鹿角萃取液
阅读：379发布：2020-05-11
专利汇可以提供鹿角萃取液专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种析出的 鹿茸 角 萃取液，该萃取液含有的组分的主要分子量小于或等于10kDa，并且该萃取液组分对内皮细胞具有增殖效应和/或改善血管原。，下面是鹿角萃取液专利的具体信息内容。
1、一种析出的鹿茸角萃取液，该萃取液组分的分子量基本小于 或等于10kDa，且该萃取液组分对内皮细胞具有增殖效应和/或能改 善血管原。
2、根据权利要求1所述的析出的鹿茸角萃取液，其中所述的组 分为肽。
3、根据权利要求1或2所述的析出的鹿茸角萃取液，其中所述的 组分在经受至少下述一种处理过程后仍保持对内皮细胞的增殖效 应，和/或保持改善血管原的能力，上述处理过程为：加热至约100℃ 持续约3分钟；在超过2.5Mrads的γ-射线下暴露进行灭菌；或冻融。
4、权利要求1或2所述的析出的鹿茸角萃取液在制备治疗伤口药 物中的应用。
5、权利要求1或2所述的析出的鹿茸角萃取液在制备治疗顽固性 伤口的药物中的应用。
6、根据权利要求1所述的析出的鹿茸角萃取液，其中所述的组 分选自下述基团：肽、碳水化合物、核酸、自由氨基酸、脂类和生 长因子或上述的组合。
7、一种析出的鹿茸角萃取液，该萃取液至少含有权利要求1中 所述萃取液中的一种组分，该组分对内皮细胞具有增殖效应和/或改 善血管原。
8、一种析出的鹿茸角萃取液，该萃取液至少含有权利要求2中 所述萃取液中的一种组分，该组分对内皮细胞具有增殖效应和/或改 善血管原。
9、一种组合物，该组合物中含有治疗有效量的、权利要求7所 述的萃取液中的一种用于治疗伤口的组分。
10、一种组合物，该组合物中含有治疗有效量的、权利要求8所 述的萃取液中的一种用于治疗伤口的组分。
11、一种组合物，该组合物中含有治疗有效量的、权利要求2或 3或6所述的萃取液中的一种用于治疗伤口的组分。
12、一种治疗伤口的方法，该方法包括给所需动物服用权利要 求9或10或11所述的组合物的步骤。
13、此处所述的参照其中任何实例、主要用于治疗伤口的析出 的萃取液。
14、此处所述的参照其中任何实例的析出的萃取液在主要在制 备治疗伤口的药物中的应用。
15、此处所述的参照其中任何实例、主要用于治疗伤口的组合 物。
技术领域
本发明涉及一种鹿角萃取液，特别是涉及一种从鹿茸角中萃取 的血管原萃取液，以及含有所述萃取液的组合物，该组合物在医疗 实践中可用于治疗人体和动物的伤口、损伤和疾病。
背景技术
为了治愈伤口，特别是顽固性的难以愈合的伤口，需要进行输 血以滋养伤口，调治治疗过程，将伤疤的形成降低至最少。通常， 一般主要用于治疗顽固性伤口的治疗方法不能使伤口自身提供血液 供应，因而治疗的过程缓慢。
治疗慢性伤口的治疗方法有很多种。然而，使用包扎绷带仍是 常用的方法(马歇尔等人，2001)。其它可用的治疗方法和一些天然 的治疗方法已经被使用，这些治疗方法的工作原理涉及含氧量的调 节，从而可以进行高压氧治疗(森等人，2002)。
通过增加血管原(组织血管化的过程)进行伤口复原在一些治 疗方法中被采用。在最近的研究中，腺苷通过作为腺苷A(2A)受 体激动剂增加了伤口愈合的速度(蒙特茜诺斯等人，2002)。这使得 被治疗伤口的微血管的数目得到了增加。增加的腺苷是本文重点显 示的疗效改善的可能机理。
在通过基因疗法传输并确保持续传输的情况下，公知的经典血 管原的生长因子，即血管内皮生长因子(VEGF)已经显示引起了血 管原性，并改善了伤口的愈合(Deodato et al.，2002)。玛琳达等人 (1998)已经发现胸腺素α1刺激了内皮细胞的迁移、血管原和伤口 的愈合，这也证明胸腺素α1是一种潜在的伤口愈合试剂。
鹿角每年脱落和再生。鹿角在生长期时每天可以长2cm，该生 长期的角称之为“茸角”。这种生长是通过角顶间充组织的干细胞群 驱动的(李等人，2002)。茸角是高度血管化的，鹿角内的血管必须 和鹿角的生长速度相同，从而支撑鹿角的生长。我们已经确定将这 个系统作为支持血管愈合过程的血管原因子的潜在来源。
有篇文献介绍了具有治疗作用或再生功能的花梗(他们称之为 胚基)可能是潜在的血管原(Auerbach et al.，1976)。该文献的作者 筛选了包括角胚基在内的许多组织，以表明该些组织含有潜在的血 管原。然而，重要的是，该文献并没有包括任何显示血管原或伤口 疗效活性的数据。胚基在鹿角脱落时作为治疗组织，这和更加成熟 的生长鹿角不同，这点本发明的发明人将在本说明书中进行说明。
没有文献公开报道生长的鹿茸角的血管原效应。发明人已经发 现生长的茸角的全蛋白萃取液中确实含有血管原因子。
本说明书中公开的研究表明：含有这些血管原因子的鹿茸角的 萃取物从整个鹿角中萃取，而不仅仅是集中在生长的鹿角顶端。
发明人已制备了单独的肽组合物，该组合物从鹿茸角中萃取、 并具有血管原效应和能用于治疗伤口。
发明人将茸角进行分馏，以评价其潜在的血管原性。作为分馏 工艺的一部分，发明人考查了茸角的高分子量馏分和低分子量馏分， 并惊奇的发现低分子量馏分具有很好的活性。这是一个激动人心的 结果，因为较小分子量可能更稳定，不会在伤口中很快分解。
根据它们的分子量，大部分典型的血管原性生长因子可以在高 分子量的馏分中发现，其中一个例外的情况是肽中的胸腺素族。
所有的参考文献，包括说明书中引用的专利和专利申请，都作 为此处的参考。但并不是说明这种参照构成现有技术。参考文献的 讨论仅仅是依据其作者的见解，申请人保留对参考文献真实性和相 关文献的置疑。可以理解，尽管此处引用了许多公开出版物，但是 这种参照在新西兰或其它任何国家并不构成现有技术的部分。
公认的，术语“组成”可以表示为开放式的或封闭式的含义。 在本说明书中，除非特别指明，术语“组成”为开放式的含义-即 其含义为不仅包括所列的组分，也包括其它不确定的组分。这种情 况也用于方法步骤种用“所组成的”或“组成的”的术语中。
本发明的目的是为了解决上述问题，或至少给公众一个有益的 选择。
本发明进一步的技术方案和优点将通过下述说明进一步阐明。
治疗慢性伤口的治疗方法有很多种。然而，使用包扎绷带仍是 常用的方法(马歇尔等人，2001)。其它可用的治疗方法和一些天然 的治疗方法已经被使用，这些治疗方法的工作原理涉及含氧量的调 节，从而可以进行高压氧治疗(森等人，2002)。
通过增加血管原(组织血管化的过程)进行伤口复原在一些治 疗方法中被采用。在最近的研究中，腺苷通过作为腺苷A(2A)受 体激动剂增加了伤口愈合的速度(蒙特茜诺斯等人，2002)。这使得 被治疗伤口的微血管的数目得到了增加。增加的腺苷是本文重点显 示的疗效改善的可能机理。
在通过基因疗法传输并确保持续传输的情况下，公知的经典血 管原的生长因子，即血管内皮生长因子(VEGF)已经显示引起了血 管原性，并改善了伤口的愈合(Deodato et al.，2002)。玛琳达等人 (1998)已经发现胸腺素α1刺激了内皮细胞的迁移、血管原和伤口 的愈合，这也证明胸腺素α1是一种潜在的伤口愈合试剂。
鹿角每年脱落和再生。鹿角在生长期时每天可以长2cm，该生 长期的角称之为“茸角”。这种生长是通过角顶间充组织的干细胞群 驱动的(李等人，2002)。茸角是高度血管化的，鹿角内的血管必须 和鹿角的生长速度相同，从而支撑鹿角的生长。我们已经确定将这 个系统作为支持血管愈合过程的血管原因子的潜在来源。
有篇文献介绍了具有治疗作用或再生功能的花梗(他们称之为 胚基)可能是潜在的血管原(Auerbach et al.，1976)。该文献的作者 筛选了包括角胚基在内的许多组织，以表明该些组织含有潜在的血 管原。然而，重要的是，该文献并没有包括任何显示血管原或伤口 疗效活性的数据。胚基在鹿角脱落时作为治疗组织，这和更加成熟 的生长鹿角不同，这点本发明的发明人将在本说明书中进行说明。
没有文献公开报道生长的鹿茸角的血管原效应。发明人已经发 现生长的茸角的全蛋白萃取液中确实含有血管原因子。
本说明书中公开的研究表明：含有这些血管原因子的鹿茸角的 萃取物从整个鹿角中萃取，而不仅仅是集中在生长的鹿角顶端。
发明人已制备了单独的肽组合物，该组合物从鹿茸角中萃取、 并具有血管原效应和能用于治疗伤口。
发明人将茸角进行分馏，以评价其潜在的血管原性。作为分馏 工艺的一部分，发明人考查了茸角的高分子量馏分和低分子量馏分， 并惊奇的发现低分子量馏分具有很好的活性。这是一个激动人心的 结果，因为较小分子量可能更稳定，不会在伤口中很快分解。
根据它们的分子量，大部分典型的血管原性生长因子可以在高 分子量的馏分中发现，其中一个例外的情况是肽中的胸腺素族。
所有的参考文献，包括说明书中引用的专利和专利申请，都作 为此处的参考。但并不是说明这种参照构成现有技术。参考文献的 讨论仅仅是依据其作者的见解，申请人保留对参考文献真实性和相 关文献的置疑。可以理解，尽管此处引用了许多公开出版物，但是 这种参照在新西兰或其它任何国家并不构成现有技术的部分。
公认的，术语“组成”可以表示为开放式的或封闭式的含义。 在本说明书中，除非特别指明，术语“组成”为开放式的含义-即 其含义为不仅包括所列的组分，也包括其它不确定的组分。这种情 况也用于方法步骤种用“所组成的”或“组成的”的术语中。
本发明的目的是为了解决上述问题，或至少给公众一个有益的 选择。
本发明进一步的技术方案和优点将通过下述说明进一步阐明。
发明内容
根据本发明中的一技术方案，其提供了一种析出的鹿茸萃取液， 该萃取液中含有的组分的分子量基本小于或等于10kDa，这些组分对 内皮细胞有增殖效应和/或促进血管原。
根据本发明的另一技术方案，其提供了一从鹿茸中得到的析出 的肽萃取液，其中肽的主要分子量小于或等于10kDa，这些组分对 内皮细胞有增殖效应和/或促进血管原。
根据本发明的另一技术方案，其主要提供了如上所述的析出的 萃取液，其中的组分对内皮细胞具有血管原效应和/或改善血管原， 其中的组分用下述至少一种工艺进行处理：约用3分钟加热到约100 ℃；用超过2.5毫拉德(mrads)的γ-射线灭菌；或冻融。
根据本发明的另一技术方案，其主要提供了如上所述的析出的 萃取液，其中的组分对内皮细胞具有增殖效应，和/或改善血管原， 其中的组分用下述至少一种工艺进行处理：约用3分钟加热到约100 ℃；用超过2.5毫拉德(mrads)的γ-射线灭菌；或冻融。
根据本发明的另一技术方案，其公开了从鹿茸中萃取的组分在 制备治疗伤口的药剂中的应用。
根据本发明的另一技术方案，其公开了从鹿茸中萃取的肽在制 备治疗伤口的药剂中的应用。
根据本发明的另一技术方案，其公开了从鹿茸中萃取的组分在 制备治疗顽固性伤口药剂的中的应用。
根据本发明的另一技术方案，其公开了从鹿茸中萃取的肽在制 备治疗顽固性伤口药剂的中的应用。
进一步根据本发明的技术方案，其提供了至少含有一种来自上 述萃取液的组分的析出的萃取液，其中该组分对内皮细胞具有增殖 效应和/或改善血管原。
进一步根据本发明的技术方案，其提供了至少含有一种来自上 述萃取液的肽的析出的萃取液，其中该肽对内皮细胞具有增殖效应 和/或改善血管原。
进一步根据本发明的技术方案，其提供了一种治疗伤口的方法， 该方法包括向所需的动物注射上述组合物的步骤。
进一步根据本发明的技术方案，其提供了一种组合物，该组合 物含有治疗有效量的上述肽，以治疗伤口。
应该注意的是，不同剂型的组合物包含在本发明的范围内。例 如，组合物的剂型可以是：凝胶、洗液、膏状物、喷雾、敷料或本 领域技术人员所知的类似物。
此处所用的术语“肽”指的是鹿茸中存在的任意一种肽或肽的 组合，包括肽、蛋白质和含有氨基酸聚合物的多肽；也包括肽、蛋 白质和改性后的多肽，该改性后的多肽包括但不限于糖类和/或脂类 部分。
此处所用的术语“组分”指的是鹿茸中出现的任意一种组分或 其结合，包括但不限于肽、糖类、核酸、自由氨基酸、脂类和生长 因子。
此处所用的术语“增殖效应”指的是本发明中的萃取液或组合 物致使细胞和/或组织快速生长和/或繁殖产生新的细胞或组织的能 力。
此处所用的术语“内皮细胞”指的是组成内皮的细胞，该内皮 位于血管内壁。血管包括动脉和静脉血管，以及毛细血管、冠状血 管和心脏内的血管。
此处所用的术语“伤口”指的是皮肤的受伤，组织或器官被撕 裂、刺穿、切开或其它的分裂或裂口，从而导致的疾病、事故或手 术。该术语指的是疼痛或受伤；包括溃疡。
此处所用的术语“顽固性伤口”指的是那些缓慢愈合、持续很 长时间的伤口。该术语也指慢性伤口。
此处所用的术语“冻融”指的是将本发明中的肽在约-20℃下升 至室温约18-25℃。
本发明中的肽的分子量在不超出本发明范围的情况下可由不同 方法测定。
通常，本发明中的肽的分子量可由凝胶过滤色谱法、电泳、质 谱分析或其它合适的方法进行测定。
此处所用的术语“鹿茸”、“鹿茸角”、“鹿角”指的是未成熟鹿 角的任意部分；通常包含鹿角的所有部分和类型。然而，在优选的 技术方案中，在制备血管原萃取液时可以除去茸皮，邻近主干部分 的基体区和褐色部分的下部也是排除的。
鹿茸是一种复杂的组织，一旦干燥后，主要由肽、蛋白质和矿 物质组成，但其中也含有其它的组分如糖类、脂类和自由氨基酸。 因此，鹿茸的萃取物也含有溶于萃取液溶剂的各种组分的混合物。 当用水溶液进行萃取时，萃取液的主要组分是肽或蛋白质(Sunwoo et al.，1995)。
通常，鹿茸采自马鹿。然而，其它种类的鹿，如麋鹿、不孕期 或白尾鹿，也可以作为鹿茸的来源。
此处所用的术语“血管原的”或“血管原”指的是物质诱导血 管生长的能力。
优选的，鹿茸在生长阶段收集。然而，这并不是对本发明的限 制，因为从成熟鹿角中得到的鹿茸也可以用于本发明。
鹿茸可以通过下述一种或多种方法处理进行保藏“冷冻—干燥， 冷冻，热浸或炉子干燥。然而，这不应看作对本发明范围的限制。
优选的，鹿茸用热浸法处理。
本发明的组分可以包括任何药学上或兽医学上可接受的载体、 赋形剂、稳定剂和/或其它本领域技术人员可以理解的配方添加剂。
鹿茸可以用多种不同的方法进行萃取，并不超出本发明的范围。
在一优选的实施例中，萃取可以使用有机溶剂。
在另一优选实施例中，萃取可以使用水溶液。
此处所用的术语“全蛋白萃取液“指的是水溶液萃取液，该萃 取液在制备时没有对包含在萃取液中的肽或蛋白质的分子量进行控 制。通过定义，全蛋白萃取液也可以含有鹿茸中不是肽或蛋白质、 而是和肽或蛋白质一起萃取的其它水溶性组分。
本发明中的鹿茸萃取液可以通过多种不同的方法分馏生产低分 子量馏分，这些方法如超滤法、凝胶过滤色谱法、透析法或通过使 用有机溶剂的方法。然而，由于也可以使用其它合适的方法，上述 列举并不是用于对本发明的限制。
