生物传感器

阅读:641发布:2020-10-28

专利汇可以提供生物传感器专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 生物 传感器 ,其中含有酶的反应层能够迅速溶解在少量的试样溶液中,能有效利用酶反应,获得良好的应答特性。该传感器具备电绝缘性 基板 、具有形成于上述基板上的工作 电极 和配极的电极系、以及形成于上述电极系上或其近旁的反应层,至少上述反应层的表面为多孔质。,下面是生物传感器专利的具体信息内容。

1.生物传感器,其特征在于,具备电绝缘性基板、具有形成于上述基板上 的工作电极和配极的电极系、以及形成于上述电极系上或其近旁的反应层, 至少上述反应层的表面为多孔质。
2.如权利要求1所述的生物传感器,其特征还在于,上述反应层至少包含 酶和平均直径在0.1μm以上、1μm以下的微粒的凝集体。
3.如权利要求1所述的生物传感器,其特征还在于,上述微粒选自高分子 化合物、陶瓷、玻璃、金刚石以及
4.如权利要求1所述的生物传感器,其特征还在于,上述反应层中还含有 电子传递体。
5.如权利要求1所述的生物传感器,其特征还在于,上述反应层的近旁具 有含有电子传递体的层。
6.如权利要求1所述的生物传感器,其特征还在于,上述反应层中含有胆 甾醇化酶及胆甾醇脱氢酶中的至少一种酶、胆甾醇酯酶以及表面活性剂, 上述反应层的近旁具有含有电子传递体的层。

说明书全文

技术领域

发明涉及对血液、尿等生物体样本、食品工业的原料以及制品、果汁等 试样中所含的基质(特定成分)等进行方便、快速、高精度定量的生物传感器

背景技术

已经有人提出不进行试样溶液的稀释或搅拌等操作对生物体样本以及食品 中的特定成分(基质)简单地进行定量的生物传感器的方案。例如,作为专利文 献1的特开平3-2020764号公报中揭示了通过在绝缘性基板上运用丝网印刷等 方法形成电极系,又在此电极系上形成了含有化还原酶和电子传递体(电子 受体)的反应层的生物传感器。
这种生物传感器对试样中的基质浓度的定量如下所述。
首先,将试样溶液滴在生物传感器的反应层上,使反应层溶解,在试样溶 液中的基质与反应层的氧化还原酶之间进行酶反应。伴随酶反应电子传递体 被还原。一定时间后,在传感器的电极上施加电压,该被还原的电子传递体 发生电化学氧化,根据得到的氧化电流值可以对试样溶液中的基质浓度进行 定量。
但是,以往的生物传感器的反应层的形成采用将含有溶性成分的溶液滴 下再干燥的方法,通过该方法成膜较困难。而且,使反应层干燥时,很难保 证表面与内部的干燥状态均一。因而,存在传感器的性能随表面的干燥状态 变化的缺点。为此,反应层中的酶量必须比需定量的试样溶液中的基质量过 剩。此外,由于反应层中的试样量较多,所以存在反应层的溶解时间加长的 缺点。
作为专利文献2的特开2001-208716号公报中揭示了在电极支持体上的含 有电极单元和微球的传感器片。这种传感器使用微球以减少测定所需试样 量,其结果是试样的溶解速度增加。
鉴于以上的以往技术中存在的问题,本发明的目的是提供能够使含有酶的 反应层在少量的试样溶液中迅速溶解,有效地利用酶反应,且应答特性良好 的生物传感器。

发明内容

为解决上述问题,本发明的生物传感器具备电绝缘性基板、具有形成于上 述基板上的工作电极和配极的电极系、以及形成于上述电极系上或其近旁的 反应层,至少上述反应层的表面为多孔质。
为使上述反应层形成为多孔质,上述反应层最好至少由酶和平均直径在0.1 μm以上、1μm以下的微粒的凝集体构成。
当然,上述反应层也可以全部为多孔质。
上述反应层的空隙率较好是在50%以上,其上限最好在90%左右。
上述微粒最好选自高分子化合物、陶瓷、玻璃、金刚石及
上述反应层中最好还含有电子传递体。
上述反应层的近旁最好设置含有电子传递体的层。
此外,上述反应层中最好含有胆甾醇氧化酶及胆甾醇脱氢酶中的至少一种 酶、胆甾醇酯酶以及表面活性剂,上述反应层的近旁最好具有含有电子传递 体的层。
附图说明
图1为本发明的实施例之一的生物传感器除去了反应层的分解立体图。
图2为图1的生物传感器的纵截面简图。
图3为实施例1、2以及比较例1的传感器的应答特性比较图。
图4为实施例1形成的反应层的光学显微镜照片。
图5为实施例5与比较例3的传感器的应答特性比较图。
图中符号说明:
1为基板,2和3为导电片,4为工作电极,5为配极,6为电绝缘层,7 为反应层,8为隔板,9为盖板,10为狭缝,11为空气孔。

