微生物菌株及其在动物中的用途
阅读：50发布：2021-12-02
专利汇可以提供微生物菌株及其在动物中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于改善 水 生动物性能的芽孢杆菌及乳酸杆菌菌株以及方法。本发明还公开了用于抑制或减缓 水生动物 中病原体生长的芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株以及方法。，下面是微生物菌株及其在动物中的用途专利的具体信息内容。
1.一种包含一种或多种分离菌株的组合物，所述分离菌株选自短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢杆菌
3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香肠乳酸杆菌CNCM-I-3699和鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698、及具有它们的所有特点的菌株、它们的任何衍生物或变体、以及它们的混合物。
2.如权利要求1中所述的组合物，其中所述组合物包含短小芽孢杆菌3064菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。
3.如权利要求1中所述的组合物，其中所述组合物包含短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。
4.如权利要求1中所述的组合物，其中所述组合物包含枯草芽孢杆菌1013(NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)菌株和枯草芽孢杆菌BS3BP5(ATCC PTA-50510)菌株。
5.如权利要求1中所述的组合物，其中所述组合物包含地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)菌株、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢杆菌BL21(ATCC PTA-50134)菌株。
6.如权利要求1中所述的组合物，其中所述组合物包含枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)菌株、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株和枯草芽孢杆菌
22C-P1(ATCC PTA-6508)菌株。
7.一种包括给动物施用有效量的组合物的方法，所述组合物包含一种或多种分离菌株，所述分离菌株选自短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香肠乳酸杆菌CNCM-I-3699和鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698、及具有它们的所有特点的菌株、它们的任何衍生物或变体、以及它们的混合物。
8.如权利要求7中所述的方法，其中在给所述动物施用后，相比于未施用所述菌株的动物，所述菌株在所述动物中或对所述动物提供至少一种下述益处：(a)存活率增加；(b)体增重增大(平均日体增重和/或总体增重)；(c)摄食量增加；(d)长度增加；(e)饲料转化率增加；(f)绒毛长度和/或绒毛密度增加；(g)低盐度抵抗力增加；(h)高盐度抵抗力增加；(i)高温抵抗力增加；(j)低温抵抗力增加；(k)福尔马林抵抗力增加；(l)对病原体响应后存活率增加或(m)死亡率。
9.如权利要求7或8中任一项所述的方法，其中所述动物为虾。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述动物为幼体期虾、后幼体期虾或幼虾期的虾。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述动物为南美白对虾(Penaeus vannamei)。
12.如权利要求7-11中任一项所述的方法，其中，当给所述动物施用所述菌株后，相比于对照组，所述菌株提供至少一种所述益处的至少2％的改善。
13.如权利要求7-12中任一项所述的方法，其中所述(一种或多种)菌株的施用量为
5 11
约1×10 至约1×10 CFU/动物/天。
14.如权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述病原体为白斑综合症病毒或弧菌属细菌。
15.如权利要求7-14中任一项所述的方法，其中所述病原体为白斑综合症病毒或哈维氏弧菌。
16.如权利要求7-15中任一项所述的方法，其中所述动物被暴露于高温或低温、高盐度或低盐度、对虾白斑综合症病毒、或弧菌属细菌。
17.如权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述组合物包含短小芽孢杆菌3064菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。
18.如权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述组合物包含短小芽孢杆菌
119(NRRL B-50796)菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。
19.如权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述组合物包含枯草芽孢杆菌
1013(NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)菌株和枯草芽孢杆菌BS3BP5(ATCC PTA-50510)菌株。
20.如权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述组合物包含地衣芽孢杆菌
842(NRRL B-50516)菌株、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢杆菌BL21(ATCC PTA-50134)菌株。
21.如权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述组合物包含枯草芽孢杆菌
3A-P4(ATCC PTA-6506)菌株、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株和枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)菌株。
22.一种动物饲料或饲料添加剂组合物，包含一种或多种分离菌株，所述分离菌株选自短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)和枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香肠乳酸杆菌CNCM-I-3699和鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698、以及具有它们的所有特点的菌株、它们的任何衍生物或变体、以及它们的混合物。
23.如权利要求22中所述的组合物，其中所述一种或多种菌株以10至2000克/吨饲料的量补充到所述组合物中。
24.如权利要求22或23中所述的组合物，其中所述组合物包含短小芽孢杆菌3064菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。
25.如权利要求22或23中所述的组合物，其中所述组合物包含短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRLB-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。
26.如权利要求22或23中所述的组合物，其中所述组合物包含枯草芽孢杆菌
1013(NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)菌株和枯草芽孢杆菌BS3BP5(ATCC PTA-50510)菌株。
27.如权利要求22或23中所述的组合物，其中所述组合物包含地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)菌株、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢杆菌BL21(ATCC PTA-50134)菌株。
28.如权利要求22或23中所述的组合物，其中所述组合物包含枯草芽孢杆菌
3A-P4(ATCC PTA-6506)菌株、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株和枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)菌株。
29.一种生产一种或多种分离菌株的方法，所述分离菌株选自短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢杆菌
3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)和枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香肠乳酸杆菌CNCM-I-3699和鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698、以及具有它们的所有特点的菌株、它们的任何衍生物或变体、以及它们的混合物，所述方法包括：(a)在液体培养基中生长包含所述一种或多种菌株的培养物；和(b)从所述液体培养基中分离所述一种或多种菌株。
30.如权利要求29中所述的方法，还包括冻干所述分离菌株并将所述冻干的菌株添加到载体上。
31.如权利要求29或30中所述的方法，还包括在分离出所述菌株后，保留所述液体培养基以产生上清液。
微生物菌株及其在动物中的用途
[0002] 本申请要求于2012年4月12日提交的美国临时专利申请号为61/623,512和2012年12月21日提交的美国临时专利申请号为61/745,324的权益，以上临时专利申请的公开内容以引用方式并入本文。
技术领域
[0004] 相关领域的说明
[0005] 水产养殖是一个越来越普遍的生产体系，它为人类日常饮食提供鱼和甲壳类产品。虾类养殖已成为一个全球化产业，每年零售额达数十亿美元。白对虾(南美白对虾(Penaeus vannamei))是世界范围内一种主要的水产养殖物种。虾农对改善水质、生产性能和存活率的解决方案非常感兴趣。
[0006] 此外，在亚洲和南美州部分地区，病原体(如白斑综合症病毒(WSSv)和弧菌属)引起的疾病频繁地大批摧毁虾养殖行业。这些损失导致了数十亿美元的经济损失和生产力的降低。因对食品安全和环境的关注，虾类养殖业中抗生素的使用正在减少。
[0007] 因此，水产养殖业迫切需要免用抗生素的解决方案来改善水质、生产性能、存活率和对水生动物病原体的抵抗力。鉴于以上原因，提供有益于水生动物的芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株及使用这些菌株的方法很有必要。附图说明
[0008] 本发明的典型实施例见附图。
[0009] 图1是一幅示意图，表示虾从幼体期、后幼体期和幼年期的成长过程。
[0010] 图2A表示后幼体期虾对芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物施用所作出响应后，虾的存活率、体增重(BWG)、长度和饲料摄取反应。
[0011] 图2B是后幼体期虾的图片，表示虾对芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物施用所作出响应后的虾体尺寸。
