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一种铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用

阅读:700发布:2021-09-19

专利汇可以提供一种铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 属于 植物 基因工程技术领域,公开了一种以番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)为病毒载体的 马 铃薯Y病毒属病毒基因沉默系统。该系统是将目的基因插入到番木瓜畸形花叶病毒PLDMV的NIb与 外壳 蛋白CP之间,并在目的基因与CP之间引入NIa-Pro酶切位点。利用Gibson拼接或In-Fusion克隆等体外拼接方法将目的基因 片段 无缝克隆插入到NIb与CP之间构建成含有植物目的基因的重组病毒沉默载体。该重组病毒沉默载体通过农杆菌注射接种植物,诱导沉默植物的目的基因后观察植物的表型变化。本发明为利用PLDMV沉默载体进行番木瓜的基因功能研究提供了强有 力 的工具,具有重大的科学意义和应用前景。,下面是一种铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用专利的具体信息内容。

1.铃薯Y病毒属病毒在诱导基因沉默中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述马铃薯Y病毒属病毒为PLDMV。
3.一种基因沉默载体,其以pGreenII-35S为骨架,含有PLDMV基因组DNA和基因沉默片段
4.根据权利要求3所述的基因沉默载体,其特征在于,所述基因沉默片段位于PLDMV基因组DNA的NIb编码区和CP编码区之间。
5.根据权利要求3或4所述的基因沉默载体,其特征在于,所述基因沉默片段为在目的基因中添加、缺失或替换一个或多个核苷酸,且能够导致目的基因沉默的核酸片段。
6.根据权利要求5所述的基因沉默载体,其特征在于,所述目的基因为CaPDS基因,所述基因沉默片段为如SEQ ID NO:1所示的野生型CaPDS序列中的4~105bp、4~303bp、4~
504bp、4~600bp、601~1200bp或1201~1749bp。
7.携带权利要求3~6任一项所述基因沉默载体的宿主。
8.根据权利要求7所述的宿主,其特征在于,所述宿主为农杆菌。
9.一种诱导植物基因沉默的方法,其特征在于,以权利要求8所述的农杆菌侵染植株。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述植株为番木瓜。

说明书全文

一种铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域,主要涉及一种马铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用。

背景技术

[0002] 病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)最早用于描述植物受病毒感染后的病症恢复现象(van Kammen,1997)。由于植物体内中存在一种抵御外源核酸入侵的防御系统,正常情况下保护植物免受病毒的侵染,但植物的这种防御机制可被病毒RNA激活,属于转录后基因沉默现象。近年来,VIGS已特指通过携带一段寄主植物目的基因cDNA片段的重组病毒来引发植物内源基因沉默的反向遗传学技术(Burch-Smith et al.,2004)。VIGS系统通过在病毒载体中插入目的基因片段,当携带目的基因的病毒载体侵染寄主植物后,会完全沉默寄主植物的目的基因或出现表达平下降,使其目标基因功能丧失或异常,导致相应表型或生理指标发生变化,从而实现对该基因功能的快速鉴定(Senthil-Kumar&Mysore,2011)。与传统遗传转化的方法相比,VIGS技术是一种免去大规模突变体筛选,不依赖于成熟的遗传转化体系,能够在当代完成目的基因功能验证,具有操作简单、快速、低成本、高通量等优点,因而成为功能基因组学研究领域最具吸引的技术手段之一(Becker&Lange,2010)。目前,VIGS沉默系统不仅在拟南芥、本生烟等模式植物上成功应用,在水稻、玉米、小麦、番茄、苹果、葡萄、柑橘等作物上的应用也有报道,但在番木瓜上还未见可用的VIGS载体相关报道。随着研究的深入和技术的不断发展,VIGS已广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等相关基因的功能鉴定,在植物性状改良及植物保护等方面也展现出良好的应用前景。
[0003] 到目前为止,已经有RNA病毒,DNA病毒以及一些病毒卫星分子被成功改造成VIGS载体。RNA病毒是最早建立VIGS体系采用的病毒,也是目前应用最多的VIGS载体病毒种类。1995年,Kumagai等基于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒的代表种—烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)完成了首个VIGS载体的构建。1998年,Ruiz等构建了马铃薯X病毒属(Potexvirus)病毒的代表种—马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)的VIGS载体。随后,基于烟草脆裂病毒属(Tobravirus)病毒的代表种—烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)的VIGS载体构建成功(Ratcliff et al.,2001),因其具有病症弱、沉默效率高、持续时间长及能够侵染分生组织等优点,在模式植物本生烟、拟南芥以及马铃薯、番茄、花、辣椒、矮牵等多种植物上得到应用,是目前应用最为广泛的VIGS载体(Huang et al.,
2012)。但每个VIGS载体受病毒寄主范围限制,对于不同的植物通常需要构建不同的病毒VIGS载体。马铃薯Y病毒属(Potyvirus)包含175种病毒,是植物RNA病毒中最大的一个属,也是在全球范围内给农业生产造成经济损失和危害最为严重的一个属,但马铃薯Y病属病毒用于VIGS载体改造的研究尚无报道。因此,利用马铃薯Y病属病毒开发其VIGS沉默系统将对植物功能基因组研究具有重要意义。
[0004] 番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的病毒,近年来已成为一种新的威胁我国番木瓜种植业的主要病毒病害。因此,利用PLDMV构建其VIGS沉默系统为番木瓜的基因功能研究提供了强有力的工具。

