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一种生物芯片微阵列点阵方法

阅读:758发布:2021-04-13

专利汇可以提供一种生物芯片微阵列点阵方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 生物 芯片微阵列点阵方法,本发明方法应用了类拉丁方实验设计。类拉丁方设计在此包括三种,即:1、亚方格内的类拉丁方阵列点阵设计;2、亚方格间的亚方格内的类拉丁方阵列点阵设计;3、同时包含亚方格内和亚方格间的亚方格内的类拉丁方阵列点阵设计。本发明的生物芯片微阵列点阵设计可以一定程度上避免和消除不同因子引起的空间效应误差,一定程度上提高所涉及的生物实验或试验结果的准确性。,下面是一种生物芯片微阵列点阵方法专利的具体信息内容。

1.一种生物芯片微阵列点阵方法,其特征在于:所述的样品微阵列点阵,采用类拉丁方排列。
2.如权利要求1所述的一种生物芯片微阵列点阵方法,其特征在于:所述的微阵列点阵在每个亚方格内采用类拉丁方阵列点阵设计。
3.如权利要求1所述的一种生物芯片微阵列点阵方法,其特征在于:所述的微阵列点阵在亚方格间的亚方格内采用类拉丁方阵列点阵设计。
4.如权利要求1所述的一种生物芯片微阵列点阵方法,其特征在于:所述的微阵列点阵在亚方格内和亚方格间的亚方格内同时采用类拉丁方阵列点阵设计。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种生物芯片微阵列点阵方法,其特征在于:亚方格内的点的阵列为n*n点阵,其中n=2-1000。
6.如权利要求5所述的一种生物芯片微阵列点阵方法,其特征在于:亚方格内的点的阵列为n*n点阵,其中n=3-20。
7.如权利要求1-4任一项所述的一种生物芯片微阵列点阵方法,其特征在于:多个亚方格排成阵列,阵列为n*n,其中n=3-100。
8.如权利要求1-4任一项所述的一种生物芯片微阵列点阵方法,其特征在于:所述的生物芯片包括DNA芯片、RNA芯片、iRNA芯片、蛋白芯片、抗体芯片、抗原芯片或糖芯片。

说明书全文

一种生物芯片微阵列点阵方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域,具体地涉及一种生物芯片微阵列点阵方法。