在一优选的实施例中，分馏法在鹿茸用水溶液进行萃取前，用 70％的乙醇作为有机溶剂对鹿茸进行了浸泡。此处所用的术语“乙 醇预处理后的萃取液”指的是用这种方法制备的萃取液。
在另一优选的实施例中，分馏法在鹿茸全蛋白萃取液的水溶液 中加入了冷乙醇，从而将高分子量蛋白质沉淀下来，然后通过离心 过滤或过滤除去这些高分子量蛋白质。此处所用的术语“乙醇沉淀 的萃取液”指的是用这种方法制备的萃取液。
在进一步的实施例中，分馏法可以使用超滤法。
通常，本发明最终的鹿茸萃取液可以是水溶液、干燥的多孔固 体或冻干粉末。然而，这些不应看作是对本发明范围的限制。
优选的，水溶液的溶剂可以是水、磷酸缓冲液(PBS)或其它合 适的水溶剂。
除了上述公开的关于萃取的优选方法，本领域的技术人员可以 从专利申请NZ524868和PCT申请PCT/NZ2004/000058中得到有关萃 取的详细叙述。
综上所述，本发明的优选实施例和现有技术相比，具有如下优 点：
1、提供了一种从鹿茸中获得血管原组合物的萃取方法；
2、提供了一种来自鹿茸并具有血管原效应的组合物；
3、提供了一种来自鹿茸并能用于治疗伤口或损伤的组合物；
4、提供了一种来自鹿茸并能用于顽固性伤口治疗的组合物。
附图说明
通过下述实例和附图的说明，对本发明进一步的技术方案进行 了充分的公开。其中附图说明如下：
图1：通过对全蛋白萃取液进行超滤作用得到的鹿茸中的高分子 量馏分的凝胶过滤色谱图。色谱图显示了分子量的近似分布，虚线 表示的是期望得到的10kDa蛋白质的位置。
图2：通过对全蛋白萃取液进行超滤作用得到的鹿茸中的低分子 量馏分的凝胶过滤色谱图。色谱图显示了分子量的近似分布，虚线 表示的是期望得到的10kDa蛋白质的位置。
图3：鹿茸中全蛋白萃取液的凝胶过滤色谱图。色谱图显示了分 子量的近似分布，虚线表示的是期望得到的10kDa蛋白质的位置。
图4：通过用70％乙醇预处理后的水溶液萃取液而得到的低分子 量萃取液的凝胶过滤色谱图。色谱图显示了分子量的近似分布，虚 线表示的是期望得到的10kDa蛋白质的位置。
图5：通过用70％乙醇预处理鹿茸得到的低分子量鹿茸萃取液 (“LMW Extract”)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，以及鹿茸的全 蛋白萃取液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图(“TP Extract”)。(A)用 库马西亮蓝G250染色；(B)然后用银进行染色。通道(lanes)中含 有5、10、25或50ug的萃取液。分子量标记的混合物(“MW Markers”) 设置在凝胶的第一和最后通道中，标记蛋白质的分子量在另一张图 中有显示。
图6：柱状图显示了不同鹿角萃取液在响应1％血清(“对照”)、 沸腾前的全部蛋白质鹿茸萃取液(“全蛋白萃取液”)和沸腾3分钟后 的部蛋白质鹿茸萃取液(“沸腾的全蛋白萃取液”)、或低分子量萃取 液(通过70％乙醇的预处理进行制备)(“低分子量萃取液”)对人 脐静脉内皮细胞系的增殖效应。鹿茸萃取液的使用浓度为500ug/ml， 并含有1％的血清(serum)。
图7：该曲线显示了细胞迁移的试验结果。BAE细胞的迁移响应 1％血清(“对照”)、全部蛋白质鹿茸萃取液(“全部蛋白质”)、用乙 醇沉淀后得到的低分子量萃取液(“乙醇沉淀物”)、或通过超滤作用 得到的低分子量萃取液(“超滤液”)。鹿茸萃取液的使用浓度为 100ug/ml和500ug/ml，并含有1％的血清。
图8：显示细胞迁移试验结果的另一曲线。BAE细胞的迁移响应 1％血清(“对照”)或低分子量鹿茸萃取液(通过70％的乙醇预处理 萃取得到)之前(“AE”)和沸腾3分钟之后(“沸腾的AE”)。鹿茸萃 取液的使用浓度为100ug/ml和500ug/ml，并含有1％的血清。
图9：在茸角顶部的前软骨区域通过VEGF探针得到的原位杂交 的图片。A)反义探针的亮区；B)显示杂交区域反义探针的暗区； C)同义探针的亮区；D)仅显示背景的同义探针的暗区。其中， *标记的前软骨区；V标记的是血管。
图10：该曲线显示了老鼠伤口治疗试验的结果。伤口用25ul的盐 水(“对照”)或用低分子量鹿茸萃取液(在盐水中的浓度为1mg/ml) (“治疗”)进行治疗。低分子量萃取液用乙醇预处理进行萃取制得。 药剂在0、2、4、7和10天使用。显示的数据是受伤后每天伤口的平 均尺寸占原始伤口尺寸的百分比。在2、4、7、10、14和17天时显示 的误差棒是平均值之间的标准误差。带星号的重要水平是：*P＜0.05， **P＜0.01。
图11：曲线显示了老鼠伤口治疗试验的结果，该试验考查了低 分子量萃取液剂量对老鼠伤口愈合的影响；其中低分子量萃取液用 70％乙醇预处理鹿茸后用水溶液萃取得到。伤口用25ul的盐水(“对 照”)或含有低分子量鹿茸萃取液的盐水(“治疗”)处理。低分子量 萃取液用乙醇预处理后萃取得到，使用的浓度为(a)0.1mg/ml (b)2 mg/ml (c)10mg/ml (d)100mg/ml。药剂于0、2、4、6、8和10天 使用，除了100mg/ml在第10天没有使用外。显示的数据是受伤后每 天伤口的平均尺寸占原始伤口尺寸的百分比。在2、4、6、8、10、 12、14和16天时显示的误差棒是平均值之间的标准误差。带星号的 重要水平是：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图12：曲线显示了老鼠伤口治疗试验的结果，该试验考查了低 分子量萃取液使用频率对老鼠伤口愈合的影响；其中低分子量萃取 液用70％乙醇预处理鹿茸后用水溶液萃取得到。伤口用25ul的盐水 (“对照”)或含有低分子量鹿茸萃取液的盐水(“治疗”)处理。低 分子量萃取液用乙醇预处理后萃取得到。在(a)在0、2、4、6、8 和10天多次使用，剂量为10mg/ml；而(b)在0天使用一次，剂量 为10mg/ml。显示的数据是受伤后每天伤口的平均尺寸占原始伤口 尺寸的百分比。在2、4、6、8、10、12、14和16天时显示的误差棒 是平均值之间的标准误差。带星号的重要水平是：*P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001。
图13：曲线显示了老鼠伤口治疗试验的结果，该试验考查了低 分子量萃取液不同配方对老鼠伤口愈合的影响；其中低分子量萃取 液用70％乙醇预处理鹿茸后用水溶液萃取得到。伤口用25ul含有(“治 疗”)和不含有(“对照”)低分子量鹿茸萃取液的不同制剂进行处理。 低分子量萃取液用乙醇预处理后萃取得到。已处理的伤口在0、2、4、 6和8天时用萃取液进行处理，萃取液在(a)磷酸缓冲液(PBS)、(b) 甲基纤维素E-4M凝胶、(c)聚醚(聚醚)F-127凝胶或(d)聚羰乙 烯-934P凝胶中的浓度为2mg/ml。显示的数据是受伤后每天伤口的平 均尺寸占原始伤口尺寸的百分比。在2、4、6、8、10、12、14和16 天时显示的误差棒是平均值之间的标准误差。带星号的重要水平是： *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图14：图片显示了伤口的组织，马氏染色法(Masson′s Trichrome staining)显示了伤口组织在单独使用低分子量鹿茸萃取液(“治疗”) 或PBS(“对照”)4天后的情况。低分子量萃取液用乙醇预处理后萃 取得到。(A)是对照伤口的放大图，其中Punch Biopsy(局部切片) 在水平线右侧很明显。对照伤口较大的放大图(C)显示了伤口表面 的伤疤(S)和下面的伤口组织(WT)。用低分子量萃取液治疗后的 局部切片在(B)中是明显的。治疗后的伤口的更大的放大图(D) 显示了真皮组织(DT)、血管空间以及形成的表皮(E)。(A)和(B) 的柱状比例为200um，(C)和(D)的柱状比例为100um。
图15：单独使用低分子量鹿茸萃取液(“治疗”)或PBS(“对照”) 4天后的伤口组织的板层素免疫组织(Laminin immunohistochemistry)。低分子量萃取液用乙醇预处理后萃取得到。 (A)在对照伤口中，板层素仅仅在伤口边缘的组织中发现，在局部 切片中没有。(B)在治疗的伤口中，板层素在伤口边缘和伤口中都 有发现。(C)(A)中对照伤口的较大放大图中有很少可以看到的血 管。(D)(B)中治疗的伤口的较大放大图中的基体血管和新血管下 的上皮细胞是可见的。(E)(A)中伤口边缘的较大放大图仅显示了 没有受伤的组织。(F)用于板层素抗体的兔子免疫球蛋白对照中没 有发现信号。(A)和(B)的柱状比例为200um，(C)和(D)的柱 状比例为100um。
根据本发明的另一技术方案，其提供了一从鹿茸中得到的析出 的肽萃取液，其中肽的主要分子量小于或等于10kDa，这些组分对 内皮细胞有增殖效应和/或促进血管原。
根据本发明的另一技术方案，其主要提供了如上所述的析出的 萃取液，其中的组分对内皮细胞具有血管原效应和/或改善血管原， 其中的组分用下述至少一种工艺进行处理：约用3分钟加热到约100 ℃；用超过2.5毫拉德(mrads)的γ-射线灭菌；或冻融。
根据本发明的另一技术方案，其主要提供了如上所述的析出的 萃取液，其中的组分对内皮细胞具有增殖效应，和/或改善血管原， 其中的组分用下述至少一种工艺进行处理：约用3分钟加热到约100 ℃；用超过2.5毫拉德(mrads)的γ-射线灭菌；或冻融。
根据本发明的另一技术方案，其公开了从鹿茸中萃取的组分在 制备治疗伤口的药剂中的应用。
根据本发明的另一技术方案，其公开了从鹿茸中萃取的肽在制 备治疗伤口的药剂中的应用。
根据本发明的另一技术方案，其公开了从鹿茸中萃取的组分在 制备治疗顽固性伤口药剂的中的应用。
根据本发明的另一技术方案，其公开了从鹿茸中萃取的肽在制 备治疗顽固性伤口药剂的中的应用。
进一步根据本发明的技术方案，其提供了至少含有一种来自上 述萃取液的组分的析出的萃取液，其中该组分对内皮细胞具有增殖 效应和/或改善血管原。
进一步根据本发明的技术方案，其提供了至少含有一种来自上 述萃取液的肽的析出的萃取液，其中该肽对内皮细胞具有增殖效应 和/或改善血管原。
进一步根据本发明的技术方案，其提供了一种治疗伤口的方法， 该方法包括向所需的动物注射上述组合物的步骤。
进一步根据本发明的技术方案，其提供了一种组合物，该组合 物含有治疗有效量的上述肽，以治疗伤口。
应该注意的是，不同剂型的组合物包含在本发明的范围内。例 如，组合物的剂型可以是：凝胶、洗液、膏状物、喷雾、敷料或本 领域技术人员所知的类似物。
此处所用的术语“肽”指的是鹿茸中存在的任意一种肽或肽的 组合，包括肽、蛋白质和含有氨基酸聚合物的多肽；也包括肽、蛋 白质和改性后的多肽，该改性后的多肽包括但不限于糖类和/或脂类 部分。
此处所用的术语“组分”指的是鹿茸中出现的任意一种组分或 其结合，包括但不限于肽、糖类、核酸、自由氨基酸、脂类和生长 因子。
此处所用的术语“增殖效应”指的是本发明中的萃取液或组合 物致使细胞和/或组织快速生长和/或繁殖产生新的细胞或组织的能 力。
此处所用的术语“内皮细胞”指的是组成内皮的细胞，该内皮 位于血管内壁。血管包括动脉和静脉血管，以及毛细血管、冠状血 管和心脏内的血管。
此处所用的术语“伤口”指的是皮肤的受伤，组织或器官被撕 裂、刺穿、切开或其它的分裂或裂口，从而导致的疾病、事故或手 术。该术语指的是疼痛或受伤；包括溃疡。
此处所用的术语“顽固性伤口”指的是那些缓慢愈合、持续很 长时间的伤口。该术语也指慢性伤口。
此处所用的术语“冻融”指的是将本发明中的肽在约-20℃下升 至室温约18-25℃。
本发明中的肽的分子量在不超出本发明范围的情况下可由不同 方法测定。
通常，本发明中的肽的分子量可由凝胶过滤色谱法、电泳、质 谱分析或其它合适的方法进行测定。
此处所用的术语“鹿茸”、“鹿茸角”、“鹿角”指的是未成熟鹿 角的任意部分；通常包含鹿角的所有部分和类型。然而，在优选的 技术方案中，在制备血管原萃取液时可以除去茸皮，邻近主干部分 的基体区和褐色部分的下部也是排除的。
鹿茸是一种复杂的组织，一旦干燥后，主要由肽、蛋白质和矿 物质组成，但其中也含有其它的组分如糖类、脂类和自由氨基酸。 因此，鹿茸的萃取物也含有溶于萃取液溶剂的各种组分的混合物。 当用水溶液进行萃取时，萃取液的主要组分是肽或蛋白质(Sunwoo et al.，1995)。
通常，鹿茸采自马鹿。然而，其它种类的鹿，如麋鹿、不孕期 或白尾鹿，也可以作为鹿茸的来源。
此处所用的术语“血管原的”或“血管原”指的是物质诱导血 管生长的能力。
优选的，鹿茸在生长阶段收集。然而，这并不是对本发明的限 制，因为从成熟鹿角中得到的鹿茸也可以用于本发明。
鹿茸可以通过下述一种或多种方法处理进行保藏“冷冻—干燥， 冷冻，热浸或炉子干燥。然而，这不应看作对本发明范围的限制。
优选的，鹿茸用热浸法处理。
本发明的组分可以包括任何药学上或兽医学上可接受的载体、 赋形剂、稳定剂和/或其它本领域技术人员可以理解的配方添加剂。
鹿茸可以用多种不同的方法进行萃取，并不超出本发明的范围。
在一优选的实施例中，萃取可以使用有机溶剂。
在另一优选实施例中，萃取可以使用水溶液。
此处所用的术语“全蛋白萃取液“指的是水溶液萃取液，该萃 取液在制备时没有对包含在萃取液中的肽或蛋白质的分子量进行控 制。通过定义，全蛋白萃取液也可以含有鹿茸中不是肽或蛋白质、 而是和肽或蛋白质一起萃取的其它水溶性组分。
本发明中的鹿茸萃取液可以通过多种不同的方法分馏生产低分 子量馏分，这些方法如超滤法、凝胶过滤色谱法、透析法或通过使 用有机溶剂的方法。然而，由于也可以使用其它合适的方法，上述 列举并不是用于对本发明的限制。
在一优选的实施例中，分馏法在鹿茸用水溶液进行萃取前，用 70％的乙醇作为有机溶剂对鹿茸进行了浸泡。此处所用的术语“乙 醇预处理后的萃取液”指的是用这种方法制备的萃取液。
在另一优选的实施例中，分馏法在鹿茸全蛋白萃取液的水溶液 中加入了冷乙醇，从而将高分子量蛋白质沉淀下来，然后通过离心 过滤或过滤除去这些高分子量蛋白质。此处所用的术语“乙醇沉淀 的萃取液”指的是用这种方法制备的萃取液。
在进一步的实施例中，分馏法可以使用超滤法。
通常，本发明最终的鹿茸萃取液可以是水溶液、干燥的多孔固 体或冻干粉末。然而，这些不应看作是对本发明范围的限制。
优选的，水溶液的溶剂可以是水、磷酸缓冲液(PBS)或其它合 适的水溶剂。
除了上述公开的关于萃取的优选方法，本领域的技术人员可以 从专利申请NZ524868和PCT申请PCT/NZ2004/000058中得到有关萃 取的详细叙述。
综上所述，本发明的优选实施例和现有技术相比，具有如下优 点：
1、提供了一种从鹿茸中获得血管原组合物的萃取方法；
