗菌剂加载到水凝胶体系中，赋予水凝胶抗菌性能，并增加抗菌肽自身稳定性。硼砂在PVA、BC、FengycinA‑M3之间起到交联剂的作用，导致动态硼酸酯键的形成，同时不同组分之间的氢键相互作用产生了水凝胶网络。 [0022] 图1为实施例1制备的AMP@BC@PVA复合水凝胶在不同放大倍数下的SEM图； [0023] 图2为BC基质在不同放大倍数下的SEM图； [0024] 图3为对比例1制备的PVA水凝胶在不同放大倍数下的SEM图； [0025] 图4为对比例2制备的BC@PVA复合水凝胶在不同放大倍数下的SEM图； [0026] 图5为实施例1制备的水凝胶、对比例1‑2制备的水凝胶、BC基质和纯AMP粉末的红外光谱图； [0027] 图6为制备例制备的抗菌肽FengycinA‑M3的HPLC分析图。 具体实施方式[0028] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。 [0029] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。 [0030] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。 [0031] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。 [0032] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。 [0033] 本发明中所述的“室温”、“常温”如无特别说明，均按25±2℃计。 [0034] 本发明以下实施例所用原料均为市售所得。 [0035] 本发明提供了一种抗菌肽复合水凝胶的制备方法，包含如下步骤： [0036] 步骤1)将聚乙烯醇溶液、细菌纤维素悬液和抗菌肽FengycinA‑M3水溶液混合，得到水凝胶的前体溶液； [0037] 步骤2)将水凝胶的前体溶液和硼砂溶液混合后形成抗菌肽复合水凝胶； [0038] 所述抗菌肽FengycinA‑M3的序列为(CH2)16‑Arg‑Arg‑Tyr‑Thr‑Arg‑Ala‑Pro‑Arg‑Tyr‑Ile。 [0039] 在本发明中，所述抗菌肽FengycinA‑M3的结构序列为(CH2)16‑Arg‑Arg‑Tyr‑Thr‑Arg‑Ala‑Pro‑Arg‑Tyr‑Ile或(CH2)16‑RRYTRAPRYI； [0040] 其中，Arg或R表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基； [0041] Tyr或Y表示英文名称为Tyrosine，中文名称为酪氨酸的氨基酸的相应残基； [0042] Thr或T表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基； [0043] Ala或A表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基； [0044] Pro或P表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基； [0045] Ile或I表示英文名称为Isoleucine，中文名称为异亮氨酸的氨基酸的相应残基。 [0046] 在本发明中，步骤1)的具体混合方式为： [0047] 将聚乙烯醇溶液、细菌纤维素悬液和抗菌肽FengycinA‑M3水溶液混合，不断搅拌直至混合物混合均匀，得到水凝胶的前体溶液。 [0048] 在本发明中，步骤2)的具体混合方式为： [0049] 将硼砂溶液加入水凝胶的前体溶液中，常温下不断搅拌直至形成均匀的FengycinA‑M3@细菌纤维素@聚乙烯醇复合水凝胶即抗菌肽复合水凝胶。 [0050] 在本发明中，细菌纤维素悬液购自桂林奇宏科技有限公司(固含量为0.75％)。 [0051] 在本发明中，FengycinA‑M3抗菌肽粉末溶于去离子水中，制成FengycinA‑M3水溶液。 [0052] 在本发明中，将聚乙烯醇加到去离子水中，在90℃下加热直至聚乙烯醇全部溶解，制备聚乙烯醇溶液。 [0053] 在本发明中，将十水四硼酸钠溶于去离子水中制备硼砂溶液。 [0054] 在本发明中，所述聚乙烯醇溶液的浓度为5～15wt％，优选为6～13wt％，进一步优选为8～12wt％，更进一步优选为10wt％。 [0055] 在本发明中，所述细菌纤维素悬液的固含量为0.75％。 [0056] 在本发明中，所述抗菌肽FengycinA‑M3水溶液的浓度为256～1024μg/mL，优选为300～800μg/mL，进一步优选为500～600μg/mL。 [0057] 在本发明中，所述聚乙烯醇溶液、细菌纤维素悬液和抗菌肽FengycinA‑M3水溶液的体积比为1～3:1:1，优选为2:1:1。 [0058] 在本发明中，所述硼砂溶液的浓度为0.05～0.2mol/mL，优选为0.07～0.15mol/mL，进一步优选为0.1mol/mL。 [0059] 在本发明中，所述硼砂溶液和水凝胶的前体溶液的体积比为1:4～5，优选为1:4。 [0060] 本发明还提供了上述的抗菌肽复合水凝胶的制备方法制备得到的抗菌肽复合水凝胶。 [0061] 本发明还提供了上述的抗菌肽复合水凝胶在食品保鲜材料中的应用。 [0062] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0063] 在本发明的实施例中，细菌纤维素悬液购自桂林奇宏科技有限公司(固含量为0.75％)； [0064] FengycinA‑M3抗菌肽粉末溶于去离子水中，制成FengycinA‑M3水溶液； [0065] 聚乙烯醇加到去离子水中，在90℃下加热直至聚乙烯醇全部溶解，制成聚乙烯醇溶液； [0066] 在本发明中，将十水四硼酸钠溶于去离子水中制备硼砂溶液。 [0067] 制备例 [0068] 抗菌肽FengycinA‑M3的制备： [0069] 1、原料信息 [0070] 名称 简称 包装规格 批号 厂家Fmoc‑Ala‑OH Ala 500g/袋 PS105021‑230318 上海正极生物科技有限公司 Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH Arg 500g/袋 PS107018‑230309 上海正极生物科技有限公司Fmoc‑Ile‑OH Ile 500g/袋 PS127007‑221102 上海正极生物科技有限公司 Fmoc‑Pro‑OH Pro 500g/袋 PS148013‑221229 上海正极生物科技有限公司 Fmoc‑Thr(tBu)‑OH Thr 500g/袋 ZYF07023021501 成都郑源生化科技有限公司 Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH Tyr 500g/袋 ZYF07723031802 成都郑源生化科技有限公司 Palmiticacid pal 500g/瓶 P1952173 上海泰坦科技股份有限公司 [0071] 2、试剂信息 [0072] [0073] [0074] 3、树脂信息 [0075] [0076] 4、生产过程： [0077] 树脂总用量10g，分2杯进行合成，每杯5g，工艺一致，将以单杯合成工艺进行描述。 [0078] 取代度为0.74mmol/g，投料当量为3eq，即5*0.74*3＝11.1mmol。 [0079] 1)树脂改造 [0080] 2‑CTC Resin：取5g氯树脂加入柱状反应器中，加入DCM(50ml)鼓泡溶胀30min后抽干，取5.28mmol的Fmoc‑Ile‑OH(1868.02mg)，加入DCM(50ml)溶解，再加入2倍当量的DIEA(1.84ml)加入反应器中，氮气鼓泡反应4h，加入5ml甲醇封端，抽干试剂，用DMF(10ml/g)洗5次，每次氮气鼓泡1min，抽干1min。取代度检测为0.74mmol/g。 [0081] 2)脱保护 [0082] 加入20％哌啶/DMF(30ml/g)鼓气30min。 [0083] 3)脱保护洗涤 [0084] 真空抽干脱保护试剂，用DMF(50ml)洗5次，每次鼓气1min，抽干1min。 [0085] 4)脱保护检测 [0087] 5)缩合第二个氨基酸 [0088] 3倍当量的Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH(5100.78mg)及3倍当量的HATU(4220.66mg)，加入75ml DMF溶解，再加入6倍当量的DIEA(5.52ml)活化5min后将其加入反应器中，反应1h。 [0089] 6)反应洗涤 [0090] 真空抽干试剂，用DMF(50ml)洗5次，每次鼓气3min，抽干1min。 [0091] 7)反应检测 [0092] 取20粒树脂放入检测试管中，再加入1ml茚三酮检测试剂，将检测试管放入120℃以上加热器中3min，取出观察树脂颜色，树脂颜色无明显变化，证明缩合成功。 [0093] 8)按照多肽序列的氨基酸，重复步骤2‑7直至Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH缩合完成。 [0094] 9)树脂N端偶联Palmitic acid [0095] 3倍当量的Palmitic acid(2820.62mg)及3倍当量的HATU(4220.66mg)，加入75ml DMF溶解，再加入6倍当量的DIEA(5.52ml)活化5min后将其加入反应器中，反应2h。按6)、7)操作后完成缩合验证。 [0096] 固相合成结束。 [0097] 5、树脂抽干与转移 [0098] 加入甲醇50ml，洗涤树脂5次，树脂转入抽干台真空抽干1h，树脂转交裂解室。 [0099] 6、树脂裂解和干燥 [0100] 裂解物料信息 [0101] [0102] 裂解过程 [0103] 裂解试剂配方为：TFA/TIS/H2O/EDT/茴香硫醚＝87.5/2.5/2.5/5/2.5，加入50ml裂解液，室温裂解3h，过滤出反应液分为7管，每管加至80ml的冰乙醚中，离心沉淀，并用冰乙醚洗涤3次，离心机设定转速为3000R/min，离心时间为2min，得到多肽固体粗品待冻干。 [0104] 多肽固体粗品待冻干经高效液相色谱仪纯化，纯化合格的样品HPLC分析图如图6所示，样品冻干后获得纯品：2400mg；收率：20.40％；纯度：75.015％；Mw:1589.98。 [0105] 实施例1 [0106] 将浓度为10wt％的聚乙烯醇溶液(PVA)、固含量为0.75％的细菌纤维素悬液(BC)和浓度为256μg/mL抗菌肽FengycinA‑M3水溶液(AMP)按照2:1:1的体积比混合，不断搅拌直至混合物混合均匀。该混合物作为水凝胶的前体溶液，再按硼砂溶液(0.1mol/mL)：前体溶液的体积比为1:4的比例将硼砂溶液滴加进前体溶液中，不断搅拌直至形成均匀的AMP@BC@PVA复合水凝胶。 [0107] 实施例2 [0108] 与实施例1的区别仅在于抗菌肽FengycinA‑M3水溶液的浓度为512μg/mL。 [0109] 实施例3 [0110] 与实施例2的区别仅在于抗菌肽FengycinA‑M3水溶液的浓度为1024μg/mL。 [0111] 实施例4 [0112] 与实施例1的区别仅在于聚乙烯醇溶液、细菌纤维素悬液和抗菌肽FengycinA‑M3水溶液按照3:1:1的体积比混合。 [0113] 对比例1 [0114] 按硼砂溶液：聚乙烯醇体积比为1:4的比例将硼砂溶液滴加入聚乙烯醇溶液中，不断搅拌直至形成均匀的聚乙烯醇水凝胶即PVA水凝胶。 [0115] 对比例2 [0116] 将聚乙烯醇溶液、细菌纤维素悬液按照2:2的体积比混合均匀作为水凝胶的前体溶液，再按硼砂溶液(0.1mol/mL)：前体溶液的体积比为1:4的比例将硼砂溶液滴加进前体溶液中，不断搅拌直至形成均匀的BC@PVA复合水凝胶。 [0117] 测试例 [0119] (1)将实施例1和对比例1‑2制备得到的水凝胶样品分别在‑40℃条件下进行冷冻干燥， [0120] (2)将冷冻干燥后的样品固定，并将其切成厚度为1mm的片状样品，经过10s喷金处理，在电镜下进行观察。 [0121] 试验结果：BC基质构成3D纤维网状结构，形成的孔径较大(图2)。PVA水凝胶表面存在较多褶皱，形成的孔洞较浅(图3)，BC的加入使得BC@PVA水凝胶表面变得较为平整，基本呈现多孔结构(图4)。AMP@BC@PVA水凝胶与其他两种水凝胶相比，水凝胶表面更为光滑平整，形成的孔径更为均匀(图1)。AMP@BC@PVA水凝胶的高度多孔结构可以促进抗菌肽的包封和释放。 [0122] 2、复合水凝胶的傅里叶变换红外光谱分析(FT‑IR) [0123] (1)将实施例1和对比例1‑2制备得到的水凝胶样品在‑40℃条件下进行冷冻干燥。 [0126] 试验结果如图5所示：对于纯AMP粉末，3343、1167、1514、1376、837cm‑1处的特征峰属于胺基(N‑H)拉伸、酰胺键(C＝O)伸缩、芳香族环上的C＝C键伸缩、羧酸(COOH)伸缩、肽键‑1(C‑N)伸缩。