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基于转录组的椴树属EST-SSR引物及其筛选方法和应用

阅读:37发布:2021-09-19

专利汇可以提供基于转录组的椴树属EST-SSR引物及其筛选方法和应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一套基于南京椴全长转录组序列开发的EST-SSR分子标记,涉及引物共27对,其核酸序列如 序列表 SEQ ID NO.1~54所示。本发明的27对EST-SSR标记是基于转录组序列筛选候选SSR位点并设计的SSR扩增引物,并通过该属不同物种为材料,选用基因组DNA进行扩增验证为明确的SSR标记,具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、共显性且易于检测等优点。本组标记填补了椴树属共显标记的空白,为本属 植物 种类鉴定、遗传谱系分析、种质资源的保护和辅助育种等领域,能够极大的促进椴树属资源的研究及开发应用。,下面是基于转录组的椴树属EST-SSR引物及其筛选方法和应用专利的具体信息内容。

1.基于转录组的椴树属EST-SSR引物,其特征是,所述引物共27 对,所述引物序列如SEQ ID NO.1 54所示。
~
2.根据权利要求1所述的基于转录组的椴树属EST-SSR引物的筛选方法,其特征是,包括:
构建转录组文库:分别提取南京椴根、茎、叶、花和苞片5个组织的RNA,并等量混合后,反转录合成全长cDNA,构建不同大小的cDNA文库,经质控后,使用PacBio RSII平台进行测序,获得全长非嵌合序列;
 对全长非嵌合序列进行聚类分析,校正后获得高质量转录本序列, 经去冗余分析得到高质量去冗余转录本序列;
采用MISA 软件对南京椴转录组数据中的高质量去冗余转录本序列进行单基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR 和混合SSR 位点搜索;
采用Primer3 软件进行SSR 引物设计,引物序列长度18-27bp,预计扩增产物长度100-
280 bp,GC 含量40% -60%,退火温度57-63℃,上、下游引物的退火温度值相差不大于2℃;
提取椴树属不同物种的叶片DNA,进行设计引物有效性的PCR 鉴定,筛选SSR 引物,若有与预计扩增产物长度相近的扩增产物,该引物即为有效引物。
3.根据权利要求2所述的基于转录组的椴树属EST-SSR引物的筛选方法,其特征是,所述质控包括过对全长cDNA进行末端修复并连接接头后,使用Blue pippin进行文库二次筛选,经Qubit2.0和Agilent 2100进行定性和定量检测。
4.根据权利要求2所述的基于转录组的椴树属EST-SSR引物的筛选方法,其特征是,进行设计引物有效性的PCR 鉴定的反应体系为:2×PCR mix 8μL,浓度为10 μmol/L的上、下游引物各0.5μL,基因组DNA 2 5ng,总体积10μL。
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5.根据权利要求2所述的基于转录组的椴树属EST-SSR引物的筛选方法,其特征是,进行设计引物有效性的PCR 鉴定的反应程序为:98℃ 2 min ;98℃10s,Tm+2℃30s,72℃10s,
30个循环;72℃ 10min;扩增产物采用8%的聚丙烯酰胺变性胶进行分离,电泳染显色。
6.根据权利要求1所述的基于转录组的椴树属EST-SSR引物在椴树属植物种类鉴定、遗传谱系分析、种质资源的保护和辅助育种领域的应用。

说明书全文

基于转录组的椴树属EST-SSR引物及其筛选方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于转录组的椴树属EST-SSR引物及其筛选方法和应用,属于分子标记技术开发及应用技术领域。