2、提供了一种来自鹿茸并具有血管原效应的组合物；
3、提供了一种来自鹿茸并能用于治疗伤口或损伤的组合物；
4、提供了一种来自鹿茸并能用于顽固性伤口治疗的组合物。
附图说明
通过下述实例和附图的说明，对本发明进一步的技术方案进行 了充分的公开。其中附图说明如下：
图1：通过对全蛋白萃取液进行超滤作用得到的鹿茸中的高分子 量馏分的凝胶过滤色谱图。色谱图显示了分子量的近似分布，虚线 表示的是期望得到的10kDa蛋白质的位置。
图2：通过对全蛋白萃取液进行超滤作用得到的鹿茸中的低分子 量馏分的凝胶过滤色谱图。色谱图显示了分子量的近似分布，虚线 表示的是期望得到的10kDa蛋白质的位置。
图3：鹿茸中全蛋白萃取液的凝胶过滤色谱图。色谱图显示了分 子量的近似分布，虚线表示的是期望得到的10kDa蛋白质的位置。
图4：通过用70％乙醇预处理后的水溶液萃取液而得到的低分子 量萃取液的凝胶过滤色谱图。色谱图显示了分子量的近似分布，虚 线表示的是期望得到的10kDa蛋白质的位置。
图5：通过用70％乙醇预处理鹿茸得到的低分子量鹿茸萃取液 (“LMW Extract”)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，以及鹿茸的全 蛋白萃取液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图(“TP Extract”)。(A)用 库马西亮蓝G250染色；(B)然后用银进行染色。通道(lanes)中含 有5、10、25或50ug的萃取液。分子量标记的混合物(“MW Markers”) 设置在凝胶的第一和最后通道中，标记蛋白质的分子量在另一张图 中有显示。
图6：柱状图显示了不同鹿角萃取液在响应1％血清(“对照”)、 沸腾前的全部蛋白质鹿茸萃取液(“全蛋白萃取液”)和沸腾3分钟后 的部蛋白质鹿茸萃取液(“沸腾的全蛋白萃取液”)、或低分子量萃取 液(通过70％乙醇的预处理进行制备)(“低分子量萃取液”)对人 脐静脉内皮细胞系的增殖效应。鹿茸萃取液的使用浓度为500ug/ml， 并含有1％的血清(serum)。
图7：该曲线显示了细胞迁移的试验结果。BAE细胞的迁移响应 1％血清(“对照”)、全部蛋白质鹿茸萃取液(“全部蛋白质”)、用乙 醇沉淀后得到的低分子量萃取液(“乙醇沉淀物”)、或通过超滤作用 得到的低分子量萃取液(“超滤液”)。鹿茸萃取液的使用浓度为 100ug/ml和500ug/ml，并含有1％的血清。
图8：显示细胞迁移试验结果的另一曲线。BAE细胞的迁移响应 1％血清(“对照”)或低分子量鹿茸萃取液(通过70％的乙醇预处理 萃取得到)之前(“AE”)和沸腾3分钟之后(“沸腾的AE”)。鹿茸萃 取液的使用浓度为100ug/ml和500ug/ml，并含有1％的血清。
图9：在茸角顶部的前软骨区域通过VEGF探针得到的原位杂交 的图片。A)反义探针的亮区；B)显示杂交区域反义探针的暗区； C)同义探针的亮区；D)仅显示背景的同义探针的暗区。其中， *标记的前软骨区；V标记的是血管。
图10：该曲线显示了老鼠伤口治疗试验的结果。伤口用25ul的盐 水(“对照”)或用低分子量鹿茸萃取液(在盐水中的浓度为1mg/ml) (“治疗”)进行治疗。低分子量萃取液用乙醇预处理进行萃取制得。 药剂在0、2、4、7和10天使用。显示的数据是受伤后每天伤口的平 均尺寸占原始伤口尺寸的百分比。在2、4、7、10、14和17天时显示 的误差棒是平均值之间的标准误差。带星号的重要水平是：*P＜0.05， **P＜0.01。
图11：曲线显示了老鼠伤口治疗试验的结果，该试验考查了低 分子量萃取液剂量对老鼠伤口愈合的影响；其中低分子量萃取液用 70％乙醇预处理鹿茸后用水溶液萃取得到。伤口用25ul的盐水(“对 照”)或含有低分子量鹿茸萃取液的盐水(“治疗”)处理。低分子量 萃取液用乙醇预处理后萃取得到，使用的浓度为(a)0.1mg/ml (b)2 mg/ml (c)10mg/ml (d)100mg/ml。药剂于0、2、4、6、8和10天 使用，除了100mg/ml在第10天没有使用外。显示的数据是受伤后每 天伤口的平均尺寸占原始伤口尺寸的百分比。在2、4、6、8、10、 12、14和16天时显示的误差棒是平均值之间的标准误差。带星号的 重要水平是：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图12：曲线显示了老鼠伤口治疗试验的结果，该试验考查了低 分子量萃取液使用频率对老鼠伤口愈合的影响；其中低分子量萃取 液用70％乙醇预处理鹿茸后用水溶液萃取得到。伤口用25ul的盐水 (“对照”)或含有低分子量鹿茸萃取液的盐水(“治疗”)处理。低 分子量萃取液用乙醇预处理后萃取得到。在(a)在0、2、4、6、8 和10天多次使用，剂量为10mg/ml；而(b)在0天使用一次，剂量 为10mg/ml。显示的数据是受伤后每天伤口的平均尺寸占原始伤口 尺寸的百分比。在2、4、6、8、10、12、14和16天时显示的误差棒 是平均值之间的标准误差。带星号的重要水平是：*P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001。
图13：曲线显示了老鼠伤口治疗试验的结果，该试验考查了低 分子量萃取液不同配方对老鼠伤口愈合的影响；其中低分子量萃取 液用70％乙醇预处理鹿茸后用水溶液萃取得到。伤口用25ul含有(“治 疗”)和不含有(“对照”)低分子量鹿茸萃取液的不同制剂进行处理。 低分子量萃取液用乙醇预处理后萃取得到。已处理的伤口在0、2、4、 6和8天时用萃取液进行处理，萃取液在(a)磷酸缓冲液(PBS)、(b) 甲基纤维素E-4M凝胶、(c)聚醚(聚醚)F-127凝胶或(d)聚羰乙 烯-934P凝胶中的浓度为2mg/ml。显示的数据是受伤后每天伤口的平 均尺寸占原始伤口尺寸的百分比。在2、4、6、8、10、12、14和16 天时显示的误差棒是平均值之间的标准误差。带星号的重要水平是： *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图14：图片显示了伤口的组织，马氏染色法(Masson′s Trichrome staining)显示了伤口组织在单独使用低分子量鹿茸萃取液(“治疗”) 或PBS(“对照”)4天后的情况。低分子量萃取液用乙醇预处理后萃 取得到。(A)是对照伤口的放大图，其中Punch Biopsy(局部切片) 在水平线右侧很明显。对照伤口较大的放大图(C)显示了伤口表面 的伤疤(S)和下面的伤口组织(WT)。用低分子量萃取液治疗后的 局部切片在(B)中是明显的。治疗后的伤口的更大的放大图(D) 显示了真皮组织(DT)、血管空间以及形成的表皮(E)。(A)和(B) 的柱状比例为200um，(C)和(D)的柱状比例为100um。
图15：单独使用低分子量鹿茸萃取液(“治疗”)或PBS(“对照”) 4天后的伤口组织的板层素免疫组织(Laminin immunohistochemistry)。低分子量萃取液用乙醇预处理后萃取得到。 (A)在对照伤口中，板层素仅仅在伤口边缘的组织中发现，在局部 切片中没有。(B)在治疗的伤口中，板层素在伤口边缘和伤口中都 有发现。(C)(A)中对照伤口的较大放大图中有很少可以看到的血 管。(D)(B)中治疗的伤口的较大放大图中的基体血管和新血管下 的上皮细胞是可见的。(E)(A)中伤口边缘的较大放大图仅显示了 没有受伤的组织。(F)用于板层素抗体的兔子免疫球蛋白对照中没 有发现信号。(A)和(B)的柱状比例为200um，(C)和(D)的柱 状比例为100um。
具体实施方式
试验部分
方法
组织的采集：
鹿茸角是采自3岁的马鹿，且在上次鹿角脱落后生长了55-60 天。
鹿茸的采集是根据新西兰惠灵顿农业和渔业部1993年7月制定 的“在采集鹿角期间保护鹿的福利权的最低标准和建议的法则”进 行的。
鹿茸通过热浸法或冻干法进行商业处理。热浸法是中国的传统 方法，其中鹿角的茎从底部悬挂(即尖端向下)，并反复浸渍到几 乎沸腾的水中一段时间。浸渍后，鹿角在再次浸渍前可以冷却。浸 渍持续至鹿角切割底部中出现清晰的血浆泡沫。然后，鹿角于温度 约为15℃、低湿度的干燥器放置数周，直至鹿角干燥。
选择处理过的鹿角(热浸或冻干)。茸角的表皮用锐利的刀从 鹿角中除去。生长55-60天的马鹿角的所有部分都包含在内，但干 茎的底部区域排除在外，包括额痕(brow tynes)。茸角用带锯切成 1-2cm厚的环状物，然后用凿子凿成小的几厘米大小的块状物，再 用0.5mm孔径的研磨机研磨成粉状物。
萃取和分馏
鹿茸萃取和分馏后，得到富含血管原生长因子的低分子量馏 分。这种馏分可以用多种方法制备，其中包括超滤、透析、凝胶过 滤色谱、通过使用有机溶剂(如乙醇)对高分子蛋白质进行沉淀或 通过用有机溶剂(如70％的乙醇)对鹿茸角进行预处理后再用水溶 液进行萃取。此处用的生产萃取液的三种方法是超滤、用乙醇对高 分子量馏分进行沉淀，以及用70％乙醇预处理鹿茸角后用水溶液萃 取。
鹿茸角的萃取和通过超滤的分馏
鹿茸角全蛋白萃取液的制备
磷酸缓冲萃取液用5g冻干的茸角粉末和100ml磷酸缓冲液制 得。磷酸缓冲液含有磷酸氢二钠(1.15g/l)、磷酸二氢钾(0.24g/l)、 氯化钾(0.2g/l)和氯化钠(0.8g/l)。混合物在室温下搅拌1小时， 然后用玻璃纤维滤纸(瓦特曼GF/A)进行过滤。过滤在4℃、 11500rpm的条件下离心30分钟。上清液(93ml)缓慢倒入称过重 的舒特瓶(Schott bottle)中，然后在15℃冻干前冷冻分离。
鹿茸角全蛋白萃取液通过超滤进行的分馏
鹿茸磷酸缓冲液(15mg)溶于去离子水中，使其浓度为1mg/ml； 将该缓冲液缓慢倒入超滤装置(Centriprep-YM10，Amicon，USA)中， 该装置可以截去分子量为10kDa的组分。试管在4℃、2100g的条 件下离心分离40分钟，然后除去超滤液；同样的，试管离心分离2 次，每次20分钟，直至只有少量的高分子量残留物留下，超滤液混 合后缓慢倒入一新的浓缩用试管中。超滤反复进行，以确保没有高 分子量蛋白质残留。将含有低分子量馏分的最终超滤液冻干，称重 后储藏用于以后使用。含有高分子量馏分的残留物也同样的进行处 理。
通过使用乙醇从全蛋白萃取液中沉淀高分子量蛋白质，进而制 备低分子量萃取液
将干燥的鹿茸角粉末(10g)放入去离子水(100ml)中，在室 温的情况下轻轻晃动3小时后得到鹿茸角的全蛋白萃取液。该混合 物在2100g时离心分离15分钟，上清液缓慢倒一干净的离心瓶中。 上清液进一步在2100g时离心分离15分钟，以便完全澄清全蛋白萃 取液溶液；然后将该萃取液冷却至4℃。冷却的(4℃)100％乙醇(3 个体积)在正常搅拌时逐步加入。混浊的混合物在2100g、4℃时离 心分离30分钟，以除去沉淀的高分子量蛋白质。上清液移至布氏蒸 发烧瓶中，然后在真空下用布氏旋转蒸发器除去溶剂。含有低分子 量鹿茸萃取液的不定型的干燥残余物使用前在室温下密封在蒸发烧 瓶中储存。
乙醇预处理鹿茸角后萃取、进而制备低分子量萃取液
试验室制备
选择用于制备这种萃取液的方法是用70％乙醇对鹿茸角预处理 后用水溶液萃取。在这种情况下，100克热浸过的鹿茸角粉末和 600ml、70％的乙醇(食品级)混合。混合物搅拌3小时后用烧结玻 璃漏斗过滤。剩下的乙醇相在真空下用布氏旋转蒸发器从鹿茸角残 余物中除去。经过蒸发过程后，通过30℃的水浴相蒸发烧瓶提供少 量的热。将去离子水(2L)加入到干燥的鹿茸角中，混合物搅拌12 小时。然后，萃取液混合物逐步通过瓦特曼1号纸、瓦特曼6号纸， 最后用玻璃纤维滤纸(瓦特曼GF/A)进行过滤。除去鹿茸角残余物， 滤液在20℃时以11,500rpm进行离心过滤10分钟。上清液被冷冻 分离，并在15℃时冻干。总产量为4.1g(4.1％的产量)，并用于 体外生物测定试验，下面将详细说明。
小规模制备
按照上述制备的热浸的鹿茸角的粉末在34个单独的批处理中用 70％乙醇进行预处理。每批84.0-172.6g间的茸角粉末在环境温度 中用6个体积(w/v)70％的乙醇搅拌3小时。首先用安装有30℃水 浴的旋转蒸发器(布氏旋转蒸发-R，Buchi Rotavapor-R)在真空中 除去溶剂相，然后用安装有油泵的旋转蒸发器(Edwards Speedivac ED35)在真空中除去溶剂相。然后，在用冻干器干燥除去剩余的溶 剂前，将预处理的鹿茸角粉末在塑料容器中冻结。
饮用水(86L)加入到乙烷预处理过的鹿茸角粉末(4.3kg)中， 并在环境温度下将该混合物搅拌3小时。将混合物穿过Dynocone Model 612的连续固体碗式离心机(Clark Chapman，Derby UK)， 从而使固体残余物从液体萃取液中除去。鹿茸萃取液在不锈钢盘子 上冷冻和冻干器(Cuddon)内干燥之前，先通过10um的过滤袋过滤， 然后用1um的过滤袋(both GAF)过滤。冻干的低分子量鹿茸角萃 取液从干燥器的盘子上刮下，得到92g(2.1％产量)的浅棕色非品 质固体。该物质相(90克)用γ-射线(Schering-Plough，Upper Hutt， NZ)进行灭菌，射线的最小剂量为2.5Mrads，然后将其用于制剂中， 用于老鼠伤口治疗研究，下面将详细叙述。
凝胶过滤色谱法
鹿茸角萃取液通过Superose 12 HR 10/30柱(Amersham Biosciences)凝胶过滤色谱法进行分析，并用含有0.3M氯化钠和 0.05％叠氮化钠作为洗提缓冲剂的0.05M的磷酸缓冲液(pH6.9)。 样品溶于0.05M的磷酸缓冲液(pH6.9)，浓度为2-5mg/ml，每10ul 的溶液注射到柱子上，洗提的流率为0.75ml/min。洗提的蛋白质通 过测试280nm处吸收的UV进行探测。
Superose 12柱的分子量校准用公知分子量的蛋白质的分离进 行，条件和鹿茸角萃取液使用的条件一样。混合物中含有：甲状腺 球蛋白(669kDa)；牛γ-球蛋白(Cohn fraction 11，160kDa)； 牛血清白蛋白(66.7kDa)；卵白蛋白(grade V1，46kDa)；碳酸 酐酶(bovine)(29kDa)；细胞色素C(马的心脏)(12.4kDa)；L -酪氨酸(181Da)。所用标准源自Sigma，除了从BDH得到的L- 酪氨酸外。洗提蛋白质峰的表观分子量用标准曲线进行测定。该标 准曲线反映了蛋白质分子量的对数和保留时间的关系。
SDS-佩奇电泳
