大麻纤维的提取
阅读：519发布：2023-01-24
专利汇可以提供大麻纤维的提取专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及从剥落的大麻韧皮中提取大麻 纤维 的方法，其包括在约90℃或更低的 温度 下，用含有 柠檬酸 二钠、柠檬酸三钠或其混合物且pH为约6－13的 水 溶液预处理剥落的大麻韧皮；和随后用酶处理回收的纤维。确定 植物 纤维脱胶过程完成程度的方法包括用在既不产生 纤维素 酶又不产生木聚糖酶的 生物 体中表达的重组果胶酶处理脱胶纤维，以从任何在脱胶纤维上残余的果胶中释放还原糖，和确定所释放的还原糖的量。，下面是大麻纤维的提取专利的具体信息内容。
1.从剥落的大麻韧皮中提取大麻纤维的方法，其包括在约90℃或更低 的温度下，用含有柠檬酸二钠、柠檬酸三钠或其混合物且pH为约6-13的 水溶液预处理所述剥落的大麻韧皮；和随后用果胶酶处理回收的纤维。
2.权利要求1的方法，其中所述水溶液含有柠檬酸三钠。
3.权利要求1的方法，其中所述pH为8-12。
4.权利要求1的方法，其中所述温度为45-85℃。
5.权利要求1的方法，其中所述温度为55-85℃。
6.权利要求1的方法，其中所述温度为65-85℃。
7.权利要求1的方法，其中对所述剥落的韧皮的处理进行至多5小时。
8.权利要求1的方法，其中所述水溶液中柠檬酸盐的浓度为0.4- 1.6％(w/v)。
9.权利要求1的方法，其中所述水溶液中柠檬酸盐的浓度为0.8％(w/v)。
10.权利要求1的方法，其中所述水溶液还包含0.01-0.5％(w/v)的氢氧 化钠。
11.权利要求10的方法，其中所述氢氧化钠的浓度为0.04％(w/v)。
12.权利要求1的方法，其中所述水溶液不含强碱。
13.权利要求12的方法，其还包括用含有柠檬酸三钠和强碱的第二水 溶液处理所述剥落的大麻韧皮。
14.权利要求13的方法，其中所述第二水溶液中柠檬酸盐的浓度为 0.8％(w/v)，该水溶液的pH为10-13。
15.权利要求1的方法，其中用果胶酶处理是在30-45℃下在pH为4-6 的水溶液中进行的。
16.权利要求15的方法，其中用果胶酶处理进行0.5-36小时。
17.权利要求15的方法，其中用果胶酶处理进行0.5-6小时。
18.权利要求15的方法，其中用果胶酶处理是在柠檬酸一钠的存在下 进行的。
19.确定植物纤维脱胶过程完成程度的方法，其包括：用果胶酶处理脱 胶纤维以从任何在该脱胶纤维上残余的果胶中释放还原糖；和确定所释放 的还原糖的量。
20.权利要求19的方法，其中所述果胶酶包括在既不产生纤维素又不 产生木聚糖酶的生物体中表达的重组果胶酶。
21.权利要求20的方法，其中所述重组果胶酶为胡萝卜软腐欧氏杆菌 的多聚半乳糖醛酸酶。
22.权利要求20的方法，其中所述生物体为大肠杆菌。
23.权利要求19的方法，其中确定所释放的还原糖的量包括一种涉及 水杨酰肼的方法。
24.确定植物纤维软化过程完成程度的方法，其包括：在横向约束湿法 纤维的容器中提供湿法纤维；在所述湿法纤维顶部施加重量；和测量由于 所述重量的挤压而导致的湿法纤维的体积大小的变化。
25.权利要求24的方法，其中所述重量包括设定质量的TeflonTM圆盘， 而所述容器为量筒。
技术领域
背景技术
历史上，大麻纤维已被用于纺织工业。然而，近来在材料科学中的突 破已经使强力和可再生的纤维，例如那些源自大麻的纤维，代替玻璃纤维 作为复合材料中的补强。提取大麻纤维同时保持其完整性的方案的开发对 其在纺织工业和复合材料中的应用都是重要的。所述方案优选避免使用危 险的和/或不可生物降解的试剂。
在普通纤维植物，例如大麻、亚麻和黄麻中，含有韧皮纤维的树皮状 的层包围着木质核。所述韧皮纤维被果胶或其它胶环绕。手工或机械去皮 是从木质核除去树皮状的层的一种方法。
从剥落的树皮上提取纤维会使其最终得到应用。提取主要包括从纤维 中去除果胶和含颜料物质(脱胶)。果胶是一种多糖，其是一种半乳糖醛 酸的聚合物。果胶在水或酸中不溶。然而，它能用强碱溶液如苛性钠(浓 氢氧化钠)去除。
用于分离洁净纤维的通用方法包括具有不同变种的露水浸解、水浸解、 以及化学和酶方法。在这些方法中，将纤维接合在一起的胶必须首先通过 浸解被松开(或完全去除)。在传统浸解中，在切割后通过将茎置于田地 中而使其被雨露浸解。在世界的一些地方，通过将茎束置于池塘或小溪中 而使大麻被水浸解。这些浸解方法依赖于在有利条件下繁殖的微生物分泌 的酶对果胶的消化。尽管水浸解产生更均一的纤维，但是该方法污染水。 露水浸解无论在何处都需要2-6周或更长的时间才能完成，需要翻动至少一 次茎来得到最高质量的纤维。露水浸解因此受天气影响，而天气对有利条 件提供不了保证。
在工业规模上，化学浸解是常用的。其涉及强烈的、危险的化学品， 如纯碱、苛性钠和草酸。酶浸解涉及果胶酶在其它酶如木聚糖酶和/或纤维 素酶存在或不存在的情况下的作用。然而，这样的酶在分离大麻纤维上的 实际应用还有待证明。
各种浸解方法是本领域内已知的。Clarke等人(2002)描述了一种从 剥落的韧皮中去除果胶或胶质物来得到单独纤维的方法，该方法是通过将 韧皮(经过或不经过在预处理过程中在酶溶液中浸泡)置于封闭的不透气 容器如塑料袋中。韧皮天生的产酶微生物将在由酶预处理而释放的最初营 养物上繁殖，并将在这个密闭环境中完成浸解过程。Clarke等人(2002) 还描述了一种可选的包括化学品而不是酶的预处理方法，其包括苛性钠、 纯碱、硅酸钠、草酸和乙二胺四乙酸(EDTA)。
化学和酶浸解方法通常都应用普通螯合剂如草酸和EDTA以加速该方 法。它们都有在工业规模上应用和处理的问题。草酸被各个管辖区(作业 安全标准)分类或指定为有毒的、腐蚀性和危险材料(特别是对肾)。EDTA 非常惰性，在环境中没有或几乎没有可生物降解的能力。EDTA在许多天 然水中被发现，并且以较高的水平出现在废水中。EDTA已经被西欧国家、 澳大利亚和美国的部分地方禁止了，并且许多国家严格限制或谨慎控制 EDTA作为清洁剂或洗涤剂中的组分。
因此，需要一种更温和的方法分离大麻纤维，所述方法涉及环境友好 的和/或可生物降解的试剂。
在普通纤维植物，例如大麻、亚麻和黄麻中，含有韧皮纤维的树皮状 的层包围着木质核。所述韧皮纤维被果胶或其它胶环绕。手工或机械去皮 是从木质核除去树皮状的层的一种方法。
从剥落的树皮上提取纤维会使其最终得到应用。提取主要包括从纤维 中去除果胶和含颜料物质(脱胶)。果胶是一种多糖，其是一种半乳糖醛 酸的聚合物。果胶在水或酸中不溶。然而，它能用强碱溶液如苛性钠(浓 氢氧化钠)去除。
用于分离洁净纤维的通用方法包括具有不同变种的露水浸解、水浸解、 以及化学和酶方法。在这些方法中，将纤维接合在一起的胶必须首先通过 浸解被松开(或完全去除)。在传统浸解中，在切割后通过将茎置于田地 中而使其被雨露浸解。在世界的一些地方，通过将茎束置于池塘或小溪中 而使大麻被水浸解。这些浸解方法依赖于在有利条件下繁殖的微生物分泌 的酶对果胶的消化。尽管水浸解产生更均一的纤维，但是该方法污染水。 露水浸解无论在何处都需要2-6周或更长的时间才能完成，需要翻动至少一 次茎来得到最高质量的纤维。露水浸解因此受天气影响，而天气对有利条 件提供不了保证。
在工业规模上，化学浸解是常用的。其涉及强烈的、危险的化学品， 如纯碱、苛性钠和草酸。酶浸解涉及果胶酶在其它酶如木聚糖酶和/或纤维 素酶存在或不存在的情况下的作用。然而，这样的酶在分离大麻纤维上的 实际应用还有待证明。
各种浸解方法是本领域内已知的。Clarke等人(2002)描述了一种从 剥落的韧皮中去除果胶或胶质物来得到单独纤维的方法，该方法是通过将 韧皮(经过或不经过在预处理过程中在酶溶液中浸泡)置于封闭的不透气 容器如塑料袋中。韧皮天生的产酶微生物将在由酶预处理而释放的最初营 养物上繁殖，并将在这个密闭环境中完成浸解过程。Clarke等人(2002) 还描述了一种可选的包括化学品而不是酶的预处理方法，其包括苛性钠、 纯碱、硅酸钠、草酸和乙二胺四乙酸(EDTA)。