纯BC中3417、1171cm 处的特征峰属于羟基(OH)伸缩、C‑OH弯曲。观察到形成BC@‑1 PVA水凝胶后，形成了新的特征峰。851cm 处的吸收峰是由于B‑O键的拉伸振动，表明BC@PVA‑1 水凝胶的成功交联。AMP‑BC‑PVA水凝胶中1625、843cm 处的特征峰属于羧基(COOH)的伸展‑1 和B‑O键的拉伸振动。1426、1339cm 处的吸收峰归因于交联水凝胶网络中B‑O‑C键的拉伸振‑1 动。3400cm 左右羟基峰变窄表明AMP、BC和PVA之间的相互作用形成了氢键。该现象表明交联水凝胶结构网络的成功合成。 [0127] 3、复合水凝胶的机械性能测试 [0128] 水凝胶的力学性能采用质构仪进行测定。 [0129] (1)将实施例1和对比例1‑2制备得到的水凝胶用模具做成直径为10mm，高为5mm的圆柱体。 [0130] (2)设定测试前速度为1mm/sec，测试时速度为1mm/sec，测试后速度为3mm/sec，下压距离为10mm，测量水凝胶的凝胶强度及TPA参数。 [0131] 实验结果：PVA水凝胶的凝胶强度为50.48g，硬度为368.05g，弹性为0.51，其凝胶强度高，硬度高，但机械性能较差。BC@PVA水凝胶的凝胶强度为22.98g，硬度为219.82g，弹性为0.60。FengycinA‑M3@BC@PVA水凝胶的凝胶强度为20.45g，硬度为166.19g，弹性为0.60。结果显示将纳米材料细菌纤维素与抗菌肽引入PVA水凝胶后降低了水凝胶的硬度，水凝胶弹性较好，提高了水凝胶的机械性能，可延缓变形过程中的断裂，使其具有良好的机械强度与自愈性，可在食品保鲜材料领域发挥重要作用。水凝胶网络中多个氢键和动态硼酸盐键的形成有助于机械强度的提高，这些键可以有效消散界面应力并延缓变形过程中的断裂。 [0132] 4、复合水凝胶的自愈性能 [0133] 将实施例1制备的AMP@BC@PVA水凝胶沿中心轴切成两片。将两块水凝胶保持接触，没有任何外部相互作用和应力10分钟。随后，观察愈合的水凝胶在重力作用下的自愈性能。最后，使用光学显微镜在不同时间点观察水凝胶的微观自愈性能。 [0134] 试验结果：将染色的水凝胶条带接触并组合成具有异质颜色的新水凝胶条。这些水凝胶在接触30s后合并成一个水凝胶。组合水凝胶带即使在拉伸下也能保持其完整性。水凝胶由于具有良好的自愈能力，即使在受到机械外力作用下也具有较长的使用寿命。在室温下10min内重塑成的自修复水凝胶可承受50g的重量，表明具有良好的自愈能力。通过光学显微镜进一步观察了水凝胶的自愈过程。划伤的水凝胶在600s内重新自愈，受损区域的裂纹逐渐消失。水凝胶的自愈能力归因于水凝胶网络中动态可逆酯键和氢键的破坏和再生。 [0135] 5、抗菌肽的体外释放 [0136] (1)在1.5mL EP管底部加入400μL肽浓度为256μg/mL的水凝胶(实施例1)，在水凝胶顶部加入1mL去离子水，并在37℃下以60rpm连续振荡孵育，在0、0.5、1、2、4、8、12、24、48h采样200μL上清液，并补充等体积的去离子水。 [0137] (2)取20μL浓度范围为0、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024μg/mL的肽标准溶液和待测样品溶液依次加入96孔板中，每孔再加入200μLBCA工作液，使用酶标仪震板功能振荡30s，也可用手指轻弹酶标板使溶液混合均匀，在37℃放置30分钟。 [0138] (3)使用酶标仪测定562nm的吸光值。以肽标准溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，注意吸光值应减去空白对照吸光值，绘制标准曲线，得出线性公式及R2值。 [0139] (4)按照所得公式，根据所测得的待测样品吸光值，计算相应抗菌肽样品浓度。 [0140] 试验结果：将抗菌肽负载到水凝胶中，并在体外研究了抗菌肽释放行为。在0至12h之间抗菌肽从水凝胶中快速释放，总释放量为抗菌肽总含量的50％。随后抗菌肽的释放进入持续阶段，在此期间抗菌肽从水凝胶中连续释放，并在48h内达到85.2％的累积释放率。这些结果表明，抗菌肽在AMP@BC@PVA水凝胶中具有优异的缓释性能。在释放前期抗菌肽快速释放，这可能是由于水凝胶的高孔隙率和抗菌肽的小分子量可以增加抗菌肽的扩散系数。