背景技术

[0002] 微阵列数据分析方法学的学术报道主要集中在生物芯片杂交后芯片数据点的常态化和系统误差校正以消除不同来源的变异误差。Yang YH,Dudoit S,Luu P,Lin DM,Peng V,Ngai J,Speed TP.Normal ization for cDNA microarray data:a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.Nucleic Acids Res 2002,30(4):e15。Tarca AL,Cooke JE,Mackay J.A robust neural networks approach for spatial and intensity dependent normalization of cDNA microarray data.Bioinformatics 2005,21:2674-2683。这主要是因为运用微阵列技术的研究多为DNA微阵列方面,而所用DNA微阵列芯片可以从生物公司购得,省去了非常烦杂的芯片制作过程。DNA芯片的制作,需要制备几千、几万cDNA、PCR产物、或寡聚核苷酸,并要将它们点在芯片上,这一过程非常烦杂。因此,微阵列数据分析方法学的学术报道很少涉及芯片点样阵列设计,以及如何利用特定的点阵设计避免和消除一些已知或未知来源的变异误差。最近几年,越来越多的学术研究课题转向蛋白生物芯片技术,用这一技术发现人类疾病生物标志物用来检测各种人类疾病。Chatterjee M,Mohapatra S,Ionan A,Bawa G,Ali-Fehmi R,Wang X,Nowak J,Ye B,Nahhas FA,Lu K,Witkin SS,Fishman D,Munkarah A,Morris R,Levin NK,Shirley NN,Tromp G,Abrams J,Draghici S,Tainsky MA.Diagnostic markers of ovarian cancer by high-throughput antigen cloning and detection on arrays.Cancer Res.2006;66:1181-90.Chatterjee,M.Ionan,A.Draghici,S.and Tainsky,MA.Epitomics:Global Profiling of Immune Response to Disease Using Protein Microarrays,OMICS:A Journal of Integrative Biology,200610:499-506.Chen C.,Wang X,Yu,J.,et a.Autoantibody Profiles Reveal Ubiquilin1as a Humoral Immune Response Target in Lung Adenocarcinoma,2007.Cancer Research
67,3461-3467.Draghici S,Chatterjee M,Tainsky MA.Epitomics:serum screening for the early detection of cancer on microarrays using complex panels of tumor antigens.Expert Rev Mol Diagn.2005.5:735-43.Wang X,Yu J,Sreekumar A,Varambally S,Shen R,Giacherio D,Mehra R,Montie JE,Pienta KJ,Sanda MG,Kantoff PW,Rubin MA,Wei JT,Ghosh D,Chinnaiyan AM.Autoantibody signatures in prostate cancer.N Engl J Med.2005353:1224-35.Zhong L,Hidalgo GE,Stromberg AJ,Khattar NH,Jett JR,Hirschowitz EA.Using protein microarray as a diagnostic assay for non-small cell lung cancer.Am J Respir Crit Care Med.2005172:1308-14。与DNA芯片不同,蛋白芯片的蛋白来源比DNA更多元化,不同的研究用不同的蛋白,因此各个研究团队需要自己制作蛋白芯片,优化蛋白芯片点阵排列能够降低不同来源的变异误差,提高实验结果的准确性。
