技术领域
[0001] 本
发明属于酶制剂评估技术领域，具体涉及一种体外评估耐热植酸酶作用效果的方法。
背景技术
[0002] 植酸酶已广泛用于畜禽
水产等养殖行业，植酸酶添加到
饲料中后，要经受饲料加工过程中的高温处理，饲料被采食后，植酸酶在酶解营养物质的同时需要耐受畜禽体内不同的pH环境，因此，酶解效果会受到诸多因素的影响。但关于植酸酶作用效果评估方法目前仍无统一的标准，使用较多的是仿生消化体系，但评估较多样品时周期仍非常长。
[0003] 公开号为CN 106434850 A的发明
专利公开了一种耐高温植酸酶活性评估方法，其具体通过在模拟胃环境中植酸酶作用饲料样品多释放的
水溶性磷含量，对耐高温植酸酶的活性进行评估，但是其存在如下问题：1)该专利中认为耐高温植酸酶作用饲料样品多释放的水溶性磷含量越大，表明耐高温植酸酶活性越高，但是多释放的水溶性磷含量越多，即磷释放率越高，只能表明对评估原料的底物亲和
力越好，降解效果越好，而同一种植酸酶对不同原料的降解效果不同，与原料中总磷含量、植酸磷结构等因素相关，因此，用耐高温植酸酶作用饲料样品多释放的水溶性磷含量表征耐高温植酸酶活性存在不准确性，且该专利中使用多释放的磷含量表示植酸酶活性，无法体现原料中总磷对该结果的影响；2)对酶制剂进行高温处理时，该专利采用的是高压灭菌锅，
温度存在不
稳定性，且只适用于固态酶制剂，不适用于液态酶制；3)该专利中仅模拟植酸酶在胃环境中的消化2h，而实际上，植酸酶添加到饲料中后，一般是先在胃中消化45min-1h，再进入肠中消化4h，因此，仅在体外胃环境中模拟消化与实际消化存在一定的差别，不能准确体现实际的消化情况。公开号为CN 106706520A的发明专利公开了一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其同样存在上述问题。
发明内容
[0004] 为了克服上述
现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种简单、快速、高效、准确的体外评估耐热植酸酶作用效果的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明的技术方案为一种体外评估耐热植酸酶作用效果的方法，包括如下步骤：
[0006] 1)绘制标准曲线，得到直线回归方程；
[0007] 2)计算待作用试样中的总磷的物质的量y0；
[0008] 3)对耐热植酸酶制剂进行高温处理，得到经高温处理后的耐热植酸酶酶液；
[0009] 4)向待作用试样中加入经高温处理后的耐热植酸酶酶液，然后添加pH2.5
盐酸溶液模拟胃环境中的消化，再添加pH 5.5的乙酸缓冲液Ⅱ模拟肠环境中的消化，之后测定吸光值，并根据直线回归方程计算出试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的物质的量y2；
[0010] 5)以等量的乙酸缓冲液Ⅱ替代经高温处理后的耐热植酸酶酶液作空白对照，按照步骤4)测定吸光值，并根据直线回归方程计算出空白对照中试样的无机磷的物质的量y1；
[0011] 6)将y0、y2和y1代入公式Ⅰ的y中，分别计算出待作用试样中的总磷含量p0、试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的含量p2、空白对照中试样的无机磷的含量p1；
[0012]
[0013] 公式Ⅰ中，y取y0、y2或y1，umol；当y取y2或y1时，得到的p为p2或p1，为试样中无机磷的含量，mg/g；当y取y0时，得到的p为p0，为试样中总磷的含量，mg/g；31为磷的相对分子
质量；m为试样的质量，g；n为稀释倍数；5为参照GB/T 18634-2009中标准曲线进行的体积转化系数；1000为转化因子，1umol＝0.001mmol；
[0014] 7)将p0、p2和p1代入公式Ⅱ计算出试样中耐热植酸酶的磷释放率P，并根据试样中耐热植酸酶的磷释放率P对耐热植酸酶对该试样的作用效果进行评估；
[0015]
[0016] 公式Ⅱ中，P为试样中植酸酶磷释放率，％；p1为空白对照中试样的无机磷的含量，mg/g；p2为试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的含量，mg/g；p0为待作用试样中的总磷含量，mg/g。
[0017] 进一步地，步骤3)中对耐热植酸酶制剂进行高温处理的具体方法如下：取酶浓度为50～150U/mL的酶液于玻璃试管中，置于75℃～85℃水浴锅中，处理2min～5min后，立即取出放入
冰水浴中，冷却至室温。
