技术领域
[0001] 本
发明涉及一种硫辛酸的生物制备方法。
背景技术
[0002] 硫辛酸(lipoic acid，通常指α-硫辛酸)是不溶于
水的白色或淡黄色晶体，广泛分布于动
植物等
生物组织中。硫辛酸属于维生素B族的一类化合物，是一些
微生物的生长因子，在某些多酶系统中起辅因子作用，参与丙
酮酸
氧化脱羧形成乙酰辅酶A，α-酮
戊二酸的氧化脱羧反应等。硫辛酸含有双硫五元环结构，
电子密度很高，具有显著的亲电子性和与自由基反应的能
力，因此它具有抗氧化性。硫辛酸能够清除体内的多种
反应性氧自由基，增强
机体的抗氧化能力，其抗氧化性是维生素E的400倍，是人类所知的天然抗
氧化剂中效果最强的一种。硫辛酸兼具脂溶性与
水溶性，广泛用于
治疗和
预防肝病、心脏病和糖尿病等多种
疾病。硫辛酸有两种对映异构体，其中(R)-硫辛酸比(S)-硫辛酸有效得多。
[0003] 硫辛酸越来越多的应用于医药、食品和保健品中。2008年全球硫辛酸的年需求量大概为400t，2010年已达到500t，且以10％以上的速度增长，而其产量仅为200t左右，巨大的供应缺口使得硫辛酸在国内外市场上具有重要的市场地位。
[0004] 硫 辛 酸 的 主 要 合 成 途 径 有 己 二 酸 衍 生 物 合 成 法 (J.Am.Chem.Soc,1957,77,416-419)，
己二酸合成法(US 2792406)、环己酮衍生物法和环己酮五步法(中国药物化学,1999,12(9):304-305)等。在这些方法中，完成二硫键的环合之后，需要将硫辛酸酯
水解为硫辛酸作为最终产品，反应方程式如下：
[0005]
[0006] 这一关键步骤通常的水解方法是加入与底物等当量或过量的氢氧化钠等强
碱，及四丁基溴化铵等相转移催化剂或阴离子
表面活性剂作为催化剂，如中国
专利201010605575.8和201310034941.2等所述。由于水解
废水含有与底物等当量强碱，不能直接排放，需要加入等量的强酸中和。废水中含有的表面活性剂也存在不能自然降解的问题。
本发明通过使用生物酶法水解，与以公开方法相比，无须添加氢氧化钠等强碱，催化剂可重复利用并能自然降解，具有良好的应用前景，如下所示：
[0007]
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种硫辛酸的生物制备方法以解决现有化学法所存在的污染问题。
[0009] 为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
[0010] 一种硫辛酸的生物制备方法，其通过使硫辛酸酯在生物催化剂存在下、在pH8～10的水相体系中以及
温度30～50℃下发生水解反应生成硫辛酸，所述生物催化剂为脂肪酶或蛋白酶，其中：
[0011] 脂肪酶选自来源于米黑根毛酶(Rhizomucor miehei)、南极假丝
酵母(Candida Antarctica)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜热
真菌(Thermomyces lanuginose)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani pisi)、茄病镰刀菌(Fusarium solani pisi)的脂肪酶中的一种；
[0012] 蛋白酶选自来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉(Aspergillus niger)的蛋白酶中的一种。
[0013] 根据本发明，所述脂肪酶、蛋白酶的形式可以为游离酶或固定化酶，没有特别限制。
[0014] 优选地，生物催化剂为选自来源于南极假丝酵母的Novozym 435，来源于枯草杆菌的IMMOZYME AUL1，来源于嗜热真菌的Lipolase，来源于洋葱假单胞菌的IMMOZYME IMMABC，来源于荧光假单胞菌的IMMOZYME APF中的一种。。
[0015] 具体地，所述的硫辛酸酯为硫辛酸甲酯或硫辛酸乙酯或二者的组合。
[0016] 进一步地，所述的生物催化剂与硫辛酸酯的投料重量比优选为0.1～1：1，更优选为0.1～0.5：1。
[0017] 进一步地，所述的水相体系的pH优选为9～10，更优选为9.5～10。