化学和酶浸解方法通常都应用普通螯合剂如草酸和EDTA以加速该方 法。它们都有在工业规模上应用和处理的问题。草酸被各个管辖区(作业 安全标准)分类或指定为有毒的、腐蚀性和危险材料(特别是对肾)。EDTA 非常惰性，在环境中没有或几乎没有可生物降解的能力。EDTA在许多天 然水中被发现，并且以较高的水平出现在废水中。EDTA已经被西欧国家、 澳大利亚和美国的部分地方禁止了，并且许多国家严格限制或谨慎控制 EDTA作为清洁剂或洗涤剂中的组分。
因此，需要一种更温和的方法分离大麻纤维，所述方法涉及环境友好 的和/或可生物降解的试剂。
发明内容
依据本发明的一方面，其提供一种从剥落的大麻韧皮中提取大麻纤维 的方法，该方法包括在约90℃或更低的温度下，用含有柠檬酸二钠、柠檬 酸三钠或其混合物且pH为约6-13的水溶液预处理该剥落的大麻韧皮；和 随后用果胶酶处理回收的纤维。
依据本发明的另一方面，其提供一种用于确定植物纤维脱胶过程的完 成程度的方法，所述方法包括用果胶酶处理脱胶纤维以从任何在该脱胶纤 维上残余的果胶中释放还原糖；和确定所释放的还原糖的量。
依据本发明的再另一方面，其提供一种用于确定植物纤维软化过程的 完成程度的方法，所述方法包括在横向约束湿法纤维的容器中提供湿法纤 维；在湿法纤维顶部施加重量；和测量由于重量的挤压而导致的湿法纤维 的体积大小的变化。
只含有柠檬酸二钠的水溶液的pH为约6。只含有柠檬酸三钠的水溶液 的pH为约8。添加少量更强的碱例如氢氧化钠，能将柠檬酸二钠转化为柠 檬酸三钠和/或提高pH至8以上。避免苛性条件，即pH在13以上。优选 的是pH为约8-12。优选的是，所述水溶液含有柠檬酸三钠。
柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠的浓度基于水溶液的总体积优选为约 0.4％(w/v)-约1.6％(w/v)。如果期望，可通过添加更强的碱来提高pH。优选 所述更强的碱是氢氧化钠的水溶液，其浓度基于该水溶液的总体积为约 0.01％(w/v)-约0.5％(w/v)。
水溶液的温度为约90℃或更低，优选约45℃-约85℃，更优选约55℃- 约85℃，例如约65℃-约85℃。对水溶液不进行加压。提取优选进行至多 约10小时，更优选至多约5小时，甚至更优选约1小时-约5小时。可对水 溶液进行搅拌或搅动以促进提取。
如果期望，可以在不止一个阶段中进行纤维的预处理，在第一阶段中 纤维用柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠处理而不添加更强的碱，随后在一个或 更多其它阶段中纤维用柠檬酸三钠处理并添加更强的碱(例如氢氧化钠、 氢氧化钾等)以调节pH，优选至10-13。在所述其它阶段中，柠檬酸三钠 和该更强的碱的浓度如上所述。其它阶段的温度和时间条件如上所述。有 利的是，第一阶段提高其它阶段的提取效率。如果期望，在各阶段之间纤 维可以用水洗涤。
上述预处理，无论在一个阶段中或不止一个阶段中进行，都在没有酶， 例如没有果胶酶的存在下而有利地进行。用柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠预 处理的结果是，随后用果胶酶的酶处理更有效并且/或者可以在更温和的条 件下进行。有利地，在此所述的预处理允许在温和、环境友好的条件下对 大麻纤维进行实用的、工业上可应用的酶处理。
由预处理回收的大麻纤维优选在用果胶酶进行酶处理之前先用水冲 洗。对回收的大麻纤维进行的酶处理使用一种或多种果胶酶，优选来自真 菌或细菌源。优选的是，酶处理在pH为约4-6的水介质中进行。更优选的 是，pH为约4.5-5。优选的是，进行酶处理的温度为约30℃-45℃，更优选 约40℃-45℃。优选的是，所述水介质含有盐和/或缓冲液，例如柠檬酸一钠。 任何盐或缓冲液的浓度不应太高以至于不适当地影响酶的活性。例如，柠 檬酸一钠的浓度可以为约3-7mM，例如5mM。
优选的是，对纤维的酶处理进行约0.5-36小时，更优选约0.5-6小时， 例如约1-5小时或约0.5-4小时或约1-3小时。可以对水介质进行搅拌或搅 动。优选的是，在酶处理期间对水介质不断地进行搅拌或搅动。酶处理后 纯化的纤维可以用水冲洗。
为了其最终应用，可以对纯化的纤维进行其它的处理，例如漂白、染 色等。
有利的是，用柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠预处理使得可以在温和条件 下用环境友好的试剂有效提取大麻纤维。另外，对通过用柠檬酸二钠和/或 柠檬酸三钠预处理回收的纤维的酶处理有利地提高了在随后的酶处理过程 中去除果胶的效率。而且，用柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠预处理大麻纤维 有利地允许应用更温和的酶处理条件，从而允许酶在纤维提取中的反复利 用。例如，用过的酶溶液能再用于其它批次的纤维多达4次，或在某些情 况下甚至更多次。
另外，已经被广泛应用于清洁剂和去污剂的柠檬酸钠是无毒的、不致 癌、不造成生物体内累积、不危险(依据作业安全分类)和高度可生物降 解的。依据联合FAO/WHO食品添加剂专家委员会的第十七次报告，World Health Organisation Technical Report Ser.，1974.No.539；FAO Nutrition Meetings Report Series，1974，No.53.，柠檬酸和柠檬酸盐在许多食品中出现， 并且是所有活的生物体中碳水化合物的正常代谢物(Gruber & Halbeisen， 1948)。
柠檬酸盐是三羧酸循环的起点，也被称为柠檬酸循环或Krebs循环。 该循环是发生在植物、动物和微生物的细胞中的一系列化学反应。多年来， 达到4g剂量的柠檬酸钠已经被广泛用于医疗实践中而不会引起不良作用。 柠檬酸钠在好氧或厌氧条件下是快速和最终可生物降解的。例如，在测试 30天内的生物易降解性的封闭瓶实验中，柠檬酸钠达到90％ThOD(理论需 氧量)。
相对比，EDTA虽然是无毒的，但在环境中是惰性的，并被各个区域 禁止用于洗涤目的。草酸被归类为“危险和有毒的”物质。
由于果胶在粘合大麻纤维中起主要作用，估定在经处理的纤维中残留 的果胶有助于确定脱胶过程的完成程度，并从而确定纤维的质量。与其它 化学方法相比，酶水解是一个特效反应，其能破坏除果胶外的其它多糖。 为了确定果胶从纤维中去除，果胶酶能被用于水解任何来自经处理的纤维 的残留果胶。确定释放的糖的量将表明纤维上残留果胶的量。
对于这样的定量，使用源自普通真菌如曲霉菌的培养肉汤的商品果胶 酶可能被在发酵过程中共产生其它内源多糖水解酶如纤维素酶和木聚糖酶 而复杂化。能通过应用在既不产生纤维素酶又不产生木聚糖酶的生物体例 如大肠杆菌(E.coli)中表达的重组果胶酶而来降低对污染酶的这种顾虑。
在下面的详细说明中，本发明的其它特征将被描述或将变得清楚。
附图说明
为了使本发明可以被更清楚地理解，现将通过实施例并参考附图来详 细说明其实施方案，其中：
图1是在350nm或270nm处测定的光密度(O.D.)作为在用本发明的 方法提取加拿大大麻TAB纤维期间将材料释放进溶液中的反应时间(分钟) 的函数图；和
图2是在350nm或270nm处测定的光密度(O.D.)作为在用本发明的 方法提取中国大麻纤维期间将材料释放进溶液中的反应时间(分钟)的函 数图。
依据本发明的另一方面，其提供一种用于确定植物纤维脱胶过程的完 成程度的方法，所述方法包括用果胶酶处理脱胶纤维以从任何在该脱胶纤 维上残余的果胶中释放还原糖；和确定所释放的还原糖的量。
依据本发明的再另一方面，其提供一种用于确定植物纤维软化过程的 完成程度的方法，所述方法包括在横向约束湿法纤维的容器中提供湿法纤 维；在湿法纤维顶部施加重量；和测量由于重量的挤压而导致的湿法纤维 的体积大小的变化。