[0018] 更进一步地，所述酶浓度为50～150U/mL的酶液的制备方法为：当耐热植酸酶制剂为固态制剂，则称取耐热植酸酶制剂1.0g于锥形瓶中，使用100mL乙酸缓冲液Ⅱ提取30min，静置10min，再使用乙酸缓冲液Ⅱ稀释至酶浓度为50～150U/mL；当耐热植酸酶制剂为液态制剂，则直接使用乙酸缓冲液Ⅱ稀释至酶浓度为50～150U/mL。
[0019] 进一步地，步骤4)具体为：
[0020] 41)称取待作用试样置于锥形瓶中，加入经高温处理后的耐热植酸酶酶液，添加pH2.5盐
酸溶液，将锥形瓶封口后置于水浴摇床中，于37℃，振幅120rpm/min水浴震荡45min；然后取出冷却至室温，再加入pH 5.5的乙酸缓冲液Ⅱ，将锥形瓶封口后置于水浴摇床中，于37℃，振幅120rpm/min水浴震荡4h后取出，冷却至室温；
[0021] 42)取上清液加入水和磷显色液，混合后静置10min，离心10min后在415nm
波长下测定吸光值，并根据直线回归方程计算出试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的物质的量y2。
[0022] 更进一步地，于步骤41)之后，取上清液，加3％的三氯乙酸溶液混合，室温水浴摇床震荡30min，取出后离心10min，离心后的上清液用于步骤42)中与水和磷显色液混合。
[0023] 进一步地，步骤2)中计算待作用试样中的总磷的物质的量y0的具体方法如下：称取待作用试样3g于
坩埚中，在电炉上炭化，再放入
马弗炉中，在550℃下灼烧3小时，取出冷却，加入10mL盐酸溶液(1+1)和数滴
硝酸，煮沸10分钟，冷却后转入100容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到待作用试样的分解液；准确移取待作用试样的分解液1mL于50mL容量瓶中，加入
显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10分钟以上，以标准空白为参比，用1cm比色皿在415nm波长下测定待作用试样的分解液的吸光值，并根据直线回归方程计算出待作用试样中的总磷的物质的量y0。
[0024] 进一步地，步骤1)中绘制标准曲线的具体方法如下：分别取不同浓度的磷标准溶液0.2mL，加入1.8mL乙酸缓冲液Ⅰ，再加入4mL植酸钠溶液，最后加入4mL磷显色液，静置10min后于4000rpm离心10min，然后在415nm比色测定其吸光值；以吸光值为横坐标，无机磷的物质的量为纵坐标，绘制标准曲线。
[0025] 更进一步地，所述磷标准稀溶液的配制方法：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准
磷酸二氢
钾与100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液Ⅰ溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmol/L；然后将50.0mmol/L的磷酸二氢钾溶液用乙酸缓冲液Ⅱ稀释至不同浓度，得到不同浓度的磷标准溶液。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0027] (1)本发明提供的体外评估耐热植酸酶作用效果的方法，具有简单、快速、高效、准确、稳定、重现性好等优点；
[0028] (2)本发明中采用试样中植酸酶磷释放率来评估耐热植酸酶对该试样的作用效果，并且考虑了待作用试样中的总磷含量对植酸酶磷释放率的影响，更能准确地体现耐高温植酸酶对待该待作用试样的作用效果；
[0029] (3)本发明中向待作用试样中经高温处理后的耐热植酸酶酶液后，先添加pH2.5盐酸溶液模拟耐热植酸酶制剂在胃环境中的消化，再添加pH 5.5的乙酸缓冲液Ⅱ模拟耐热植酸酶制剂在肠环境中的消化，与酶制剂在动物体内的实际作用情况更为接近，更能体现耐热植酸酶在动物体内对待作用试样的实际作用效果；
[0030] (4)本发明采用水浴锅对耐热植酸酶制剂进行高温处理，温度稳定，且同时适用于固态酶制剂和液态酶制剂，扩宽了可评估的酶制剂范围；
[0031] (5)本发明的体外评估耐热植酸酶作用效果的方法评估的体系酶浓度为1-3U/mL；
[0032] (6)本发明的体外评估耐热植酸酶作用效果的方法不仅适用于饲料样品，同样适用于玉米、
豆粕等原料。
具体实施方式
[0033] 下面对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034] 本实施例提供一种体外评估耐热植酸酶作用效果的方法，包括如下步骤：
[0035] 1)绘制标准曲线，得到直线回归方程；
[0036] 2)计算待作用试样中的总磷的物质的量y0；
[0037] 3)对耐热植酸酶制剂进行高温处理，得到经高温处理后的耐热植酸酶酶液；