[0003] 在微阵列生物芯片数据分析中,信号变异可源于不同的因素。这些因素包括:芯片表面膜的均匀度、点样针、点样顺序、芯片上的样品与目标样品杂交时的杂交条件、扫描仪、等等。这些变异一般以行列空间效应、点样针效应、点样顺序效应表现出来。Tarca AL,Cooke JE,Mackay J.A robust neural networks approach for spatial and intensity dependent normalization of cDNA microarray data.Bioinformatics2005,21:2674-2683。这些效应在行或列中常常表现出梯度,也就是效应随行或列的增加逐渐变大或变小。在通常情况下,每种生物样品(cDNA、寡聚核苷酸、PCR产物、抗体抗原、或蛋白)在同一张芯片上有若干个重复,如何利用重复来避免和消除这些空间效应误差将关系到数据的准确性,将影响到整个研究课题的最终结果。如何利用重复来避免和消除这些空间效应误差就是如何将这些重复安排在在芯片的点阵中。现有的方法一般是没有重复的亚方格,在同一个亚方格中,重复的点一般是将这些重复安排在点阵中的同一列或同一行,有时甚至连在一起或堆在一起。这样的排列方法基本上没有起到避免或消除空间效应误差的作用。本发明将借鉴拉丁方实验设计的原理,设计出一系列点阵排列方法,这样的排列能充分利用生物样品在芯片上的点的重复,有效避免和消除空间效应引起的误差。
[0004] 拉丁方实验设计是统计学方面的实验设计的一种方法。Yates F.(1933)Theformation of latin square for use in field experiments.Empire J.Exp.Agric.1:235-244.拉丁方设计就是有关如何在等长二维平面空间中安排重复使得空间效应误差得到有效控制。在拉丁方中,行数和列数相等,统计分析涉及的因子数和每个因子的重复数与行数或列数相同,而且,一个因子在每一行和每一列中仅仅重复一次。例如,在一个2X2的拉丁方中,因子A和B的两个重复是这样安排的:
[0005]B A
A B
[0006] 行和列数都是2,A因子和B因子在行和列中只重复一次;在一个3X3的拉丁方中,因子A、B、和C的三个重复是这样安排的:
[0007]B A C
A C B
C B A
[0008] 或者,对调其中的行或对调其中的列可以形成另一个拉丁方:
[0009]A C B
B A C
C B A
[0010] 类似的拉丁方排列共有12个,没有一一列出。但无论如何排列,行和列数都是3,A因子、B因子、和C因子在行和列中只重复一次;在一个4X4的拉丁方中,因子A、B、C、和D的四个重复是这样安排的:
[0011]B A D C
A D C B
C B A D
D C B A
[0012] 或者,对调其中的行或对调其中的列可以形成另一个拉丁方:
[0013]A D C B
B A D C
C B A D
D C B A
[0014] 类似的拉丁方排列共有576个,没有一一列出。但无论如何排列,行和列数都是4,A因子、B因子、C因子、和D因子在行和列中只重复一次。还有5X5,6X6,……,等等,的拉丁方。由于每一个因子在每一行和每一列都有一个重复,每个因子重复的平均值就可以有效消除呈梯度递增或递减的空间效应引起的误差。微阵列生物芯片点样的点阵设计与拉丁方设计虽然不完全相同,但有相似之处。本发明就是借鉴拉丁方设计原理,将拉丁方设计应用于生物芯片的点样的点阵设计。
[0015] 生物芯片的点样一般是用安放在点样针板上的点样针来完成的。点样板由电脑程序控制做上下左右前后移动。点样板带着点样针移至盛有生物样品的样品盘(一般为384孔盘,每孔一个生物样品)上方将点样针对准盘孔向下移至适当高度取样,再移至芯片位置在芯片上点样。每根点样针点出来的点阵为一个亚方格阵列。如下图所示,如果点样板上安有16根点样针,每张芯片上就有16个亚方格;如果点样板上安有32根点样针,每张芯片上就有32个亚方格。这16个或32个亚方格组成了一个亚方格阵列,每一个亚方格又是由生物样品组成的生物样品阵列。亚方格阵列的排列方法和生物样品阵列的排列方法直接关系到空间效应误差的控制。
[0016] 16根点样针点出的16个亚方格的阵列(4X4,图1)
[0017] 32根点样针点出的32个亚方格的阵列(4X8,图2)
[0018] 现有的亚方格阵列的排列方法和生物样品阵列的排列方法不能有效地利用生物样品的重复去避免和消除空间效应引起的误差。在现有的方法有以下两个特点:1、生物样品的全部重复都是被安排在同一个亚方格中,同一芯片中没有亚方格阵列的重复;2、在一个亚方格中,一般是将生物样品重复安排在点阵中的同一列或同一行,有时甚至连在一起或堆在一起。例如,如果用32根点样针点32个亚方格阵列,一共取36次生物样品,每个生物样品重复4次;那么,每个亚方格阵列就有144个点;现有的生物样品阵列是如图3所示,包括“形式A”、“形式B”、或“形式C”的点样方法所示安排生物样品重复的。在这三个点阵中,虽然都是12X12的阵列,但由于没有有效利用生物样品的重复进行点阵阵列设计,用这三个点样方法点出的芯片得到的数据的误差中,包含着空间效应误差,将影响最终的实验分析结果,如果这个研究是一个检测疾病的研究,将一定程度上降低检测准确率。