具体实施方式

本发明的生物传感器的特征是,具备形成于电极系上或其近旁的反应层, 该电极系具有形成于上述基板上的工作电极和配极,至少上述反应层的表面 为多孔质。
为使上述反应层形成为多孔质,上述反应层最好至少由酶和平均直径在0.1 μm以上、1μm以下的微粒的凝集体构成。
当然,上述反应层也可以全部为多孔质。
所用微粒最好选自高分子化合物,二氧化、氧化、氧化等陶瓷,玻 璃,金刚石及碳。
为了形成本发明的至少表面为多孔质的反应层,一般将上述微粒分散在反 应层形成用溶液中,最好是将上述微粒分散在含有酶的水溶液中,将所得分 散液铺展在基板的电极系上或其近旁,并干燥。
这时,如果微粒的平均粒径在1μm以上,则微粒在反应层形成溶液中的 分散不佳,通常需要搅拌,使制造工艺变得复杂。而且,用微粒分散不均一 的溶液形成反应层时,反应层不均一,得不到多孔质的反应层。这种情况下, 在生物传感器的使用时,所得反应层无法整体迅速溶解,应答特性会变差。
此外,如果微粒的平均粒径小于0.1μm,则所得反应层中的微粒间的间隙 狭窄,反应层的多孔质特性低下,不能起到增加酶的表面积的作用。
针对这些问题,本发明使用平均直径在0.1μm以上、1μm以下的微粒, 使反应层中形成细小的空隙,籍此获得多孔质的反应层。这样,供给传感器 的试样溶液可以在溶解反应层中的酶的同时迅速渗透。其结果是,反应层迅 速地溶解在试样溶液中,酶反应迅速进行。由此,应答特性没有差异,能够 进行高精度的测定。
为了在微粒表面形成较薄的酶层,反应层中所含的微粒量以反应层的体积 比计较好为10~99%,这样可形成易溶于试样溶液的多孔质反应层,更好的 是10~20%。
本发明中使用的酶包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸 脱氢酶、果糖氧化酶、胆甾醇氧化酶、胆甾醇脱氢酶、胆甾醇酯酶、变旋酶、 蔗糖酶、抗坏血酸氧化酶、醇氧化酶等。可以使用其中的1种也可2种以上 混合使用。
本发明的生物传感器的反应层中也可以不含上述电子传递体。这里的电子 传递体包括氰化物盐、对苯醌及其衍生物、吩嗪甲基硫酸酯、亚甲蓝、二 茂(合)铁及其衍生物。这些电子传递体可使用其中的1种也可2种以上并用。 反应层中不含上述电子传递体时,利用试样溶液中的酶和过氧化氢可以进行 基质的定量。
电子传递体在与酶混合形成反应层时,会使保存过程中的酶的活性受损, 因此与酶分离的层中最好含有电子传递体。胆甾醇传感器中作为酶使用胆甾 醇氧化酶及胆甾醇脱氢酶中的至少一种,还使用使胆甾醇酯转化为游离型胆 甾醇的胆甾醇酯酶及表面活性剂。这种传感器中,最好在与酶分离的层中含 有上述酶等。
溶解酶和电子传递体,配制反应层形成液的溶剂为水、磷酸缓冲液、三羟 甲基基甲烷缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液、乙酸缓冲液、氯化钠水溶液等各 种水溶液,以及选自甲醇、乙醇甲苯、丙有机溶剂的1种或2种以上 的混合溶液。上述反应层形成液中加入的微粒量以体积浓度计最好为5~20%。
本发明的生物传感器的反应层中除了上述酶类和电子传递体之外,还可含 有亲水性高分子。通过在反应层中添加亲水性高分子,可以防止反应层从基 板或电极系表面的剥离。此外,还有防止反应层表面割裂和提高生物传感器 的可靠性的作用。也可在电极系上被覆亲水性高分子,其效果与上述相同。
上述亲水性高分子包括羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲 基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、聚乙烯吡 咯烷酮、聚乙烯醇、聚赖氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明胶及其衍生物、 丙烯酸聚合物或其衍生物、来酸酐的聚合物或其盐、淀粉及其衍生物等。 特别好的是羧甲基纤维素