[0038] 4)向待作用试样中加入经高温处理后的耐热植酸酶酶液，然后添加pH2.5盐酸溶液模拟胃环境中的消化，再添加pH 5.5的乙酸缓冲液Ⅱ模拟肠环境中的消化，之后测定吸光值，并根据直线回归方程计算出试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的物质的量y2；
[0039] 5)以等量的乙酸缓冲液Ⅱ替代步骤4)中的经高温处理后的耐热植酸酶酶液作空白对照，按照步骤4)测定吸光值，并根据直线回归方程计算出空白对照中试样的无机磷的物质的量y1；
[0040] 6)将y0、y2和y1代入公式Ⅰ的y中，分别计算出待作用试样中的总磷含量p0、试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的含量p2、空白对照中试样的无机磷的含量p1；
[0041]
[0042] 公式Ⅰ中，y取y0、y2或y1，umol；当y取y2或y1时，得到的p为p2或p1，为试样中无机磷的含量，mg/g；当y取y0时，得到的p为p0，为试样中总磷的含量，mg/g；31为磷的相对分子质量；m为试样的质量，g；n为稀释倍数；5为参照GB/T 18634-2009中标准曲线进行的体积转化系数；1000为转化因子，1umol＝0.001mmol；
[0043] 7)将p0、p2和p1代入公式Ⅱ计算出试样中耐热植酸酶的磷释放率P，并根据试样中耐热植酸酶的磷释放率P对耐热植酸酶对该试样的作用效果进行评估；
[0044]
[0045] 公式Ⅱ中，P为试样中植酸酶磷释放率，％；p1为空白对照中试样的无机磷的含量，mg/g；p2为试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的含量，mg/g；p0为待作用试样中的总磷含量，mg/g。
[0046] 具体地，上述步骤1)中绘制标准曲线的具体方法如下：分别取不同浓度的磷标准溶液0.2mL，加入1.8mL乙酸缓冲液Ⅰ，再加入4mL植酸钠溶液，最后加入4mL磷显色液，静置10min后于4000rpm离心10min，然后在415nm比色测定其吸光值；以吸光值为横坐标，无机磷的物质的量为纵坐标，绘制标准曲线。更进一步地，所述磷标准稀溶液的配制方法：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾与100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液Ⅰ溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmol/L；然后将50.0mmol/L的磷酸二氢钾溶液用乙酸缓冲液Ⅱ稀释至不同浓度，得到不同浓度的磷标准溶液。
[0047] 具体地，上述步骤2)中计算待作用试样中的总磷的物质的量y0的具体方法如下：称取待作用试样3g(精至0.0001g)于坩埚中，在电炉上炭化，再放入马弗炉中，在550℃下灼烧3小时，取出冷却，加入10mL盐酸溶液(1+1)和数滴硝酸，小心煮沸10分钟，冷却后转入100容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到待作用试样的分解液；准确移取待作用试样的分解液1mL于50mL容量瓶中，加入显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10分钟以上，以标准空白为参比，用1cm比色皿在415nm波长下测定待作用试样的分解液的吸光值，并根据直线回归方程计算出待作用试样中的总磷的物质的量y0。
[0048] 具体地，上述步骤3)中对耐热植酸酶制剂进行高温处理的具体方法如下：取酶浓度为50～150U/mL的酶液于10mL玻璃试管中，置于75℃～85℃水浴锅中，处理2min～5min后，立即取出放入冰水浴中，冷却至室温。更进一步地，所述酶浓度为50～150U/mL的酶液的制备方法为：当耐热植酸酶制剂为固态制剂，则称取耐热植酸酶制剂1.0g于锥形瓶中，使用100mL乙酸缓冲液Ⅱ提取30min，静置10min，再使用乙酸缓冲液Ⅱ稀释至酶浓度为50～
150U/mL；当耐热植酸酶制剂为液态制剂，则直接使用乙酸缓冲液Ⅱ稀释至酶浓度为50～
150U/mL。
[0049] 具体地，上述步骤4)包括以下步骤：
[0050] 41)称取待作用试样5.000g置于150mL锥形瓶中，加入经高温处理后的耐热植酸酶酶液1mL，添加pH2.5盐酸溶液49mL，将锥形瓶用
封口膜封口后置于水浴摇床中，于37℃，振幅120rpm/min水浴震荡45min；然后取出冷却至室温，再加入pH 5.5的乙酸缓冲液Ⅱ，将锥形瓶用封口膜封口后置于水浴摇床中，于37℃，振幅120rpm/min水浴震荡4h后取出，冷却至室温；