发明内容

[0019] 本发明洞察了上述点阵阵列设计的缺陷,借鉴拉丁方实验设计的原理,设计出一系列类拉丁方设计点阵排列方法,这样的排列能充分利用生物样品在芯片上的点的重复,有效避免和消除空间效应引起的误差。
[0020] 本发明的技术方案如下:
[0021] 一种生物芯片微阵列点阵方法,其中,所述的样品微阵列点阵,采用类拉丁方排列。
[0022] 在本发明的一较佳实施例中,所述的微阵列点阵在每个亚方格内采用类拉丁方点阵设计。这里所述的“亚方格”为每个点样针所点出的点阵。这里的“类拉丁方”如前所述,即类似于拉丁方设计,拉丁方设计中,如有n个因子,将这n个因子排列成n*n的阵列,且每一个因子在每一行和每一列都有一个重复。在这里的因子替换成生物样品。即假设有n个样品,则将其排列成n*n的样品阵列,且每一个样品在每一行和每一列都有一个重复。
[0023] 在本发明的另一较佳实施例中,所述的微阵列点阵在亚方格间的亚方格内采用类拉丁方阵列点阵设计。
[0024] 在本发明的又一实施例中,所述的微阵列点阵在亚方格内和亚方格间的亚方格内同时采用类拉丁方阵列点阵设计。
[0025] 本发明每个亚方格内的点数相同,排列成n*n的点阵,.n的数值取决于实验样品量、实验要求以及仪器的点样和分辨能等。例如,n可以为3-1000.
[0026] 在本发明中,多个亚方格排成类拉丁方阵列,亚方格阵列为n*n,n的数值取决于取样头或取样针的数量。例如,n可以为3-100。
[0027] 本发明所述的生物芯片包括DNA芯片、RNA芯片、iRNA芯片、蛋白芯片、抗体芯片、抗原芯片或糖芯片。
[0028] 本发明的生物芯片还可用液体芯片、固定蛋白的膜、或其它固定蛋白的介质、固定核酸(包括DNA、RNA)的膜、或其它固定核酸的介质替代。
[0029] 本发明的生物芯片微阵列点阵设计可以一定程度上避免和消除不同因子引起的空间效应误差,提高所涉及的生物实验或试验结果的准确性。附图说明
[0030] 图1为16根点样针点出的16个亚方格的阵列(4X4);
[0031] 图2为32根点样针点出的32个亚方格的阵列(4X8);
[0032] 图3中,A、B、C分别为现有技术形式A、形式B和形式C的阵列;
[0033] 图4为本发明的阵列;
[0034] 图5为本发明的阵列示意图之一
[0035] 图6为本发明的阵列示意图之二
[0036] 图7为本发明的阵列示意图之三
[0037] 图8为本发明的阵列示意图之四