氧化电流的测定方法包括只有测定极与配极的二电极方式,还加入了参 考电极的三电极方式。其中,三电极方式更能够进行精确的测定。
以下,参考附图对本发明的生物传感器的较好的实施方式进行说明。
图1为本发明实施方式之一的生物传感器除去了反应层的分解立体图。
1表示聚对苯二甲酸乙二醇酯形成电绝缘性基板。利用丝网印刷法在该基 板1上涂布糊,形成导电片2和3。然后,利用同样的印刷方法在该基板1 上由含有树脂粘合剂导电性碳糊形成包含工作电极4和配极5的电极系, 以及由电绝缘糊形成电绝缘层6。电绝缘层6覆盖部分导电片,工作电极4和 配极5的露出部分面积一定。
上述的导电片与电极的材料,除了银和碳以外,还可使用白金、金及钯。
该生物传感器由聚对苯二甲酸乙二醇酯形成的绝缘性基板1、盖板9以及 夹在基板1与盖板9之间的隔板8组成。图1中的点划线表示它们各自的位 置关系。隔板8中形成作为试样供给通路的狭缝10,盖板9中形成有空气孔 11。基板1与盖板9及隔板8如图1所示相连,在基板1与盖板9间形成试 样供给空间部分。此空间部分的狭缝10的开放端为试样供给口,终端部分为 空气孔11。盖板9与隔板8的一起构成盖板构件,但作为相当于隔板8的狭 缝10设计的沟槽也可作为一种盖板构件。
如图1所示,形成了电极系的绝缘性基板1上或盖板侧的狭缝内形成了至 少含有酶、电子传递体和微粒物质的1个或多个反应层7,其状态如图2所示。 反应层不一定必须形成于电极系上,也可以形成于试样供给通路内的露出部 分,只要是可使试样溶液溶解反应层并到达电极系上的结构即可。
以下,通过实施例对本发明进行具体说明,但本发明并不仅限于此。
实施例1
在图1的基板1的电极系上滴下含有聚苯乙烯制平均直径0.5μm的微粒、 铁氰化及葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4、GOD)的水溶液,在50℃的温干燥机 中干燥10分钟形成反应层7。制得的反应层7中所含的微粒物质量为每平方 厘米1mg,铁氰化钾量为1mg,GOD量为0.05mg。
接着,在此基板上组装隔板和盖板,组成传感器,并进行葡萄糖传感器的 特性评估。
将含有葡萄糖的试样溶液供给反应层7后,试样溶液中的葡萄糖被GOD 氧化。与此同时,反应层中的电子传递体被还原。供给试样溶液一段时间后, 相对于配极5在工作电极4上施加0.5V的电压,氧化电子传递体的还原体。5 秒后测定工作电极与配极间通过的电流值。此电流值与还原的电子传递体的 浓度,即试样溶液中的基质浓度成比例,通过测定电流值可以测定试样溶液 中的葡萄糖浓度。
准备0、180、360、540mg/dL浓度的葡萄糖试样,在测定时间为30秒时 测定各自对应的传感器应答电流值,结果发现应答电流值与葡萄糖浓度之间 有一定的相关性,呈现良好的直线性。测定时间为10秒时,应答电流值与葡 萄糖浓度显现出良好的直线性。图3示出了测定时间为10秒时的应答特性与 实施例2及比较例1的特性。
此外,用光学显微镜观察以上形成的反应层7是否至少表面为多孔质。在 42.5倍率下拍摄的照片示于图4,如图4所示,反应层7的表面为多孔质。
反应层的空隙率为所含成分的重量与比重算得的上述所含成分的体积与干 燥后的反应层的体积的比值。上述反应层的空隙率约为79.5%。
实施例2
配制含有铁氰化钾的水溶液,将它滴在图1的基板1的电极系上,干燥后 形成第1层。此第1层中所含的铁氰化钾量为每平方厘米1mg。
配制含GOD和同实施例1一样的聚合物微粒的水溶液,将此溶液滴在上 述第1层上,在50℃的温风干燥机中干燥10分钟形成第2层。制得的第2层 中所含的聚合物微粒量为每平方厘米1.0mg,GOD量为每平方厘米0.1mg。由 此上述第1层和第2层形成反应层7。