发明内容

[0005] 有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供一种马铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用,本发明构建的VIGS载体效果显著,沉默作用明显。
[0006] 本发明提供了马铃薯Y病毒属病毒在诱导基因沉默中的应用。
[0007] 在本发明中,所述马铃薯Y病毒属病毒为PLDMV。
[0008] 基因沉默在生物中普遍存在,其作用表现在抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵,识别并抑制外源基因表达,维持生物基因组稳定性等。VIGS作为基因沉默的特殊形式,是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒或携带cDNA的病毒载体侵染植物后,在复制与表达过程中通常会形成双链RNA(Double stranded RNA,dsRNA)形式的中间体。dsRNA作为基因沉默关键激发子,首先在细胞中被类似RNaseⅢ家族特异性核酸内切酶Dicer类似物(如DCL4)切割成21~24nt的小分子干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)。siRNAs在植物细胞内被依赖RNA的RNA聚合酶1(RNA-dependent RNApolymerase 1,RDR1)、RDR2或RDR6进一步扩增,并以单链形式与Agronaute1(AGO1)蛋白等结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),RISC特异地与细胞质中的同源RNA互作,导致同源RNA降解,从而发生转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional gene silencing,PTGS);RISC特异地与细胞核内同源DNA相互作用导致其被甲基化等修饰,从而发生转录水平的基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。
[0009] 本发明中,所述基因沉默的目标生物为番木瓜。
[0010] 利用PLDMV病毒侵染番木瓜的特性,构建的这种针对番木瓜基因的沉默载体能够有效沉默番木瓜的基因。对于其他PLDMV易感的植物,本发明所述的沉默载体也能够实现良好的沉默作用。
[0011] 本发明还提供了一种基因沉默载体,其以pGreenII-35S为骨架,含有PLDMV基因组全长cDNA和基因沉默片段。
[0012] 本发明中所述基因沉默片段位于PLDMV基因组的NIb编码区和CP编码区之间(图2)。
[0013] 本发明中,所述基因沉默片段为在目的基因中添加、缺失或替换一个或多个核苷酸,且能够导致目的基因沉默的核酸片段。
[0014] 所述基因沉默载体的构建方法,其包括:PCR扩增基因沉默片段,插入至构建的pGreenII-35S-PLDMV载体中。
[0015] 本发明中,所述目的基因为CaPDS基因,所述基因沉默片段的为如SEQ ID NO:1所示的野生型CaPDS基因序列中的4~105bp、4~303bp、4~504bp、4~600bp、601~1200bp或1201~1749bp。该基因片段为野生型番木瓜八氢番茄红素脱氢酶基因(CaPDS)的部分片段,以该基因片段连接入沉默载体中,能够有效沉默目标物的PDS基因。相对于其它截短的PDS基因序列,插入102bp的沉默载体pG35S-PLDMV-CaPDS102的沉默效果稍弱,而插入其他长度和位置的CaPDS基因序列的沉默载体的沉默效果差异不明显,皆显示较高的沉默效率。这说明本发明提供的载体和方法具有良好的沉默效果。
[0016] 本发明还提供了CaPDS基因沉默载体,其以pGreenII-35S为骨架,含有PLDMV基因组全长cDNA和所述的CaPDS基因片段;所述PDS基因片段位于PLDMV基因组的NIb编码区和CP编码区之间(图2)。
[0017] 本发明还提供了携带本发明所述基因沉默载体的宿主。
[0018] 所述宿主为农杆菌,具体的,本发明提供了携带所述基因沉默载体的农杆菌。
[0019] 所述基因为CaPDS,则携带所述基因沉默载体(CaPDS基因沉默载体)的农杆菌的构建方法:
[0020] 以质粒pGreenII-35S-PLDMV为模板,分别用引物对pldmv4991F/pldmv9068R、pldmv9045F/pldmv5020R扩增,获得片段I和片段II;
[0021] 以质粒pMD-CaPDS为模板,以引物对pld-CaPDSF/pld-CaPDSR进行扩增,获得片段III。