只含有柠檬酸二钠的水溶液的pH为约6。只含有柠檬酸三钠的水溶液 的pH为约8。添加少量更强的碱例如氢氧化钠，能将柠檬酸二钠转化为柠 檬酸三钠和/或提高pH至8以上。避免苛性条件，即pH在13以上。优选 的是pH为约8-12。优选的是，所述水溶液含有柠檬酸三钠。
柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠的浓度基于水溶液的总体积优选为约 0.4％(w/v)-约1.6％(w/v)。如果期望，可通过添加更强的碱来提高pH。优选 所述更强的碱是氢氧化钠的水溶液，其浓度基于该水溶液的总体积为约 0.01％(w/v)-约0.5％(w/v)。
水溶液的温度为约90℃或更低，优选约45℃-约85℃，更优选约55℃- 约85℃，例如约65℃-约85℃。对水溶液不进行加压。提取优选进行至多 约10小时，更优选至多约5小时，甚至更优选约1小时-约5小时。可对水 溶液进行搅拌或搅动以促进提取。
如果期望，可以在不止一个阶段中进行纤维的预处理，在第一阶段中 纤维用柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠处理而不添加更强的碱，随后在一个或 更多其它阶段中纤维用柠檬酸三钠处理并添加更强的碱(例如氢氧化钠、 氢氧化钾等)以调节pH，优选至10-13。在所述其它阶段中，柠檬酸三钠 和该更强的碱的浓度如上所述。其它阶段的温度和时间条件如上所述。有 利的是，第一阶段提高其它阶段的提取效率。如果期望，在各阶段之间纤 维可以用水洗涤。
上述预处理，无论在一个阶段中或不止一个阶段中进行，都在没有酶， 例如没有果胶酶的存在下而有利地进行。用柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠预 处理的结果是，随后用果胶酶的酶处理更有效并且/或者可以在更温和的条 件下进行。有利地，在此所述的预处理允许在温和、环境友好的条件下对 大麻纤维进行实用的、工业上可应用的酶处理。
由预处理回收的大麻纤维优选在用果胶酶进行酶处理之前先用水冲 洗。对回收的大麻纤维进行的酶处理使用一种或多种果胶酶，优选来自真 菌或细菌源。优选的是，酶处理在pH为约4-6的水介质中进行。更优选的 是，pH为约4.5-5。优选的是，进行酶处理的温度为约30℃-45℃，更优选 约40℃-45℃。优选的是，所述水介质含有盐和/或缓冲液，例如柠檬酸一钠。 任何盐或缓冲液的浓度不应太高以至于不适当地影响酶的活性。例如，柠 檬酸一钠的浓度可以为约3-7mM，例如5mM。
优选的是，对纤维的酶处理进行约0.5-36小时，更优选约0.5-6小时， 例如约1-5小时或约0.5-4小时或约1-3小时。可以对水介质进行搅拌或搅 动。优选的是，在酶处理期间对水介质不断地进行搅拌或搅动。酶处理后 纯化的纤维可以用水冲洗。
为了其最终应用，可以对纯化的纤维进行其它的处理，例如漂白、染 色等。
有利的是，用柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠预处理使得可以在温和条件 下用环境友好的试剂有效提取大麻纤维。另外，对通过用柠檬酸二钠和/或 柠檬酸三钠预处理回收的纤维的酶处理有利地提高了在随后的酶处理过程 中去除果胶的效率。而且，用柠檬酸二钠和/或柠檬酸三钠预处理大麻纤维 有利地允许应用更温和的酶处理条件，从而允许酶在纤维提取中的反复利 用。例如，用过的酶溶液能再用于其它批次的纤维多达4次，或在某些情 况下甚至更多次。
另外，已经被广泛应用于清洁剂和去污剂的柠檬酸钠是无毒的、不致 癌、不造成生物体内累积、不危险(依据作业安全分类)和高度可生物降 解的。依据联合FAO/WHO食品添加剂专家委员会的第十七次报告，World Health Organisation Technical Report Ser.，1974.No.539；FAO Nutrition Meetings Report Series，1974，No.53.，柠檬酸和柠檬酸盐在许多食品中出现， 并且是所有活的生物体中碳水化合物的正常代谢物(Gruber & Halbeisen， 1948)。
柠檬酸盐是三羧酸循环的起点，也被称为柠檬酸循环或Krebs循环。 该循环是发生在植物、动物和微生物的细胞中的一系列化学反应。多年来， 达到4g剂量的柠檬酸钠已经被广泛用于医疗实践中而不会引起不良作用。 柠檬酸钠在好氧或厌氧条件下是快速和最终可生物降解的。例如，在测试 30天内的生物易降解性的封闭瓶实验中，柠檬酸钠达到90％ThOD(理论需 氧量)。
相对比，EDTA虽然是无毒的，但在环境中是惰性的，并被各个区域 禁止用于洗涤目的。草酸被归类为“危险和有毒的”物质。
由于果胶在粘合大麻纤维中起主要作用，估定在经处理的纤维中残留 的果胶有助于确定脱胶过程的完成程度，并从而确定纤维的质量。与其它 化学方法相比，酶水解是一个特效反应，其能破坏除果胶外的其它多糖。 为了确定果胶从纤维中去除，果胶酶能被用于水解任何来自经处理的纤维 的残留果胶。确定释放的糖的量将表明纤维上残留果胶的量。
对于这样的定量，使用源自普通真菌如曲霉菌的培养肉汤的商品果胶 酶可能被在发酵过程中共产生其它内源多糖水解酶如纤维素酶和木聚糖酶 而复杂化。能通过应用在既不产生纤维素酶又不产生木聚糖酶的生物体例 如大肠杆菌(E.coli)中表达的重组果胶酶而来降低对污染酶的这种顾虑。
在下面的详细说明中，本发明的其它特征将被描述或将变得清楚。
附图说明
为了使本发明可以被更清楚地理解，现将通过实施例并参考附图来详 细说明其实施方案，其中：
图1是在350nm或270nm处测定的光密度(O.D.)作为在用本发明的 方法提取加拿大大麻TAB纤维期间将材料释放进溶液中的反应时间(分钟) 的函数图；和
图2是在350nm或270nm处测定的光密度(O.D.)作为在用本发明的 方法提取中国大麻纤维期间将材料释放进溶液中的反应时间(分钟)的函 数图。
具体实施方式
实施例1：提取源自加拿大大麻的剥落韧皮的纤维
对10克加拿大大麻TAB的剥落大麻韧皮通过在85℃下在200ml含 0.8％(w/v)的柠檬酸三钠的水溶液中搅拌3小时而进行预处理。通过用在 270nm和350nm处的UV-Vis光谱测量光密度(O.D.)来监测材料向溶液 中的释放(图1)。产生合适的O.D.的稀释倍数显示在图1的括号中。经 预处理的纤维而后用水冲洗两次。
在45℃下，在200ml含有果胶酶(Novozyme Pectinase Ultra SP-L，1040 U)和5mM柠檬酸钠的pH为约4.5的水溶液中处理回收的纤维。1小时后， 回收酶溶液以重复利用。将纤维冲洗两次。该纤维为米色，容易分离成更 精细的纤维。
实施例2：提取源自中国大麻的剥落韧皮的纤维
浸泡：将10克剥落大麻韧皮浸泡在80℃下的200ml水中30分钟。
步骤1：而后在80℃下，在200ml含0.8％(w/v)的柠檬酸三钠的水溶液 中搅动纤维1小时。经处理的纤维用自来水冲洗两次。
步骤2：在步骤1之后，在80℃下，在200ml含0.8％(w/v)的柠檬酸三 钠和0.2％(w/v)的NaOH的水溶液中搅拌1.5小时。经处理的纤维用水冲洗 两次。
步骤3：在45℃下，在200ml含有果胶酶(Novozyme Pectinase Ultra SP-L， 1040U)和5mM柠檬酸钠的pH为约4.5的水溶液中处理回收的纤维。1 小时后，回收酶溶液以重复利用。将纤维冲洗两次。该纤维容易被分离成 更精细的纤维。通过用在270nm和350nm处的UV-Vis光谱测量光密度 (O.D.)来监测材料向每个溶液中的释放(图2)。产生合适的O.D.的稀释 倍数显示在图2的括号中。
实施例3：大麻纤维的软化
在实施例1和2的酶处理后，将湿的大麻纤维(5g)用120ml异丙醇 洗涤5分钟以产生有色的异丙醇溶液。倾析出该有色的异丙醇溶液，纤维 被晾干。该纤维比未用异丙醇处理的那些更软。