背景技术

[0002] 椴树属(Tilia L.),落叶乔木,是锦葵科(Malvaceae)一个形态特殊且唯一北半球分布属,为北温带落叶至常绿阔叶林中的特征和优势属植物之一,物种多样性中心位于我国。该属植物在世界范围内栽培历史十分悠久,兼具材用、纤维用、药用、景观及蜜源等功能,开发应用前景十分广泛。
[0003] 椴树属植物特征明显,花序和果序上具有叶状独特的大型苞片,易于与其他类群区别。最新研究将全球椴树属植物共划分为23种,北美2种,欧洲至西亚4种,东亚17种,包括中国特有种15个。但属内种间缺乏生殖隔离,种质渗入现象较为普遍,近缘类群种间形态性状变异和交叉现象并未很好的解释,椴树属种间关系和演化历史仍不清楚。仅依靠叶绿体系统发育基因组学的手段很难完全解决其系统发育问题,因此从核基因入手,获得较多的信息位点,将为全面的解释椴树属物种的演化提供依据。长久以来,椴树属植物中缺乏高效的、可靠的、稳定的、共显性的核基因SSR标记。利用SSR标记不仅有助于揭示椴树属系统发育问题,而且有助于该属植物资源多样性分析及分子标记辅助育种工作的推进,对今后椴树属植物资源高效利用和开发具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术缺陷,提供一种基于转录组的椴树属EST-SSR引物及其筛选方法和应用。提供的椴树属特异性SSR分子标记可利用到属内物种分类及进化研究、资源遗传多样性分析、核心种质的构建及辅助育种等工作中,填补了椴树属共显性SSR标记的空白。
[0005] 为解决上述技术问题,本发明提供一种基于转录组的椴树属EST-SSR引物,所述引物共27对,所述引物序列如SEQ ID NO.1~54所示。
[0006] 上述椴树属植物可为椴树属中的以下种类中的任意一种或几种,但不限于以下几种,可推广应用至本属23种:南京椴(Tilia miqueliana Maxim.)、南京椴(黄叶)、糯米椴(Tilia henryana Szyszyl.)、毛椴(Tilia tomentosa Moench)、紫椴(Tilia amurensis Rupr.)、糠椴(Tilia mandshurica Maxim.)、欧洲小叶椴(Tilia cordata Mill.)。
[0007] 本发明还提供一种基于转录组的椴树属EST-SSR引物的筛选方法,包括:
[0008] 构建转录组文库:分别提取南京椴根、茎、叶、花和苞片5个组织的RNA,并等量混合后,反转录合成全长cDNA,构建不同大小的cDNA文库,经质控后,使用PacBio RSII平台进行测序,获得全长非嵌合序列;
[0009] 对全长非嵌合序列进行聚类分析,校正后获得高质量转录本序列,经去冗余分析得到高质量去冗余转录本序列;
[0010] 采用MISA软件对南京椴转录组数据中的高质量去冗余转录本序列进行单基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和混合SSR位点搜索;
[0011] 采用Primer3软件进行SSR引物设计,引物序列长度18-27bp,预计扩增产物长度100-280bp,GC含量40%-60%,退火温度57-63℃,上、下游引物的退火温度值相差不大于2℃;
[0012] 提取椴树属不同物种的叶片DNA,进行设计引物有效性的PCR鉴定,筛选SSR引物,若有与预计扩增产物长度相近的扩增产物,该引物即为有效引物。
[0013] 进一步地,所述质控包括过对全长cDNA进行末端修复并连接接头后,使用Blue pippin进行文库二次筛选,经Qubit2.0和Agilent 2100进行定性和定量检测。
[0014] 进一步地,进行设计引物有效性的PCR鉴定的反应体系为:2×PCR mix 8μL,浓度为10μmol/L的上、下游引物各0.5μL,基因组DNA 2~5ng,总体积10μL。
[0015] 进一步地,进行设计引物有效性的PCR鉴定的反应程序为:98℃2min;98℃10s,Tm+2℃30s,72℃10s,30个循环;72℃10min;扩增产物采用8%的聚丙烯酰胺变性胶进行分离,电泳后银染显色。
[0016] 本发明还提供一种基于转录组的椴树属EST-SSR引物在椴树属植物种类鉴定、遗传谱系分析、种质资源的保护和辅助育种领域的应用。
[0017] 本发明所达到的有益效果:本发明的27对EST-SSR标记是基于转录组序列筛选候选SSR位点并设计的SSR扩增引物,并通过该属不同物种为材料,选用基因组DNA进行扩增验证为明确的SSR标记,具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、共显性且易于检测等优点。本组标记填补了椴树属共显标记的空白,为本属植物种类鉴定、遗传谱系分析、种质资源的保护和辅助育种等领域,能够极大的促进椴树属资源的研究及开发应用。附图说明
[0018] 图1是样品总DNA提取结果;
[0019] 图2是部分多态性引物筛选结果;
[0020] 图3是供试样本间聚类分析图。