[0022] 将片段I、II和III在体外完成Gibson拼接,将拼接产物直接电击转化农杆菌感受态细胞,获得所述含重组病毒沉默载体的农杆菌。
[0023] 本发明中,携带沉默载体的农杆菌为根癌农杆菌。
[0024] 具体的,所述根瘤农杆菌为农杆菌GV3101(pSoup)。
[0025] 所述基因沉默载体或所述的宿主在沉默番木瓜基因中的应用。
[0026] 本发明还提供了一种诱导植物基因沉默的方法,其以本发明所述的农杆菌侵染植株。本发明中,所述植株为番木瓜。
[0027] 所述侵染的农杆菌以接种缓冲液重悬,所述接种缓冲液含有:10mM MgCl2,10mM MES pH 5.6,150μM acetosyringone。
[0028] 所述重悬至OD值为0.6,然后室温黑暗静置3h。
[0029] 所述番木瓜植株的高度为20~30cm,浸染的部位是第三、四片叶片的下表皮。
[0030] 所述侵染后,番木瓜植株放置于25℃、16/8h昼夜、80%相对湿度培养。
[0031] 在本发明中,所述方法为番木瓜的PDS基因沉默方法,其以所述的CaPDS基因沉默载体的农杆菌侵染番木瓜植株。侵染后30天,番木瓜新生嫩叶(非接种叶片)出现光漂白现象。该现象证明CaPDS基因被沉默。
[0032] 本发明提供了CaPDS基因的片段,并提供了CaPDS基因的沉默载体,其有益效果至少包括:
[0033] 1.本发明在实现了番木瓜CaPDS基因沉默体系的构建,获得了具有植物PDS基因沉默的沉默体系。
[0034] 2.本发明使用特异引物来扩增植物CaPDS基因,并利用番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)成功构建PDS基因沉默载体。
[0035] 3.通过转化农杆菌对植株进行侵染,20-30日后RNA进行检测发现,利用番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)构建的沉默体系成功侵染植株。
[0036] 4.本发明构建的沉默载体侵染植株30天后,植株便开始出现了漂白症状,白化现象沿叶脉向四周蔓延,植株的CaPDS基因表达水平下降,叶绿素被漂白。可见其效果显著,沉默作用明显。
[0037] 本发明不仅丰富了VIGS载体的种类,而且为开展番木瓜的功能基因组研究提供有效的技术手段。附图说明:
[0038] 图1示番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)的基因组结构和PLDMV的侵染性克隆(pG35S-PLDMV)及沉默番木瓜PDS基因(CaPDS)的沉默载体(pG35S-PLDMV-CaPDS)的构建示意图;
[0039] 图2是本发明实施例1所构建的pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体结构示意图(全长序列如SEQ ID NO:12所示);
[0040] 图3是本发明实施例1对构建的沉默载体pG35S-PLDMV-CaPDS阳性克隆进行PCR产物测序鉴定时的大片段扩增示意图;
[0041] 图4是本发明实施例1将沉默载体侵染番木瓜植株后出现的表型形状,其中A为健康植株对照;B为接种pG35S-PLDMV的对照组,出现叶片畸形、皱缩、花叶症状;C为接种pG35S-PLDMV-CaPDS的实验组,顶端叶片出现白化症状;
[0042] 图5是本发明实施例1对照植株(pG35S-PLDMV)与沉默CaPDS基因的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS)在侵染第30天后的CaPDS相对表达量qRT-PCR检测结果图;
[0043] 图6示本发明实施例2构建不同番木瓜CaPDS基因片段长度和位置的沉默载体示意图及侵染番木瓜植株后的沉默效果图,其中A为构建不同番木瓜CaPDS基因片段长度和位置的沉默载体示意图;B为接种pG35S-PLDMV的对照组(WT)和接种5种不同CaPDS沉默载体(pG35S-PLDMV-CaPDS102、CaPDS300、CaPDS597、CaPDS600、CaPDS549)的番木瓜植株沉默效果图,顶端叶片出现不同程度的白化;
[0044] 图7示本发明实施例对照植株(pG35S-PLDMV-WT)与5种沉默不同CaPDS基因片段的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS102、CaPDS300、CaPDS597、CaPDS600、CaPDS549)在侵染第30天后的CaPDS相对表达量的qRT-PCR检测结果图。