鹿茸角的全蛋白萃取液和低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理 后萃取制得)负载在16.5％Tris-Tricine SDS-聚丙烯酰胺凝胶上 (BioRad)。样品在负载到凝胶上之前，用2-巯基乙醇进行变性， 并用4分钟加热到99℃。10ul的MultiMark分子量标记混合物 (Invitrogen)分别和5、10、25和50ug的萃取液负载到凝胶上。 凝胶在190伏的电压下运行50分钟。然后除去凝胶，并用0.25％的 库马西亮蓝(库马西Brillant Blue)G-250(BDH)溶液染色15分 钟，并使甲醇和25％的三氯乙酸每份相等。然后，凝胶在5％的三 氯乙酸溶液中经过一晚上的再次染色。凝胶进一步在1％戊二醛溶液 中固定5分钟之前，用25％的甲醇/1％乙酸清洗5分钟后，用1％ 的甲醇/0.5％乙酸清洗5分钟，接着用去离子水(MilliQ)清洗6 次(1.5分钟/次)。
银染色是这样进行的：将92.5ul的10M氢氧化钠加入到1.44ml 的28％氨水溶液中，用MilliQ水稀释至45ml，得到溶液A。溶液B 由2.5ml的MilliQ水和0.5克的硝酸银组成。在使用前，立即将溶 液A和B混合，凝胶在混合物中染色10分钟。染色后，凝胶在MilliQ 水中清洗3次，共用时10分钟。最后，凝胶在0.005％柠檬酸/0.02 ％甲醛溶液中显影约1分钟后，加入25％甲醇/0.26％乙酸2分钟后 停止显影。然后用Kodak DC120数码相机对凝胶进行拍摄展示。
细胞增殖试验
人体脐静脉内皮细胞在培养基199(GibcoBRL)中培养；在37℃、 5％二氧化碳的T75组织培养烧瓶(NunclonTM)中，培养基附加有 10％的胎牛血清(GibcoBRL)、50U/ml的青霉素、50μg/ml的链霉 素、2mM的L-谷氨酸盐和1ng/ml碱性纤维原细胞生长因子 (bFGF)。细胞进行牛血清化后(0.025％牛血清、0.265mMEDTA、 GibcoBRL)，植入在密度3000细胞/well/200ul的96-well plate (NunclonTM)中培养3天。细胞在1％的血清中饥饿24小时，然后 用含有1ng/ml bFGF的1％的血清进行处理，或用不含有鹿茸角萃取 液进一步处理48小时。在结束孵化的2小时之前，20ul的Celltiter 96 Aqueous One Solution Reagent加入到每个well中。在37℃、潮湿的， 含有5％二氧化碳的氛围中完成孵化后，用plate reader(Bio-Tek)记 录下wells在490nm(“OD490”)处的光密度。
牛大动脉内皮细胞的迁移
牛大动脉内皮(BAE)细胞可以在Dulbecco’s改Eagle medium (DMEM，GibcoBRL)中生长汇合，该培养基在12-well plate (NunclonTM)中含有10％的胎牛血清(GibcoBRL)。单层通过刮蹭 穿过盘子的可处理的吸液管尖端受到创伤。用Dulbecco’s PBS和钙 (0.1g/L)(GIBCOTM，Invitrogen Corporation)清洗后，受伤的单 层进一步在含有或不含有鹿茸角萃取液的新鲜的1％血清中培养48 小时。这样得到了全蛋白茸角萃取液、通过超滤制备的低分子量萃 取液、从全蛋白萃取液中沉淀高分子量蛋白质得到的低分子量萃取 液和用70％乙醇预处理茸角后得到的低分子量萃取液。其后的低分 子量萃取液液在100℃中沸腾3分钟后进行测试。一些wells作为阳 极对照，并在10％的血清中培养。受伤单层内的细胞的移动程度取 决于所拍摄的初始受伤和受伤48小时后的显微照片。显微照片用 Olympus CK2 inverted microscope的20倍放大率拍摄，并打印成 15cm宽×10cm厚的标准尺寸。1.5cm×10cm的线形格子和基线平行， 放置于照片上。基线设在“受伤线”的上面，其中细胞被原始刮掉。 记录下每条线截取的细胞的数目。这样可以测试迁移距显微照片基 线1.5，3.0，4.5，6.0，7.5或9.0cm处的细胞的数目。
原位杂交
探针的产生
原位杂交的方法以Clark等人(1996)公开的方法为基础。包含 VEGF编码序列1-4的探针克隆到转录载体pGEMTEasy中 (Promega，Madison，WI)。并通过限制性消解SacII，NcoI(New England Biolabs，Beverly，MA)，或SalI(Boehringer Mannheim， Germany)线形化产生同义探针(sense probe)和反义探针(antisense probe)。单股同义和反义核糖探针(riboprobes)根据生产指令() 通过转录和10μCi/μl[33p]UTP一起进行标记。
片段的制备
片段在二甲苯中脱蜡，然后放入浓度正在减少的乙醇中，再在 0.2M的HCl中浸泡20分钟(室温)，再在2×SSC(1×SSC含 有150mM氯化钠和15mM氯酸钠，pH 7.0)中清洗30分钟。蛋白 酶K(Sigma Chemical)的消解在浓度为2μg/ml的200mM Tris-HCl(pH 7.2)，50mM EDTA(pH 8.0)、温度为37℃的条件下进行15分钟。 然后载玻片在含有100mM的三乙醇胺(pH 8.0)、0.25％的乙酸酐的溶 液中浸泡2×5分钟(室温)。载玻片在2×SSC(室温)中清洗5 分钟后，脱水、干燥。
杂交
在探针产品(约2×106cpm/μl)中如上标记的1ul核糖探针和 20-60ul杂交缓冲液混合。杂交缓冲液中含有：50％(v/v)的去离 子甲酰胺、0.3M的NaCl、10mM的Tris-HCl(pH 6.8)、10mM的磷 酸钠(pH6.8)、5mM的EDTA(pH8.0)、1×Denhardts溶液(BSA、 Ficoll和polyvinyl pyrrolidone分别为0.02％(w/v))、10％(w/v)右 旋糖苷硫酸盐、50mM的二硫代苏糖醇和1mg/ml的发酵tRNA (生 命技术)。这种含有探针的混合物在95℃下进行变性，然后用于预处 理和干燥的组织片段中，组织片段随后被小片的帕拉胶膜(parafilm) 覆盖；没有发生预杂交。杂交在54℃下于密封容器中进行18小时， 该密封容器用50％的甲酰胺和0.3M的NaCl潮湿化。
载玻片在50℃下于5×SSC中清洗15分钟(×2)，然后在65 ℃下于50％的甲酰胺中清洗30分钟。在37℃下于2×SSC中进行四 次清洗，每次持续5分钟。载玻片在37℃下用核糖核酸酶A(Sigma Chemical)培育30分钟，核糖核酸酶A在1×清洗液(400mM NaCl， 10mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH 7.5)的最终浓度为20μg/ml。然后 通过用含有50％甲酰胺的2×SSC在65℃时将载玻片清洗30分钟除 去RNase A，并接着在37℃下，分别于2×SSC and 0.2×SSC中清 洗15分钟。片段分别用含有0.3M醋酸铵的30、60、80和95％的乙 醇进行脱水，并最终用100％的乙醇清洗两次。
片段用空气干燥，并用自动X射线照相用的乳液(LM-1 emulsion； Amersham International plc)进行涂敷。乳液涂敷的载玻片于4℃下在 不透光的盒子中以粉状储存3周。然后将载玻片显影(D19 developer； Kodak，Rochester，NY，USA)并影像地固定(30％的硫代硫酸钠)， 从而在杂交位上产生可见的银颗粒。而片段用吉尔苏木素(Gills Haemotoxylin)进行染色，并可以用亮和暗场在Zeiss Axioplan显微 镜上观察。
含低分子量鹿茸角萃取液制剂的制备
鹿茸角血管原萃取液的局部凝胶制剂用三种不同类型的高分子 进行制备，即聚羰乙烯-934P，聚醚(Pluronic)F-127和甲基纤 维素-E4M。聚羰乙烯-934P是Chemcolor New Zealand Limited给的 样品，聚醚F-127是BASF New Zealand Limited给的样品，甲基纤 维素-E4M FG是Dow Chemical Limited Australia给的样品。
等渗磷酸缓冲液的制备
pH为7.0的等渗磷酸缓冲液(0.063M)通过将1.295克的无水 正磷酸氢二钠(Na2HPO4)、0.9125克的磷酸二氢钠一水化物 (NaH2PO4·H2O)和1.199克氯化钠溶于水中。然后将该溶液体积用水 调到250ml。
用聚碳乙烯-934P制备的制剂
聚羰乙烯在等渗甘露醇水溶液中制备。
为了制备加倍浓缩的聚羰乙烯凝胶，0.5克的聚羰乙烯-934P 加入到50ml的加倍浓缩(double strength)的等渗甘露醇溶液中， 并用电磁搅拌器搅拌30分钟，然后静置，使气泡升至表面。甘露醇 溶液是由5.07克的甘露醇和50ml的水混合制成。并加入10％(w/v) 的氢氧化钠溶液将pH值调为7.0。
低分子量茸角萃取液(乙醇预处理后萃取制备得到)的加倍浓 缩溶液为溶于蒸馏水中、浓度为4mg/ml的萃取液。
对照制剂是这样制备的：将3克加倍浓缩的聚羰乙烯凝胶加入 到3ml的水中，并用软膏刀(spatula)轻轻的搅拌。然后使用前在 4℃下储存。
治疗制剂是这样制备的：将3克加倍浓缩的聚羰乙烯凝胶加入 到3ml加倍浓缩的萃取液溶液中，并用软膏刀轻轻的搅拌。然后使 用前在4℃下储存。
用聚醚F-127制备的制剂
聚醚F-127制剂在pH值为7.0的等渗磷酸缓冲液中制备。
加倍浓缩聚醚凝胶是这样制备的：将20克的聚醚F-127加入到 50ml的冷等渗磷酸缓冲液中，并轻轻用电磁搅拌器搅拌。加完后， 溶液继续搅拌10分钟。在4℃下保存过夜，用超声波降解3小时后， 再在4℃下保存过夜。
低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取制得)的加倍浓缩 溶液是这样制备的：将萃取液溶于等渗磷酸缓冲液中，使其浓度为 4mg/ml。
对照制剂是这样制备的：称量4克的加倍浓缩聚醚凝胶，并在 其中加入4ml的等渗磷酸缓冲液。然后将其在冰箱里保存几分钟， 使聚醚凝胶转化为溶液(4℃时聚醚在水中是溶液，37℃时聚醚在水 中是凝胶)。然后用药膏刀轻轻混合，使用前在4℃下保存。
为了制备治疗制剂，将4克的加倍浓缩聚醚凝胶装入一个小瓶 中；并加入4ml的加倍浓缩萃取液溶液。然后在冰箱里放置几分钟， 使聚醚凝胶转化为溶液。然后轻轻的用药膏刀混合，使用前在4℃下 保存。
用甲基纤维素-E4M制备的制剂
甲基纤维素-E4M制剂在pH值为7.0的等渗磷酸缓冲液中制备。
加倍浓缩甲基纤维素凝胶是这样制备的：将2克的甲基纤维素 -E4M FG缓慢加入到25ml、加热到80℃的、搅拌过的等渗磷酸缓冲 液中，再将25ml、冷却为4℃的等渗磷酸缓冲液加入到甲基纤维素 中分散，进一步搅拌3分钟。混合物在4℃下保存5小时。
低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取制得)的加倍浓缩 溶液是这样制备的：将萃取液溶于等渗磷酸缓冲液中、使其浓度为 4mg/ml。
对照制剂是这样制备的：称量5克的加倍浓缩甲基纤维素凝胶， 并在其中加入55ml的等渗磷酸缓冲液，该混合物用药膏刀轻轻混合， 使用前在4℃下保存。
为了制备治疗制剂，将5克的加倍浓缩甲基纤维素凝胶装入一 个小瓶中；并加入55ml的加倍浓缩萃取液溶液；然后轻轻的用药膏 刀混合，该混合物使用前在4℃下保存。
老鼠伤口治疗试验
这些试验条件是在惠灵顿医药健康学校的动物道德委员会监督 下进行的。
使Male Lewis老鼠(鼠龄为19-23周)适应环境，在试验期间 单独保藏。在试验期间供给老鼠正常的饮食，并从第0天开始，让 老鼠每天口服果冻(4ml)。在第0天，给动物注射克他命(100mg/kg 体重)和甲苯噻嗪(5mg/kg体重)进行麻醉。每个动物在其沿着脊 骨的背部表面做两个8mm的全皮活组织切片检查。颅骨基部末端的 伤口为6cm到8cm。应仔细操作以确保每个活组织切片检查与皮肤间 有一个合适的角度。伤口用纱布擦拭，以除去多余的血液，然后比 例标记和标码一起拍照。然后向伤口上加入制剂和对照溶液。康复 后，进行皮下注射0.05mg/kg体重的Temgisic。间隔2-3天后，重 复进行附图(图10-13)中所示的治疗和对照。在这期间，用3.5％ 的三氟溴氯乙烷对动物进行轻微麻醉。重复试验的动物伤口也进行 了拍照。然后每隔2-3天再进行试验，直至全部伤口愈合。
在老鼠伤口治疗模型中对剂量和低分子量鹿茸角萃取液(乙醇 预处理后萃取制得)的应用进行了评价。载体、定量给料的规则和 萃取液的浓度在附图(图10-13)中进行了说明。每个动物的一个伤 口用25ul制剂治疗，而另一个伤口用25ul的对照物质进行治疗。 除了1mg/ml剂量(图10)仅用4个动物之外，所有的试验用了6 个动物进行试验。每个伤口的照片用Canon EOS 3000N相机(F2.8 macro lens)进行拍摄。每个曝光的打印都被数码记录，伤口的面积 通过这些图像用NIH Image 1.63软件进行计算。每个时间点的伤口 尺寸以占原始伤口的百分比进行计算，每个时间点的统计分析通过 差异分析(ANOVA)进行。
伤口组织学
如上所述，伤口在老鼠的背部上。在第0天，单独将PBS用于 每个老鼠的对照伤口上，同时在同一天用10mg/ml低分子量鹿茸角 萃取液(乙醇预处理后萃取制得)PBS溶液对伤口进行治疗。动物 (N＝6)受伤后麻醉4天。伤口被切离。在转移到70％的乙醇中之前， 四个动物的组织在10％的中性福尔马林缓冲液中放置24小时；另外 两个动物的组织保持原状，以进行胶原质分析。被切成一半后，伤 口中植入固体石蜡，并将切面进行切片。片段切成5um后放在载玻 片上，并用APES(3-氨丙基-三乙氧基硅烷)进行涂敷。
用马森三色法对伤口进行着色
着色用Bancroft和Stevens(1990)所述的方法进行。片段用二 甲苯(5minutes×2)进行脱蜡，然后在浓度递减的一系列乙醇溶液 中进行再水合。接着，片段在用活水清洗10分钟之前，用Weigerts 苏木素着色10分钟。将这些片段在0.5％的品红酸液中放置5分钟， 然后用蒸馏水清洗。用1％的磷钼酸处理了5分钟后，用2％的甲基 蓝着色5分钟，并用蒸馏水清洗。用1％的乙酸处理2分钟后，片段 进行了脱水，在逐渐上升浓度的乙醇系列溶液中，用二甲苯进行处 理，并逐渐用DePeX(BDH)覆盖。
照片用具有蔡司镜头的Canon PowerShot G5(5mega pixel)数 码相机拍摄。图片用使用佳能远控软件的遥控装置进行捕获，其分 辨率为每英寸72像素，并被转化为Adobe Photoshop(version 5.5) 进行图示。