实施例4：在大肠杆菌中表达的胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora) 的重组多聚半乳糖醛酸酶的制备
一种重组果胶酶，即胡萝卜软腐欧氏杆菌的多聚半乳糖醛酸酶的生产 已经通过以下过程实现：(i)通过PCR从胡萝卜软腐欧氏杆菌中分离果胶 酶基因，(ii)克隆进线状质粒pTrX中，和(iii)在大肠杆菌中表达所述 基因。用于基因克隆的前体质粒pTrX以前已经被公布(Sung等人，1998 年6月2日授予Sung等人的美国专利5,759,840，其公开在此并入作为参 考)。其含有官能性里氏木酶木聚糖酶基因，并因而能表达木聚糖酶。
PCR被用于在质粒pEcp3a的构建中用PCR引物Ecp-N1a和Ecp-C1a 产生编码分泌物前导序列和成熟果胶酶的DNA片段。
Ecp-N1a
1 2 3 4 5 6 7 8
分泌物前导序列 E Y Q S G K R V
5＇-TT GCT AGC GAA TAT CAA TCA GGC AAG CGA GTT TTA TC
NheI
Ecp-C1a
379 378 377 376 375 374 373 372 371 370
中止K K V T V N K I Q W
5＇-AA AGA TCT TTA CTT CTT AAC GGT GAC GTT CTT GAT TTG CCA
BgI II
序列号1＝EYQSGKRV
序列号2＝TT GCT AGC GAA TAT CAA TCA GGC AAG CGA GTT TTA
TC
序列号3＝KKVTVNKIQW
序列号4＝AA AGA TCT TTA CTT CTT AAC GGT GAC GTT CTT GAT
TTG CCA
PCR模板是细菌胡萝卜软腐欧氏杆菌的DNA，其在正常PCR方案下 被直接释放。用引物Ecp-N1a，制备1100bp的PCR产物。该产物被限制 酶NheI和BgIII切段，并连接到NheI/BgIII-线状质粒pTrX中以产生新的质 粒pEcp3a。
随后的克隆步骤包括(i)转化成大肠杆菌HB101感受态细胞，而后 在YT板(含有5g酵母提取物、3g胰化蛋白胨、5gNaCl、1L水中15g琼 脂、1g雷马亮蓝R-D-木聚糖)和氨比西林(100mg/L)上铺开，(2)通过 木聚糖酶活性的丧失(在40℃下过夜，蓝木聚糖板上的菌群周围的透明区 或晕圈的消失)来识别含有新质粒pEcp3a的果胶酶转化体，和(3)通过 隔离的质粒pEcp3a的双脱氧核苷酸序列确定成功的克隆。
重组果胶酶的产生通过用质粒pEcp3a培养大肠杆菌转化体而完成。培 养条件包括在含有氨比西林(100mg/L)的2YT培养基(16g胰化蛋白胨、 10g酵母提取物、5gNaCl、1L水)中的5ml过夜接种菌的培养。其在被含 有氨比西林(100mg/L)的0.5L固化YT琼脂(8g酵母提取物、5g胰化蛋 白胨、5gNaCl、1L水中15g琼脂)均匀覆盖的盘(32×25cm)上铺开。培 养菌在37℃下生长。40小时后，获得用于提取果胶酶的细胞(2g)。
将所获得的细胞置于试管中用于果胶酶的冻融提取。该程序包括在干 冰/乙醇浴中5分钟的冷冻周期，随后水/冰浴10分钟。重复该程序三次。 将细胞用缓冲液(5mal，100mM柠檬酸钠，pH5.5)提取。在8000×g下离 心30分钟，得到含有果胶酶的上清液，其能直接被用于实施例5的分析化 验。
实施例5：经处理的纤维中残留的果胶的分析
果胶从大麻纤维中的去除程度通过测量果胶酶对经处理的纤维上残留 的果胶的特异水解而产生的还原糖的量来确定。
C1是未处理的大麻的对比样品。C2是用7％(w/v)NaOH在90℃下加工 的大麻的对比样品，所述加工引起纤维破坏。C3是从Aurorasilk Com. (Portland，Oregon，U.S.A.)得到的可商用化学加工大麻的对比样品。S1是依 据实施例2加工的大麻的样品。
诸如用于生产样品C3的商业方法通常包括使用高压(例如80lbs每平 方英寸)、高温(例如160℃)和高浓度的氢氧化钠(例如6％(w/v))。
所使用的果胶酶中的一种是如实施例4中制备的在大肠杆菌中表达的 胡萝卜软腐欧氏杆菌的重组多聚半乳糖醛酸酶。所使用的另一种果胶酶为 来自黑曲霉的Novozyme果胶酶(多聚半乳糖醛酸酶)。应用下列通用方法。
在400μl缓冲液(100mM柠檬酸钠，对于重组果胶酶pH5.0，对于 Novozyme果胶酶pH4.5)中含有30mg经处理的纤维和1U重组果胶酶或 20μl稀释的Novozyme果胶酶(50×稀释液)的反应混合物被加热至40℃。 1小时后，移出50μl反应溶液，并添加至1ml的10mM NaOH中以停止进 一步的水解。还原糖的量用涉及水杨酰肼试剂(HBAH)的固定方法(Lever， 1972 Analytical Biochem 47：273-279，其公开在此并入作为参考)来确定。 HBAH处理后，溶液变为黄色。还原糖的量能通过在420nm处读取O.D.， 并依照O.D.对已知量的半乳糖醛酸的标准曲线读数而确定。表1提供了结 果。
表1
样品 通过胡萝卜软腐欧氏杆菌的重 组果胶酶，过夜，从残留果胶中 释放还原糖(OD420) 通过来自黑曲霉的Novozyme果胶酶 (多聚半乳糖醛酸酶)从残留果胶中 释放还原糖(OD420) C1 2.350 1.353 C2 0.154 0.168 C3 0.169 0.334 S1 0.342 0.215
由表1明显表明，本发明的提取方法对使大麻纤维脱胶是有效的。依 据由重组细菌胡萝卜软腐欧氏杆菌果胶酶的分析，样品S1代表的实施例2 的方法没有商业方法(C3)或使用7％NaOH的方法(C2)有效，但是在 C2和C3中的条件苛刻得多，并对环境较不友好。然而，另一种由真菌黑 曲霉果胶酶的分析表现出相反顺序的有效性，S1具有比C3少的残留果胶。 尽管由两种分析试验得到略微不同的结果，但是两个试验一般都显示，相 比未处理的大麻，S1的大部分果胶被实施例2的方法去除。该实施例证明 了用于确定残留果胶的基于果胶酶的分析的有效性。
实施例6：监测纤维体(fiber mass)的柔软度的方法
除了亮度和分离度外，纤维的柔软度也是经加工的纤维的重要参数。 处理过程中监测源自硬质天然物质的纤维的逐渐软化的有效方法对最佳加 工技术的开发是有用的。
基于硬质和未分离的纤维束经得起施加在顶部的一定重量的能力已经 建立了一种监测方法，称为“坠落实验(Drop Test)”。在处理过程中， 由于湿加工纤维体的软化和分离而导致硬度的丧失将降低其经受设定重量 的抗力。所述对设定重量的抗力的逐渐丧失能通过测量纤维体在量筒中占 有的空间的减少而确定。经处理的纤维体所占有的空间是其溶胀块与由块 自身的硬度导致的空气隙的结合。
为此，将已排去溶液的湿加工纤维体放于玻璃量筒中。TeflonTM圆盘形 式的重量被轻轻地落至其顶部。通过量筒的刻度，测定纤维体所占据的体 积或空间。重复这样的测量三次，接受3次测量的平均值。随着处理的进 行，脱胶的纤维体软化，其开始丧失其经受圆盘的硬度，从而在量筒中占 据的空间逐渐减少。 实施例7：用于监测通过实施例1的2步方案的变型方式加工的加拿大大麻 纤维的“坠落试验”
五个加拿大大麻纤维的样品通过表2所列述的五个方案进行加工。S2 表示依据本发明加工的样品。实施例1的方案中的主要变化在括号中表示。 实施例1的通用条件在表2的最后一行示出作为参考。
表2
样品 步骤1 步骤2* S2 柠檬酸三钠，55℃，5小时 (55℃，5小时) Pectinase Ultra，柠檬酸钠缓冲液， 45℃ C4 柠檬酸三钠，55℃，5小时 (55℃，5小时) 柠檬酸钠缓冲液，45℃ (无果胶酶) C5 水，55℃，5小时 (无柠檬酸三钠；55℃，5小时) 水，45℃ (无果胶酶，或柠檬酸钠缓冲液) C6 水，55℃，5小时 (无柠檬酸三钠；55℃，5小时) 柠檬酸钠缓冲液，45℃ (无果胶酶) C7 不进行步骤1 Pectinase Ultra，柠檬酸钠缓冲液， 45℃ 实施例1 柠檬酸三钠，85℃，3小时 Pectinase Ultra，柠檬酸钠缓冲液， 45℃，1小时