通过与实施例1同样的方法测定对应于葡萄糖标准液的传感器应答电流 值,测定时间为30秒和10秒时的应答电流值与葡萄糖浓度呈良好的直线性。 上述反应层的空隙率约为79%。
比较例1
在图1的基板1的电极系上滴下含有铁氰化钾及GOD的水溶液,在50℃ 的温风干燥机中干燥10分钟形成反应层。该反应层中所含的铁氰化钾量为每 平方厘米1mg,GOD量为0.05mg。
通过与实施例1同样的方法测定对应于葡萄糖标准液的传感器应答电流 值,测定时间为30秒时,应答电流值与葡萄糖浓度呈良好的直线性,但测定 时间为10秒时,应答电流值与葡萄糖浓度的关系在高浓度区域未呈直线性。
实施例3
配制含有非晶硅制平均直径0.3μm的微粒、铁氰化钾和GOD的水溶液, 通过与实施例1同样的方法,用此水溶液在图1的基板1的电极系上形成反 应层7。制得的反应层7中所含的微粒量为每平方厘米1.5mg,铁氰化钾量为 1mg,GOD量为0.05mg。
通过与实施例1同样的方法,测定对应于葡萄糖标准液的传感器应答电流 值,测定时间为30和10秒时,应答电流值与葡萄糖浓度均呈良好的直线性, 上述空隙率约为74.5%。
实施例4
配制含有铁氰化钾的水溶液,将它滴在图1的基板1的电极系上,干燥后 形成第1层。此第1层中所含的铁氰化钾量为每平方厘米1mg。
然后,配制含GOD和同实施例3一样的非晶硅制微粒的水溶液,将此溶 液滴在上述第1层上,在50℃的温风干燥机中干燥10分钟形成第2层。制得 的第2层中所含的聚合物微粒量是1平方厘米的反应层中含有1.5mg,GOD 量为1平方厘米的反应层中含有0.1mg。上述第1层和第2层形成反应层7。
通过与实施例1同样的方法测定对应于葡萄糖标准液的传感器应答电流 值,测定时间为30秒和10秒时,应答电流值均与葡萄糖浓度呈良好的直线 性。上述反应层的空隙率约为74%。
比较例2
配制含有铁氰化钾的水溶液,将它滴在图1的基板1的电极系上,干燥后 形成第1层。此第1层中所含有的铁氰化钾量为每平方厘米1mg。
然后,配制含GOD和平均直径1.5μm的非晶硅制微粒的水溶液。但是, 该水溶液中出现微粒迅速沉淀的现象,需要在滴加过程中进行搅拌。将此水 溶液滴在第1层上,在50℃的温风干燥机中干燥10分钟形成第2层。即,上 述第1层和第2层形成反应层7。制得的第2层中所含的聚合物微粒量是1平 方厘米反应层中含有1.3mg,每个传感器(每个单元)中的含量出现差异。因此, GOD量也出现差异,平均1平方厘米的反应层中含有0.1mg。
与实施例1同样的方法测定葡萄糖标准液对应的应答电流值,测定时间为 30秒、10秒时的应答电流值均与葡萄糖浓度呈良好的线性。但多个传感器对 应于同一浓度的葡萄糖标准液的应答值的测定结果的差异增大。
实施例5
与实施例2一样,形成含有铁氰化钾的第1层。
配制含有胆甾醇酯酶、胆甾醇氧化酶、非晶硅制平均直径0.5μm的微粒 及作为表面活性剂的Triton X-100的水溶液,将它滴在上述第1层上,在50 ℃的温风干燥机中干燥10分钟形成第2层。即,上述第1层和第2层形成反 应层7。上述第2层中所含的酶量为1平方厘米反应层中含有0.10mg的胆甾 醇氧化酶和0.05mg的胆甾醇酯酶,所含微粒量为1平方厘米反应层中含有 1mg,所含Triton X-100量为1平方厘米反应层中含有0.04mg。
采用与葡萄糖传感器同样的方法制作胆甾醇传感器,测定含有胆甾醇的试 样溶液的传感器应答电流值,测定时间为3分钟时的应答电流值与胆甾醇浓 度呈良好的直线性。测定时间为1分钟时的应答电流值与胆甾醇浓度同样呈 现良好的直线性。
图5示出了测定时间为10秒时的应答特性以及比较例3的特性。上述反 应层的空隙率约为74.5%。