伤口上的核纤层蛋白免疫组织化学
片段用二甲苯(5minutes×2)脱蜡，接着在浓度逐渐降低的乙 醇系列溶液中再水合。除了特别指明之外，所用的反应物、抗体和 酶可以从Zymed Laboratories Inc，CA购买。片段用胃蛋白酶(Cat No.20671651)于37℃下处理15分钟。之后的过程在室温下进行。 用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗(5minutes×2)后，通过20％的正常 山羊的血清在1％BSA/PBS中处理30分钟，没有具体的连接点是阻 塞的。然后，片段用多细胞系的野兔抗-核纤层蛋白抗体(1∶1000 稀释)(Novus Biologicals Inc.，Cat No.NB 300-144)培育1小 时。对于阴极对照，初始的抗体用非-免疫野兔免疫球蛋白IgG(10 μg/ml)代替。片段在PBS(5分钟)、在0.5％非-脂肪奶粉末/0.1 ％Tween-20/2×PBS(10minutes×2)和PBS(5分钟)中清洗，接 着用生物素化的次级山羊抗-野兔抗体(5μg/ml)培育30分钟。片 段再次在PBS(5分钟)、在0.5％非-脂肪奶粉末/0.1％Tween-20/2× PBS(10minutes×2)和PBS(5分钟)中清洗。
酶的过氧物在非活性内生过氧化酶中应用9分钟。用PBS(5 minutes×2)清洗后，片段在HRP-Streptavidin Conjugate(2.5 μg/ml)中培育10分钟。片段在PBS(5minutes×2)中清洗，并用 3，3’-二氨基联苯胺(DAB)试剂盒进行显影。在水中清洗后，片段在 系列浓度逐渐降低的乙醇溶液中脱水，接着用二甲苯处理，然后用 DePeX(BDH)覆盖。照片用蔡司镜头、400ASA的柯达黑白胶卷拍摄， 并被转化为Adobe Photoshop(version 5.5)进行图示
结果
分馏和凝胶过滤色谱法
用离心机-YM10设备对鹿茸角进行超滤分离，得到高分子量 馏分(图1)和低分子量馏分(图2)。
全蛋白萃取液的凝胶过滤色谱图如图3所示。该图中的全蛋白 鹿茸角萃取液的表观分子量分别广泛，并正如期望的一样，高分子 量蛋白质为主要组分。相比之下，用70％乙醇预处理鹿茸角得到的 低分子量萃取液的示图(图4)表明：乙醇预处理过程使鹿茸角萃取 液中的主要蛋白质的分子量小于10kDa。这种萃取液中有6个主峰 是明显的。
SDS-佩奇电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶首先用库马西(图5A)进行着色，然后用 银(Figure 5B)着色，然后使用这种SDS-聚丙烯酰胺凝胶显示和 进一步描述低分子量鹿茸角萃取液中出现的蛋白质，从而和全蛋白 萃取液对比。全蛋白萃取液显示了多种蛋白质，特别是60kDa以上 和约20kDa的蛋白质，无论是用库马西或银着色，但是在低分子量 萃取液轨道中仅有2个明显峰段。它们的表观分子量为6kDa左右 和超过60kDa。
细胞增殖试验
和1％的血清相比(图6)，在培育时鹿角萃取液可以增强人体 脐静脉内皮细胞的增殖。这种增强的增殖主要标记为低分子量萃取 液(用70％乙醇预处理后得到)。应注意的是，当全蛋白鹿茸角萃 取液沸腾3分钟后，其保持了对内皮细胞的增殖活性。
牛大动脉内皮细胞的迁移
为了进一步证实萃取液的血管原活性，考查了牛大动脉内皮 (BAE)细胞。和对照相比(图7)，通过超滤作用和乙醇沉淀方法制 得的低分子量萃取液都显著增加了细胞从细胞擦伤处移出的距离和 数量。
如图8所示，沸腾3分钟的低分子量萃取液(来自乙醇预处理 方法)没有降低萃取液对BAE细胞迁移的增强效果。
原位杂交
除此之外，我们已经表明鹿角的血管原活性不可能是由于血管 内皮生长因子(VEGF)，VEGF是几乎公知的有效的血管原因子。 原位杂交是这样进行的：用覆盖VEGF外显子1-4的探针，从而可 以探测到所有的剪接变异体(splice variant)。图9显示的结果 表明VEGF mRNA只在鹿角的前软骨细胞中探测到，而不是在紧邻 血管的细胞中。VEGF显示的mRNA量相对低下。
我们也考查了鹿角mRNA作为原位杂交(数据没显示)中使用 的其它典型的血管原因子。奇怪的是，我们没有能发现大量的酸性 或碱性生长因子mRNA在促使鹿角血管原性上起了重要作用。
老鼠受伤试验
图10显示了用盐或1mg/ml的低分子量萃取液治疗的伤口愈合 百分比，其中低分子量萃取液是用70％乙醇预处理鹿茸角得到的。 和仅用盐处理的对照伤口相比，治疗的伤口愈合速度快很多。
老鼠受伤模型用于测试治疗的剂量范围。低分子量鹿茸角萃取 液(乙醇预处理后萃取得到)和单独的载体PBS(对照治疗)相对照。 每种溶液都取25ul放在伤口上。鹿茸萃取液的剂量为0.1mg/ml，对 照组和治疗组是分开的，不过这种差异在统计上是不重要的(图 11a)。鹿茸萃取液的剂量为2mg/ml、在2、4、6、8、10和14天 时大大改善了伤口愈合的速度(图11b)。10mg/ml剂量的低分子 量鹿茸角萃取液在8和10天时显示了令人满意的较快的伤口愈合 (图11c)。非常高剂量的萃取液(100mg/ml)同样增加了伤口愈合的 速度，在6、8、10、12、14和16天显示了较大的改善(图11d)。
在受伤当天10mg/ml的单一剂量的低分子量鹿茸角萃取液(乙 醇预处理后萃取得到)的效果和单独载体(对照)(图12)的效果 进行对比。单一剂量的萃取液改善了伤口愈合的速度，对照伤口和 治疗伤口之间的差异在第8天是显著的。
低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取得到)的不同制剂 在剂量为2mg/ml(图13)时进行了考查。每个方案中的对照是没有萃 取液的单独载体。和单独的载体相比，用甲基纤维素制备的萃取液 制剂大大改善了2-14天时的伤口愈合速度(图13b)。用聚醚制备 的萃取液制剂大大改善了所有天的伤口愈合速度(图13b)，不过单 独的载体(对照)在治疗初始阶段(图13c)有消极影响。当萃取液 制剂用聚羰乙烯时，伤口愈合的速度在2、4、6、8、10和14(图13d) 天时得到了大大的改善。
伤口组织学
单独用10mg/ml的低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取 制得)和单独用PBS进行对比，对伤口组织学在4天康复情况进行 了考查。该试验使用了六只动物，不过仅四只动物用在组织学上。 局部切片的康复位置相对于设置在活组织切片检查左侧的未受伤组 织时明显的(图14A，B)。在对照伤口中，局部切片的面积通过伤 口组织下面和表面的伤疤进行区分。破裂该伤口组织，该伤口组织 由细胞外基质和分散的细胞组分组成(图14A，C)。治疗的伤口显 示了明显的不同组织学(图14B，D)。伤疤(图14B)出现在上皮细 胞集中的地方。表皮下面的一层我们称之为真皮组织(图14D)。 这在导致伤疤的胶原质中并不丰富。真皮中有很好的细胞组织和丰 富的血管组织，从而可以调制自然伤口的康复过程。4个动物中的3 个动物的治疗伤口非常一致，第四个在对照伤口和治疗伤口间的差 异和图14相比很小。
组织考查后，进行膜蛋白层粘连蛋白基的免疫组织化学。对照 伤口的层粘连蛋白免疫组织化学显示没有血管，特别是在上皮面(图 15A，C)。在伤口边缘探测出的对照伤口层粘连蛋白表明着色的抗体 在这些区域有效果(图15E)。治疗伤口的基部血管和上皮面中的 血管是清洗明显的(图15B，D)。表面的血管和基部血管具有不同 的形态学，并对上皮面进行了轻微的着色。
讨论
本部分集中于萃取液和鹿茸角馏分中的肽和蛋白质的尺寸。这 主要是因为干燥的鹿茸角组织的主要组分是蛋白质，以及典型的血 管原因子也是蛋白质。不过，发明人意识到其它非蛋白组分不可避 免的含在鹿茸角萃取液和馏分中，这些组分也可能对所观察到的活 性有益或起主要作用。
具有血管原活性、主要分子量小于或等于10kDa的低分子量馏分 的发现是令人惊异的，因为许多典型的血管原生长因子都是大于 10kDa的(表1)。
凝胶过滤色谱分析方法和SDS-佩奇分析方法给出了低分子量鹿 茸角萃取液组成的明显对比信息。在SDS-佩奇中，凝胶用库马西亮 蓝G250染色后，再用银着色(图5)。和凝胶过滤色谱分析(图4) 期望的结果相比，低分子量萃取液显示了较少的峰段。此外，分子 量大于10kDa的蛋白质和期望的相比，着色更加明显。不过，SDS- 佩奇凝胶上没有完成和不存在的蛋白质的着色对于库马西和银着色 是很好鉴别的特征(如Smith，2002；Kondratiuk et al.，1982)。对于在 低分子量萃取液中低于10kDa的蛋白质低于期望着色强度可能是由 于这种现象造成的。
由鹿茸角组织上的原位杂交(图9)探测出的潜在血管原生长因 子VEGF的RNA信使限于前软骨区域，并仅以低水平出现。在aFGF 或bFGF mRNA的原位杂交中没有发现和血管原性发生的区域相关 的转录(数据没有显示)。这产生了这样一个问题，即是什么因子 促使鹿角中的血管每天生长达2cm。
测试了人体脐静脉内皮细胞(HUVEC)对萃取液的增殖反应。 发现全蛋白鹿茸角萃取液甚至在沸腾3分钟(图6)后还能引起 HUVEC的增殖。低分子量鹿茸角萃取液(用70％乙醇预处理后萃取 制得)使HUVEC发生了明显的增殖。在内皮细胞迁移试验中，当用 牛大动脉内皮(BAE)细胞评价全蛋白鹿茸角萃取液、乙醇沉淀制 备的低分子量萃取液和超滤制备的低分子量萃取液时，都使更多的 细胞迁移到受伤的区域(图7)。用乙醇沉淀制备的低分子量萃取液 在100μg/ml时反应最明显；而在500μg/ml时，响应没有一个剂量响 应的明显。
70％乙醇预处理后萃取制得的低分子量萃取液在沸腾前和沸腾 3分钟后(图8)进行了活性测试。结果显示，沸腾没有对所测试剂 量的活性产生影响。这证实了具有血管原活性的分子在加热3分钟后 还是稳定的。
70％乙醇预处理后萃取制得的低分子量萃取液在老鼠体内进行 测试，并发现加速了伤口的康复，使康复仅需3天(图10)。发现治 疗的伤口在康复过程的起始和结束大大加快了康复的速度，这表面 萃取液对整个康复过程都有影响。这种推论进一步通过体内试验进 行了证实(图11和13)。
动物创伤试验的结果表明低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理 后萃取制得)具有许多积极影响。例如，该萃取液在暴露于杀菌剂 量(2.5Mards)的γ-射线后仍保持其潜在的活性。该萃取液在1mg/ml 和100mg/ml(图10和11)间对于改善伤口的愈合具有有效的剂量。没 有发现剂量有消极影响。通过用低分子量鹿茸角萃取液对当天受伤 (图12)进行单一治疗考查了要求产生反应的应用数量。和对比伤 口相比，在一时间点(第8天)达到统计显著性的差异时，发现伤口 的愈合速度增加了。这是一个有趣的发现，对于产生积极结果的不 同剂量都需要进行测试以证实。
剂量为2mg/ml的低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取制 得)的不同制剂在老鼠伤口康复模型上进行了测试(图13)。用甲 基纤维素和聚羰乙烯制备的制剂和以PBS作为载体的制剂是相似的， 大大改善了多数时间点的伤口愈合速度。而聚醚制剂可能是相反的， 载体单独对伤口愈合的初始速度具有消极影响(图13c)。这些结果 表明萃取液可以制成不同的制剂仍保持活性。
用马森三色法对伤口组织学进行了考查，马森三色法是常用的 着色方法，但是对细胞外基质蛋白质有效。图14的图片显示了受伤4 天后的情况，低分子量萃取液治疗的伤口的真皮组织具有正常皮肤 所具有的结构。这表明表皮开始变化、真皮组织含有血管和有组织 的细胞组分开始迁移到伤口内。对照伤口仍保持在伤口修复的早期， 其仍然有一个伤疤和主要是没有特殊组织的细胞组分点缀的真皮伤 口组织。因而组织学表明低分子量萃取液治疗的伤口处于一个康复 的领先阶段。组织学还表明萃取液调制组织修复，并导致伤口的正 常愈合，而不仅仅是一个胶原伤疤。伤口为基部细胞膜蛋白和层粘 连蛋白进行免疫着色。层粘连蛋白和内皮基面上的基部细胞膜关联。 结果显示：受伤4天后，和对照伤口相比(用PBS处理)，用低分子 量鹿茸角萃取液治疗的伤口面上有更多的血管。最明显的是，和对 照伤口相比，在治疗伤口的上部/上皮下的区域内的血管数目有增加。
对照伤口在伤口区域内有很少，或没有可见的血管(如15A，D，E)。 在对照伤口的边缘、未受伤的区域，血管清晰表明免疫着色在这些 片段上成功实现(图15E)。在低分子量鹿茸角萃取液治疗的伤口中， 位于伤口上皮细胞中的血管用马森三色法的方式着色后是明显的， 尽管层粘连蛋白的免疫着色是来自如图14所示的不同的动物。治疗 伤口表面上的血管更加轻微的在上皮面(图15D)进行着色。血管也 向表面排列，这也许表明血管正在发展成顶生表面，这些血管周围 的基部细胞膜正处于被放弃的过程。层粘连蛋白免疫组织化学表明 增加的血管原是在伤口上使用低分子量鹿茸角萃取液的结果。
总而言之，结果表明源自鹿茸角的组合物具有血管原活性。特 别是，低分子量鹿茸角萃取液具有潜在的伤口治疗活性，其中该萃 取液先用乙醇预处理后再萃取制得。在体内，该萃取液增加了内皮 细胞的迁移和增殖。在体内伤口治疗模型中，低分子量鹿茸角萃取 液在剂量范围为1mg/ml-100mg/ml杂交了伤口愈合的速度。在动物 上没有看到任何阶段的消极副作用。治疗伤口的形态学表明该萃取 液诱导了包括血管原性的有益于伤口康复的反应。这些结果表明用 低分子量鹿茸角萃取液治疗伤口是一种改善伤口愈合速度，从而有 助于伤口愈合的有效方法。
表1：一些公知的血管原生长因子的分子量(跟踪拉包括任何 未处理的前体) 血管原生长因子 初始的登陆号 分子量 血管内皮生长因子A P15692 27kDa 纤维原细胞生长因子1 P05230 17kDa 胎盘生长因子 P49763 25kDa 多效素 P21247 19kDa 血管生成素-1 Q15389 58kDa 血管生成素-2 Q15123 57kDa CYR61 P15692 27kDa 胸腺素β4 P05230 17kDa
本发明的特征仅用实例进行叙述。应该理解的是，任何没有超 出本发明范围的修改和增加包含在本发明的权利要求书的范围内。
Auerbach R.，Kubai L.，Sidky Y.1976 Angiogenesis induction by tumors，embryonic tissues，and lymphocytes.Cancer Research 36：3435-3440.