*允许进行步骤2以显示果胶酶对纤维的作用。纤维样品用“坠落试验” 在2、4、6、24、30和48小时时监测。
为监测3g剥落加拿大大麻纤维的加工，使用高度为32cm、内径为3.8cm 和刻度2ml的标准250ml量筒。将外径为3.6cm、高度为2cm、重量为22g 并在中心垂直钻有三个直径为0.4cm的孔的环状TeflonTM圆盘轻轻置于量 筒内，使其滑至纤维体的顶部上。纤维体(膨体)所占据的空间(体积) 基于圆盘的底部相对量筒上的刻度来读取。
随着处理进行，纤维开始丧失其硬度，对抗TeflonTM圆盘的能力下降。 整个纤维体的体积变小并更软，从而在相同圆盘的重量下占有较少的空间 (表3)。
步骤1后，基于加工的纤维的膨松度，很明显的是用步骤1中的柠檬 酸三钠处理的样品S2和C4，相比仅用水加工的C5和C6(44ml和48ml 对69ml和72ml)，具有更小的体积或占有较少空间。实际上，S2和C4 在颜色上比C5和C6更浅。这证实了柠檬酸三钠在软化和亮化纤维中的有 益作用。步骤1中的柠檬酸三钠处理也增强了随后的酶步骤2的效果，如 下所示。
表3
步骤2期间，用果胶酶处理的样品S2，与受无酶的柠檬酸钠缓冲液处 理的C4(24hr内7ml)相比，其体积随时间持续较大幅地下降(24hr内12ml) (表3)。
在步骤2期间，未用果胶酶处理并且之前在步骤1中仅用水加工的样 品C5和C6在体积上随时间都显示出相对较小的下降(24hr后，C5中5ml 对C6中7ml)(表3)。然而，实际上C6比C5更亮，前者受柠檬酸钠缓 冲液处理而后者仅受水处理。
样品C7省略了柠檬酸三钠处理的步骤1而只依靠步骤2的果胶酶处 理，在体积上显示出随时间稳定的减少(表3)，与C4、C5和C6相反。 这证明果胶酶对软化纤维的本质作用。然而，在24小时(46ml对32ml) 和48小时(45ml对27ml)后，C7比S2体积更大，不像样品S2，其体积 不再进一步下降。而且，经加工的C7实际上比S2暗。S2和C7间的这些 差别证明，在大麻纤维的加工中，步骤1的柠檬酸三钠对增强随后的果胶 酶处理步骤的至关重要的作用。
确定步骤2期间释放的单糖
确定用或未用步骤2中的Pectinase Ultra释放的单糖以证明表2列述的 步骤1和2中的变化的效果。确定释放的糖的量的程序与实施例5描述的 一致。为此，移出50μl的反应上清液并添加至1ml的10mM NaOH中以停 止进一步的水解。用涉及水杨酰肼试剂(HBAH)的固定方法(Lever，1972 Analytical Biochem 47：273-279，其公开在此并入作为参考)来确定还原糖的 量。HBAH处理后，溶液变为黄色。还原糖的量能通过在420nm处的O.D. 读数来确定，如表4所示。
表4
五个样品(表4)中，仅在步骤2中用了果胶酶的S2和C7释放大量 的还原糖至上清液中。而剩余的在步骤2中未用果胶酶的三个样品中，样 品C5在过程中释放很少或不释放还原糖。
对加工的加拿大大麻纤维中保留的残留果胶的分析
除了“坠落试验”来检测纤维的硬度或柔软度外，还研究了样品S2、 C4、C5、C6和C7中的脱胶程度。为此，纤维样品中残留的果胶通过已经 在实施例5中描述的酶过程来确定。为了比较，将C3，从Aurorasilk Com. (Portland，Oregon，U.S.A)得到的可商购的化学加工大麻用作参考。来自黑曲 霉的Novozyme果胶酶(多聚半乳糖醛酸酶)被用于从样品上的任何残留果 胶中释放还原糖。从不同的纤维样品中释放的还原糖在2hr、5hr和24hr时 被测定(表5)。
表5
在酶分析(表5)中，对于在步骤1中用柠檬酸三钠处理和在步骤2中 用Pectinase Ultra处理的样品S2，在2hr、5hr和24hr时由果胶酶释放出非 常少的还原糖。这表明，与可商购的化学加工大麻样品C3相比，其仅保留 了非常少的残留果胶(在24hr时分别为0.537OD对0.548OD)。
其它样品C4、C5、C6和C7未经步骤1中的柠檬酸三钠或步骤2中的 果胶酶处理，保留了大量的果胶(在24hr时分别为2.756、2.093、5.196和 2.954 OD)。在未进行步骤1的样品C7中，单独用步骤2中的果胶酶处理 没有去除大部分果胶。结果，大量的残留果胶保留在加工的纤维C7中(表 5)。
尽管加工样品C5在坠落试验中体积最大(表3)并证明在步骤2期间 释放最少的单糖至上清液中，但与C4、C6和C7相比，在残留果胶分析中 其释放较小量的还原糖(5hr时为0.590 OD，表5)。这表明大部分果胶仍 包埋在加工样品C5中。
当已加工的样品(C5)经受另一轮更严格的加工时，证实了在C5中包 埋的果胶的存在，所述更严格的加工包括用柠檬酸三钠的步骤1(55℃， 5hr)，和用Pectinase Ultra的步骤2(柠檬酸钠缓冲液，45℃)，两个步骤 都包含柠檬酸钠，与表2中的起始设计中仅用水相对。在新的步骤2中对 上清液的分析，显示从再加工的C5中释放大量的单糖，OD在2hr和6hr 后分别为1.221和1.967。所述通过再加工样品C5释放还原糖废料与表4 中的样品S2是相当的，从而证实柠檬酸三钠在脱胶过程中的作用。
实施例8：监测通过实施例2的3步方案的变体加工的中国大麻纤维的“坠 落试验”
为了加工6g天然中国脱落大麻纤维，使用高度为32cm、内径为5.3cm 和刻度5ml的标准500ml量筒。将外径为4.8cm、高度为2cm、重量为55g 和在中心垂直钻有三个直径为0.4cm的孔的环状TeflonTM圆盘置于加工纤 维的顶部，以得到纤维体相对量筒上的刻度的体积的精确读数。
四个中国大麻纤维的样品通过表6列述的四个方案被加工。与实施例2 的方案的主要变化显示在括号中。实施例2的通用条件在表6的最后一行 显示出作为参考。
表6
样品 步骤1 步骤2 步骤3* S3 柠檬酸三钠， 80℃，1hr NaOH，柠檬酸三钠， 80℃，1.5hr Pectinase Ultra，柠檬酸 钠缓冲液，45℃ S4 柠檬酸三钠， 80℃，1hr NaOH，柠檬酸三钠， 80℃，4hr(4hr) 相同 C8 水，80℃，1hr (未用柠檬酸三钠) NaOH，水，80℃，1.5hr (未用柠檬酸三钠) 相同 C9 水，80℃，1hr (未用柠檬酸三钠) NaOH，水，80℃，4hr (未用柠檬酸三钠；4hr) 相同 实施例2 柠檬酸三钠， 80℃，1hr NaOH，柠檬酸三钠， 80℃，1.5hr Pectinase Ultra，柠檬酸 钠缓冲液，45℃，1hr
*允许进行步骤3以显示果胶酶对纤维的作用。纤维样品用“坠落试验” 在1、3、4和5hr时监测。
综上，依据本发明，样品S3和S4在步骤1和2中用柠檬酸三钠处理。 S3和S4间的区别仅是涉及NaOH的步骤2的时间由S3的1.5hr延长至S4 的4hr(表6)。样品C8和C9的条件与S3和S4的条件一样，不同之处是 在步骤1和2中都没有柠檬酸三钠。全部4个样品都最终在步骤3中用果 胶酶处理。
随着处理进行，纤维开始丧失其硬度，对抗TeflonTM圆盘的能力下降。 整个纤维体的体积变得更小并更软，从而在相同圆盘的重量下占有较少的 空间(表7)。步骤1的纤维体用上述500ml量筒测量。在步骤2和3中， 纤维体用实施例7中所述的较小的250ml量筒和较小的圆盘来测量。
表7
步骤1后，四个样品仍然非常坚硬和体积很大(145-175ml)(表7)。
在涉及氢氧化钠的步骤2中，在过程中添加了柠檬酸三钠的S3和S4 相比未用柠檬酸三钠的C8和C9(分别为60ml和49ml)具有较小的体积 (分别为46ml和42ml)，因此通常证明在过程中柠檬酸三钠在软化纤维上 的有益作用。处理的时间长短(S3和C8为1.5hr，而S4和C9为4hr)也 影响步骤2中体积的下降。