[0012] 图3表示幼虾对芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物施用所作出的存活率、体增重、饲料转化率和摄食量响应。
[0013] 图4是图片，表示施用过芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物的虾绒毛组织与没有经两者中的任一组分处理的对照组的虾绒毛组织的对比。
[0014] 图5表示相比于未有两者中的任一组分施用的对照组，施用过芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物的虾的内脏中弧菌浓度。
发明内容
[0015] 本发明提供了分离的芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株、包含此类芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株的组合物、向动物施用这些菌株的方法、包含该菌株的动物饲料或饲料添加剂以及生产菌株的方法。
[0016] 在一个实施例中，该发明提供了一个或多个分离的芽孢杆菌菌株，该菌株选自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜碱芽抱杆菌(B.alkalophilus)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和迟缓芽孢杆菌(B.lentus)。在另一个实施例中，该发明提供了一种或多种分离的乳酸杆菌菌株，该菌株选自瑞士乳酸杆菌(L.helveticus)、食淀粉乳酸杆菌(L.amylovorus)、弯曲乳酸杆菌(L.curvatus)、纤维二糖乳酸杆菌(L.cellobiosus)、降解淀粉类乳酸杆菌(L.amylolyticus)、消化乳酸杆菌(L.alimentarius)、鸟乳酸杆菌(L.aviaries)、卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)、弯曲乳酸杆菌(L.curvatus)、鸡乳酸杆菌(L.gallinarum)、希氏乳酸杆菌(L.hilgardii)、约氏乳酸杆菌(L.johnsonii)、克菲尔乳酸杆菌(L.kefiranofaecium)、高加索酸奶乳酸杆菌(L.kefiri)、黏液乳酸杆菌(L.mucosae)、面包乳酸杆菌(L.panis)、戊糖乳酸杆菌(L.pentosus)、桥乳酸杆菌(L.pontis)、玉米乳酸杆菌(L.zeae)、旧金山乳酸杆菌(L.sanfranciscensis)、副干酪乳酸杆菌(L.paracasei)、干酪乳酸杆菌(L.casei)、嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus)、布氏乳乳酸杆菌(L.buchnerii)、香肠乳酸杆菌
(L.farciminis)、鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus)、罗伊氏乳酸杆菌(L.reuteri)、发酵乳酸杆菌(L.fermentum)、短乳酸杆菌(L.brevis)、乳酸乳杆菌(L.lactis)、胚芽乳酸杆菌(L.plantarum)、沙克乳酸杆菌(L.sakei)或唾液乳酸杆菌(L.salviarium)的菌株。
(L.farciminis)、鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus)、罗伊氏乳酸杆菌(L.reuteri)、发酵乳酸杆菌(L.fermentum)、短乳酸杆菌(L.brevis)、乳酸乳杆菌(L.lactis)、胚芽乳酸杆菌(L.plantarum)、沙克乳酸杆菌(L.sakei)或唾液乳酸杆菌(L.salviarium)的菌株。
[0017] 在特定实施例中，该发明提供了一种或多种分离菌株，该菌株选自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)3064、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、枯草芽孢杆菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)842(NRRL B-50516)、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)AGTP BS 1068(NRRL B-50543)和枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香肠乳酸杆菌(Lactobacillus farcimins)CNCM-I-3699、鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698，及具备它们的所有特点的菌株、它们的任何衍生物或变体、及它们的混合物。
[0018] 在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含一种或多种分离菌株，该菌株选自短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、短小芽孢杆菌AGTP BS1068(NRRL B-50543)以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香肠乳酸杆菌(Lactobacillus farcimins)CNCM-I-3699、鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698，及具备它们的所有特点的菌株、它们的任何衍生物品或变体、以及它们的混合物。
[0019] 在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，其包含短小芽孢杆菌3064菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物，其包含短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物，其包含枯草芽孢杆菌1013(NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)菌株和枯草芽孢杆菌BS3BP5(ATCC PTA-50510)菌株。在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物，其包含地衣芽孢杆菌842(NRRLB-50516)菌株、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢杆菌BL21(ATCC PTA-50134)菌株。在其他实施例中，本发明提供了一种组合物，其包含枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)菌株、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株和枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCCPTA-6508)菌株。
[0020] 在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，包括给动物施用有效量的组合物，该组合物包含一种或多种分离菌株，该分离菌株选自短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香肠乳酸杆菌(Lactobacillus farcimins)CNCM-I-3699、鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698，及具备它们的所有特点的菌株、它们的任何衍生物或变体、及它们的混合物。
[0021] 在一些实施例中，本文所述的方法包括给动物施用有效量的组合物，该组合物包含短小芽孢杆菌3064菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。在一些实施例中，本文所述的方法包括给动物施用有效量的组合物，该组合物包含短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。在一些实施例中，本文所述的方法包括给动物施用有效量的组合物，该组合物包含枯草芽孢杆菌1013(NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)菌株和枯草芽孢杆菌BS3BP5(ATCC PTA-50510)菌株。在一些实施例中，本文所述的方法包括给动物施用有效量的组合物，该组合物包含地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)菌株、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢杆菌BL21(ATCC PTA-50134)菌株。在一些实施例中，本文所述的方法包括给动物施用有效量的组合物，该组合物包含枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)菌株、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株和枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)菌株。
[0022] 任一本文所述的实施例中，相比未施用所述菌株的动物，在给动物施用时，所述菌株在动物中或对动物产生至少一种如下益处：(a)存活率增加；(b)体增重增大(平均日体增重和/或总体增重)；(c)摄食量增加；(d)长度增加；(e)饲料转化率增加；(f)绒毛长度和/或绒毛密度增加；(g)低盐度抵抗力增加；(h)高盐度抵抗力增加；(i)高温抵抗力增加；(j)低温抵抗力增加；(k)福尔马林抵抗力增加；(l)对病原体响应后，存活率增加或(m)死亡率。本发明有益于动物抵抗应激和病原性感染。在一些实施例中，本发明针对病原体提供了增大的存活率，所述病原体如白斑综合症病毒或弧菌属细菌(例如：哈维氏弧菌(Vibrio harveyi))。在其它实施例中，该发明提供了针对高温或低温、或者高盐度或低盐度的增加的抵抗力。在某些实施例中，将动物暴露于高温或低温、高盐度或低盐度、白斑综合症病毒或弧菌属细菌。
[0023] 本文所述的任何实施例中，动物为虾。在一些实施例中，这种虾为幼体、后期幼体或幼虾。应用于本文所述实施例中的虾包括所有品种和物种的虾，包含但不限于(以举例的方式)滨对虾(Litopenaeus)属虾、美对虾(Farfantepenaeus)属虾和对虾属(Penaeus)的虾。对虾属包括但不限于：细角对虾(Penaeus stylirostris)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、中国对虾(Penaeus chinensis)、西方对虾(Penaeus occidentalis)、加州对虾(Penaeus californiensis)、短沟对虾(Penaeus semisulcatus)、斑节对虾(Penaeus monodon)、食用对虾(Penaeus esculentu)、白对虾(Penaeus setiferus)、日本对虾(Penaeus japonicus)、褐对虾(Penaeus aztecus)、桃红对虾(Penaeus duorarum)、印度对虾(Penaeus indicus)和墨吉对虾(Penaeus merguiensis)。在特定环境中，该虾指南美白对虾。