具体实施方式

[0045] 本发明提供了一种马铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
[0046] 本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
[0047] 下面结合实施例,进一步阐述本发明:下面结合实例对本发明作进一步阐述,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未特别指明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场购得的常规产品。实施例未详述的方案和配方,请参见《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社。
[0048] 实施例1:沉默番木瓜PDS基因(CaPDS)的番木瓜畸形花叶病毒诱导的基因沉默载体(pG35S-PLDMV-CaPDS)的构建和应用方法
[0049] 实验试剂:引物由Invitrogen公司合成;高速高保真DNA聚合酶(PrimerSTAR Max DNA Polymerase)及反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time))荧光定量RT-PCR试剂盒(TB Green Premix DimerEraser(Perfect Real Time))购自Takara公司;TRIZOL Reagent购自Invitrogen;2×Rapid Taq Master Mix和胶回收试剂盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司,Gibson Assembly Master Mix购自NEB公司,农杆菌菌株GV3101(pSoup)感受态细胞由本实验室自制保存,其余所需试剂均可通过商业途径购买得到。
[0050] 本发明构建pG35S-PLDMV-CaPDS基因沉默载体及应用,包括以下步骤:
[0051] (1)引物设计:本发明中PLDMV诱导的基因沉默载体的构建策略是采用Gibson拼接或In-Fusion克隆等体外连接的无缝克隆方法,分为具有15-20bp重叠区的病毒基因组、载体及沉默靶基因片段等多个DNA片段设计PCR扩增引物。本实施例基于本实验室前期构建获得的PLDMV全长cDNA侵染性克隆质粒pG35S-PLDMV(见Tuo D.C.,Fu L.L.,Shen W.T.,et al.,Generation of stable infectious clones of plant viruses by using Rhizobium radiobacter for both cloning and inoculation.Virology,2017,510:99-103.)和前期克隆的番木瓜八氢番茄红素脱氢酶基因(Carica  papaya phytoene desaturase,CaPDS)质粒pMD-CaPDS利用Vector NTI软件设计引物,引物具体序列见引物表;
[0052] 表1:用于pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体构建及鉴定的引物
[0053]
[0054] (2)pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体构建的片段扩增:以质粒pG35S-PLDMV为模板,分别用引物对pldmv4991F/pldmv9068R、pldmv9045F/pldmv5020R,采用高速高保真的PrimeSTAR Max DNAPolymerase进行扩增,经普通琼脂糖凝胶电泳检测和胶回收,获得大小分别为4078bp和9361bp的PCR产物回收片段I和II;以质粒pMD-CaPDS为模板,采用高速高保真的PrimeSTAR Max DNA Polymerase以引物对pld-CaPDSF/pld-CaPDSR进行扩增,经普通琼脂糖凝胶电泳检测和胶回收,获得大小为551bp的PCR产物回收片段III(含有野生型CaPDS片段的4~504bp和引物接头片段)。
[0055] (3)pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体的构建与阳性克隆筛选鉴定:将PCR产物回收片段I、II和III在体外完成Gibson拼接反应,取5-10μl连接产物直接电击转化农杆菌GV3101(pSoup)感受态细胞,涂布于含卡那霉素和利福平抗性的LB平板,放置于28℃条件下培养2-3天,挑取单克隆至2ml离心管用200μl含卡那霉素和利福平抗性的LB液体培养基摇菌3-5h,然后用2×Rapid Taq Master Mix和引物对pld-CaPDSF/pld-CaPDSR进行菌液PCR检测,对菌液PCR检测为阳性的克隆用50ml离心管扩大培养,用5ml含卡那霉素和利福平抗性的LB液体培养基过夜摇菌后抽提质粒,以抽提得到的质粒为模板用高速高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase分别用引物对pGreen35S-F/pldmv5614R和pldmv5441F/pGreen35S-R将病毒基因组分为两个重叠的大片段F5和F3进行PCR扩增鉴定(图3),PCR产物F5和F3经普通琼脂糖凝胶电泳检测和胶回收后进行测序鉴定。