[0051] 42)取上清液2.5mL，加10mL3％的三氯乙酸溶液混合，室温水浴摇床震荡30min，取出后于4000rpm离心10min；通过在上清液中添加三氯乙酸，可以沉降杂蛋白，提高吸光值测定的稳定性；
[0052] 43)取上清液1mL加入5mL水和4mL磷显色液，混合后静置10min，于4000rpm离心10min后在415nm波长下比色测定吸光值，并根据直线回归方程计算出试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的物质的量y2。
[0053] 本实施例中的步骤5)与步骤4)的步骤方法相同，区别在于以等量的乙酸缓冲液Ⅱ替代步骤4)中的经高温处理后的耐热植酸酶酶液作空白对照，并按照步骤4)测定吸光值，并根据直线回归方程计算出空白对照中试样的无机磷的物质的量y1。
[0054] 采用本实施例提供的体外评估耐热植酸酶作用效果的方法，测定不同耐热植酸酶对各种原料和饲料的作用效果，具体方法如下：
[0056] 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水，参考GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法。清洗试验用器皿不要用含磷
清洗剂。
[0057] pH2.50盐酸溶液：用1:1的盐酸溶液调节蒸馏水至pH值为2.50±0.01；
[0058] 乙酸缓冲液：称取20.52g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH至6.00±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；
[0059] 乙酸缓冲液Ⅰ：称取20.52g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH至5.50±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；
[0060] 乙酸缓冲液Ⅱ：称取20.52g无水乙酸钠，0.5g曲拉通X-100(Triton X-100)，0.5g
牛血清蛋白(BSA)于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH至5.50±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；
[0061] 植酸钠溶液：称取0.69g植酸钠，精确至0.1mg，置于100mL烧杯中，用约80mL乙酸缓冲液(4.3)溶解，用冰乙酸调节pH至5.50±0.01，转至100mL容量瓶中，并用乙酸缓冲液(4.3)定容至刻度，现用现配；
[0062] 3％三氯乙酸溶液：称取3.0g三氯乙酸，溶解于90mL，定容至100mL；
[0063] 磷显色液(
钒钼酸铵显色剂，参照GB/T 18634-2009饲用植酸酶活性的测定分光光度法配制)
[0064] 磷酸二氢钾(KH2PO4)：基准物；
[0065] 植酸酶溶液：将提取后的植酸酶制剂用乙酸缓冲液Ⅱ(4.4)稀释成5u/mL的酶液；
[0066] 盐酸溶液(1+1)；硝酸。
[0067] 2、仪器与设备
[0068] 实验室用样品
粉碎机、
电子分析天平(感量0.001g)、水浴恒温
振荡器(温度
精度为0.1℃)、秒表(每小时误差不超过5s)、可见分光光度计、移液器(100-1000μL和1-5mL)、pH计(pH精确至0.01)、离心机(转速可达4000r/min以上)。
[0069] 3、试样制备
[0070] 待作用试样：玉米、豆粕、米糠粕、米糠1、米糠2、肉鸡全价料；
[0071] 按GB/T 14699.1的规定进行
采样，选取有代表性样品，用四分法将试样缩分至100g，粉碎通过0.42mm标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化；
[0072] 4、试验步骤
[0073] 4.1标准曲线的绘制
[0074] 准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾与100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液Ⅰ溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmol/L；按表1的比例用乙酸缓冲液Ⅱ稀释至不同浓度；
[0075] 表1标准稀释比例
[0076]