[0024] 在某些实施例中，本文所述的菌株在动物身上施用时，相比未经处理的对照，所述菌株使至少一种本文所述的益处改善至少2％。所提供菌株可以任意有效浓度来施用以改5 11
善本文所述的至少一种益处。在一些实施例中，按照约1×10 至约1×10 CFU/动物/天施用(一种或多种)菌株。
善本文所述的至少一种益处。在一些实施例中，按照约1×10 至约1×10 CFU/动物/天施用(一种或多种)菌株。
[0025] 在另一个实施例中，本发明提供一种动物饲料或饲料添加剂组合物，其包含一种或多种分离菌株，该分离菌株选自短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、短小芽孢杆菌AGTP BS1068(NRRL B-50543)以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香肠乳酸杆菌(Lactobacillus farcimins)CNCM-I-3699、鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698及具有它们的所有特点的菌株、以及它们的衍生物或变体、及它们的混合物。
[0026] 在一些实施例中，本发明提供一种动物饲料或饲料添加剂组合物，其包含短小芽孢杆菌3064菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。在一些实施例中，本发明提供一种动物饲料或饲料添加剂组合物，其包含短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)菌株、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。在一些实施例中，本发明提供一种动物饲料或饲料添加剂组合物，其包含枯草芽孢杆菌1013(NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢杆菌BS918(NRRL B-50508)菌株和枯草芽孢杆菌BS3BP5(ATCC PTA-50510)菌株。在一些实施例中，本发明提供一种动物饲料或饲料添加剂组合物，其包含地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)菌株、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢杆菌BL21(ATCC PTA-50134)菌株。在一些实施例中，本发明提供一种动物饲料或饲料添加剂组合物，其包含枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)菌株、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株和枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)菌株。在一些实施例中，本文所述的一种或多种菌株在动物饲料或饲料添加剂组合物中的添加量为10-2000克/吨饲料。在一些实施例中，本文所述的一种或多种菌株在动物饲料或饲料添加剂组合物中的添加量为50、100、250、500或1000克/吨饲料。
[0027] 在一些实施例中，本发明提供一种产生一种或多种分离菌株的方法，所述分离菌株选自短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢杆菌BS15 A4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢杆菌3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢杆菌842(NRRL B-50516)、枯草芽孢杆菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香肠乳酸杆菌(Lactobacillus farcimins)CNCM-I-3699、鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698，及具有它们的所有特点的菌株、它们的衍生物或变体、及它们的混合物，该方法包括(a)在液体培养基中培养包含上述一种或多种菌株的培养物；和(b)从该液体培养基中分离上述一种或多种菌株。在一些实施例中，该方法进一步包括冻干该分离菌株并将该冻干后的菌株添加至载体。在其它实施例中，该方法进一步包括在已分离了该菌株之后保留液体培养基，从而产生上清液。
具体实施方式
[0028] 在详细阐明本发明实施例前，应当理解本发明的用途并不局限于下文提及或下图阐述的成分构造和安排细节。本发明也适用其他实施例，或者说它可以以各种方式被实施或执行。同样应当理解，本文所述措辞和术语仅为介绍该发明，不能视为具有限制性。
[0029] 根据本发明，可以采用本领域技术内的常规分子生物学和微生物学。此类技术在文献中充分阐明。参见：Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(Sambrook，Fritsch和Maniatis《分子克隆：实验手册》第三版(2001)，纽约，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社)。
[0030] 本公开中的数值范围为近似值范围，因此，除非另外说明，否则其中可包括数值范围外的值。数值范围包含自下限值至上限值(含上限值和下限值)的所有数值，以一个单位的增量，前提条件是任意下限值和上限值之间存在至少两个单位的间距。举例来说，如果一个被列举范围为100-1,000，旨在将所有的单个数值，如100、101、102等等，以及子范围，如100-144、155-170、197-200等等进行明确枚举。对包含小于1的值的范围、或者包含大于1的分数(如，1.1、1.5等等)的范围，一个单位应该被认为以0.0001、0.001、0.01或0.1为宜。对包含小于10的个位数(如，1-5)的范围，典型的一个单位应该为0.1。这些只是一些特别提出的例子，所有处于所枚举下限值和上限值之间可能的数值组合都被认为在本公开中明确陈述。在其他方面，本公开中针对混合物中组分的相对量提供了数值范围，并且在方法中表述了各个温度和其他参数范围。
[0031] 本发明者发现某些微生物菌株可用于改善水生动物的性能。此外，本发明者发现某些微生物菌株可用于抑制或减缓水生动物病原体的生长或者提高水生动物抗应激性。
[0032] 本文所述微生物菌株为对水生动物健康有益的芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株。现在将说明可用于水生动物的优选芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株。该实例并非要将本发明限制于芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株仅对水生动物可用。
[0033] 在一个实施例中，芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株可用于改善水生动物的性能。本文所用的“性能”指的是下文所述的水生动物(如一种虾)的一个或多个参数：(a)存活率增加；(b)体增重增大(平均日体增重和/或总体增重)；(c)摄食量增加；(d)长度增加；(e)饲料转化率，其包括饲料量：增重和增重：饲料两者；(f)绒毛长度和/或绒毛密度增加；(g)低盐度抵抗力增加；(h)高盐度抵抗力增加；(i)高温抵抗力增加；(j)低温抵抗力增加；(k)福尔马林抵抗力增加；(l)对病原体(如白斑综合症病毒和弧菌属细菌)响应后，存活率增加或(m)死亡率以及本领域已知的其他度量。
[0034] 本文所用的，“性能上的改善”或“改善的性能”指至少一种性能定义下所列的参数有改善。改善的性能相对于对照动物测量。本文所述对照动物为未施用芽孢杆菌和/或乳酸杆菌组合物的动物(例如，虾)。
[0035] 本申请提供了给水生动物(例如虾)施用有效量的一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株的方法。在一个实施例中，该方法改善了水生动物的性能。因此，对水产养殖者来说，日常施用一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株，无论是单独施用还是与其他芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株结合施用，或许是经济的。这样不仅可预防和治疗疾病，而且还可改善性能。
[0036] 在另一个实施例中，施用一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株抑制或减缓病原性微生物的生长。例如，施用一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌抑制或减缓白斑综合症病毒或弧菌属细菌的生长该方法也可能被用于目前还未感染此类病原体的水生动物，来减轻或预防白斑综合症病毒或弧菌属细菌相关疾病。通过抑制或减缓病原体的生长，本文所述水生动物将验证其在暴露于病原体时存活率的改善，或者，将如本文所述验证性能的改善。
[0037] 在另一个实施例中，施用一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株可提高水生动物的抗应激性。例如，施用一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株可提高水生动物的对高或低盐度、高或低温、或者高或低福尔马林暴露的抵抗力。通过增加动物的抗应激性，本文所述水生动物将验证在暴露于应激时存活率的改善，或者将验证本文所述的性能的改善。
[0038] 还提供了给水生动物施用一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株的方法。这些方法可包括给水生动物(例如：虾)喂食一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株。可在幼体期、后幼体期、幼年期或该动物成长过程中的任一阶段喂食所述(一种或多种)菌株。
[0039] 特别是芽孢杆菌菌株具有许多使其可用于被动物摄取的组合物的品质。比如，芽孢杆菌菌株可产生胞外酶，如蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶。此外，芽孢杆菌菌株还可产生抗微生物因子，如短杆菌肽、枯草菌素、杆菌肽和多粘菌素。而且，芽孢杆菌菌株属产孢菌类，因此很稳定。此外，很多芽孢杆菌具有公认安全(GRAS)的状态，也就是说，它们通常被认为是安全的。芽孢杆菌物种是唯一公认安全的产孢菌类。