Bancroft and Stevens(eds.).1990.Theory and practice of histological techniques，3rd Edition.
Clark D.E.，Smith S.K.，Sharkey A.M.，Sowter H.M.， Charnock-Jones D.S.1996 Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor c-met；localisation and expression in the human placenta throughout pregnancy.Journal of Endocrinology 151：459-467.
Deodato B.，Arsic N.，Zentilin L.，Galeano M.，Santoro D.，Torre V.， Altavilla D.，Valdembri D.，Bussolino F.，Squadrito F.，Giacca M.2002 Recombinant AAV vector encoding human VEGF 165 enhances wound healing.Gene Therapy 9：777-785.
Kondratiuk T.P.，KurskiǐM.D.，Fedorov A.N.，Osipenko A.A.， Meshkova L.I.，Litvinenko E.A.1982.[Characterization of endogenous phosphorylation substrates of sarcoplasmic reticulum fragments from fast skeletal muscles of the rabbit].Biokhimiia 47：950-6
Li C.，Clark D.E.，Lord E.A.，Stanton J-A.L.，Suttie J.M.2002 Sampling techniques to discriminate the different tissue layers of growing antler tips for gene discovery.The Anatomical Record 268：125-130.
Malinda K.M.，Sidhu G.S.，Banaudha K.K.，Gaddipati J.P.， Maheshwari R.K.，Goldstein A.L.，Kleinman H.K.1998 Thymosin β1 stimulates endothelial cell migration，angiogenesis，and wound healing.The Journal of Immunology 160：1001-1006.
Marshall J.L.，Mead P.，Jones K.，Kaba E.，Roberts A.P.2001 The implementation of venous leg ulcer guidelines：process analysis of the intervention used in a multi-centre，pragatic，randomized，controlled trial.Journal of Clinical Nursing 10：758-766.
Montesinos M.C.，Desai A.，Chen J.F.，Yee H.，Schwarzschild M.A.，Fink J.S.，Cronstein B.N.2002 Adenosine promotes wound healing and mediates angiogenesis in response to tissue injury via occupancy of A(2A)receptors.American Journal of Pathology 160：2009-2018.
Sen C.K.，Khanna S.，Gordillo G.，Bagchi D.，Bagchi M.，Roy S. 2002 Oxygen，oxidants，and antioxidants in wound healing.Annals of the New York Academy of Sciences 957：239-249.
Smith，B.J.2002.Quantification of proteins on polyacrylamide gels.In：Walker，J.M.(ed.).The Protein Protocols Handbook，2nd Edition.Humana Press Inc.，Totowa，N.J.pp 237-242.
Sunwoo，H.H.，Nakano，T.，Hudson，R.J.and Sim，J.S.1995. Chemical composition of antlers from wapiti(Cervus elaphus). Journal of Agricultural and Food Chemistry 43：2846-2849.
方法
组织的采集：
鹿茸角是采自3岁的马鹿，且在上次鹿角脱落后生长了55-60 天。
鹿茸的采集是根据新西兰惠灵顿农业和渔业部1993年7月制定 的“在采集鹿角期间保护鹿的福利权的最低标准和建议的法则”进 行的。
鹿茸通过热浸法或冻干法进行商业处理。热浸法是中国的传统 方法，其中鹿角的茎从底部悬挂(即尖端向下)，并反复浸渍到几 乎沸腾的水中一段时间。浸渍后，鹿角在再次浸渍前可以冷却。浸 渍持续至鹿角切割底部中出现清晰的血浆泡沫。然后，鹿角于温度 约为15℃、低湿度的干燥器放置数周，直至鹿角干燥。
选择处理过的鹿角(热浸或冻干)。茸角的表皮用锐利的刀从 鹿角中除去。生长55-60天的马鹿角的所有部分都包含在内，但干 茎的底部区域排除在外，包括额痕(brow tynes)。茸角用带锯切成 1-2cm厚的环状物，然后用凿子凿成小的几厘米大小的块状物，再 用0.5mm孔径的研磨机研磨成粉状物。
萃取和分馏
鹿茸萃取和分馏后，得到富含血管原生长因子的低分子量馏 分。这种馏分可以用多种方法制备，其中包括超滤、透析、凝胶过 滤色谱、通过使用有机溶剂(如乙醇)对高分子蛋白质进行沉淀或 通过用有机溶剂(如70％的乙醇)对鹿茸角进行预处理后再用水溶 液进行萃取。此处用的生产萃取液的三种方法是超滤、用乙醇对高 分子量馏分进行沉淀，以及用70％乙醇预处理鹿茸角后用水溶液萃 取。
鹿茸角的萃取和通过超滤的分馏
鹿茸角全蛋白萃取液的制备
磷酸缓冲萃取液用5g冻干的茸角粉末和100ml磷酸缓冲液制 得。磷酸缓冲液含有磷酸氢二钠(1.15g/l)、磷酸二氢钾(0.24g/l)、 氯化钾(0.2g/l)和氯化钠(0.8g/l)。混合物在室温下搅拌1小时， 然后用玻璃纤维滤纸(瓦特曼GF/A)进行过滤。过滤在4℃、 11500rpm的条件下离心30分钟。上清液(93ml)缓慢倒入称过重 的舒特瓶(Schott bottle)中，然后在15℃冻干前冷冻分离。
鹿茸角全蛋白萃取液通过超滤进行的分馏
鹿茸磷酸缓冲液(15mg)溶于去离子水中，使其浓度为1mg/ml； 将该缓冲液缓慢倒入超滤装置(Centriprep-YM10，Amicon，USA)中， 该装置可以截去分子量为10kDa的组分。试管在4℃、2100g的条 件下离心分离40分钟，然后除去超滤液；同样的，试管离心分离2 次，每次20分钟，直至只有少量的高分子量残留物留下，超滤液混 合后缓慢倒入一新的浓缩用试管中。超滤反复进行，以确保没有高 分子量蛋白质残留。将含有低分子量馏分的最终超滤液冻干，称重 后储藏用于以后使用。含有高分子量馏分的残留物也同样的进行处 理。
通过使用乙醇从全蛋白萃取液中沉淀高分子量蛋白质，进而制 备低分子量萃取液
将干燥的鹿茸角粉末(10g)放入去离子水(100ml)中，在室 温的情况下轻轻晃动3小时后得到鹿茸角的全蛋白萃取液。该混合 物在2100g时离心分离15分钟，上清液缓慢倒一干净的离心瓶中。 上清液进一步在2100g时离心分离15分钟，以便完全澄清全蛋白萃 取液溶液；然后将该萃取液冷却至4℃。冷却的(4℃)100％乙醇(3 个体积)在正常搅拌时逐步加入。混浊的混合物在2100g、4℃时离 心分离30分钟，以除去沉淀的高分子量蛋白质。上清液移至布氏蒸 发烧瓶中，然后在真空下用布氏旋转蒸发器除去溶剂。含有低分子 量鹿茸萃取液的不定型的干燥残余物使用前在室温下密封在蒸发烧 瓶中储存。
乙醇预处理鹿茸角后萃取、进而制备低分子量萃取液
试验室制备
选择用于制备这种萃取液的方法是用70％乙醇对鹿茸角预处理 后用水溶液萃取。在这种情况下，100克热浸过的鹿茸角粉末和 600ml、70％的乙醇(食品级)混合。混合物搅拌3小时后用烧结玻 璃漏斗过滤。剩下的乙醇相在真空下用布氏旋转蒸发器从鹿茸角残 余物中除去。经过蒸发过程后，通过30℃的水浴相蒸发烧瓶提供少 量的热。将去离子水(2L)加入到干燥的鹿茸角中，混合物搅拌12 小时。然后，萃取液混合物逐步通过瓦特曼1号纸、瓦特曼6号纸， 最后用玻璃纤维滤纸(瓦特曼GF/A)进行过滤。除去鹿茸角残余物， 滤液在20℃时以11,500rpm进行离心过滤10分钟。上清液被冷冻 分离，并在15℃时冻干。总产量为4.1g(4.1％的产量)，并用于 体外生物测定试验，下面将详细说明。
小规模制备
按照上述制备的热浸的鹿茸角的粉末在34个单独的批处理中用 70％乙醇进行预处理。每批84.0-172.6g间的茸角粉末在环境温度 中用6个体积(w/v)70％的乙醇搅拌3小时。首先用安装有30℃水 浴的旋转蒸发器(布氏旋转蒸发-R，Buchi Rotavapor-R)在真空中 除去溶剂相，然后用安装有油泵的旋转蒸发器(Edwards Speedivac ED35)在真空中除去溶剂相。然后，在用冻干器干燥除去剩余的溶 剂前，将预处理的鹿茸角粉末在塑料容器中冻结。
饮用水(86L)加入到乙烷预处理过的鹿茸角粉末(4.3kg)中， 并在环境温度下将该混合物搅拌3小时。将混合物穿过Dynocone Model 612的连续固体碗式离心机(Clark Chapman，Derby UK)， 从而使固体残余物从液体萃取液中除去。鹿茸萃取液在不锈钢盘子 上冷冻和冻干器(Cuddon)内干燥之前，先通过10um的过滤袋过滤， 然后用1um的过滤袋(both GAF)过滤。冻干的低分子量鹿茸角萃 取液从干燥器的盘子上刮下，得到92g(2.1％产量)的浅棕色非品 质固体。该物质相(90克)用γ-射线(Schering-Plough，Upper Hutt， NZ)进行灭菌，射线的最小剂量为2.5Mrads，然后将其用于制剂中， 用于老鼠伤口治疗研究，下面将详细叙述。
凝胶过滤色谱法
鹿茸角萃取液通过Superose 12 HR 10/30柱(Amersham Biosciences)凝胶过滤色谱法进行分析，并用含有0.3M氯化钠和 0.05％叠氮化钠作为洗提缓冲剂的0.05M的磷酸缓冲液(pH6.9)。 样品溶于0.05M的磷酸缓冲液(pH6.9)，浓度为2-5mg/ml，每10ul 的溶液注射到柱子上，洗提的流率为0.75ml/min。洗提的蛋白质通 过测试280nm处吸收的UV进行探测。
Superose 12柱的分子量校准用公知分子量的蛋白质的分离进 行，条件和鹿茸角萃取液使用的条件一样。混合物中含有：甲状腺 球蛋白(669kDa)；牛γ-球蛋白(Cohn fraction 11，160kDa)； 牛血清白蛋白(66.7kDa)；卵白蛋白(grade V1，46kDa)；碳酸 酐酶(bovine)(29kDa)；细胞色素C(马的心脏)(12.4kDa)；L -酪氨酸(181Da)。所用标准源自Sigma，除了从BDH得到的L- 酪氨酸外。洗提蛋白质峰的表观分子量用标准曲线进行测定。该标 准曲线反映了蛋白质分子量的对数和保留时间的关系。
SDS-佩奇电泳
鹿茸角的全蛋白萃取液和低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理 后萃取制得)负载在16.5％Tris-Tricine SDS-聚丙烯酰胺凝胶上 (BioRad)。样品在负载到凝胶上之前，用2-巯基乙醇进行变性， 并用4分钟加热到99℃。10ul的MultiMark分子量标记混合物 (Invitrogen)分别和5、10、25和50ug的萃取液负载到凝胶上。 凝胶在190伏的电压下运行50分钟。然后除去凝胶，并用0.25％的 库马西亮蓝(库马西Brillant Blue)G-250(BDH)溶液染色15分 钟，并使甲醇和25％的三氯乙酸每份相等。然后，凝胶在5％的三 氯乙酸溶液中经过一晚上的再次染色。凝胶进一步在1％戊二醛溶液 中固定5分钟之前，用25％的甲醇/1％乙酸清洗5分钟后，用1％ 的甲醇/0.5％乙酸清洗5分钟，接着用去离子水(MilliQ)清洗6 次(1.5分钟/次)。
银染色是这样进行的：将92.5ul的10M氢氧化钠加入到1.44ml 的28％氨水溶液中，用MilliQ水稀释至45ml，得到溶液A。溶液B 由2.5ml的MilliQ水和0.5克的硝酸银组成。在使用前，立即将溶 液A和B混合，凝胶在混合物中染色10分钟。染色后，凝胶在MilliQ 水中清洗3次，共用时10分钟。最后，凝胶在0.005％柠檬酸/0.02 ％甲醛溶液中显影约1分钟后，加入25％甲醇/0.26％乙酸2分钟后 停止显影。然后用Kodak DC120数码相机对凝胶进行拍摄展示。
细胞增殖试验
人体脐静脉内皮细胞在培养基199(GibcoBRL)中培养；在37℃、 5％二氧化碳的T75组织培养烧瓶(NunclonTM)中，培养基附加有 10％的胎牛血清(GibcoBRL)、50U/ml的青霉素、50μg/ml的链霉 素、2mM的L-谷氨酸盐和1ng/ml碱性纤维原细胞生长因子 (bFGF)。细胞进行牛血清化后(0.025％牛血清、0.265mMEDTA、 GibcoBRL)，植入在密度3000细胞/well/200ul的96-well plate (NunclonTM)中培养3天。细胞在1％的血清中饥饿24小时，然后 用含有1ng/ml bFGF的1％的血清进行处理，或用不含有鹿茸角萃取 液进一步处理48小时。在结束孵化的2小时之前，20ul的Celltiter 96 Aqueous One Solution Reagent加入到每个well中。在37℃、潮湿的， 含有5％二氧化碳的氛围中完成孵化后，用plate reader(Bio-Tek)记 录下wells在490nm(“OD490”)处的光密度。
牛大动脉内皮细胞的迁移
牛大动脉内皮(BAE)细胞可以在Dulbecco’s改Eagle medium (DMEM，GibcoBRL)中生长汇合，该培养基在12-well plate (NunclonTM)中含有10％的胎牛血清(GibcoBRL)。单层通过刮蹭 穿过盘子的可处理的吸液管尖端受到创伤。用Dulbecco’s PBS和钙 (0.1g/L)(GIBCOTM，Invitrogen Corporation)清洗后，受伤的单 层进一步在含有或不含有鹿茸角萃取液的新鲜的1％血清中培养48 小时。这样得到了全蛋白茸角萃取液、通过超滤制备的低分子量萃 取液、从全蛋白萃取液中沉淀高分子量蛋白质得到的低分子量萃取 液和用70％乙醇预处理茸角后得到的低分子量萃取液。其后的低分 子量萃取液液在100℃中沸腾3分钟后进行测试。一些wells作为阳 极对照，并在10％的血清中培养。受伤单层内的细胞的移动程度取 决于所拍摄的初始受伤和受伤48小时后的显微照片。显微照片用 Olympus CK2 inverted microscope的20倍放大率拍摄，并打印成 15cm宽×10cm厚的标准尺寸。1.5cm×10cm的线形格子和基线平行， 放置于照片上。基线设在“受伤线”的上面，其中细胞被原始刮掉。 记录下每条线截取的细胞的数目。这样可以测试迁移距显微照片基 线1.5，3.0，4.5，6.0，7.5或9.0cm处的细胞的数目。