在果胶酶步骤3中，在步骤1和2中受柠檬酸三钠处理的样品S3和S4， 与C8和C9相比，随时间保持较小的体积(表7)。作为实施例，用果胶 酶5hr后，样品S3和S4的体积分别为38ml和38ml，而C8和C9分别为 48ml和40ml。这表明在步骤1和2中用柠檬酸三钠的最初处理增强了步骤 3中的果胶酶对纤维的软化效果。
对加工的中国纤维中残留的果胶的分析
除了“坠落试验”来检测纤维的硬度或柔软度外，还研究了样品S3、 S4、C8和C9中的脱胶程度。纤维样品中残留的果胶通过已经在实施例5 和7中描述的酶过程来确定。为了比较，使用C3，从Aurorasilk Com.(Portland， Oregon，U.S.A)得到的可商购的化学加工大麻。从不同的纤维样品中释放的 还原糖在2hr、5hr和24hr时被确定(表8)。
表8
在酶分析(表8)中，四个样品与商业的化学加工大麻参考样品C3相 比，在2hr、5hr和24hr时都由果胶酶释放出较少量的还原糖。这表明四个 样品保留了非常少的残留果胶，因而全部都被成功得脱胶。尽管四个加工 样品都丧失了其大部分果胶(表8)，基于坠落试验判断样品S3和S4比 C8和C9更软和硬度更低(表7)。
参考文献：
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Zhang，J.，Johansson，G.，Petterson，B.，Akin，D.E.，Foulk，J.A.，Khalili，S. 和Henriksson.G.(2003)Textile Res.J.73：263-267。
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本发明固有的其它优点对本领域内的技术人员是明显的。这里所述的 实施例是示例性的，并不意欲限制本发明所要求的保护范围。前述实施方 案的变体对普通技术人员是显而易见的，并包括在所附权利要求中。
相关申请的交叉参考
本申请要求2006年6月8日提交的美国临时专利申请USSN 60/811,791 的权利，其全部内容在此并入作为参考。
序列表
<110>加拿大国立研究院
Sung，Wing L.
Mark，Wood
Fang，Huang
<120>大麻纤维的提取
<130>11816-98
<150>US 60/811,791
<151>2006-06-08
<160>4
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>Erwinia carotovora
<400>1
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>Primer
<400>2
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>Erwinia carotovora
<400>3
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>Primer
<400>4
对10克加拿大大麻TAB的剥落大麻韧皮通过在85℃下在200ml含 0.8％(w/v)的柠檬酸三钠的水溶液中搅拌3小时而进行预处理。通过用在 270nm和350nm处的UV-Vis光谱测量光密度(O.D.)来监测材料向溶液 中的释放(图1)。产生合适的O.D.的稀释倍数显示在图1的括号中。经 预处理的纤维而后用水冲洗两次。
在45℃下，在200ml含有果胶酶(Novozyme Pectinase Ultra SP-L，1040 U)和5mM柠檬酸钠的pH为约4.5的水溶液中处理回收的纤维。1小时后， 回收酶溶液以重复利用。将纤维冲洗两次。该纤维为米色，容易分离成更 精细的纤维。
实施例2：提取源自中国大麻的剥落韧皮的纤维
浸泡：将10克剥落大麻韧皮浸泡在80℃下的200ml水中30分钟。
步骤1：而后在80℃下，在200ml含0.8％(w/v)的柠檬酸三钠的水溶液 中搅动纤维1小时。经处理的纤维用自来水冲洗两次。
步骤2：在步骤1之后，在80℃下，在200ml含0.8％(w/v)的柠檬酸三 钠和0.2％(w/v)的NaOH的水溶液中搅拌1.5小时。经处理的纤维用水冲洗 两次。
步骤3：在45℃下，在200ml含有果胶酶(Novozyme Pectinase Ultra SP-L， 1040U)和5mM柠檬酸钠的pH为约4.5的水溶液中处理回收的纤维。1 小时后，回收酶溶液以重复利用。将纤维冲洗两次。该纤维容易被分离成 更精细的纤维。通过用在270nm和350nm处的UV-Vis光谱测量光密度 (O.D.)来监测材料向每个溶液中的释放(图2)。产生合适的O.D.的稀释 倍数显示在图2的括号中。
实施例3：大麻纤维的软化
在实施例1和2的酶处理后，将湿的大麻纤维(5g)用120ml异丙醇 洗涤5分钟以产生有色的异丙醇溶液。倾析出该有色的异丙醇溶液，纤维 被晾干。该纤维比未用异丙醇处理的那些更软。
实施例4：在大肠杆菌中表达的胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora) 的重组多聚半乳糖醛酸酶的制备
一种重组果胶酶，即胡萝卜软腐欧氏杆菌的多聚半乳糖醛酸酶的生产 已经通过以下过程实现：(i)通过PCR从胡萝卜软腐欧氏杆菌中分离果胶 酶基因，(ii)克隆进线状质粒pTrX中，和(iii)在大肠杆菌中表达所述 基因。用于基因克隆的前体质粒pTrX以前已经被公布(Sung等人，1998 年6月2日授予Sung等人的美国专利5,759,840，其公开在此并入作为参 考)。其含有官能性里氏木酶木聚糖酶基因，并因而能表达木聚糖酶。
PCR被用于在质粒pEcp3a的构建中用PCR引物Ecp-N1a和Ecp-C1a 产生编码分泌物前导序列和成熟果胶酶的DNA片段。
Ecp-N1a
1 2 3 4 5 6 7 8
分泌物前导序列 E Y Q S G K R V
5＇-TT GCT AGC GAA TAT CAA TCA GGC AAG CGA GTT TTA TC
NheI
Ecp-C1a
379 378 377 376 375 374 373 372 371 370
中止K K V T V N K I Q W
5＇-AA AGA TCT TTA CTT CTT AAC GGT GAC GTT CTT GAT TTG CCA
BgI II
序列号1＝EYQSGKRV
序列号2＝TT GCT AGC GAA TAT CAA TCA GGC AAG CGA GTT TTA
TC
序列号3＝KKVTVNKIQW
序列号4＝AA AGA TCT TTA CTT CTT AAC GGT GAC GTT CTT GAT
TTG CCA
PCR模板是细菌胡萝卜软腐欧氏杆菌的DNA，其在正常PCR方案下 被直接释放。用引物Ecp-N1a，制备1100bp的PCR产物。该产物被限制 酶NheI和BgIII切段，并连接到NheI/BgIII-线状质粒pTrX中以产生新的质 粒pEcp3a。
随后的克隆步骤包括(i)转化成大肠杆菌HB101感受态细胞，而后 在YT板(含有5g酵母提取物、3g胰化蛋白胨、5gNaCl、1L水中15g琼 脂、1g雷马亮蓝R-D-木聚糖)和氨比西林(100mg/L)上铺开，(2)通过 木聚糖酶活性的丧失(在40℃下过夜，蓝木聚糖板上的菌群周围的透明区 或晕圈的消失)来识别含有新质粒pEcp3a的果胶酶转化体，和(3)通过 隔离的质粒pEcp3a的双脱氧核苷酸序列确定成功的克隆。
重组果胶酶的产生通过用质粒pEcp3a培养大肠杆菌转化体而完成。培 养条件包括在含有氨比西林(100mg/L)的2YT培养基(16g胰化蛋白胨、 10g酵母提取物、5gNaCl、1L水)中的5ml过夜接种菌的培养。其在被含 有氨比西林(100mg/L)的0.5L固化YT琼脂(8g酵母提取物、5g胰化蛋 白胨、5gNaCl、1L水中15g琼脂)均匀覆盖的盘(32×25cm)上铺开。培 养菌在37℃下生长。40小时后，获得用于提取果胶酶的细胞(2g)。