[0040] 本文所述的芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株抑制或减缓水生动物中一种或多种病原体的生长。例如，在本发明的范围之内的病原体包括很多种专门感染海上养殖的病原体。病原体包括病毒或细菌病原体，还有海藻类(例如鞭毛藻类)产生的毒素。这些病原体包括，举例说明但不限于，白斑综合症病毒(WSSv)、挑拉综合征病毒(TSV)、对虾黄头病毒(YHV)、弧菌物种(包括鳗弧菌(V.anguillarum)和海鱼弧菌(V.ordalii)、杀鲑弧菌(V.salmonicida)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi))、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHN)和IHHNV的病原体和病毒、导致畸形综合征的病原体或南美白对虾矮的RDS、杆状病毒(BLV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、比目鱼杆状病毒(HIRRV)、鲱鱼腹水病毒(YaV)、条纹鲹神经坏死病毒(SJNNV)、虹彩病毒(Irido)、嗜水气单胞菌(Aeromonos hydrophila)、杀鲑产气单胞菌(Aeromonos salmonicida)、液化沙雷菌(Serratia liquefaciens)、鲁氏耶尔森菌I型(Yersnia ruckeri type I)、传染性鲑鱼贫血病(USA)病毒、胰腺疾病(PD)、病毒性出血败血症(VHS)、鲑肾杆菌(Rennibacterium salmoninarum)、杀鲑产气单胞菌、嗜水气单胞菌、巴斯德氏菌(Pasteurella)物种(包括杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida))、耶尔森氏菌物种、链球菌物种、迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)以及鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluria)；这些病毒引发病毒性出血败血症、传染性胰坏死、鲤春病毒血症、河鲶病毒、草鱼出血性病毒、野田病毒科病毒(如：神经坏死病毒、传染性鲑鱼贫血病毒)；以及Ceratomyxa shasta寄生虫、多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifillius)、鲑 隐 鞭 虫(Cryptobia salmositica)、鲑 鱼 海 虱 (Lepeophtheirus salmonis)、四膜虫(Tetrahymena)物种、车轮虫(Trichodina)物种以及Epistylus物种、钩鞭藻毒素(dinoflagellates toxins)，包括毒素引起的腹泻性贝毒(DSP)、麻痹性贝毒(PSP)、神经性贝毒(NSP)和鱼毒，还有很多，它们都会引起水产养殖业的严重损害。在一个实施例中，芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株或本发明抑制或减缓水生动物中白斑综合症病毒或弧菌属细菌的生长。在另一个实施例中，芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株或本发明抑制或减缓水生动物中白斑综合症病毒或哈维氏弧菌的生长。许多芽孢杆菌菌株可以联合使用，来控制各种病原体(比如上述病原体)。
[0041] 已发现对本文所述用法有效的芽孢杆菌菌株包括但不限于，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜碱芽抱杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、环状芽胞杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌菌株。至少有一些实施例中，这些芽孢杆菌菌株为短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTPBS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、短小芽孢杆菌119、枯草芽孢杆菌3A-P4、枯草芽孢杆菌22C-P1、地衣芽孢杆菌842、枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢杆菌BL21和枯草芽孢杆菌AGTPBS1069。至少有一些实施例中，该短小芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌AGTP BS 1068。在一个实施例中，本发明所用芽孢杆菌菌株为短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4的组合。在另一个实施例中，本发明所用芽孢杆菌菌株为短小芽孢杆菌119、枯草芽孢杆菌BS 2084和枯草芽孢杆菌BS15 Ap4的组合。在另一个实施例中，本发明所用芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌BS1013、枯草芽孢杆菌BS918和枯草芽孢杆菌BS3BP5的组合。在另一个实施例中，本发明所用芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌3A-P4、枯草芽孢杆菌
15A-P4和枯草芽孢杆菌22C-P1的组合。在另一个实施例中，本发明所用芽孢杆菌菌株为地衣芽孢杆菌842、枯草芽孢杆菌BS27和地衣芽孢杆菌BL21的组合。
15A-P4和枯草芽孢杆菌22C-P1的组合。在另一个实施例中，本发明所用芽孢杆菌菌株为地衣芽孢杆菌842、枯草芽孢杆菌BS27和地衣芽孢杆菌BL21的组合。
[0042] 这些菌株目前由Danisco USA,Inc.of Waukesha,Wisconsin(威斯康星州沃基肖的丹尼斯克(美国)有限公司)保藏于Agricultural Research Service
Culture Collection(NRRL),1815 North University Street,Peoria,Ill.,61604.(美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)；保藏中心地址：1815 NorthUniversity
Street,Peoria,Ill.,61604)。原始保藏的日期和保藏编号如下：枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5：2011年5月13日，(NRRL B-50510)；枯草芽孢杆菌AGTP BS442：2011年8月4日，(NRRL B-50542)；枯草芽孢杆菌AGTP BS521：2011年8月4日，(NRRL B-50545)；枯草芽孢杆菌AGTP BS918：2011年5月13日，(NRRL B-50508)；枯草芽孢杆菌AGTP BS1013：
2011年5月13日，(NRRL B-50509)；短小芽孢杆菌AGTP BS 1068：2011年8月4日，(NRRL B-50543)；枯草芽孢杆菌AGTP BS1069：2011年8月4日，(NRRL B-50544)。枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)于2007年3月8日保藏在美国农业研究菌种保藏中心。地址：1815 North University Street,Peoria,Ill.,61604。所有保藏行为按照《国际承认用于专利程序目的的微生物保存布达佩斯条约》实施。
Culture Collection(NRRL),1815 North University Street,Peoria,Ill.,61604.(美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)；保藏中心地址：1815 NorthUniversity
Street,Peoria,Ill.,61604)。原始保藏的日期和保藏编号如下：枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5：2011年5月13日，(NRRL B-50510)；枯草芽孢杆菌AGTP BS442：2011年8月4日，(NRRL B-50542)；枯草芽孢杆菌AGTP BS521：2011年8月4日，(NRRL B-50545)；枯草芽孢杆菌AGTP BS918：2011年5月13日，(NRRL B-50508)；枯草芽孢杆菌AGTP BS1013：
2011年5月13日，(NRRL B-50509)；短小芽孢杆菌AGTP BS 1068：2011年8月4日，(NRRL B-50543)；枯草芽孢杆菌AGTP BS1069：2011年8月4日，(NRRL B-50544)。枯草芽孢杆菌BS2084(NRRL B-50013)于2007年3月8日保藏在美国农业研究菌种保藏中心。地址：1815 North University Street,Peoria,Ill.,61604。所有保藏行为按照《国际承认用于专利程序目的的微生物保存布达佩斯条约》实施。
[0043] 以下菌株由Agtech Products,Inc.of Waukesha,Wisconsin(威斯康星州沃基肖的美国农业技术产品有限公司)保藏于American Type Culture Collection(ATCC)10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110(美国典型菌种保藏中心(ATCC)；保藏中心地址：10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110)。原始保藏的日期和保藏编号如下：枯草芽孢杆菌3A-P4：2005年1月12日，(ATCC PTA 6506)；枯草芽孢杆菌BS15-AP4：2005年1月
12日，(ATCC PTA-6507)；枯草芽孢杆菌22C-P1：2005年1月12日，(ATCC PTA-6508)。
12日，(ATCC PTA-6507)；枯草芽孢杆菌22C-P1：2005年1月12日，(ATCC PTA-6508)。
[0044] 地衣芽孢杆菌842由威斯康星州沃基肖的丹尼斯克(美国)有限公司保藏于美国农业研究菌种保藏中心；日期和编号：2011年5月20日，(NRRL B-50516)。枯草芽孢杆菌BS27由威斯康星州沃基肖的美国农业技术产品有限公司保藏于美国农业研究菌种保藏中心；日期和编号：2008年1月24日，(NRRL B-50105)。地衣芽孢杆菌BL21由威斯康星州沃基肖的美国农业技术产品有限公司保藏于美国农业研究菌种保藏中心；日期和编号：2008年4月15日，(NRRL B-50134)。短小芽孢杆菌BP119由DuPont Nutrition Biosciences ApS of Copenhagen,Denmark(丹麦哥本哈根的杜邦营养生物科学有限公司)保藏于美国农业研究菌种保藏中心；日期和编号：2012年12月18日，(NRRL B-50796)；同时可商购自Genesis Biosciences(Lawrenceville,GA)(创世纪生物科学公司(乔治亚州，劳伦斯维尔))。
[0045] 任何芽孢杆菌衍生物或变体同样包括于并可用于本文所述并受权利要求保护的方法中。在一些实施例中，具有短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、短小芽孢杆菌119、枯草芽孢杆菌3A-P4、枯草芽孢杆菌22C-P1、地衣芽孢杆菌842、枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢杆菌BL21、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069所有特点的菌株同样包括于并可用于本文所述并受权利要求保护的方法中。
[0046] 在某些实施例中，短小芽孢杆菌3064、枯草芽孢杆菌BS 2084、枯草芽孢杆菌BS15 Ap4、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、短小芽孢杆菌119、枯草芽孢杆菌3A-P4、枯草芽孢杆菌22C-P1、地衣芽孢杆菌842、枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢杆菌BL21、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069的任何衍生物或变体同样包括于并可用于本文所述并受权利要求保护的方法中。
