[0001] 技术领域 本
发明涉及一种基于荧光素的线粒体靶向型长波长荧光探针。
[0002] 背景技术 线粒体是细胞中有
氧呼吸的场所,为
生物体的各种活动提供着
能量,被人们形象的成为“动
力工厂”。此外,线粒体还参与了细胞代谢、
信号传导和细胞凋亡等生理过程,是细胞中非常重要的细胞器之一。线粒体存在于大多数的真核细胞中,大小不一,一般在(0.5-1.0)×(1-2)μm,在光学
显微镜下需要经过特殊
染色才能看见。线粒体一般呈短棒状或圆球状,也有环状、线状、
哑铃状、分杈状、扁盘状等其它形状。线粒体的数量与形状不但与细胞的种类有关,也与代谢活动和相关
疾病密切相关。因此线粒体的形态、数量以及分布状况对于研究线粒体的功能与
预防相关疾病具有重要意义。
[0003] 随着荧光技术的快速发展,荧光探针已成为
基础医学和生物成像研究的重要手段。荧光探针具有
荧光量子产率高,光
稳定性好,生物兼容性好等优点,常被应用于细胞、组织以及体型较小的活体动
植物的荧光成像中,成为显微成像的理想工具。目前用于线粒体成像的荧光探针种类很多,绝大多数为短波长荧光探针,其发射波长位于400-600nm,但是发射波长处于
近红外区并能够
定位于线粒体中的荧光探针种类却很少。长波长荧光探针与短波长相比具有明显的优势,长波长荧光探针具有较强的组织渗透性和较小的
生物组织或生物体自发荧光的干扰,对生物组织的光损害较小,同时可以为短波长探针提供共定位实验的参比探针,因此急需开发具有靶向定位于线粒体的长波长荧光探针。
[0004] 发明内容 本发明提供了一种线粒体靶向型长波长荧光探针FAI。FAI的结构如(I)所示:
[0005]
[0006]
[0007] 上述这种荧光探针的制备反应式如下:
[0008]
[0009] 上述的FAI探针的合成方法按如下步骤进行:
[0010] 1摩尔量的二氯荧光素单
醛,与1.1倍摩尔量的N-R-2,3,3-三甲基-3H-吲哚,分别加入到无
水乙醇中,在氮气保护下加热回流反应5-7小时,反应液冷却后过滤,
滤饼用无水乙醇清洗,滤饼经无水乙醇重结晶后,得到黄色固体即为目标产物。
[0011] 上述的FAI探针可以对线粒体进行染色,所述的活细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或RAW264.7细胞株。
[0012] 本发明的有益效果是:本发明的荧光探针分子能够快速的定位于线粒体中,另外,该探针还具有较长的发射波长(600-650nm),较好的化学稳定性,较好的溶解性和生物兼容性,不受其他
活性氧和活性氮等物种的干扰。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性,对细胞和生物体无毒
副作用。
附图说明
[0013] 图1是探针FAI-1的荧光
光谱和吸收光谱(归一化)
[0014] 图2是
实施例制备的FAI对线粒体中的荧光共聚焦显微成像。
具体实施方式
[0015] 二氯荧光素单醛的制备方法:
[0016] 二氯荧光素(2.5g,6.14mmol)溶于8ml NaOH 33%(
质量分数)溶液与14ml甲醇中,再加入0.4ml 15-冠醚-5,0℃下滴加12ml三氯甲烷,再升温至55℃下回流反应10h。在0℃下将反应液用浓
盐酸酸化,pH调至1-2,出现絮状沉淀。过滤得到橙黄色固体。用
硅胶柱层析提,得浅黄色固体0.9g,产率15%。MS:427.9
[0017] 实施例(1)FAI-1
[0018] 二氯荧光素单醛(0.59g,1.39mmol)与N-甲基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.25g,1.56mmol),溶于2mL无水乙醇中,在氮气保护下加热回流反应5-7小时,反应液冷却后过滤,滤饼用无水乙醇清洗,滤饼经无水乙醇重结晶后,得到黄色固体即为目标产物,产率为
89%。MS:584.1
[0019] 实施例(2)FAI-2
[0020] 二氯荧光素单醛(0.6g,1.41mmol)与N-乙基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.3g,1.62mmol),溶于2mL无水乙醇中,在氮气保护下加热回流反应5-7小时,反应液冷却后过滤,滤饼用无水乙醇清洗,滤饼经无水乙醇重结晶后,得到黄色固体即为目标产物,产率为
89%。MS:584.1
[0021] 实施例(3)FAI-1对线粒体的荧光显微成像
[0022] 向含有MCF-7或RAW264.7(Hela)细胞株的培养皿中,加入浓度为0.05-0.1M的FAI-1的二甲基亚砜溶液,与细胞培养液混合均匀后,使FAI-1在培养液中的终浓度达到10uM。染色5min后,用pH=7.2的
磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次,然后将该培养皿置于37℃恒温
培养箱中进行孵育24小时,最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。结果如图2所示。
[0023] 实验结果发现,染有FAI-1的细胞线粒体中呈现出较强的红色荧光,实验结果表明FAI-1具有较好的细胞膜透过性,能够定位于细胞的线粒体中。