将所获得的细胞置于试管中用于果胶酶的冻融提取。该程序包括在干 冰/乙醇浴中5分钟的冷冻周期，随后水/冰浴10分钟。重复该程序三次。 将细胞用缓冲液(5mal，100mM柠檬酸钠，pH5.5)提取。在8000×g下离 心30分钟，得到含有果胶酶的上清液，其能直接被用于实施例5的分析化 验。
实施例5：经处理的纤维中残留的果胶的分析
果胶从大麻纤维中的去除程度通过测量果胶酶对经处理的纤维上残留 的果胶的特异水解而产生的还原糖的量来确定。
C1是未处理的大麻的对比样品。C2是用7％(w/v)NaOH在90℃下加工 的大麻的对比样品，所述加工引起纤维破坏。C3是从Aurorasilk Com. (Portland，Oregon，U.S.A.)得到的可商用化学加工大麻的对比样品。S1是依 据实施例2加工的大麻的样品。
诸如用于生产样品C3的商业方法通常包括使用高压(例如80lbs每平 方英寸)、高温(例如160℃)和高浓度的氢氧化钠(例如6％(w/v))。
所使用的果胶酶中的一种是如实施例4中制备的在大肠杆菌中表达的 胡萝卜软腐欧氏杆菌的重组多聚半乳糖醛酸酶。所使用的另一种果胶酶为 来自黑曲霉的Novozyme果胶酶(多聚半乳糖醛酸酶)。应用下列通用方法。
在400μl缓冲液(100mM柠檬酸钠，对于重组果胶酶pH5.0，对于 Novozyme果胶酶pH4.5)中含有30mg经处理的纤维和1U重组果胶酶或 20μl稀释的Novozyme果胶酶(50×稀释液)的反应混合物被加热至40℃。 1小时后，移出50μl反应溶液，并添加至1ml的10mM NaOH中以停止进 一步的水解。还原糖的量用涉及水杨酰肼试剂(HBAH)的固定方法(Lever， 1972 Analytical Biochem 47：273-279，其公开在此并入作为参考)来确定。 HBAH处理后，溶液变为黄色。还原糖的量能通过在420nm处读取O.D.， 并依照O.D.对已知量的半乳糖醛酸的标准曲线读数而确定。表1提供了结 果。
表1
样品 通过胡萝卜软腐欧氏杆菌的重 组果胶酶，过夜，从残留果胶中 释放还原糖(OD420) 通过来自黑曲霉的Novozyme果胶酶 (多聚半乳糖醛酸酶)从残留果胶中 释放还原糖(OD420) C1 2.350 1.353 C2 0.154 0.168 C3 0.169 0.334 S1 0.342 0.215
由表1明显表明，本发明的提取方法对使大麻纤维脱胶是有效的。依 据由重组细菌胡萝卜软腐欧氏杆菌果胶酶的分析，样品S1代表的实施例2 的方法没有商业方法(C3)或使用7％NaOH的方法(C2)有效，但是在 C2和C3中的条件苛刻得多，并对环境较不友好。然而，另一种由真菌黑 曲霉果胶酶的分析表现出相反顺序的有效性，S1具有比C3少的残留果胶。 尽管由两种分析试验得到略微不同的结果，但是两个试验一般都显示，相 比未处理的大麻，S1的大部分果胶被实施例2的方法去除。该实施例证明 了用于确定残留果胶的基于果胶酶的分析的有效性。
实施例6：监测纤维体(fiber mass)的柔软度的方法
除了亮度和分离度外，纤维的柔软度也是经加工的纤维的重要参数。 处理过程中监测源自硬质天然物质的纤维的逐渐软化的有效方法对最佳加 工技术的开发是有用的。
基于硬质和未分离的纤维束经得起施加在顶部的一定重量的能力已经 建立了一种监测方法，称为“坠落实验(Drop Test)”。在处理过程中， 由于湿加工纤维体的软化和分离而导致硬度的丧失将降低其经受设定重量 的抗力。所述对设定重量的抗力的逐渐丧失能通过测量纤维体在量筒中占 有的空间的减少而确定。经处理的纤维体所占有的空间是其溶胀块与由块 自身的硬度导致的空气隙的结合。
为此，将已排去溶液的湿加工纤维体放于玻璃量筒中。TeflonTM圆盘形 式的重量被轻轻地落至其顶部。通过量筒的刻度，测定纤维体所占据的体 积或空间。重复这样的测量三次，接受3次测量的平均值。随着处理的进 行，脱胶的纤维体软化，其开始丧失其经受圆盘的硬度，从而在量筒中占 据的空间逐渐减少。 实施例7：用于监测通过实施例1的2步方案的变型方式加工的加拿大大麻 纤维的“坠落试验”
五个加拿大大麻纤维的样品通过表2所列述的五个方案进行加工。S2 表示依据本发明加工的样品。实施例1的方案中的主要变化在括号中表示。 实施例1的通用条件在表2的最后一行示出作为参考。
表2
样品 步骤1 步骤2* S2 柠檬酸三钠，55℃，5小时 (55℃，5小时) Pectinase Ultra，柠檬酸钠缓冲液， 45℃ C4 柠檬酸三钠，55℃，5小时 (55℃，5小时) 柠檬酸钠缓冲液，45℃ (无果胶酶) C5 水，55℃，5小时 (无柠檬酸三钠；55℃，5小时) 水，45℃ (无果胶酶，或柠檬酸钠缓冲液) C6 水，55℃，5小时 (无柠檬酸三钠；55℃，5小时) 柠檬酸钠缓冲液，45℃ (无果胶酶) C7 不进行步骤1 Pectinase Ultra，柠檬酸钠缓冲液， 45℃ 实施例1 柠檬酸三钠，85℃，3小时 Pectinase Ultra，柠檬酸钠缓冲液， 45℃，1小时
*允许进行步骤2以显示果胶酶对纤维的作用。纤维样品用“坠落试验” 在2、4、6、24、30和48小时时监测。
为监测3g剥落加拿大大麻纤维的加工，使用高度为32cm、内径为3.8cm 和刻度2ml的标准250ml量筒。将外径为3.6cm、高度为2cm、重量为22g 并在中心垂直钻有三个直径为0.4cm的孔的环状TeflonTM圆盘轻轻置于量 筒内，使其滑至纤维体的顶部上。纤维体(膨体)所占据的空间(体积) 基于圆盘的底部相对量筒上的刻度来读取。
随着处理进行，纤维开始丧失其硬度，对抗TeflonTM圆盘的能力下降。 整个纤维体的体积变小并更软，从而在相同圆盘的重量下占有较少的空间 (表3)。
步骤1后，基于加工的纤维的膨松度，很明显的是用步骤1中的柠檬 酸三钠处理的样品S2和C4，相比仅用水加工的C5和C6(44ml和48ml 对69ml和72ml)，具有更小的体积或占有较少空间。实际上，S2和C4 在颜色上比C5和C6更浅。这证实了柠檬酸三钠在软化和亮化纤维中的有 益作用。步骤1中的柠檬酸三钠处理也增强了随后的酶步骤2的效果，如 下所示。
表3
步骤2期间，用果胶酶处理的样品S2，与受无酶的柠檬酸钠缓冲液处 理的C4(24hr内7ml)相比，其体积随时间持续较大幅地下降(24hr内12ml) (表3)。
在步骤2期间，未用果胶酶处理并且之前在步骤1中仅用水加工的样 品C5和C6在体积上随时间都显示出相对较小的下降(24hr后，C5中5ml 对C6中7ml)(表3)。然而，实际上C6比C5更亮，前者受柠檬酸钠缓 冲液处理而后者仅受水处理。
样品C7省略了柠檬酸三钠处理的步骤1而只依靠步骤2的果胶酶处 理，在体积上显示出随时间稳定的减少(表3)，与C4、C5和C6相反。 这证明果胶酶对软化纤维的本质作用。然而，在24小时(46ml对32ml) 和48小时(45ml对27ml)后，C7比S2体积更大，不像样品S2，其体积 不再进一步下降。而且，经加工的C7实际上比S2暗。S2和C7间的这些 差别证明，在大麻纤维的加工中，步骤1的柠檬酸三钠对增强随后的果胶 酶处理步骤的至关重要的作用。
确定步骤2期间释放的单糖
确定用或未用步骤2中的Pectinase Ultra释放的单糖以证明表2列述的 步骤1和2中的变化的效果。确定释放的糖的量的程序与实施例5描述的 一致。为此，移出50μl的反应上清液并添加至1ml的10mM NaOH中以停 止进一步的水解。用涉及水杨酰肼试剂(HBAH)的固定方法(Lever，1972 Analytical Biochem 47：273-279，其公开在此并入作为参考)来确定还原糖的 量。HBAH处理后，溶液变为黄色。还原糖的量能通过在420nm处的O.D. 读数来确定，如表4所示。
表4
五个样品(表4)中，仅在步骤2中用了果胶酶的S2和C7释放大量 的还原糖至上清液中。而剩余的在步骤2中未用果胶酶的三个样品中，样 品C5在过程中释放很少或不释放还原糖。