[0047] 利用标准RAPD图谱分析以及伴侣素60通用靶标(cpn60)和16SrDNA桑格测序的方法，对比菌株短小芽孢杆菌3064和短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)的基因档案。基于5个复制样品的RPAD带型和cpn60和16S rDNA序列分析，短小芽孢杆菌3064与短小芽孢杆菌119(NRRL B-50796)被确定为在遗传上是等同的。因此，本文所用的短小芽孢杆菌3064与短小芽孢杆菌119可互相交换使用。
[0048] 已被发现可用于本文所述用途的乳酸杆菌菌株包括但不限于，瑞士乳酸杆菌、食淀粉乳酸杆菌、弯曲乳酸杆菌、纤维二糖乳酸杆菌、降解淀粉类乳酸杆菌、消化乳酸杆菌、鸟乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、弯曲乳酸杆菌、鸡乳酸杆菌、希氏乳酸杆菌、约氏乳酸杆菌、克菲尔乳酸杆菌、高加索酸奶乳酸杆菌、黏液乳酸杆菌、面包乳酸杆菌、戊糖乳酸杆菌、桥乳酸杆菌、玉米乳酸杆菌、旧金山乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、布氏乳酸杆菌、香肠乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、罗伊氏乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、短乳酸杆菌、乳酸乳杆菌、胚芽乳酸杆菌、沙克乳酸杆菌或唾液乳酸杆菌菌株。至少在一些实施例中，乳酸杆菌菌株为香肠乳酸杆菌CNCM-I-3699、鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698或它们的组合。香肠乳酸杆菌CNCM-I-3699与鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698都保藏于National Micro-organism Collection of Pasteur Institute(CNCM,Paris)(法国巴斯德研究所国家菌物保藏中心)(巴黎，CNCM)。
[0049] 任何乳酸杆菌衍生物或变体同样包括于并可用于本文所述并受权利要求保护的方法中。在一些实施例中，具有香肠乳酸杆菌CNCM-I-3699或鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698所有特点的菌株，同样包括于并可用于本文所述并受权利要求保护的方法中。
[0050] 在某些实施例中，香肠乳酸杆菌CNCM-I-3699或鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698的任何衍生物或变体同样包括于并可用于本文所述并受权利要求保护的方法中。
[0051] 本文所用的，使用随机扩增多态DNA聚合酶链式反应(RAPD-PCR)分析时，“变体”与所公开菌株的基因序列至少有80％同一性。基因序列同一性程度可以有差异。在一些实施例中，使用随机扩增多态DNA聚合酶链式反应(RAPD-PCR)分析时，该变体与所公开菌株的基因序列至少有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。随机扩增多态DNA聚合酶链式反应(RAPD-PCR)分析可用的6种引物包括如下：引物1(5'-GGTGCGGGAA-3')(SEQ ID NO:1)；引物2(5'-GTTTCGCTCC-3')(SEQ ID NO:2)；引物3(5'-GTAGACCCGT-3')(SEQ ID NO:3)；引物4(5'-AAGAGCCCGT-3')(SEQ ID NO:4)；引物5(5'-AACGCGCAAC-3')(SEQ ID NO:5)；引物6(5'-CCCGTCAGCA-3')(SEQ ID NO:6)。在进行RAPD分析时，可使TM用为进行RAPD分析设计为预混料和预分装反应的Ready-to-Go RAPD分析珠(Amersham Biosciences,Sweden)(瑞典安玛西亚生物科学公司)。
[0052] 直接饲用微生物的制备和饲喂
[0053] 为制备本文所述的直接饲用微生物，菌株可在液体营养培养基中生长。对于芽孢杆菌菌株，其生长优选至形成最高数量孢子的程度。在一个实施例中，菌株生长到其中产率7 9
为至少10 ～10 个菌落形成单位(CFU)/毫升培养物的光学密度(OD)。本发明中的菌株通过细菌菌株的发酵作用产生。发酵作用通过放大种菌培养物开始。这涉及到反复无菌地将培养物转化为越来越大的体积，从而作为发酵作用的接种体，发酵作用通过包含蛋白质、碳水化合物以及最佳生长所必需的矿物质的培养基在大不锈钢发酵罐中进行。一种非限制性的示例性培养基为胰蛋白胨大豆肉汤。在将接种体加入发酵容器中后，控制温度和搅动来达到最佳生长。一旦该培养物达到最大种群密度，通过从发酵培养基中分离细胞来收获该培养物。收获通常通过离心分离来实现。上清液可应用于本文所述方法中。然后确定该培养物的计数。
为至少10 ～10 个菌落形成单位(CFU)/毫升培养物的光学密度(OD)。本发明中的菌株通过细菌菌株的发酵作用产生。发酵作用通过放大种菌培养物开始。这涉及到反复无菌地将培养物转化为越来越大的体积，从而作为发酵作用的接种体，发酵作用通过包含蛋白质、碳水化合物以及最佳生长所必需的矿物质的培养基在大不锈钢发酵罐中进行。一种非限制性的示例性培养基为胰蛋白胨大豆肉汤。在将接种体加入发酵容器中后，控制温度和搅动来达到最佳生长。一旦该培养物达到最大种群密度，通过从发酵培养基中分离细胞来收获该培养物。收获通常通过离心分离来实现。上清液可应用于本文所述方法中。然后确定该培养物的计数。
[0054] 至少在一些实施例中，细菌是颗粒状的。至少在一些实施例中，细菌是冻干的。至少在一些实施例中，细菌与载体混合在一起。然而，在使用菌株前不必将它们冻干。这些菌株可与或不与防腐剂一起进行使用，也可以以浓缩、非浓缩或稀释的形式使用。
[0055] 然后可测定培养物计数。CFU或菌落形成单位指得自标准微生物平皿培养法的样本中活细胞计数。此术语来源于该现象，即：当把单个细胞接种到合适的培养基培养时，该细胞将在琼脂培养基中生长并变成活菌落。因多个细胞可能产生为一个活细胞菌落，此术语菌落形成单位更多用作计量单位，而不是细胞数目。
[0056] 当与载体合并时，细菌计数是重要的。在一个实施例中，在生产组合物时，计数为6 12
至少为1.0×10 ～1.0×10 CFU/g。然而，该计数可能在这些基础数据上增加或者减少，
3 4
并且仍具有完整的效果。例如，组合物生产时，该计数可能至少为大约1.0×10、1.0×10、
5 6 7 8 9 10 11 12
1.0×10 、1.0×10、1.0×10、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、
13 14 15
1.0×10 、1.0×10 或1.0×10 CFU/g。
至少为1.0×10 ～1.0×10 CFU/g。然而，该计数可能在这些基础数据上增加或者减少，
3 4
并且仍具有完整的效果。例如，组合物生产时，该计数可能至少为大约1.0×10、1.0×10、
5 6 7 8 9 10 11 12
1.0×10 、1.0×10、1.0×10、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、
13 14 15
1.0×10 、1.0×10 或1.0×10 CFU/g。
[0057] 提供了一种本文所述的含有一种或多种菌株的组合物。可将该组合物作为直接饲用微生物(DFM)饲喂给水生动物。一个或多个载体或其他成分可添加入DFM。DFM可呈现为不同物质形态。例如，作为追肥(top dress)，或用于作为液体浸淋物使用的水溶性浓缩液，或添加到代乳品、明胶胶囊或凝胶中。在追肥形式的一个实施例中，冻干的乳酸菌发酵产品被添加至载体上，如乳清蛋白、麦芽糖糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干淀粉，和/或硅铝酸钠。在当作液体浸淋物的水溶性浓缩液或代乳品补充物的一个实施例中，冻干的乳酸菌发酵产品被添加至一种水溶性载体上，如乳清蛋白、麦芽糊精、蔗糖、右旋糖、干淀粉、硅铝酸钠，并且添加液体来形成该浸淋物，或者添加至乳或代乳品的补充物。在明胶胶囊形式的一个实施例中，冻干的乳酸菌发酵产品被添加至载体上，如乳清蛋白、麦芽糖糊精、糖类、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干淀粉和/或硅铝酸钠。在一个实施例中，该乳酸菌和载体被可降解明胶胶囊包裹。在凝胶形式的一个实施例中，冻干的乳酸菌发酵产品被添加至载体上，如植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨酯80、丙二醇、叔丁基羟基茴香醚、柠檬酸、乙氧喹和/或人造色素，从而形成凝胶。
[0058] 所述(一种或多种)菌株可任选与添加剂(包括但不限于生长基质、酶、糖类、碳水化合物、提取物和促生长的微量成分)的干燥制剂混合。糖类可包括：乳糖；麦芽糖；右旋糖；麦芽糊精；葡萄糖；果糖；甘露糖；塔格糖；山梨糖；棉子糖；和半乳糖。单独的或以组合形式的糖的范围为50-95％。提取物可包括酵母或干燥酵母发酵可溶物，范围为5-50％。生长基质可包括：胰蛋白酶解酪蛋白，范围为5-25％；乳酸钠，范围为5-30％；以及吐温80，范围为1-5％。碳水化合物可包括甘露醇、山梨醇、侧金盏花醇和阿糖醇。单独的或组合形式的碳水化合物的范围为5-50％。微量成分可包括：碳酸钙，范围为0.5-5.0％；氯化钙，范围为0.5-5.0％；磷酸氢二钾，范围为0.5-5.0％；磷酸钙，范围为0.5-5.0％；锰蛋白，范围为0.25-1.00％；以及锰，范围为0.25-1.0％。
[0059] 这些培养物和载体(所使用的)可被加入到螺条混合机或桨式混合机并混合约15分钟，但混合时间可增加或减少。将各组分共混以使得产生培养物与载体的均匀混合物。最终产物优选为干燥可流动的粉末。所述(一种或多种)菌株可被添加到动物饲料或饲料预混料，或添加到动物饮水中，或者以在本领域中所了解的其他途径进行施用。动物用饲料中可补充一种或多种本文所述菌株，也可补充本文所述组合物。
[0060] 菌株可能以有效量施用给动物，所述动物包括但不限于水生动物。水生动物包括：脊椎动物、无脊椎动物、节肢动物、鱼类、软体动物，以举例的方式，除了其它之外，包括但不限于：虾(例如，南美白对虾、盐水虾、淡水虾，等等)、蟹、牡蛎、扇贝、虾蛤、软骨鱼类(例如，鲈鱼、条纹鲈鱼、罗非鱼、鲶鱼、海鲷、彩虹鳟鱼、斑马鱼、红鼓鱼、大马哈鱼、鲤鱼、鲶鱼、黄狮鱼、鲤鱼，等等)以及甲壳类动物。虾包括所有品种和物种的虾，以举例的方式，包括但不限于：滨对虾属虾、美对虾属虾和对虾属虾。除其他以外，对虾属包括但不限于：细角对虾、南美白对虾、斑节对虾、中国对虾、西方对虾、加州对虾、短沟对虾、斑节对虾、食用对虾、白对虾、日本对虾、褐对虾、桃红对虾、印度对虾和墨吉对虾。
[0061] 本文所述芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物可在水生动物生长的任一阶段施用。在一些实施例中，该组合物被施用于虾成长的幼体期、后幼体期或幼年期。见例图1。
[0062] 所谓“施用”指向水生动物引入本文所述至少一种菌株和/或来自至少一种菌株的培养物的上清液的行为。在一些实施例中施用至少一种菌株指至动物胃肠道。施用方式可为口服。该施用可特别地通过在将要饲喂动物的饲料中补充至少一种菌株来实施，添加后的饲料之后将被动物摄取。该施用也可利用胃管或任何其他方法来实施，使得可直接将至少一种菌株送入动物胃肠道。在一些实施例中，对动物施用一种或多种菌株是通过任何简便的方法完成的，包括将芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株添加到动物接触或动物饮用的水中、通过追肥、作为用于液体浸淋物的水溶性浓缩物、明胶胶囊或凝胶。芽孢杆菌菌株优选作为孢子施用。