具体实施方式

[0021] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0022] 本发明提供基于全长转录组测序,并结合生物信息学方法进行SSR序列查找和SSR标记引物设计和验证,其具体实施方式如下:
[0023] 1.转录组数据的组装与筛选
[0024] 1.1RNA提取与检测
[0025] 提取南京椴根、茎、叶、花及苞片5个组织RNA材料,采用以下方法完成RNA质量和浓度的测定:a.使用Nanodrop检测RNA的纯度(OD260/280)、浓度、核酸吸收峰是否正常;b.Agilent 2100精确检测RNA的完整性,检测指标包括:RIN值、28S/18S、图谱基线有无上抬、5S峰;c.电泳检测RNA样品是否有基因组DNA的污染。
[0026] 1.2全长cDNA文库构建及测序
[0027] 检测合格后混合5个组织等量RNA,使用SMARTer TM PCR cDNA Synthesis Kit合成mRNA的全长cDNA,使用Blue Pippin筛选全长cDNA文库,构建不同大小的cDNA文库,然后通过PCR扩增放大筛选的全长cDNA,并对全长cDNA进行末端修复,连接SMRT接头,进行核酸外切酶消化,最后使用Blue pippin进行文库二次筛选,经Qubit2.0和Agilent 2100进行定性和定量检测。检测合格后,使用PacBio RSII进行转录组测序。
[0028] 1.3测序数据及质量控制
[0029] 经PacBio RSII测序平台共获得下机数据共获得聚合酶(Polymerase Read)序列511,632个。
[0030] 1.3.1过滤Polymerase Read片段长度小于50bp、序列准确性小于0.75的序列,将剩余序列从接头处打断并过滤掉接头序列后得到subreads,过滤长度小于50bp的subread,剩余subread即为clean data,数据量为10.84Gb,subread数为4,388,533个。根据条件full passes>=0且序列准确性大于0.75从原始序列提取ROI序列307,278条。通过检测ROI序列中是否包含5’引物,3’引物及polyA尾,可将序列分成全长序列(包含5’引物,3’引物及polyA尾)和非全长序列。
[0031] 1.3.2采用classify过程去除ROI序列中cDNA引物序列及polyA序列获得建库时的插入序列,同时根据建库时两端引物的差别确定链合成方向,并将序列分为全长序列和非全长序列、嵌合序列和非嵌合序列。进而获得全长非嵌合序列165,812条。
[0032] 1.3.3使用SMRT Analysis软件的IsoSeq模对全长序列进行聚类分析,得到一致性转录本92,732个,使用非全长序列校正后的高质量转录本序列共69,475个。
[0033] 2.SSR位点鉴别及SSR引物设计
[0034] 2.1筛选500bp以上的转录本,采用MISA软件对南京椴转录组数据中的62189条高质量转录本序列进行单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和混合SSR位点搜索,SSR分析结果,参见表1。
[0035] 表1.SSR分析结果统计
[0036]
[0037] 2.2采用Primer3软件进行SSR引物设计。引物设计参数:基于SSR重复单元前后的序列设计引物,每条SSR产生5条引物,引物序列长度18-27bp,预计扩增产物长度100-280bp,GC含量40%-60%,退火温度57-63℃,上、下游引物的退火温度值相差不大于2℃。共设计获得29894个SSR位点的PCR引物。
[0038] 在上述引物中随机选择764对引物序列,引物的合成由南京擎科生物科技有限公司负责。
[0039] 3.SSR引物筛选与多样性分析
[0040] 3.1植物材料选择
[0041] 本实例中供试植物DNA模板材料取自7份椴树属植物(见表2),包括6个种及1个南京椴黄叶芽变植株。植物采集过程中取叶片材料分别置于纸质茶叶包后置于自封袋中,并按质量比1:5加入变色胶制成干样备用。
[0042] 表2椴树属SSR引物筛选实验材料统计表
[0043] 编号 名称 来源 采集时间A 南京椴 南京中山植物园分类园 2018.04.14
B 南京椴(黄叶变异个体) 南京中山植物园苗圃 2018.04.30
C 糯米椴 南京中山植物园树木园 2018.04.30
D 银毛椴 南京中山植物园苗圃 2018.04.30
Z 紫椴 安徽省滁州市天长市城镇苗圃 2018.05.08
K 糠椴 江苏省淮安市洪泽区东一道苗圃 2018.05.09
H 心叶椴(灰) 江苏省淮安市洪泽区东一道苗圃 2018.05.09
[0044] 3.2 DNA提取
[0045] 用北京百泰克生物科技有限公司的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒提取样品DNA。DNA样品经2%琼脂糖凝胶电泳检测合格后,置于-20℃箱中备用,电泳结果见图1。
[0046] 3.3 PCR扩增