原位杂交
探针的产生
原位杂交的方法以Clark等人(1996)公开的方法为基础。包含 VEGF编码序列1-4的探针克隆到转录载体pGEMTEasy中 (Promega，Madison，WI)。并通过限制性消解SacII，NcoI(New England Biolabs，Beverly，MA)，或SalI(Boehringer Mannheim， Germany)线形化产生同义探针(sense probe)和反义探针(antisense probe)。单股同义和反义核糖探针(riboprobes)根据生产指令() 通过转录和10μCi/μl[33p]UTP一起进行标记。
片段的制备
片段在二甲苯中脱蜡，然后放入浓度正在减少的乙醇中，再在 0.2M的HCl中浸泡20分钟(室温)，再在2×SSC(1×SSC含 有150mM氯化钠和15mM氯酸钠，pH 7.0)中清洗30分钟。蛋白 酶K(Sigma Chemical)的消解在浓度为2μg/ml的200mM Tris-HCl(pH 7.2)，50mM EDTA(pH 8.0)、温度为37℃的条件下进行15分钟。 然后载玻片在含有100mM的三乙醇胺(pH 8.0)、0.25％的乙酸酐的溶 液中浸泡2×5分钟(室温)。载玻片在2×SSC(室温)中清洗5 分钟后，脱水、干燥。
杂交
在探针产品(约2×106cpm/μl)中如上标记的1ul核糖探针和 20-60ul杂交缓冲液混合。杂交缓冲液中含有：50％(v/v)的去离 子甲酰胺、0.3M的NaCl、10mM的Tris-HCl(pH 6.8)、10mM的磷 酸钠(pH6.8)、5mM的EDTA(pH8.0)、1×Denhardts溶液(BSA、 Ficoll和polyvinyl pyrrolidone分别为0.02％(w/v))、10％(w/v)右 旋糖苷硫酸盐、50mM的二硫代苏糖醇和1mg/ml的发酵tRNA (生 命技术)。这种含有探针的混合物在95℃下进行变性，然后用于预处 理和干燥的组织片段中，组织片段随后被小片的帕拉胶膜(parafilm) 覆盖；没有发生预杂交。杂交在54℃下于密封容器中进行18小时， 该密封容器用50％的甲酰胺和0.3M的NaCl潮湿化。
载玻片在50℃下于5×SSC中清洗15分钟(×2)，然后在65 ℃下于50％的甲酰胺中清洗30分钟。在37℃下于2×SSC中进行四 次清洗，每次持续5分钟。载玻片在37℃下用核糖核酸酶A(Sigma Chemical)培育30分钟，核糖核酸酶A在1×清洗液(400mM NaCl， 10mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH 7.5)的最终浓度为20μg/ml。然后 通过用含有50％甲酰胺的2×SSC在65℃时将载玻片清洗30分钟除 去RNase A，并接着在37℃下，分别于2×SSC and 0.2×SSC中清 洗15分钟。片段分别用含有0.3M醋酸铵的30、60、80和95％的乙 醇进行脱水，并最终用100％的乙醇清洗两次。
片段用空气干燥，并用自动X射线照相用的乳液(LM-1 emulsion； Amersham International plc)进行涂敷。乳液涂敷的载玻片于4℃下在 不透光的盒子中以粉状储存3周。然后将载玻片显影(D19 developer； Kodak，Rochester，NY，USA)并影像地固定(30％的硫代硫酸钠)， 从而在杂交位上产生可见的银颗粒。而片段用吉尔苏木素(Gills Haemotoxylin)进行染色，并可以用亮和暗场在Zeiss Axioplan显微 镜上观察。
含低分子量鹿茸角萃取液制剂的制备
鹿茸角血管原萃取液的局部凝胶制剂用三种不同类型的高分子 进行制备，即聚羰乙烯-934P，聚醚(Pluronic)F-127和甲基纤 维素-E4M。聚羰乙烯-934P是Chemcolor New Zealand Limited给的 样品，聚醚F-127是BASF New Zealand Limited给的样品，甲基纤 维素-E4M FG是Dow Chemical Limited Australia给的样品。
等渗磷酸缓冲液的制备
pH为7.0的等渗磷酸缓冲液(0.063M)通过将1.295克的无水 正磷酸氢二钠(Na2HPO4)、0.9125克的磷酸二氢钠一水化物 (NaH2PO4·H2O)和1.199克氯化钠溶于水中。然后将该溶液体积用水 调到250ml。
用聚碳乙烯-934P制备的制剂
聚羰乙烯在等渗甘露醇水溶液中制备。
为了制备加倍浓缩的聚羰乙烯凝胶，0.5克的聚羰乙烯-934P 加入到50ml的加倍浓缩(double strength)的等渗甘露醇溶液中， 并用电磁搅拌器搅拌30分钟，然后静置，使气泡升至表面。甘露醇 溶液是由5.07克的甘露醇和50ml的水混合制成。并加入10％(w/v) 的氢氧化钠溶液将pH值调为7.0。
低分子量茸角萃取液(乙醇预处理后萃取制备得到)的加倍浓 缩溶液为溶于蒸馏水中、浓度为4mg/ml的萃取液。
对照制剂是这样制备的：将3克加倍浓缩的聚羰乙烯凝胶加入 到3ml的水中，并用软膏刀(spatula)轻轻的搅拌。然后使用前在 4℃下储存。
治疗制剂是这样制备的：将3克加倍浓缩的聚羰乙烯凝胶加入 到3ml加倍浓缩的萃取液溶液中，并用软膏刀轻轻的搅拌。然后使 用前在4℃下储存。
用聚醚F-127制备的制剂
聚醚F-127制剂在pH值为7.0的等渗磷酸缓冲液中制备。
加倍浓缩聚醚凝胶是这样制备的：将20克的聚醚F-127加入到 50ml的冷等渗磷酸缓冲液中，并轻轻用电磁搅拌器搅拌。加完后， 溶液继续搅拌10分钟。在4℃下保存过夜，用超声波降解3小时后， 再在4℃下保存过夜。
低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取制得)的加倍浓缩 溶液是这样制备的：将萃取液溶于等渗磷酸缓冲液中，使其浓度为 4mg/ml。
对照制剂是这样制备的：称量4克的加倍浓缩聚醚凝胶，并在 其中加入4ml的等渗磷酸缓冲液。然后将其在冰箱里保存几分钟， 使聚醚凝胶转化为溶液(4℃时聚醚在水中是溶液，37℃时聚醚在水 中是凝胶)。然后用药膏刀轻轻混合，使用前在4℃下保存。
为了制备治疗制剂，将4克的加倍浓缩聚醚凝胶装入一个小瓶 中；并加入4ml的加倍浓缩萃取液溶液。然后在冰箱里放置几分钟， 使聚醚凝胶转化为溶液。然后轻轻的用药膏刀混合，使用前在4℃下 保存。
用甲基纤维素-E4M制备的制剂
甲基纤维素-E4M制剂在pH值为7.0的等渗磷酸缓冲液中制备。
加倍浓缩甲基纤维素凝胶是这样制备的：将2克的甲基纤维素 -E4M FG缓慢加入到25ml、加热到80℃的、搅拌过的等渗磷酸缓冲 液中，再将25ml、冷却为4℃的等渗磷酸缓冲液加入到甲基纤维素 中分散，进一步搅拌3分钟。混合物在4℃下保存5小时。
低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取制得)的加倍浓缩 溶液是这样制备的：将萃取液溶于等渗磷酸缓冲液中、使其浓度为 4mg/ml。
对照制剂是这样制备的：称量5克的加倍浓缩甲基纤维素凝胶， 并在其中加入55ml的等渗磷酸缓冲液，该混合物用药膏刀轻轻混合， 使用前在4℃下保存。
为了制备治疗制剂，将5克的加倍浓缩甲基纤维素凝胶装入一 个小瓶中；并加入55ml的加倍浓缩萃取液溶液；然后轻轻的用药膏 刀混合，该混合物使用前在4℃下保存。
老鼠伤口治疗试验
这些试验条件是在惠灵顿医药健康学校的动物道德委员会监督 下进行的。
使Male Lewis老鼠(鼠龄为19-23周)适应环境，在试验期间 单独保藏。在试验期间供给老鼠正常的饮食，并从第0天开始，让 老鼠每天口服果冻(4ml)。在第0天，给动物注射克他命(100mg/kg 体重)和甲苯噻嗪(5mg/kg体重)进行麻醉。每个动物在其沿着脊 骨的背部表面做两个8mm的全皮活组织切片检查。颅骨基部末端的 伤口为6cm到8cm。应仔细操作以确保每个活组织切片检查与皮肤间 有一个合适的角度。伤口用纱布擦拭，以除去多余的血液，然后比 例标记和标码一起拍照。然后向伤口上加入制剂和对照溶液。康复 后，进行皮下注射0.05mg/kg体重的Temgisic。间隔2-3天后，重 复进行附图(图10-13)中所示的治疗和对照。在这期间，用3.5％ 的三氟溴氯乙烷对动物进行轻微麻醉。重复试验的动物伤口也进行 了拍照。然后每隔2-3天再进行试验，直至全部伤口愈合。
在老鼠伤口治疗模型中对剂量和低分子量鹿茸角萃取液(乙醇 预处理后萃取制得)的应用进行了评价。载体、定量给料的规则和 萃取液的浓度在附图(图10-13)中进行了说明。每个动物的一个伤 口用25ul制剂治疗，而另一个伤口用25ul的对照物质进行治疗。 除了1mg/ml剂量(图10)仅用4个动物之外，所有的试验用了6 个动物进行试验。每个伤口的照片用Canon EOS 3000N相机(F2.8 macro lens)进行拍摄。每个曝光的打印都被数码记录，伤口的面积 通过这些图像用NIH Image 1.63软件进行计算。每个时间点的伤口 尺寸以占原始伤口的百分比进行计算，每个时间点的统计分析通过 差异分析(ANOVA)进行。
伤口组织学
如上所述，伤口在老鼠的背部上。在第0天，单独将PBS用于 每个老鼠的对照伤口上，同时在同一天用10mg/ml低分子量鹿茸角 萃取液(乙醇预处理后萃取制得)PBS溶液对伤口进行治疗。动物 (N＝6)受伤后麻醉4天。伤口被切离。在转移到70％的乙醇中之前， 四个动物的组织在10％的中性福尔马林缓冲液中放置24小时；另外 两个动物的组织保持原状，以进行胶原质分析。被切成一半后，伤 口中植入固体石蜡，并将切面进行切片。片段切成5um后放在载玻 片上，并用APES(3-氨丙基-三乙氧基硅烷)进行涂敷。
用马森三色法对伤口进行着色
着色用Bancroft和Stevens(1990)所述的方法进行。片段用二 甲苯(5minutes×2)进行脱蜡，然后在浓度递减的一系列乙醇溶液 中进行再水合。接着，片段在用活水清洗10分钟之前，用Weigerts 苏木素着色10分钟。将这些片段在0.5％的品红酸液中放置5分钟， 然后用蒸馏水清洗。用1％的磷钼酸处理了5分钟后，用2％的甲基 蓝着色5分钟，并用蒸馏水清洗。用1％的乙酸处理2分钟后，片段 进行了脱水，在逐渐上升浓度的乙醇系列溶液中，用二甲苯进行处 理，并逐渐用DePeX(BDH)覆盖。
照片用具有蔡司镜头的Canon PowerShot G5(5mega pixel)数 码相机拍摄。图片用使用佳能远控软件的遥控装置进行捕获，其分 辨率为每英寸72像素，并被转化为Adobe Photoshop(version 5.5) 进行图示。
伤口上的核纤层蛋白免疫组织化学
片段用二甲苯(5minutes×2)脱蜡，接着在浓度逐渐降低的乙 醇系列溶液中再水合。除了特别指明之外，所用的反应物、抗体和 酶可以从Zymed Laboratories Inc，CA购买。片段用胃蛋白酶(Cat No.20671651)于37℃下处理15分钟。之后的过程在室温下进行。 用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗(5minutes×2)后，通过20％的正常 山羊的血清在1％BSA/PBS中处理30分钟，没有具体的连接点是阻 塞的。然后，片段用多细胞系的野兔抗-核纤层蛋白抗体(1∶1000 稀释)(Novus Biologicals Inc.，Cat No.NB 300-144)培育1小 时。对于阴极对照，初始的抗体用非-免疫野兔免疫球蛋白IgG(10 μg/ml)代替。片段在PBS(5分钟)、在0.5％非-脂肪奶粉末/0.1 ％Tween-20/2×PBS(10minutes×2)和PBS(5分钟)中清洗，接 着用生物素化的次级山羊抗-野兔抗体(5μg/ml)培育30分钟。片 段再次在PBS(5分钟)、在0.5％非-脂肪奶粉末/0.1％Tween-20/2× PBS(10minutes×2)和PBS(5分钟)中清洗。
酶的过氧物在非活性内生过氧化酶中应用9分钟。用PBS(5 minutes×2)清洗后，片段在HRP-Streptavidin Conjugate(2.5 μg/ml)中培育10分钟。片段在PBS(5minutes×2)中清洗，并用 3，3’-二氨基联苯胺(DAB)试剂盒进行显影。在水中清洗后，片段在 系列浓度逐渐降低的乙醇溶液中脱水，接着用二甲苯处理，然后用 DePeX(BDH)覆盖。照片用蔡司镜头、400ASA的柯达黑白胶卷拍摄， 并被转化为Adobe Photoshop(version 5.5)进行图示
结果
分馏和凝胶过滤色谱法
用离心机-YM10设备对鹿茸角进行超滤分离，得到高分子量 馏分(图1)和低分子量馏分(图2)。
全蛋白萃取液的凝胶过滤色谱图如图3所示。该图中的全蛋白 鹿茸角萃取液的表观分子量分别广泛，并正如期望的一样，高分子 量蛋白质为主要组分。相比之下，用70％乙醇预处理鹿茸角得到的 低分子量萃取液的示图(图4)表明：乙醇预处理过程使鹿茸角萃取 液中的主要蛋白质的分子量小于10kDa。这种萃取液中有6个主峰 是明显的。
SDS-佩奇电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶首先用库马西(图5A)进行着色，然后用 银(Figure 5B)着色，然后使用这种SDS-聚丙烯酰胺凝胶显示和 进一步描述低分子量鹿茸角萃取液中出现的蛋白质，从而和全蛋白 萃取液对比。全蛋白萃取液显示了多种蛋白质，特别是60kDa以上 和约20kDa的蛋白质，无论是用库马西或银着色，但是在低分子量 萃取液轨道中仅有2个明显峰段。它们的表观分子量为6kDa左右 和超过60kDa。
细胞增殖试验
和1％的血清相比(图6)，在培育时鹿角萃取液可以增强人体 脐静脉内皮细胞的增殖。这种增强的增殖主要标记为低分子量萃取 液(用70％乙醇预处理后得到)。应注意的是，当全蛋白鹿茸角萃 取液沸腾3分钟后，其保持了对内皮细胞的增殖活性。
牛大动脉内皮细胞的迁移
为了进一步证实萃取液的血管原活性，考查了牛大动脉内皮 (BAE)细胞。和对照相比(图7)，通过超滤作用和乙醇沉淀方法制 得的低分子量萃取液都显著增加了细胞从细胞擦伤处移出的距离和 数量。
如图8所示，沸腾3分钟的低分子量萃取液(来自乙醇预处理 方法)没有降低萃取液对BAE细胞迁移的增强效果。
原位杂交
除此之外，我们已经表明鹿角的血管原活性不可能是由于血管 内皮生长因子(VEGF)，VEGF是几乎公知的有效的血管原因子。 原位杂交是这样进行的：用覆盖VEGF外显子1-4的探针，从而可 以探测到所有的剪接变异体(splice variant)。图9显示的结果 表明VEGF mRNA只在鹿角的前软骨细胞中探测到，而不是在紧邻 血管的细胞中。VEGF显示的mRNA量相对低下。
我们也考查了鹿角mRNA作为原位杂交(数据没显示)中使用 的其它典型的血管原因子。奇怪的是，我们没有能发现大量的酸性 或碱性生长因子mRNA在促使鹿角血管原性上起了重要作用。