[0063] 所谓“有效量”指DFM和/或上清液的量足以允许改善动物性能、或者抑制或减缓本文所述病原体生长。改善的量可依本文所述进行测量，也可通过在本领域中已知的其它方法测量。可通过提供任意涉及含DFM的饲料的手段来给动物施用这些有效量。DFM可以以单剂量或多剂量来施用。
[0064] 至少在一些实施例中，与未处理的对照组相比，改善至少为2％。在某些实施例中，改善至少为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0065] 可向动物施用单剂量或多剂量的有效量。所谓“至少一种菌株”，其意既指单一菌株，又指包含至少两个细菌菌株的菌株混合物。至少在一些实施例中，组合使用本文所述的(一种或多种)菌株。所谓“至少两种菌株的混合物”，其意指两种、三种、四种、五种、六种或甚至更多种菌株的混合物。在菌株的混合物的一些实施例中，比例可自1％变化至99％。在某些实施例中，混合物中所用菌株的比例至少为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。菌株的混合物的其他实施例为25％至75％。菌株的混合物的另外的实施例是每种菌株大约为50％。当混合物包含两种以上菌株时，菌株可以基本上相等的比例或以不同比例存在于混合物中。
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。菌株的混合物的其他实施例为25％至75％。菌株的混合物的另外的实施例是每种菌株大约为50％。当混合物包含两种以上菌株时，菌株可以基本上相等的比例或以不同比例存在于混合物中。
[0066] 例如，菌株可以不同比率组合，从而确定出改善动物性能或者抑制或减缓病原体生长的最佳比率。当组合使用时，可使用以下示例性、非限制性比率：三种不同菌株每种1/3；四种不同菌株每种1/4；五种不同菌株每种1/5；第一种菌株40％、第二种菌株40％、第三种菌株20％；第一种菌株50％、第二种菌株25％、第三种菌株25％；第一种菌株70％、第二种菌株20％、第三种菌株10％。也可使用其它菌株组合。此外，具有50％更多CFU/克的组合可用于提高饲喂给动物的微生物的数量。
[0067] 在一些实施例中，当细菌被添加到动物饲料或动物饲料添加剂中时，添加的量为每吨饲料至少10至20,000克。该量可从该数量增加或减少，并任然具有完整的功效。例如，该添加于饲料的细菌量可为每吨饲料10、25、50、100、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、10,000、15,000或20,000克。作为另外一种选择，该量可为处于50至20,000克每吨饲料范围中的任意量。
[0068] 在一些实施例中，该一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株被添加到动物饲料的比1
率为至少1.0×10CFU/动物/天。在另一个实施例中，该一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆
2 3 4 5 6
菌菌株被添加到动物饲料的比率为至少1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、
7 8 9 10 11 12 13 14
1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 或
15
1.0×10 CFU/动物/天。
率为至少1.0×10CFU/动物/天。在另一个实施例中，该一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆
2 3 4 5 6
菌菌株被添加到动物饲料的比率为至少1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、
7 8 9 10 11 12 13 14
1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 或
15
1.0×10 CFU/动物/天。
[0069] 在一些实施例中，该一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株被添加到动物饲料的比3
率为至少1.0×10CFU/克饲料。在另一个实施例中，该一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌
4 5 6 7 8
菌株被添加到动物饲料的比率为至少1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、
9 10 11 12 13 14 15
1.0×10、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 或1.0×10 CFU/克饲料。在
8
一个具体实施例中，该芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株被添加到动物饲料的比率为至少2×10 至
9
2×10CFU/g。
率为至少1.0×10CFU/克饲料。在另一个实施例中，该一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌
4 5 6 7 8
菌株被添加到动物饲料的比率为至少1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、
9 10 11 12 13 14 15
1.0×10、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 或1.0×10 CFU/克饲料。在
8
一个具体实施例中，该芽孢杆菌或乳酸杆菌菌株被添加到动物饲料的比率为至少2×10 至
9
2×10CFU/g。
[0070] 可将本文所给出的DFM按以下形式进行施用：，例如，作为含有菌株的培养溶液、产生菌株的上清液或培养溶液的细菌产物。
[0071] 可通过多种方法中的一种给动物施用该DFM。例如，所述(一种或多种)菌株可能以固体形式进行施用，可被分散进赋形剂、优选水，可被直接饲喂给动物、可能以干燥形式与饲料物理混合、也可以将所述(一种或多种)菌株形成溶液然后喷到饲料上。给动物施用(一种或多种)菌株的方法被认为是在本领域技术人员的技术范围内。
[0073] 施用时间并不重要，只要本文所述的一种或多种性能特性有了改善，比如：(a)存活率增加；(b)体增重增大(平均日体增重和/或总体增重)；(c)摄食量增加；(d)长度增加；(e)饲料转化率，其包括饲料：增重和增重：饲料两者；(f)绒毛长度和/或绒毛密度增加；(g)低盐度抵抗力增加；(h)高盐度抵抗力增加；(i)高温抵抗力增加；(j)低温抵抗力增加；(k)福尔马林抵抗力增加；(l)对病原体(如白斑综合症病毒和弧菌属细菌)响应后，存活率增加或(m)死亡率。在任何时间、有无饲料均可施用。但是，该芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物优选在饲喂时一起或即将饲喂前施用。
[0074] 因此，至少在一些实施例中，至少一种细菌菌株的有效量的施用，是通过在用来饲喂动物的饲料中补充至少一种细菌菌株的有效量来实现的。本文所用的“补充”意为将有效量的本文提供的细菌直接掺入意欲用于动物的饲料的行为。因此，该动物在饲喂时也摄取了本文所提供的细菌。
[0075] 用于动物的饲料包含至少一种本文所述的细菌菌株。
[0076] 至少在一些实施例中，提供了一种方法，所述方法包括以下步骤：将有效量的芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物、一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的组合、一种或多种来自芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物培养物的上清液、包含一种或多种芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的饲料或它们的混合物施用给水生动物。该施用改善了本文所述的一种或多种性能特性，例如：(a)存活率增加；(b)体增重增大(平均日体增重和/或总体增重)；(c)摄食量增加；(d)长度增加；(e)饲料转化率，其包括饲料：增重和增重：饲料两者；(f)绒毛长度和/或绒毛密度增加；(g)低盐度抵抗力增加；(h)高盐度抵抗力增加；(i)高温抵抗力增加；(j)低温抵抗力增加；(k)福尔马林抵抗力增加；(l)对病原体(如白斑综合症病毒和弧菌属细菌)响应后，存活率增加或(m)死亡率。
[0077] 以下所提供实例仅为示例性的目的。本文所包括的实例仅为有助于更完整地理解当前描述的发明。这些实例不以任何方式限制本文所述或受权利要求保护的本发明的范围。
[0078] 实例
[0079] 实例1
[0080] 芽孢杆菌与热灭活的乳酸杆菌对后幼体期白对虾(南美白对虾)生长性能的影响[0081] 在本研究中，对动物的初始体重、最终体重、周体增重、摄食量、饲料转化率(FCR)、长度、存活率、肌肉内脏比率、肝胰腺色泽、畸形情况以及污垢程度进行测量。采用后幼体期的凡纳滨(Litopenaeus vannamei)白对虾。对下表1中显示的每种处理进行了五次复测(Bac＝芽孢杆菌；HIL＝热灭活的乳酸杆菌。)在一个200升的玻璃缸中，每平方米虾数量维持在大约300只。水温维持在29℃，盐度维持在25ppt。每天的换水量大约为20％。
[0082] 表1
[0083]序号 处理 测试的剂量(克/吨)
1 对照组 -
2 Bac 500 500(108CFU/克饲料)
3 HIL 500 500
4 HIL 1000 1000
5 HIL 500+Bac 500 500克/吨HIL+500克/吨Bac
1 对照组 -
2 Bac 500 500(108CFU/克饲料)
3 HIL 500 500
4 HIL 1000 1000
5 HIL 500+Bac 500 500克/吨HIL+500克/吨Bac
[0084] 芽孢杆菌饲料组合物包含干芽孢杆菌发酵产品、碳酸钙、稻壳以及矿物油。最低计数为2×108至2×109CFU/g。该组合物包含短小芽孢杆菌3064(50％)、枯草芽孢杆菌BS2084(25％)以及枯草芽孢杆菌BS15Ap4(25％)。如前文所述，短小芽孢杆菌3064和短小芽孢杆菌119已被确定为在遗传上是等同的，这种确定基于五个复制样品的RAPD带型和cpn60与16S rDNA的序列分析。因此，短小芽孢杆菌3064和短小芽孢杆菌119本文相互替代使用。
[0085] 乳酸杆菌饲料组合物被热灭活。乳酸杆菌在热灭活之前的初始浓度为8.10×109CFU/g。乳酸杆菌在最终产品中的理论浓度为8.10×108CFU/g。乳酸杆菌组合物包含热灭活的乳酸杆菌、海草粉、碎膨化玉米、碎大豆(提取获得)、微粉碎的米糠、二氧化硅和丙酸钙。组合物包含鼠李糖乳杆菌MA27/6B、香肠乳杆菌MA27/6R。
[0086] 采用适合于虾体型的商业虾饲料。根据剂量要求对芽孢杆菌和/或乳酸杆菌细胞进行称重，然后与1.5％的无菌生理盐水(1克饲料/125微升生理盐水)混合。将该溶液与虾饲料均匀混合。虾饲料中涂有鱼油，比率为40微升鱼油/克饲料。使用之前，样本于-4℃保存。在挤压之后，芽孢杆菌和/或乳酸杆菌细胞以追肥的方式加入饲料。
[0087] 在孵卵处，对后幼体期的虾每四个小时规律性地饲喂一次。给虾饲喂活卤虫，其后变为饲喂试验饲料(逐餐/交替性地饲喂)直至为期20天的实验阶段结束。记录并仔细调整每餐中试喂饲料的量。