具体实施方式

[0038] 以下将参照实施例详细描述本发明。
[0039] 本发明的类拉丁方设计点阵,在两个平上借鉴了拉丁方设计的原理,第一个水平是亚方格内水平;第二个水平是亚方格间水平。
[0040] 1、亚方格内水平上的类拉丁方设计
[0041] 为了阐明亚方格内水平上的拉丁方设计,再以上述相同的例子为例。如果用32根点样针点32个亚方格阵列,一共取36次生物样品,每个生物样品重复4次;那么,每个亚方格阵列就有144个点。本发明的生物样品阵列是将不同于“形式A”、“形式B”、或“形式C”的点样方法所示安排生物样品重复的。如下图所示,在这个例子中,用本发明的亚方格内水平上的类拉丁方设计制作的作品点阵,实际上每个亚方格是由9个拉丁方点阵组成,第1、10、19、28号生物样品组成第一个拉丁方点阵;第2、11、20、29号生物样品组成第二个拉丁方点阵;第3、12、21、30号生物样品组成第三个拉丁方点阵;第4、13、22、31号生物样品组成第四个拉丁方点阵;第5、14、23、32号生物样品组成第五个拉丁方点阵;第6、15、24、33号生物样品组成第六个拉丁方点阵;第7、16、25、34号生物样品组成第七个拉丁方点阵;
第8、17、26、35号生物样品组成第八个拉丁方点阵;第9、18、27、36号生物样品组成第九个拉丁方点阵。这只是第一个亚方格点阵,32个亚方格中的每个亚方格点阵都可以承载相同数量的生物样品,但所承载的生物样品是不同的,这样一张芯片可以点1152个不同的生物样品。可以看出,生物样品的号数是按顺序加入的,生物样品的号之所以没有进行随机化处理,是因为给生物样品编号时已经随机化处理了。这九个拉丁方有如下两点不同之处:1、生物样品不同;2、在芯片上所处的空间位置略有不同。因此,这九个不尽相同的拉丁方组合在一起,用平均数来避免和消除空间效应误差,与真正的拉丁方设计方法略有不同,但得到的效果将十分相近,这也是称之为“类拉丁方设计”的原因。当然,4X4拉丁方阵列的方式可以通过调换各行或各列变换,所有的576个4X4拉丁方阵列排列方式都有同样的效果。
[0042] 2、亚方格间水平上的类拉丁方设计
[0043] 为了说明亚方格间水平上的类拉丁方设,以如下的例子为例:,见图5,用16根点样针点16个亚方格阵列,一共取36次生物样品,每个生物样品重复4次,但4个重复不再排列在同一个亚方格中,而是按照拉丁方设计,安排在不同的亚方格中。那么,如下图所示,每一个亚方格包含了144个不同的生物样品,每个生物样品在一个亚方格中只有一个重复。四个重复被安排到不同的亚方格中。这样,亚方格A将包含1至144号生物样品;亚方格B将包含145至288号生物样品;亚方格C将包含289至432号生物样品;亚方格D将包含
433至576号生物样品。而且,亚方格A、B、C、D各自都有四个重复,正好组成一个4X4的亚方格间的拉丁方设计点阵。这样,一张芯片上就有144个拉丁方点阵,这144个拉丁方点阵的生物样品不同,所处空间位置也不完全一样。
[0044] 如图6所示,如果要充分利用生物芯片上的面积来增加生物样品数量,可以排列两个4X4的亚方格间拉丁方设计阵列。这样就可以点两倍数量的生物样品,也就是1152个生物样品。
[0045] 如图7所示,如果要充分利用生物芯片上的面积来提高分析精度,可以排列两个相同的4X4的亚方格间拉丁方设计阵列。这样,576个生物样品中的每一个的重复数就可以达到8个。两个4X4的亚方格间拉丁方设计阵列也可以用不同的拉丁方设计排列[0046] 如图8所示,两个4X4的亚方格间拉丁方设计阵列也可以用不同的拉丁方设计排列,这种排列或许是一个更好的排列。
[0047] 3、同时包含亚方格内水平和亚方格间水平上的类拉丁方设计
[0048] 如果想要达到更高的精度或准确度,在生物样品数量较少或者允许足够高点阵密度的情况下有可能是可行的,那就是采用同时包含亚方格内水平和亚方格间水平上的类拉丁方设计。每个生物样品精度或准确度的提高,是以生物样品的数量降低为代价;所以,该拉丁方设计适合于生物样品数量较少的情况(例如经过上一轮筛选,已经选出数量较少的有用的生物样品)。如果一张芯片包含一个4X4的亚方格间拉丁方设计阵列,每个生物样品的重复达到16个(每个亚方格36个生物样品,亚方格阵列内每个生物样品4个重复,亚方格间阵列有4个亚方格重复),这时一张芯片只能承载144个生物样品;如果一张芯片包含两个4X4的亚方格间拉丁方设计阵列,两个亚方格间拉丁方设计阵列包含相同的生物样品,每个生物样品的重复达到32个(每个亚方格36个生物样品,亚方格阵列内每个生物样品4个重复,每个亚方格间阵列有4个亚方格重复,两个亚方格间阵列包含相同的生物样品),这时一张芯片也只能承载144个生物样品;如果一张芯片包含两个4X4的亚方格间拉丁方设计阵列,两个亚方格间拉丁方设计阵列包含不同的生物样品,这时,每个生物样品的重复达到16个(每个亚方格36个生物样品,亚方格阵列内每个生物样品4个重复,每个亚方格间阵列有4个亚方格重复,两个亚方格间阵列包含不同的生物样品),这时一张芯片只能承载288个生物样品。增加点阵密度可以增加生物样品承载数量,这要根据具体情况而定。减少亚方格点阵内的重复数量也可增加生物样品承载数量,比如,用三个重复,每个亚方格点阵包含16个3X3拉丁方,这样可以增加三分之一的生物样品数量。也可以同时增加点阵密度和减少亚方格内生物样品重复数。还可以用不同的点样针板,组成不同的点样针阵列(亚方格阵列)。