老鼠受伤试验
图10显示了用盐或1mg/ml的低分子量萃取液治疗的伤口愈合 百分比，其中低分子量萃取液是用70％乙醇预处理鹿茸角得到的。 和仅用盐处理的对照伤口相比，治疗的伤口愈合速度快很多。
老鼠受伤模型用于测试治疗的剂量范围。低分子量鹿茸角萃取 液(乙醇预处理后萃取得到)和单独的载体PBS(对照治疗)相对照。 每种溶液都取25ul放在伤口上。鹿茸萃取液的剂量为0.1mg/ml，对 照组和治疗组是分开的，不过这种差异在统计上是不重要的(图 11a)。鹿茸萃取液的剂量为2mg/ml、在2、4、6、8、10和14天 时大大改善了伤口愈合的速度(图11b)。10mg/ml剂量的低分子 量鹿茸角萃取液在8和10天时显示了令人满意的较快的伤口愈合 (图11c)。非常高剂量的萃取液(100mg/ml)同样增加了伤口愈合的 速度，在6、8、10、12、14和16天显示了较大的改善(图11d)。
在受伤当天10mg/ml的单一剂量的低分子量鹿茸角萃取液(乙 醇预处理后萃取得到)的效果和单独载体(对照)(图12)的效果 进行对比。单一剂量的萃取液改善了伤口愈合的速度，对照伤口和 治疗伤口之间的差异在第8天是显著的。
低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取得到)的不同制剂 在剂量为2mg/ml(图13)时进行了考查。每个方案中的对照是没有萃 取液的单独载体。和单独的载体相比，用甲基纤维素制备的萃取液 制剂大大改善了2-14天时的伤口愈合速度(图13b)。用聚醚制备 的萃取液制剂大大改善了所有天的伤口愈合速度(图13b)，不过单 独的载体(对照)在治疗初始阶段(图13c)有消极影响。当萃取液 制剂用聚羰乙烯时，伤口愈合的速度在2、4、6、8、10和14(图13d) 天时得到了大大的改善。
伤口组织学
单独用10mg/ml的低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取 制得)和单独用PBS进行对比，对伤口组织学在4天康复情况进行 了考查。该试验使用了六只动物，不过仅四只动物用在组织学上。 局部切片的康复位置相对于设置在活组织切片检查左侧的未受伤组 织时明显的(图14A，B)。在对照伤口中，局部切片的面积通过伤 口组织下面和表面的伤疤进行区分。破裂该伤口组织，该伤口组织 由细胞外基质和分散的细胞组分组成(图14A，C)。治疗的伤口显 示了明显的不同组织学(图14B，D)。伤疤(图14B)出现在上皮细 胞集中的地方。表皮下面的一层我们称之为真皮组织(图14D)。 这在导致伤疤的胶原质中并不丰富。真皮中有很好的细胞组织和丰 富的血管组织，从而可以调制自然伤口的康复过程。4个动物中的3 个动物的治疗伤口非常一致，第四个在对照伤口和治疗伤口间的差 异和图14相比很小。
组织考查后，进行膜蛋白层粘连蛋白基的免疫组织化学。对照 伤口的层粘连蛋白免疫组织化学显示没有血管，特别是在上皮面(图 15A，C)。在伤口边缘探测出的对照伤口层粘连蛋白表明着色的抗体 在这些区域有效果(图15E)。治疗伤口的基部血管和上皮面中的 血管是清洗明显的(图15B，D)。表面的血管和基部血管具有不同 的形态学，并对上皮面进行了轻微的着色。
讨论
本部分集中于萃取液和鹿茸角馏分中的肽和蛋白质的尺寸。这 主要是因为干燥的鹿茸角组织的主要组分是蛋白质，以及典型的血 管原因子也是蛋白质。不过，发明人意识到其它非蛋白组分不可避 免的含在鹿茸角萃取液和馏分中，这些组分也可能对所观察到的活 性有益或起主要作用。
具有血管原活性、主要分子量小于或等于10kDa的低分子量馏分 的发现是令人惊异的，因为许多典型的血管原生长因子都是大于 10kDa的(表1)。
凝胶过滤色谱分析方法和SDS-佩奇分析方法给出了低分子量鹿 茸角萃取液组成的明显对比信息。在SDS-佩奇中，凝胶用库马西亮 蓝G250染色后，再用银着色(图5)。和凝胶过滤色谱分析(图4) 期望的结果相比，低分子量萃取液显示了较少的峰段。此外，分子 量大于10kDa的蛋白质和期望的相比，着色更加明显。不过，SDS- 佩奇凝胶上没有完成和不存在的蛋白质的着色对于库马西和银着色 是很好鉴别的特征(如Smith，2002；Kondratiuk et al.，1982)。对于在 低分子量萃取液中低于10kDa的蛋白质低于期望着色强度可能是由 于这种现象造成的。
由鹿茸角组织上的原位杂交(图9)探测出的潜在血管原生长因 子VEGF的RNA信使限于前软骨区域，并仅以低水平出现。在aFGF 或bFGF mRNA的原位杂交中没有发现和血管原性发生的区域相关 的转录(数据没有显示)。这产生了这样一个问题，即是什么因子 促使鹿角中的血管每天生长达2cm。
测试了人体脐静脉内皮细胞(HUVEC)对萃取液的增殖反应。 发现全蛋白鹿茸角萃取液甚至在沸腾3分钟(图6)后还能引起 HUVEC的增殖。低分子量鹿茸角萃取液(用70％乙醇预处理后萃取 制得)使HUVEC发生了明显的增殖。在内皮细胞迁移试验中，当用 牛大动脉内皮(BAE)细胞评价全蛋白鹿茸角萃取液、乙醇沉淀制 备的低分子量萃取液和超滤制备的低分子量萃取液时，都使更多的 细胞迁移到受伤的区域(图7)。用乙醇沉淀制备的低分子量萃取液 在100μg/ml时反应最明显；而在500μg/ml时，响应没有一个剂量响 应的明显。
70％乙醇预处理后萃取制得的低分子量萃取液在沸腾前和沸腾 3分钟后(图8)进行了活性测试。结果显示，沸腾没有对所测试剂 量的活性产生影响。这证实了具有血管原活性的分子在加热3分钟后 还是稳定的。
70％乙醇预处理后萃取制得的低分子量萃取液在老鼠体内进行 测试，并发现加速了伤口的康复，使康复仅需3天(图10)。发现治 疗的伤口在康复过程的起始和结束大大加快了康复的速度，这表面 萃取液对整个康复过程都有影响。这种推论进一步通过体内试验进 行了证实(图11和13)。
动物创伤试验的结果表明低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理 后萃取制得)具有许多积极影响。例如，该萃取液在暴露于杀菌剂 量(2.5Mards)的γ-射线后仍保持其潜在的活性。该萃取液在1mg/ml 和100mg/ml(图10和11)间对于改善伤口的愈合具有有效的剂量。没 有发现剂量有消极影响。通过用低分子量鹿茸角萃取液对当天受伤 (图12)进行单一治疗考查了要求产生反应的应用数量。和对比伤 口相比，在一时间点(第8天)达到统计显著性的差异时，发现伤口 的愈合速度增加了。这是一个有趣的发现，对于产生积极结果的不 同剂量都需要进行测试以证实。
剂量为2mg/ml的低分子量鹿茸角萃取液(乙醇预处理后萃取制 得)的不同制剂在老鼠伤口康复模型上进行了测试(图13)。用甲 基纤维素和聚羰乙烯制备的制剂和以PBS作为载体的制剂是相似的， 大大改善了多数时间点的伤口愈合速度。而聚醚制剂可能是相反的， 载体单独对伤口愈合的初始速度具有消极影响(图13c)。这些结果 表明萃取液可以制成不同的制剂仍保持活性。
用马森三色法对伤口组织学进行了考查，马森三色法是常用的 着色方法，但是对细胞外基质蛋白质有效。图14的图片显示了受伤4 天后的情况，低分子量萃取液治疗的伤口的真皮组织具有正常皮肤 所具有的结构。这表明表皮开始变化、真皮组织含有血管和有组织 的细胞组分开始迁移到伤口内。对照伤口仍保持在伤口修复的早期， 其仍然有一个伤疤和主要是没有特殊组织的细胞组分点缀的真皮伤 口组织。因而组织学表明低分子量萃取液治疗的伤口处于一个康复 的领先阶段。组织学还表明萃取液调制组织修复，并导致伤口的正 常愈合，而不仅仅是一个胶原伤疤。伤口为基部细胞膜蛋白和层粘 连蛋白进行免疫着色。层粘连蛋白和内皮基面上的基部细胞膜关联。 结果显示：受伤4天后，和对照伤口相比(用PBS处理)，用低分子 量鹿茸角萃取液治疗的伤口面上有更多的血管。最明显的是，和对 照伤口相比，在治疗伤口的上部/上皮下的区域内的血管数目有增加。
对照伤口在伤口区域内有很少，或没有可见的血管(如15A，D，E)。 在对照伤口的边缘、未受伤的区域，血管清晰表明免疫着色在这些 片段上成功实现(图15E)。在低分子量鹿茸角萃取液治疗的伤口中， 位于伤口上皮细胞中的血管用马森三色法的方式着色后是明显的， 尽管层粘连蛋白的免疫着色是来自如图14所示的不同的动物。治疗 伤口表面上的血管更加轻微的在上皮面(图15D)进行着色。血管也 向表面排列，这也许表明血管正在发展成顶生表面，这些血管周围 的基部细胞膜正处于被放弃的过程。层粘连蛋白免疫组织化学表明 增加的血管原是在伤口上使用低分子量鹿茸角萃取液的结果。
总而言之，结果表明源自鹿茸角的组合物具有血管原活性。特 别是，低分子量鹿茸角萃取液具有潜在的伤口治疗活性，其中该萃 取液先用乙醇预处理后再萃取制得。在体内，该萃取液增加了内皮 细胞的迁移和增殖。在体内伤口治疗模型中，低分子量鹿茸角萃取 液在剂量范围为1mg/ml-100mg/ml杂交了伤口愈合的速度。在动物 上没有看到任何阶段的消极副作用。治疗伤口的形态学表明该萃取 液诱导了包括血管原性的有益于伤口康复的反应。这些结果表明用 低分子量鹿茸角萃取液治疗伤口是一种改善伤口愈合速度，从而有 助于伤口愈合的有效方法。
表1：一些公知的血管原生长因子的分子量(跟踪拉包括任何 未处理的前体) 血管原生长因子 初始的登陆号 分子量 血管内皮生长因子A P15692 27kDa 纤维原细胞生长因子1 P05230 17kDa 胎盘生长因子 P49763 25kDa 多效素 P21247 19kDa 血管生成素-1 Q15389 58kDa 血管生成素-2 Q15123 57kDa CYR61 P15692 27kDa 胸腺素β4 P05230 17kDa
本发明的特征仅用实例进行叙述。应该理解的是，任何没有超 出本发明范围的修改和增加包含在本发明的权利要求书的范围内。
Auerbach R.，Kubai L.，Sidky Y.1976 Angiogenesis induction by tumors，embryonic tissues，and lymphocytes.Cancer Research 36：3435-3440.
Bancroft and Stevens(eds.).1990.Theory and practice of histological techniques，3rd Edition.
Clark D.E.，Smith S.K.，Sharkey A.M.，Sowter H.M.， Charnock-Jones D.S.1996 Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor c-met；localisation and expression in the human placenta throughout pregnancy.Journal of Endocrinology 151：459-467.
Deodato B.，Arsic N.，Zentilin L.，Galeano M.，Santoro D.，Torre V.， Altavilla D.，Valdembri D.，Bussolino F.，Squadrito F.，Giacca M.2002 Recombinant AAV vector encoding human VEGF 165 enhances wound healing.Gene Therapy 9：777-785.
Kondratiuk T.P.，KurskiǐM.D.，Fedorov A.N.，Osipenko A.A.， Meshkova L.I.，Litvinenko E.A.1982.[Characterization of endogenous phosphorylation substrates of sarcoplasmic reticulum fragments from fast skeletal muscles of the rabbit].Biokhimiia 47：950-6
Li C.，Clark D.E.，Lord E.A.，Stanton J-A.L.，Suttie J.M.2002 Sampling techniques to discriminate the different tissue layers of growing antler tips for gene discovery.The Anatomical Record 268：125-130.
Malinda K.M.，Sidhu G.S.，Banaudha K.K.，Gaddipati J.P.， Maheshwari R.K.，Goldstein A.L.，Kleinman H.K.1998 Thymosin β1 stimulates endothelial cell migration，angiogenesis，and wound healing.The Journal of Immunology 160：1001-1006.
Marshall J.L.，Mead P.，Jones K.，Kaba E.，Roberts A.P.2001 The implementation of venous leg ulcer guidelines：process analysis of the intervention used in a multi-centre，pragatic，randomized，controlled trial.Journal of Clinical Nursing 10：758-766.
Montesinos M.C.，Desai A.，Chen J.F.，Yee H.，Schwarzschild M.A.，Fink J.S.，Cronstein B.N.2002 Adenosine promotes wound healing and mediates angiogenesis in response to tissue injury via occupancy of A(2A)receptors.American Journal of Pathology 160：2009-2018.
Sen C.K.，Khanna S.，Gordillo G.，Bagchi D.，Bagchi M.，Roy S. 2002 Oxygen，oxidants，and antioxidants in wound healing.Annals of the New York Academy of Sciences 957：239-249.
Smith，B.J.2002.Quantification of proteins on polyacrylamide gels.In：Walker，J.M.(ed.).The Protein Protocols Handbook，2nd Edition.Humana Press Inc.，Totowa，N.J.pp 237-242.
Sunwoo，H.H.，Nakano，T.，Hudson，R.J.and Sim，J.S.1995. Chemical composition of antlers from wapiti(Cervus elaphus). Journal of Agricultural and Food Chemistry 43：2846-2849.
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