[0088] 如图2可见，相比于未经处理的对照组虾，芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的施用致使后幼体期虾的存活率、体增重(BWG)、长度和摄食量均增加。每吨饲料中500克芽孢杆菌组合物的施用致使了5.3％的存活率增长、27.3％的体增重增长、9.6％的长度增长和6.0％的摄食量增长。每吨饲料中1000克乳酸杆菌组合物的施用致使了8.0％的存活率增长、32.9％的体增重增长、13.7％的长度增长和5.7％的摄食量增长。所有数值为相对于未接收芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的对照组，且为四次试验的总和(S(ANOVA p<0.05))。
[0089] 实例2
[0090] 芽孢杆菌与热灭活的乳酸杆菌对后幼体期白对虾(南美白对虾)抗应激性的影响[0091] 本研究中，对后幼体期虾面对高盐度、低盐度、高温和低温的应激响应进行评估。此外，对所述虾面对福尔马林的应激响应进行评估。测量了存活率、HSP70热休克蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和ATP酶的N/K。HSP70是一种70kDa热休克蛋白，该热休克蛋白是一种保护性分子伴侣，发现于细胞液和细胞的其它区室内，它可提高受应激细胞的存活。
无论正常还是应激环境下，它们在很多蛋白质的生命周期里起着重要作用。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是具有氧化物酶活性的酶家族的总称，这类酶的主要生理功能为避免组织器官受到氧化性损伤。谷胱甘肽过氧化物酶的生物化学功能为将过氧化氢脂质还原为它们相应的醇类，以及将游离的过氧化氢还原为水。甲醛溶液(或福尔马林)是一种普遍的消毒剂，其作为杀菌剂、杀真菌剂或防腐剂在各个行业中使用。其主要的作用方式为，与蛋白质官能团形成共价交联键。水产养殖中，它通常作为孵卵处的消毒剂使用。
无论正常还是应激环境下，它们在很多蛋白质的生命周期里起着重要作用。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是具有氧化物酶活性的酶家族的总称，这类酶的主要生理功能为避免组织器官受到氧化性损伤。谷胱甘肽过氧化物酶的生物化学功能为将过氧化氢脂质还原为它们相应的醇类，以及将游离的过氧化氢还原为水。甲醛溶液(或福尔马林)是一种普遍的消毒剂，其作为杀菌剂、杀真菌剂或防腐剂在各个行业中使用。其主要的作用方式为，与蛋白质官能团形成共价交联键。水产养殖中，它通常作为孵卵处的消毒剂使用。
[0092] 采用后幼体期的凡纳滨白对虾。对下表2中显示的每种处理进行了五次复测(Bac＝芽孢杆菌；HIL＝热灭活的乳酸杆菌。)每10升玻璃鱼缸内的虾数量维持在大约40只。将后幼虾期的虾蓄养在20ppt的半咸水中进行0至800ppm的福尔马林应激测试。将后幼虾期的虾蓄养在25ppt的半咸水中进行15至35℃的温度应激测试。在0-5ppt和40ppt的半咸水中，在27-28℃的室温下进行盐度应激测试。将虾置于应激环境下24小时。
[0093] 表2
[0094]
[0095] 如实例1所述制备芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物、饲料组合物和食物制剂。如表3可见，芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)的施用致使虾的抗应激性增强。具体来说，芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)组合物的施用致使虾对低盐度(分别为17.7％和8.2％)和高盐度(分别为1.1％和6.5％)的抵抗力显著增强。此外，芽孢杆菌或乳酸杆菌的施用致使虾对低温的抵抗力增强(分别为12.5％和12.7％)。乳酸杆菌的施用也致使虾对高温的抵抗力增强(3.2％)。所有数值均为相对于未接收芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的未处理的对照群体。
[0096] 对位于存在强降雨季节的地区(如亚洲)的水产养殖厂，这些数据格外相关。在这种雨季常出现低盐和低温。
[0097] 表3
[0098]处理 芽孢杆菌(500克/吨)HIL(1000克/吨)
低盐度(0-5ppt) +17.7 +8.2
高盐度(40ppt) +1.1 +6.5
低温(15℃) +12.5 +12.7
高温(35℃) -10.1 +3.2
低盐度(0-5ppt) +17.7 +8.2
高盐度(40ppt) +1.1 +6.5
低温(15℃) +12.5 +12.7
高温(35℃) -10.1 +3.2
[0099] *所示值为相对于未经处理的对照群体所增长的百分数
[0100] S(ANOVA p<0.05)
[0101] 如表4可见，芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)的施用致使幼虾肝胰腺和肠道内果胶酶和淀粉酶活性均增加。特别是，芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的施用致使果胶酶的活性显著增加，在肝胰腺中分别为30.2％和19.6％，在肠道中分别为0.2％和6.11％。芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的施用致使淀粉酶活性增加，在肝胰腺中分别为4.8％和13.1％，在肠道中分别为6.8％和10.2％。所有数值为相对未接收芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的未处理的对照群体。
[0102] 表4
[0103]芽孢杆菌(500克/吨) HIL(1000克/吨)
肝胰腺中相对果胶酶活性 +30.2 +19.6
肠道内相对果胶酶活性 +0.2 +6.11
肝胰腺中相对果胶酶活性 +30.2 +19.6
肠道内相对果胶酶活性 +0.2 +6.11
[0104]肝胰腺中相对淀粉酶活性 +4.8 +13.1
肠道中相对淀粉酶活性 +6.8 +10.2
肠道中相对淀粉酶活性 +6.8 +10.2
[0105] *所示值为相对于未经处理的对照群体所增长的百分数
[0106] S(ANOVA p<0.05)
[0107] 实例3
[0108] 芽孢杆菌与热灭活的乳酸杆菌对幼虾期白对虾(南美白对虾)生长性能的影响[0109] 本研究中，对动物的体重增加量、长度、饲料转化率(FCR)、肝胰腺和肠道中的消化酶(果胶酶、淀粉酶)和内脏组织进行测量。测量对象为幼虾期凡纳滨白对虾。对下表5所示的每种处理进行五次复测(Bac＝芽孢杆菌；HIL＝热灭活的乳酸杆菌。)在一项研究中，每次复测测试每个玻璃缸中大约25只虾。水温维持在29℃，盐度为25ppt。在另一项研究中，每次复测测试保持每个网中大约300只虾。实验开始之间将虾放入网笼中7天使其适应环境。网笼安置在养虾池塘中，并加上网板防止虾脱逃。虾池中装有两套浆轮，用来增加池中溶解氧并循环水。
[0110] 表5
[0111]序号 处理 测试的剂量(克/吨)
1 对照组 -
2 Bac 500 500
3 HIL 500 500
4 HIL 1000 1000
5 HIL 500+Bac 500 500克/吨HIL+500克/吨Bac
1 对照组 -
2 Bac 500 500
3 HIL 500 500
4 HIL 1000 1000
5 HIL 500+Bac 500 500克/吨HIL+500克/吨Bac
[0112] 如实例1所述制备芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物、饲料组合物和食物制剂。如图3可见，芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)组合物的施用致使幼虾的存活率、体增重(BWG)和摄食量均增长。剂量为500克/吨饲料的芽孢杆菌组合物的施用致使存活率增长3.7％，体增重增长11.7％，摄食量增长11.9％。剂量为1000克/吨饲料的乳酸杆菌组合物的施用致使存活率增长4.0％，体增重增长12.8％，摄食量增长21.2％。所有数值为相对于未接收芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的未处理的对照组，且为三次试验的总和(S(ANOVA p<0.05))。
[0113] 在研究结束时，评估了虾的绒毛组织。施用了芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的虾，出现了性能的提高，至少一部分是由于内脏生理机能的改善。如图4可见，相对于未喂食补充剂的对照组，饲喂补充过芽孢杆菌或乳酸杆菌的食物的虾呈现出更长和更高密度的绒毛。改善了的内脏生理机能表明，施用了芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的虾具有更高的消化潜能。
[0114] 实例4
[0115] 芽孢杆菌与热灭活的乳酸杆菌对幼虾期白对虾(南美白对虾)抗应激性的影响[0116] 本研究中，评估了对高盐度、低盐度、高温以及低温的应激响应。此外，也对虾对福尔马林的应激响应进行了评估。对存活率、HSP70热休克蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、脂质过氧化物酶、硫代巴比妥酸反应物质(TBAR)以及过氧化氢酶进行了测量。
[0117] 盐度：在表6中所述的三次处理复测中取20只虾作为样品，并分成两组来研究盐度应激测试。第一组蓄养在含40ppt水的玻璃缸中。第二组蓄养在含0-5ppt水的玻璃缸中。对存活率进行了评估。
[0118] 福尔马林：在表6中所述的三次处理复测中取20只虾作为样品，并分成两组来研究福尔马林应激测试。第一组蓄养在含0ppm水中福尔马林的10升玻璃缸中。第二组蓄养在含600ppm水中福尔马林的10升玻璃缸中。每天对存活率进行评估，持续一周。
[0119] 温度：每周，针对每次复测取20只虾作为样品，用作为期30天的温度应激耐受力研究。第一组蓄养在水温为35℃，1,000升水槽中悬挂的小篮子内。取自各处理的虾被蓄养24小时。第二组蓄养在水温为15℃的10升玻璃缸内，用作对温度应激耐受力的研究。取自各处理的虾被蓄养1小时。
[0120] 表6
[0121]
[0122]
[0123] 如实例1中所述制备芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物、饲料组合物以及食物制剂。如表7可见，芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)的施用致使幼虾的抗应激性增强。具体而言，芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的施用致使对低盐度的抵抗力显著增加(分别为13.3％和10.0％)。芽孢杆菌组合物的施用还致使对高盐度的抵抗力增加(1.8％)。此外，芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的施用致使对低温的抵抗力显著增加(分别为16.4％和16.4％)。芽孢杆菌组合物的施用还致使对高温的抵抗力增加(3.3％)。所有数值为相对于未接收芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的未处理的对照群体。
[0124] 如前例所讨论，对位于存在强降雨季节的地区(如亚洲)的水产养殖厂，这些数据格外相关。在此类雨季常出现低盐度和低温。
[0125] 表7
[0126]处理 芽孢杆菌(500克/吨)HIL(1000克/吨)
低盐度(0-5ppt) +13.3 +10.0
高盐度(40ppt) +1.8 -0.7
低温(15℃) +16.4 +16.4
高温(35℃) +3.3 -5.0
低盐度(0-5ppt) +13.3 +10.0
高盐度(40ppt) +1.8 -0.7
低温(15℃) +16.4 +16.4
高温(35℃) +3.3 -5.0
[0127] *所示值为相对于未经处理的对照群体所增长的百分数
[0128] S(ANOVA p<0.05)