[0077] 分别取不同浓度的标准稀释液0.2mL，加入1.8mL乙酸缓冲液Ⅰ，再加入4mL植酸钠溶液，最后加入4mL磷显色液，静置10min后于4000rpm离心10min，然后在415nm比色。以吸光值为横坐标，无机磷的物质的量为纵坐标，绘制标准曲线，得到直线回归方程；
[0078] 4.2待作用试样中无机磷的物质的量测定
[0079] 称取试样3g(精至0.0001g)于坩埚中，在电炉上小心炭化，在放入马弗炉中，在550度灼烧3小时，取出冷却，加入10mL盐酸溶液(1+1)和硝酸数滴，小心煮沸约10分钟，冷却后转入100容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液准确移取试样分解液1mL于50mL容量瓶中，加入显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10分钟以上，以标准空白为参比，用1cm比色皿在415nm波长下测定分解液的吸光值，并根据直线回归方程计算出待作用试样中的总磷的物质的量y0；结果如表2所示；
[0080] 表2待作用试样中无机磷的物质的量y0
[0081]
[0082] 4.3高温处理
[0083] 当耐热植酸酶制剂为固态制剂，则称取耐热植酸酶制剂1.0g于锥形瓶中，使用100mL乙酸缓冲液Ⅱ提取30min，静置10min，再使用乙酸缓冲液Ⅱ稀释至酶浓度为50～
150U/mL；当耐热植酸酶制剂为液态制剂，则直接使用乙酸缓冲液Ⅱ稀释至酶浓度为50～
150U/mL；取酶浓度为50～150U/mL的酶液于10mL玻璃试管中，置于75℃～85℃水浴锅中，处理2min～5min后，立即取出放入冰水浴中，冷却至室温，得到经高温处理后的耐热植酸酶酶液；
[0084] 4.4磷释放率的测定
[0085] 称取待作用试样5.000g置于150mL锥形瓶中，加入经高温处理后的耐热植酸酶酶液1mL，添加pH2.5盐酸溶液49mL，将锥形瓶用封口膜封口后置于水浴摇床中，于37℃，振幅120rpm/min水浴震荡45min；然后取出冷却至室温，再加入pH 5.5的乙酸缓冲液Ⅱ，将锥形瓶用封口膜封口后置于水浴摇床中，于37℃，振幅120rpm/min水浴震荡4h后取出，冷却至室温；空白对照以1mL乙酸缓冲液Ⅱ替代经高温处理后的耐热植酸酶酶液；
[0086] 取上清液2.5mL，加10mL 3％的三氯乙酸溶液混合，室温水浴摇床震荡30min，取出后于4000rpm离心10min；取1mL上清液加入5mL水和4mL磷显色液，混合后静置10min，于4000rpm离心10min后在415nm比色测定吸光值，并根据直线回归方程计算出试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的物质的量y2和空白对照中试样的无机磷的物质的量y1；
[0087] 然后将y0、y2和y1代入公式Ⅰ的y中，分别计算出待作用试样中的总磷含量p0、试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的含量p2、空白对照中试样的无机磷的含量p1；
[0088]
[0089] 公式Ⅰ中，y为根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的磷的物质的量，umol，参考GB/T 18634-2009饲用植酸酶活性的测定中磷标准曲线，y可取y0、y2或y1；当y取y2或y1时，得到的p为p2或p1，为试样中无机磷的含量，mg/g；当y取y0时，得到的p为p0，为试样中总磷的含量，mg/g；31为磷的相对分子质量；m为试样的质量，g；n为稀释倍数；5为参照GB/T 18634-2009中标准曲线进行的体积转化系数；1000为转化因子，1umol＝0.001mmol；
[0090] 最后将p0、p2和p1代入公式Ⅱ计算出试样中耐热植酸酶的磷释放率P，并根据试样中耐热植酸酶的磷释放率P对耐热植酸酶对该试样的作用效果进行评估；
[0091]
[0092] 公式Ⅱ中，P为试样中植酸酶磷释放率，％；p1为空白对照中试样的无机磷的含量，mg/g；p2为试样经耐热植酸酶消化后的无机磷的含量，mg/g；p0为待作用试样中的总磷含量，mg/g；
[0093] 不同试样中的不同耐热植酸酶的磷释放率P的计算结果如下表3所示，试验结果以平行测定结果的算术平均值为准，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值8％。
[0094] 表3不同植酸酶对不同原料的磷释放率
[0095]
[0096] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