[0018] 优选地，所述的水解反应在温度38～42℃下进行。
[0019] 优选地，所述方法还包括使水解反应在助
溶剂存在下进行，助溶剂具体为乙腈、DMSO或二者的组合。
[0020] 优选地，助溶剂的体积比浓度为10％～15％。
[0021] 根据本发明，硫辛酸酯具体可以为硫辛酸乙酯、硫辛酸甲酯等，也可以是硫辛 酸的其他烷基酯。
[0022] 根据本发明的一个具体且优选的实施方式，生物催化剂为选自来源于南极假丝酵母的Novozym 435，来源于枯草杆菌的IMMOZYME AUL1，来源于嗜热真菌的Lipolase，来源于洋葱假单胞菌的IMMOZYME IMMABC，来源于荧光假单胞菌的IMMOZYME APF中的一种。；生物催化剂与硫辛酸酯的投料重量比为0.1～0.5：1，水相体系的pH为9.5～10，水解反应的温度为38～42℃，水解反应还在DMSO的存在下进行，DMSO的体积比浓度为10％～15％。根据该实施方式，反应进行6h后，转化率即达到90％以上。
[0023] 根据本发明的一个最佳实施方式，生物催化剂与硫辛酸酯的投料重量比为0.1～0.5：1，生物催化剂为选自来源于南极假丝酵母的Novozym 435或来源于枯草杆菌的IMMOZYME AUL1，水相体系的pH为10，水解反应的温度为39～41℃，水解反应在DMSO的存在下进行，DMSO的体积比浓度为15％。根据该实施方式，反应进行6h后，转化率即达到
99％以上。
附图说明
[0024] 图1为
实施例3所得产物的液相色谱图。
具体实施方式
[0025] 以下结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明不限于以下实施例。
[0026] 实施例1不同脂肪酶或蛋白酶催化硫辛酸乙酯水解制备硫辛酸的转化率比较[0027] 于2ml 96孔板中加入不同的水解酶10mg，底物硫辛酸乙酯10mg，1ml pH 7.0100mM的
磷酸盐缓冲溶液，密封后于30℃下震荡反应8小时，取样检测转化率，见表1。
[0028] 表1不同酶对水解反应的催化作用
[0029]名称 类型 来源物种 供应商 转化率
Lipase AK 脂肪酶 Pseudomonas fluorecens AMANO 51.6％
Lipase AS 脂肪酶 Aspergillus niger AMANO 5.0％
Lipase AY 脂肪酶 Candida rugosa AMANO 67.9％
Lipase PS 脂肪酶 Burkholderia cepacia AMANO 84.5％
Amano M4 脂肪酶 Mucor javanicus AMANO 93.8％
Amano F-AP154 脂肪酶 Rhizopus oryzae AMANO 25.3％
CALA 脂肪酶 Candida antarctica Novozymes 54.2％
Novozym 435 脂肪酶 Candida antarctica Novozymes >99％
Lipolase 脂肪酶 Thermomyces lanuginosa Novozymes 94.9％
Cutinase 脂肪酶 Fusarium solani pisi Novozymes 92.1％
RML 脂肪酶 Rhizomucor miehei sigma-aldrich 90.8％
[0030]IMMOZYME IMMABC 固定化脂肪酶 Pseudomonas cepacia chiral vision 97.9％IMMOZYME APF 固定化脂肪酶 Pseudomonas fluorescens chiral vision 98.6％IMMOZYME AULI 固定化脂肪酶 Bacillus subtilis chiral vision >99％IMMOZYME CALB 固定化脂肪酶 Candida antarctica chiral vision 72.1％IMMCRL 固定化脂肪酶 Candida rugosa chiral vision 89.6％
Lipase OF 脂肪酶 Candida cylindracea sp. Meito 3.1％
Papain 蛋白酶 Carica papaya sigma-aldrich 12.4％
Alkaline protease 蛋白酶 Bacillus subtilis AMANO 89.6％