[0129] 实例5
[0130] 芽孢杆菌与热灭活的乳酸杆菌对白对虾(南美白对虾)对疾病响应的影响
[0131] 该研究中，对存活率、免疫指标(例如，总白细胞数(THC)、吞噬活性、血糖水平、氧血清素(Oxy)、氧血清素与蛋白质比率(Oxy:prot)、酚氧化酶活性(PO)以及血淋巴蛋白)以及酚氧化酶原(proPO)、HSP70、SP、PE以及LGBPP的基因表达进行了测量。对凡纳滨白对虾的疾病响应进行了测量。对如下表8所示每种处理进行了五次复测(Bac＝芽孢杆菌；HIL＝热灭活的乳酸杆菌。)每次复测中，每个玻璃缸中测试约20至25只虾。
[0132] 白斑综合症病毒的疾病攻击：在本次实验结束时，对取自每种处理的虾进行了白斑综合症病毒感染的抵抗力测试。为虾注射了先前所确定的LD50浓度的对虾白斑综合征病毒混悬剂。对病毒攻击后10天的死亡率进行了记录。通过聚合酶链反应(PCR)分析确定了诱发死亡率。
[0133] 弧菌攻击：在本次实验结束时，对取自每种处理的虾进行了对虾哈维氏弧菌感染的抵抗力测试。从18至24小时的培养物中制备出一种哈维氏弧菌的细菌悬浮剂，并调整使其最终浓度达到约106CFU/毫升培养液。暴露于该悬浮剂之后，将虾移回培养水槽中，进行14天的死亡率记录。培养水和虾肠道中总弧菌属细菌的计数是使用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖作为弧菌的特定培养基来实现的。总弧菌属细菌的个数，在35℃温育18至24小时后进行计算。
[0134] 表8
[0135]序号 处理 测试的剂量(克/吨)
1 对照组 -
2 Bac 500 500
3 HIL 1000 1000
4 HIL 500+Bac 500 500克/吨HIL+500克/吨Bac
1 对照组 -
2 Bac 500 500
3 HIL 1000 1000
4 HIL 500+Bac 500 500克/吨HIL+500克/吨Bac
[0136] 如实例1中所述制备芽孢杆菌和乳酸杆菌组合物、饲料组合物和食物制剂。如表9可见，芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)的施用致使了在暴露于对虾白斑综合征病毒或弧菌属细菌后的10至14天，虾的存活率增加。具体地讲，芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)组合物的施用致使暴露于对虾白斑综合征病毒或弧菌属细菌后存活率显著增加；针对对虾白斑综合征病毒分别为6.1％和
12.2％，针对弧菌属细菌分别为8.8％和2.3％。此外，如图5所示，芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)组合物的施用致使虾内脏内病原体的量减少(S(ANOVA p<0.05))。
12.2％，针对弧菌属细菌分别为8.8％和2.3％。此外，如图5所示，芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)组合物的施用致使虾内脏内病原体的量减少(S(ANOVA p<0.05))。
[0137] 所有数值为相对于未接收芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物的未处理的对照群体(S(ANOVA p<0.05))。
[0138] 表9
[0139]芽孢杆菌(500克/吨) HIL(1000克/吨)
白斑综合症病毒暴露 +6.1 +12.2
弧菌属细菌暴露 +8.8 +2.3
白斑综合症病毒暴露 +6.1 +12.2
弧菌属细菌暴露 +8.8 +2.3
[0140] *所有数值为相对未处理对照群体的增长百分比
[0141] S(ANOVA p<0.05)
[0142] 芽孢杆菌(500克/吨饲料)或乳酸杆菌(1000克/吨饲料)组合物的施用似乎可至少部分防止白斑综合症病毒和弧菌病原体对虾的侵害，因其激活了与免疫过程相关的基因表达和细胞活性。例如，相对未经处理的对照，当虾用芽孢杆菌组合物处理后，吞噬活性提升了21.0％。此外，相对未经处理的对照，当虾用乳酸杆菌组合物处理后，过氧化酶活性提升了24.8％。另外，经芽孢杆菌或乳酸杆菌组合物处理的虾，在暴露于白斑综合症病毒后，proPO和HSP70的基因表达下降了。
[0143] 实例6
[0144] 相比于基于商业芽孢杆菌的备选解决方案，白虾(南美白对虾)的性能提升[0145] 对比了本芽孢杆菌组合物与基于商业芽孢杆菌的备选解决方案Novozymes 和INVE Sanolife对生长在室外池塘中白虾(南美白对虾)生长性
能和死亡率的影响。对如下表10和表13所示的每种处理进行了三次复测。室外池塘规模约为3330平方米，其中蓄养大约187,000只虾/池塘(562,500只虾/公顷)。试验开始之前，虾经历了为期两周的调整期，调整期内它们适应了基础食物和实验条件。调整期之后，在五个月的试验期内，每天饲喂虾两次以使其明显饱足。试验期内，水温变化范围为20至
31℃。所有食物为等氮饲料和等能饲料。(见表11)。饲料提供商为Zhejiang Xinxin Feed Co.,Ltd(浙江欣欣饲料股份有限公司)(中国浙江省嘉兴市)。每个池塘配备两个通风装置，无排水装置。个体体重在试验中期和末期测量。摄食量每天进行记录。同样对蓄养密度(虾数量/公顷)、收获重量(千克/公顷)、摄食量(千克/公顷)、饲料转化率(FCR)和存活率(％)进行测量。
能和死亡率的影响。对如下表10和表13所示的每种处理进行了三次复测。室外池塘规模约为3330平方米，其中蓄养大约187,000只虾/池塘(562,500只虾/公顷)。试验开始之前，虾经历了为期两周的调整期，调整期内它们适应了基础食物和实验条件。调整期之后，在五个月的试验期内，每天饲喂虾两次以使其明显饱足。试验期内，水温变化范围为20至
31℃。所有食物为等氮饲料和等能饲料。(见表11)。饲料提供商为Zhejiang Xinxin Feed Co.,Ltd(浙江欣欣饲料股份有限公司)(中国浙江省嘉兴市)。每个池塘配备两个通风装置，无排水装置。个体体重在试验中期和末期测量。摄食量每天进行记录。同样对蓄养密度(虾数量/公顷)、收获重量(千克/公顷)、摄食量(千克/公顷)、饲料转化率(FCR)和存活率(％)进行测量。
[0146] 所有数据以平均值±标准偏差的方法表示。所有数据通过单因素方差分析的方法分析。使用Duncan程序分析组间差异。认为一项P<0.05的差异是统计上显著的差异。所有试验用SPSS 11.5完成。
[0147] 表10
[0148]
[0149] 处理2和3中的芽孢杆菌饲料组合物中包含干芽孢杆菌发酵产品、碳酸钙、稻壳和矿物油。该组合物通过在虾饲料表面喷洒芽孢杆菌溶液来掺入虾饲料。
Novozymes 直接喷洒在池塘中。
Novozymes 直接喷洒在池塘中。
[0150] 如前文所述，短小芽孢杆菌3064和短小芽孢杆菌119已被确定为在遗传上是等同的，这种确定基于五个复制样品的RAPD带型和cpn60与16SrDNA的序列分析。因此，短小芽孢杆菌3064和短小芽孢杆菌119本文相互替代使用。
[0151] 表11
[0153] 表12
[0154] 生长性能
[0155]
[0156] 如表12所示，相对于未经处理的对照处理，就最终体重和FCR(p<0.05)来说，所有处理提高了池塘中白虾的最终产品获得率。同样所有处理的存活率也得到增加。显而易见，相比于Novozymes 芽孢杆菌产品，枯草芽孢杆菌BS2084、枯草芽孢杆菌BS15Ap4和短小芽孢杆菌BP119组合物(处理4)与 枯草芽孢杆菌BS27、地衣
芽孢杆菌BA842和地衣芽孢杆菌BL21组合物(处理3)表现出对生长性能显著的改善。枯草芽孢杆菌BS2084、枯草芽孢杆菌BS 15Ap4和短小芽孢杆菌BP119组合物对生长性能表现出了尤为明显的改善，相对于未处理的对照样本，收获重量产生了19.2％的增长；相对Novozymes 收获重量产生了14.3％的增长。枯草芽孢杆菌BS2084、枯草芽孢杆
菌BS 15Ap4和短小芽孢杆菌BP119组合物，相对于未经处理的对照处理，在FCR上表现出了24.3％的改善；相对于Novozymes 表现出了11.7％的改善。
枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢杆菌BA842和地衣芽孢杆菌BL21组合物，相对于未经处理的对照组和Novozymes 同样产生了显著改善(见表12)。
芽孢杆菌BA842和地衣芽孢杆菌BL21组合物(处理3)表现出对生长性能显著的改善。枯草芽孢杆菌BS2084、枯草芽孢杆菌BS 15Ap4和短小芽孢杆菌BP119组合物对生长性能表现出了尤为明显的改善，相对于未处理的对照样本，收获重量产生了19.2％的增长；相对Novozymes 收获重量产生了14.3％的增长。枯草芽孢杆菌BS2084、枯草芽孢杆
菌BS 15Ap4和短小芽孢杆菌BP119组合物，相对于未经处理的对照处理，在FCR上表现出了24.3％的改善；相对于Novozymes 表现出了11.7％的改善。
枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢杆菌BA842和地衣芽孢杆菌BL21组合物，相对于未经处理的对照组和Novozymes 同样产生了显著改善(见表12)。
[0157] 表13
[0158]
[0159] 表13处理2中芽孢杆菌饲料组合物包含干芽孢杆菌发酵产品、碳酸钙、稻壳和矿物油。该组合物通过在虾饲料表面喷洒液体芽孢杆菌溶液来掺入到虾饲料中。
[0160] 表14
[0161] 生长性能
[0162]
[0163] 如表14所示，相比于未经处理的对照处理，就最终重量和FCR(p<0.05)而言，处理2和3增加了池塘中白虾的最终产品获得率。值得注意的是，相比于INVE Sanolife，枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢杆菌BA842和地衣芽孢杆菌BL21组合物(处理3)对生长性能表现出显著的改善。 枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢杆菌
BA842和和地衣芽孢杆菌BL21组合物，相对于未经处理的对照，收获重量提升了17.7％；相对于INVE Sanolife样本，提升了11.0％。 枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢
杆菌BA842和地衣芽孢杆菌BL21组合物，相对于未经处理的对照，FCR提升了19.6％；相对于INVE Sanolife样本，提升了7.1％。相对于未经处理的对照和INVE Sanolife样本，枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢杆菌BA842和地衣芽孢杆菌BL21组合物对存
活率也有提升。
BA842和和地衣芽孢杆菌BL21组合物，相对于未经处理的对照，收获重量提升了17.7％；相对于INVE Sanolife样本，提升了11.0％。 枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢
杆菌BA842和地衣芽孢杆菌BL21组合物，相对于未经处理的对照，FCR提升了19.6％；相对于INVE Sanolife样本，提升了7.1％。相对于未经处理的对照和INVE Sanolife样本，枯草芽孢杆菌BS27、地衣芽孢杆菌BA842和地衣芽孢杆菌BL21组合物对存
活率也有提升。
[0164] 这些结果表明，本芽孢杆菌组合物作为饲料添加剂使用时，其在提升饲养于池塘的白虾的生长性能和产品获得率上，比可选的微生物方案更优越。相对于Novozymes INVE Sanolife以及未经处理的对照处理，本组合物能明显地提升
最终体增重和FCR。
最终体增重和FCR。
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