比较例3
在图1的基板1的电极系上滴下含有铁氰化钾、胆甾醇氧化酶和胆甾醇酯 酶的混合水溶液,在50℃的温风干燥机中干燥10分钟形成反应层7。制得的 反应层7中所含的铁氰化钾量为1平方厘米反应层中含有1mg,胆甾醇氧化 酶的含量为0.1mg,胆甾醇酯酶的含量为0.05mg。
然后,通过与实施例3同样的方法测定传感器的应答电流值。其结果是, 测定时间为1分钟和3分钟时均未呈现良好的应答直线性。
比较例4
与实施例3一样,形成含有铁氰化钾的第1层。
配制含有胆甾醇酯酶、胆甾醇氧化酶、非晶硅制平均直径1.5μm的微粒 和作为表面活性剂的Triton X-100的水溶液,将它滴在上述第1层上,在50 ℃的温风干燥机中干燥10分钟,形成第2层。上述第1层和第2层形成反应 层7。但是,此水溶液中的微粒出现迅速沉淀的现象,需要在滴加过程中经常 搅拌。反应层中所含的酶量为1平方厘米含有0.10mg的胆甾醇氧化酶、0.05mg 的胆甾醇酯酶、0.5~1.5mg的微粒、1.0mg的Triton X-100。
通过与实施例3同样的方法测定传感器的应答电流值。其结果是,测定时 间为1分钟和3分钟时均没有呈现良好的应答直线性。这是由于形成反应层 时所用的溶液中的微粒很难均一分散,制作传感器时的反应层中的微粒量不 确定,导致了评估传感器应答特性时的应答值的差异较大。
实施例6
在图1的基板上的白金制电极系上滴下含有胆甾醇氧化酶(GOD)和聚乙烯 制平均直径0.8μm的微粒(空心颗粒)的水溶液,形成反应层7。制得的反应层 7中所含的GOD量为1平方厘米0.03mg,微粒物质量为1平方厘米1.5mg。
将含有葡萄糖的试样溶液供给该电极系,试样溶液中的葡萄糖被GOD氧 化生成过氧化氢。供给试样溶液10秒后,对应于配极5在工作电极4上施加 1.0V的电压,5秒后测定电流值。此电流值与试样溶液中的基质浓度成比例, 通过测定电流值,可以求得试样溶液中的葡萄糖浓度。
准备0、180、360、540mg/dL浓度的葡萄糖试样,在测定时间为30秒时 测定各自对应的应答电流值,结果显示应答电流值与葡萄糖浓度之间有一定 的相关性,呈现良好的直线性。测定时间为10秒时,应答电流值与葡萄糖浓 度呈良好的直线性。上述反应层的空隙率约为84.7%。
在反应层中未混合微粒的情况下,在基质的高浓度区域失去了应答直线 性,这是由于反应层为致密结构,且经过干燥,因此在向传感器供给试样溶 液时,只有表面溶解并发生反应。
另一方面,混合微粒而制得的反应层与未混合微粒而制得的反应层相比, 前者是酶和电子传递体在微粒表面呈薄膜状干燥的结构。此外,试液溶液非 常迅速地通过微粒间隙进入到反应层中,使含有酶的试样顺利溶解,快速发 生酶反应。其结果是,缩短了传感器的测定时间。
这种情况下,如果反应层中含有的微粒的平均直径不足0.1μm,则含有微 粒的反应层的结构变得非常细微,不能在微粒间形成空隙,这样反应层就不 能顺利地溶入试样溶液中。如果微粒的平均直径在1μm以上,则反应层形成 液中的微粒发生沉淀,或在上部凝固,使制造工艺变得复杂。
因此,微粒的平均直径应该在0.1μm~1.0μm的范围内。通过形成含有 上述微粒的反应层,即使使用血液等含有大量血细胞和蛋白质等成分的试样, 也能得到很好的传感器应答性。
以上的实施例中,对葡萄糖传感器以及胆甾醇传感器进行了说明,但使用 了其他酶的葡萄糖传感器或胆甾醇传感器及乳酸传感器、果糖传感器、蔗糖 传感器、乙醇传感器、抗坏血酸传感器等各种传感器也适用本发明。
如上所述,本发明提供了能够以高精度快速、方便地对血液和尿样等生物 试样、食品工业的原料和制品等试样中所含的基质进行定量的生物传感器。
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