随着时间的延长，AMP@BC@PVA的亲水凝胶层阻断了水分子的进入，并维持了水分子的进入。 [0141] 6、复合水凝胶的体外抗菌活性 [0142] 分别将100μL大肠杆菌与金黄色葡萄球菌悬液(1*105CFU/mL)接种到100μLBC悬液、BC@PVA水凝胶、AMP@BC@PVA水凝胶表面，将接种的水凝胶在37℃下孵育12h。取样20μL菌液并涂于LB固体培养基上。将琼脂平板在37℃下培养24h后，计数琼脂平板上的菌落总数。使用未与水凝胶孵育的细菌溶液作为阴性对照。 [0143] 试验结果：由于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是肉类中主要的腐败菌，因此选择这两种菌株作为模型菌，以证明AMP@BC@PVA水凝胶的杀菌活性。BC@PVA水凝胶处理后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活菌数分别下降了0.37lg CFU/mL和0.83lg CFU/mL。AMP@BC@PVA水凝胶显示出比BC@PVA更有效的灭菌效果。当水凝胶中抗菌肽浓度达256μg/mL时，AMP@BC@PVA水凝胶对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌能力。用该水凝胶处理后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活菌数分别下降了3.83lg CFU/mL和5.80lg CFU/mL。因此，AMP@BC@PVA水凝胶可以应用于作为冷藏肉类的保鲜包装，以减少产品表面的细菌污染。 [0144] 7、复合水凝胶生物相容性 [0145] (1)制备3mL的PVA水凝胶、BC@PVA水凝胶、三个浓度梯度(256μg/mL、512μg/mL、1024μg/mL)的AMP@BC@PVA水凝胶，紫外照射灭菌2h后将水凝胶与3mL完全培养基在37℃共同孵育12h，取水凝胶浸提液置4℃冷藏保存用于细胞毒性试验。 [0146] (2)在96孔板中接种100uL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养12h(37℃，5％CO2)。 [0147] (3)弃掉培养基，孔中加入10μL不同水凝胶浸提液与100μL培养基。 [0148] (4)培养24h后，弃掉培养基，加入新的培养基。 [0149] (5)避光条件下，向每孔加入10μL CCK溶液。 [0150] (6)将培养板在培养箱内孵育30min‑4h。 [0151] (7)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 [0152] 试验结果：通过CCK‑8测定法在不同浓度的水凝胶提取物下测试水凝胶对RAW264.7细胞的生物相容性。不同浓度的AMP@BC@PVA水凝胶与RAW264.7细胞一起培养24h后的细胞活力超过100％，促进了细胞的生长，共培养48h后，细胞活力大于95％，这些结果表明AMP@BC@PVA水凝胶几乎无细胞毒性，这意味着AMP@BC@PVA水凝胶作为食品包装材料是安全的。 [0153] 由以上实施例可知，本发明提供了一种抗菌肽复合水凝胶及其制备方法和应用。本发明利用物理和化学双交联策略相结合所形成的双网络抗菌肽水凝胶将有利于获得水凝胶的平衡性质，通过物理‑化学双交联策略，结合抗菌肽FengycinA‑M3、细菌纤维素(BC)及聚乙烯醇(PVA)，并用十水四硼酸钠作为交联剂，制备一种FengycinA‑M3@细菌纤维素@聚乙烯醇复合水凝胶。聚乙烯醇作为水凝胶基体，细菌纤维素用于改善水凝胶机械性能，FengycinA‑M3作为抗菌剂加载到水凝胶体系中，赋予水凝胶抗菌性能，并增加抗菌肽自身稳定性。硼砂在PVA、BC、FengycinA‑M3之间起到交联剂的作用，导致动态硼酸酯键的形成，同时不同组分之间的氢键相互作用产生了水凝胶网络。 [0154] 本发明制备的抗菌肽复合材料具有优良机械性能、生物相容性和抗菌性能，可以作为食品包装材料用于食品保鲜中。 [0155] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 |
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