[0047] 分别以表2中的7份DNA材料,依次采用764对随机筛选引物进行扩增。PCR扩增体系共10μL:其中包括8μL 2×擎科金牌PCR mix,上下游引物(浓度10ng/μL)各0.5μL,1μL模板DNA2~5ng;扩增反应在ABI Veriti96 PCR仪上完成,具体步骤为::98℃预变性2min;98℃变性10s,Tm+2℃退火30s,72℃延伸10s,30个循环;72℃延伸1min,4℃储存。产物的检采用8%的聚丙烯酰胺变性胶进行分离,电泳后银染显色。引物退火温度参见表3,部分扩增结果,参见图2。
[0048] 3.4 PCR引物筛选
[0049] 选择7个模板在100bp~400bp均能扩增出条带清晰,且产物具有多态性的引物共27对,序列信息参见表3。
[0050] 表3椴树属EST-SSR引物特征(SEQ ID NO.1~54)。
[0051]
[0052]
[0053]
[0054] 统计分别27对引物的扩增结果进行判读,统计多态性条带的迁移率,按多态性条带有小及大进行判读,有条带计为1,无条带计为0,建立原始矩阵。
[0055] 采用PowerMarker V3.25软件对二级矩阵进行分析,计算每对引物扩增的等位基因位点数(Na,number of alleles),基因多样性指数(H,expected heterozygosity),多态性信息含量(PIC,polymorphism information content)。
[0056] 表4. 27对引物多态性信息含量分析
[0057] 引物名称 等位基因数目(Na) 基因多样性(H) 多态性信息含量(PIC)B2405 6.0000 0.8163 0.7913C80 4.0000 0.6939 0.6414
B2975 3.0000 0.5714 0.5015
B1340 6.0000 0.8163 0.7913
B2550 3.0000 0.6122 0.5298
B55 6.0000 0.8163 0.7913
D150 5.0000 0.7755 0.7397
B2410 4.0000 0.7347 0.6847
C840 4.0000 0.6939 0.6414
C3380 7.0000 0.8571 0.8397
C3235 6.0000 0.8163 0.7913
B485 6.0000 0.8163 0.7913
B1045 2.0000 0.4898 0.3698
C2155 3.0000 0.6531 0.5798
B75 7.0000 0.8571 0.8397
B595 7.0000 0.8571 0.8397
B2145 5.0000 0.7755 0.7397
B90 6.0000 0.8163 0.7913
C280 6.0000 0.8163 0.7913
B2915 7.0000 0.8571 0.8397
B505 5.0000 0.7347 0.6997
C2700 5.0000 0.7347 0.6997
C1050 4.0000 0.7347 0.6847
C110 4.0000 0.6122 0.5698
E5 2.0000 0.4082 0.3249
C3260 4.0000 0.6939 0.6414
C3150 6.0000 0.8163 0.7913
Mean 4.9259 0.7362 0.6940
[0058] 应用POPGene 1.32软件计算7个供试样本间的遗传距离(见表5)。
[0059] 表5供试样本间的遗传距离
[0060]   A B C D Z K HA 1.0000000 0.4383562 0.5777778 0.5810811 0.5625000 0.5542169 0.5844156B 0.4383562 1.0000000 0.5301205 0.5000000 0.5657895 0.5925926 0.6081081C 0.5777778 0.5301205 1.0000000 0.6219512 0.4625000 0.4941176 0.5903614D 0.5810811 0.5000000 0.6219512 1.0000000 0.6111111 0.5616438 0.6376812Z 0.5625000 0.5657895 0.4625000 0.6111111 1.0000000 0.3802817 0.5555556K 0.5542169 0.5925926 0.4941176 0.5616438 0.3802817 1.0000000 0.5270270H 0.5844156 0.6081081 0.5903614 0.6376812 0.5555556 0.5270270 1.0000000[0061] 按非加权配对算术平均法(unweighted  pair-group  method  using arithmeticaverages,UPGMA),利用NTSYS-pc 2.1软件提供的SHAN模块(sequential,hierarchical,and nested clustering进行聚类分析,并绘制树状图(见图3)。
[0062] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变形,这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
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