Neutral protease 蛋白酶 Bacillus subtilis AMANO 18.6％
Acid protease 蛋白酶 Aspergillus niger AMANO 46.7％
Alcalase 蛋白酶 Bacillus subtilis Novozymes 72.0％
[0031] 从表1可见，来源于米黑根毛酶(Rhizomucor miehei)、南极假丝酵母(Candida Antarctica)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜热真菌(Thermomyces lanuginose)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani pisi)、茄病镰刀菌(Fusarium solani pisi)的脂肪酶，来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉(Aspergillus niger)的蛋白酶均对制备硫辛酸的水解反应有不同程度的催化作用。其中，采用来源于南极假丝酵母的Novozym 435，来源于枯草杆菌的IMMOZYME AUL1，来源于嗜热真菌的Lipolase，来源于洋葱假单胞菌的IMMOZYME IMMABC，来源于荧光假单胞菌的IMMOZYME APF的脂肪酶的转化率达到95％以上。
[0032] 实施例2不同反应条件对于水解反应的影响
[0033] 例2.1于2ml 96孔板中加入脂肪酶Novozym 435 5mg，底物硫辛酸乙酯10mg，1ml pH 7.0 100mM的磷酸盐缓冲溶液，密封后置于30℃下震荡反应24小时，取样检测转化率为77％。
[0034] 例2.2于2ml 96孔板中加入脂肪酶Novozym 435 5mg，底物硫辛酸乙酯10mg，1ml pH 7.0 100mM的磷酸盐缓冲溶液，密封后分别置于30℃、40℃和50℃下震荡反应24小时，取样检测转化率为97％和72％。
[0035] 例2.3于2ml 96孔板中加入脂肪酶Novozym 435 5mg，底物硫辛酸乙酯10mg，加入1ml pH 8.0 100mM的磷酸盐缓冲溶液，密封后于40℃下震荡反应6小时，取样检测转化率为82％，震荡反应22小时，取样检测转化率为98％。
[0036] 例2.4与例2.3基本相同，不同的是，加入的磷酸盐缓冲溶液的pH分别为9.0，10.0，11.0，12.0，6小时所检测的转化率依次为92％、99％、87％和73％，22小时所检测的转化率依次为98％、99％、98％和78％。
[0037] 例2.5于2ml 96孔板中加入脂肪酶Novozym 435 5mg，底物硫辛酸乙酯10 mg，加入0.9ml pH 10.0 100mM的磷酸盐缓冲溶液和0.1ml DMSO，密封后于40℃下震荡反应6小时，取样检测转化率为88％。
[0038] 例2.6与例2.5基本相同，不同的是，分别用
甲苯、乙腈、异辛烷替代DMSO，6小时所检测的转化率依次为44％、76％、68％。
[0039] 例2.7与例2.5基本相同，不同的是，改变DMSO的体积比浓度，使其分别为10％，15％，20％，25％，30％，6小时所检测的转化率依次为68％、86％、44％、46％、42％。
[0040] 实施例3
[0041] 40℃水浴反应器中，加入5g硫辛酸乙酯，加入去离子水102ml和DMSO 18ml，调节pH至9.0～9.5之间，控制磁力搅拌800rpm，搅拌均匀，加入2.5g Novozym 435固定化脂肪酶，开始反应，用8％NaOH水溶液控制pH值10.0，HPLC监控反应至6小时，底物转化率99.7％，产物纯度97.9％，产物液相色谱图见图1。
[0042] 实施例4
[0043] 15ml层析柱中，加入Novozym 435固定化脂肪酶1.2g，去离子水10ml。40℃水浴保存的储液罐中，加入5g硫辛酸乙酯，再加入去离子水100mL，调节pH在10.0，磁力搅拌约800rpm，用
蠕动泵输入至层析柱中，开始反应，HPLC监控反应至12小时，底物转化率98.5％。
[0044] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