[0056] (4)pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体农杆菌注射接种番木瓜植株:将测序鉴定正确的农杆菌阳性克隆pG35S-PLDMV-CaPDS和本实验室前期构建保存的不含外源插入基因的PLDMV全长cDNA侵染性克隆pG35S-PLDMV(对照组)分别接种到2ml含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平的LB液体培养基中,置于28℃摇床上,220rpm/min振荡培养过夜12-16h;然后将菌液分别按1:100稀释转接到新的10ml含10mM MES,20μM乙酰丁香(acetosyringone),50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平的LB液体培养基中,置于28℃摇床上,220rpm/min振荡培养至OD600约为1.0;然后室温下6000g,离心15min,去上清,收集各菌体。然后用注射接种缓冲液(10mM MgCl2,10mM MES pH 5.6,150μM acetosyringone)重悬菌体,并调其OD600为0.6左右,室温黑暗静置3h后注射接种番木瓜植株;使用去针头的1ml注射器,注射接种20-30cm长势一致的番木瓜苗的第三、四片叶(叶片长约1cm为第一片叶)的下表皮,然后将接种后的番木瓜植株放置于25℃、16h/8h昼夜周期、80%相对湿度的植物光照培养箱中生长;定期观察和记录各植株的生长情况和表型变化。
[0057] (5)pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体接种番木瓜后的表型观察:接种30天后,注射接种pG35S-PLDMV-CaPDS的番木瓜新生嫩叶(非接种叶片)出现光漂白现象;而注射接种pG35S-PLDMV的对照组番木瓜新生嫩叶仅有明显的病症出现,未见光漂白现象(图4)。
[0058] (6)qRT-PCR对CaPDS基因沉默效果分析:接种30天后,分别收取上述表型叶片,通过qRT-PCR检测沉默CaPDS的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS)和对照植株(pG35S-PLDMV)体内的CaPDS基因的mRNA表达水平。具体qRT-PCR检测方法如下:
[0059] a、Trizol法分别提取沉默CaPDS的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS)和对照植株(pG35S-PLDMV)的叶片总RNA;
[0060] b、分别取1μg提取的总RNA用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行反转录反应合成cDNA;
[0061] c、以获得的cDNA为模板,用引物CapdsF/CapdsR采用TB Green  Premix DimerEraser(Perfect Real Time)试剂盒进行Real Time PCR反应,具体反应体系和反应条件参照试剂盒说明书,同时以番木瓜的actin基因为内参基因,内参基因引物为actinF/actinR。
[0062] qRT-PCR检测结果如图5所示:与对照植株(pG35S-PLDMV)相比,沉默CaPDS的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS)体内的PDS表达量均下调了83%左右。上述结果表明,PLDMV介导的VIGS载体成功沉默了番木瓜的CaPDS基因,可用于番木瓜基因的沉默。
[0063] 实施例2不同番木瓜CaPDS基因片段长度和区域的沉默效果
[0064] 采用与实施例1相同的方法,在pG35S-PLDMV载体中的相应位置分别插入来自番木瓜CaPDS基因的不同长度和区域的片段(图6),插入的片段分别为CaPDS基因的4~105bp、4~303bp、4~600bp、601~1200bp、1201~1749bp,构建获得的沉默载体依次为pG35S-PLDMV-CaPDS102、pG35S-PLDMV-CaPDS300、pG35S-PLDMV-CaPDS597、pG35S-PLDMV-CaPDS600、pG35S-PLDMV-CaPDS549。结果表明,以PLDMV病毒作为基因沉默载体,不论插入的片段长短或区域怎样选择,都能够取得良好的沉默效果,顶端叶片均出现不同程度的白化。对以携带不同载体的农杆菌侵染后的番木瓜植株中的CaPDS相对表达量进行检测,结果如图7,相对于野生型番木瓜,CaPDS基因的表达显著降低。
[0065] 以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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