对加工的加拿大大麻纤维中保留的残留果胶的分析
除了“坠落试验”来检测纤维的硬度或柔软度外，还研究了样品S2、 C4、C5、C6和C7中的脱胶程度。为此，纤维样品中残留的果胶通过已经 在实施例5中描述的酶过程来确定。为了比较，将C3，从Aurorasilk Com. (Portland，Oregon，U.S.A)得到的可商购的化学加工大麻用作参考。来自黑曲 霉的Novozyme果胶酶(多聚半乳糖醛酸酶)被用于从样品上的任何残留果 胶中释放还原糖。从不同的纤维样品中释放的还原糖在2hr、5hr和24hr时 被测定(表5)。
表5
在酶分析(表5)中，对于在步骤1中用柠檬酸三钠处理和在步骤2中 用Pectinase Ultra处理的样品S2，在2hr、5hr和24hr时由果胶酶释放出非 常少的还原糖。这表明，与可商购的化学加工大麻样品C3相比，其仅保留 了非常少的残留果胶(在24hr时分别为0.537OD对0.548OD)。
其它样品C4、C5、C6和C7未经步骤1中的柠檬酸三钠或步骤2中的 果胶酶处理，保留了大量的果胶(在24hr时分别为2.756、2.093、5.196和 2.954 OD)。在未进行步骤1的样品C7中，单独用步骤2中的果胶酶处理 没有去除大部分果胶。结果，大量的残留果胶保留在加工的纤维C7中(表 5)。
尽管加工样品C5在坠落试验中体积最大(表3)并证明在步骤2期间 释放最少的单糖至上清液中，但与C4、C6和C7相比，在残留果胶分析中 其释放较小量的还原糖(5hr时为0.590 OD，表5)。这表明大部分果胶仍 包埋在加工样品C5中。
当已加工的样品(C5)经受另一轮更严格的加工时，证实了在C5中包 埋的果胶的存在，所述更严格的加工包括用柠檬酸三钠的步骤1(55℃， 5hr)，和用Pectinase Ultra的步骤2(柠檬酸钠缓冲液，45℃)，两个步骤 都包含柠檬酸钠，与表2中的起始设计中仅用水相对。在新的步骤2中对 上清液的分析，显示从再加工的C5中释放大量的单糖，OD在2hr和6hr 后分别为1.221和1.967。所述通过再加工样品C5释放还原糖废料与表4 中的样品S2是相当的，从而证实柠檬酸三钠在脱胶过程中的作用。
实施例8：监测通过实施例2的3步方案的变体加工的中国大麻纤维的“坠 落试验”
为了加工6g天然中国脱落大麻纤维，使用高度为32cm、内径为5.3cm 和刻度5ml的标准500ml量筒。将外径为4.8cm、高度为2cm、重量为55g 和在中心垂直钻有三个直径为0.4cm的孔的环状TeflonTM圆盘置于加工纤 维的顶部，以得到纤维体相对量筒上的刻度的体积的精确读数。
四个中国大麻纤维的样品通过表6列述的四个方案被加工。与实施例2 的方案的主要变化显示在括号中。实施例2的通用条件在表6的最后一行 显示出作为参考。
表6
样品 步骤1 步骤2 步骤3* S3 柠檬酸三钠， 80℃，1hr NaOH，柠檬酸三钠， 80℃，1.5hr Pectinase Ultra，柠檬酸 钠缓冲液，45℃ S4 柠檬酸三钠， 80℃，1hr NaOH，柠檬酸三钠， 80℃，4hr(4hr) 相同 C8 水，80℃，1hr (未用柠檬酸三钠) NaOH，水，80℃，1.5hr (未用柠檬酸三钠) 相同 C9 水，80℃，1hr (未用柠檬酸三钠) NaOH，水，80℃，4hr (未用柠檬酸三钠；4hr) 相同 实施例2 柠檬酸三钠， 80℃，1hr NaOH，柠檬酸三钠， 80℃，1.5hr Pectinase Ultra，柠檬酸 钠缓冲液，45℃，1hr
*允许进行步骤3以显示果胶酶对纤维的作用。纤维样品用“坠落试验” 在1、3、4和5hr时监测。
综上，依据本发明，样品S3和S4在步骤1和2中用柠檬酸三钠处理。 S3和S4间的区别仅是涉及NaOH的步骤2的时间由S3的1.5hr延长至S4 的4hr(表6)。样品C8和C9的条件与S3和S4的条件一样，不同之处是 在步骤1和2中都没有柠檬酸三钠。全部4个样品都最终在步骤3中用果 胶酶处理。
随着处理进行，纤维开始丧失其硬度，对抗TeflonTM圆盘的能力下降。 整个纤维体的体积变得更小并更软，从而在相同圆盘的重量下占有较少的 空间(表7)。步骤1的纤维体用上述500ml量筒测量。在步骤2和3中， 纤维体用实施例7中所述的较小的250ml量筒和较小的圆盘来测量。
表7
步骤1后，四个样品仍然非常坚硬和体积很大(145-175ml)(表7)。
在涉及氢氧化钠的步骤2中，在过程中添加了柠檬酸三钠的S3和S4 相比未用柠檬酸三钠的C8和C9(分别为60ml和49ml)具有较小的体积 (分别为46ml和42ml)，因此通常证明在过程中柠檬酸三钠在软化纤维上 的有益作用。处理的时间长短(S3和C8为1.5hr，而S4和C9为4hr)也 影响步骤2中体积的下降。
在果胶酶步骤3中，在步骤1和2中受柠檬酸三钠处理的样品S3和S4， 与C8和C9相比，随时间保持较小的体积(表7)。作为实施例，用果胶 酶5hr后，样品S3和S4的体积分别为38ml和38ml，而C8和C9分别为 48ml和40ml。这表明在步骤1和2中用柠檬酸三钠的最初处理增强了步骤 3中的果胶酶对纤维的软化效果。
对加工的中国纤维中残留的果胶的分析
除了“坠落试验”来检测纤维的硬度或柔软度外，还研究了样品S3、 S4、C8和C9中的脱胶程度。纤维样品中残留的果胶通过已经在实施例5 和7中描述的酶过程来确定。为了比较，使用C3，从Aurorasilk Com.(Portland， Oregon，U.S.A)得到的可商购的化学加工大麻。从不同的纤维样品中释放的 还原糖在2hr、5hr和24hr时被确定(表8)。
表8
在酶分析(表8)中，四个样品与商业的化学加工大麻参考样品C3相 比，在2hr、5hr和24hr时都由果胶酶释放出较少量的还原糖。这表明四个 样品保留了非常少的残留果胶，因而全部都被成功得脱胶。尽管四个加工 样品都丧失了其大部分果胶(表8)，基于坠落试验判断样品S3和S4比 C8和C9更软和硬度更低(表7)。
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本发明固有的其它优点对本领域内的技术人员是明显的。这里所述的 实施例是示例性的，并不意欲限制本发明所要求的保护范围。前述实施方 案的变体对普通技术人员是显而易见的，并包括在所附权利要求中。
相关申请的交叉参考
本申请要求2006年6月8日提交的美国临时专利申请USSN 60/811,791 的权利，其全部内容在此并入作为参考。
序列表
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Sung，Wing L.
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<150>US 60/811,791
<151>2006-06-08
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<210>1
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<212>PRT
<213>Erwinia carotovora
<400>1
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>Primer
<400>2
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>Erwinia carotovora
<400>3
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>Primer
<400>4
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