[0049] 上述的3个类拉丁方设计方法都能或多或少地降低空间效应误差,本发明的类拉丁方设计方法能降低空间效应误差的原理与标准的拉丁方设计方法相同,亦即:由于拉丁方设计将生物样品重复分布在每一行和每一列,这些重复的平均值将吸收消化掉空间效应误差。而常规设计由于将生物样品重复放在同一行或同一列,这些未被吸收消化的空间效应误差将被计入生物样品效应,引起分析误差,使最终结果偏离真实值。但是,类拉丁方设计不是标准的拉丁方设计,所吸收消化的空间效应误差的量比标准的拉丁方设计要稍小。
[0050] 实施例1、抗原蛋白芯片拉丁方设计与常规设计的空间效应误差吸收消化比较[0051] 本实施例采用单一生物样品来完成整个实施例,这也是本发明的独特之处。采用同一个生物样品,能简化分析统计,使目标、过程、结果更清晰。根据Chatterjee的方法制备了抗原蛋白克隆库,从克隆库中取一个克隆,用这个克隆制备了3个384孔盘的抗原蛋白生物样品(这1152个盘孔盛着同一克隆)。Chatterjee M,Mohapatra S,Ionan A,Bawa G,Ali-Fehmi R,Wang X,Nowak J,Ye B,Nahhas FA,Lu K,Witkin SS,Fi shman D,Munkarah A,Morris R,Levin NK,Shirley NN,Tromp G,Abrams J,Draghici S,Tainsky MA.Diagnostic markers of ovarian cancer by high-throughput antigen cloning and detection on arrays.Cancer Res.2006;66:1181-90.用4X8的点样针阵列点12张抗原蛋白生物芯片,其中,6张用常规点阵阵列排列方法点样,另外6张用亚方格内类拉丁方设计点阵阵列点样。这12张空白芯片来自同一盒芯片,这12张芯片在同一批次用相同的3个384抗原蛋白克隆盘点样,修改电脑程序使得点样顺序为:第1、4、5、7、9、11张芯片用常规点阵阵列方法点样;第2、3、6、8、10、12张芯片用亚方格内类拉丁方设计点阵阵列方法点样。将这12张抗原蛋白芯片按Chatterjee的方法与同一个血清样品杂交。Chatterjee M,Mohapatra S,Ionan A,Bawa G,Ali-Fehmi R,Wang X,Nowak J,Ye B,Nahhas FA,Lu K,Witkin SS,Fishman D,Munkarah A,Morris R,Levin NK,Shirley NN,Tromp G,Abrams J,Draghici S,Tainsky MA.Diagnostic markers of ovarian cancer by high-throughput antigen cloning and detection on arrays.Cancer Res.2006;66:1181-90.并 且 用Axon4200AL荧光扫描仪扫描,再将得到的图像文件数据用Imagene软件转化为数字数据。每个点的Cy5信号强度除以Cy3的信号强度做为该点的数据。因为这1152个盘孔承载着的是相同的抗原蛋白克隆,每个孔中的生物样品都是一样的,但是,为了叙述方便,且称每个孔为一个生物样品。空间效应误差吸收消化效果用以下参数检验:1、每个样品(实际上是每个384孔盘盘孔中的样品)的4个重复的CV(变异系数)大小;2、每个芯片生物样品间的效应变异大小。对CV而言,这4个重复点分布得越集中,CV越小,吸收消化了越少的空间效应误差;这4个重复点分布得越分散,CV越大,吸收消化了越多的空间效应误差。对每个芯片生物样品间的效应变异而言,由于这1152个“生物样品”都是来自同一个抗原蛋白克隆,被吸收消化掉越少的空间效应误差,生物样品间的效应变异就越大;反之,被吸收消化掉越多的空间效应误差,生物样品间的效应变异就越小。
[0052] 表1,常规设计与类拉丁方设计效果
[0053]
[0054] CV1*:4个重复的CV,1152个CV值的平均得出;
[0055] CV2**:生物样品值(平均了4个重复后)间的CV,基于1152个值计算得出。
[0056] 全部12张芯片的统计分析结果表明:1、全部6张类拉丁方设计芯片的全部1152个“生物样品”的4个重复的CV(变异系数)的平均值都大于常规设计的6张芯片,6张芯片的总平均值类拉丁方设计(0.080)比常规设计(0.047)高约70%;2、“生物样品”(平均了4个重复后)间的CV总平均值类拉丁方设计(0.096)比常规设计(0.127)低约13%。
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