本发明涉及可对试样中的特定成分简便地进行迅速而高精度的定量的生物传 感器。

迄今为止，作为无需将试液稀释、搅拌等即可对试样中的特定成分进行简易 定量的方式，已有各种各样生物传感器的方案提出。其中一例是日本专利公开公 报1990年第062952号公开的下述传感器。

即，用网板印刷等方法在绝缘性基板上形成由工作电极、对应电极和参比电 极组成的电极系，然后在该电极系上紧接着电极系，形成含亲水性高分子、氧化 还原酶和电子受体的酶反应层。可根据需要，在该酶反应层中添加缓冲剂。

当在如此制得的生物传感器的酶反应层上滴加含底物的试液时，由于酶反应 层溶解试液中，酶与底物反应，电子受体随之还原。酶反应结束后，将还原的电 子受体电化学氧化，可从此时得到的氧化电流值对试液中的底物浓度进行定量。

由于上述生物传感器可选择以测定对象为底物的酶，因此在原理上可适用于 各种物质的测定。酶以蛋白质为主要成分，在加至传感器之前，往往进行纯化处 理。根据该纯化过程的条件，有时会出现作为酶的构成要素和活性中心的金属离 子脱落，酶的立体结构发生变化的情况。其结果，酶的底物特异性出现变化或活 性下降。

此外，在贮存传感器期间，有时也会出现吸收周围空气中的水分而变性的情 况。因此，反应层含有的酶的量必须预计到上述变性的酶的量。

另一方面，若酶反应依赖于反应层中酶的量，则所得应答电流值变得不与底 物浓度成比例。因此，反应层中必须含有可与试液中的底物充分反应的量的酶。

如上所述，在制作传感器时，反应层必须含有比试样中预期含有的底物的量 多相当多的量的酶。因此，每个传感器需要相当量的酶，传感器的单价变得非常 高。

本发明的目的在于，通过最大限度地发挥传感器中酶的活性，消减每个传感 器的酶加载量而提供一种廉价且贮存稳定性高的生物传感器。

本发明提供这样一种生物传感器它具有绝缘性基板、在上述基板上形成的 至少包括工作电极和对应电极的电极系、在上述电极系上或其近旁形成的至少含 酶和电子介质的反应层、以及在上述反应层中或在反应层近旁、与反应层隔离而 设置的2价金属的水溶性盐。

本发明的优选的生物传感器具有电绝缘性基板、在上述基板上形成的至少包 括工作电极和对应电极的电极系、与上述基板相组合的、在与基板之间形成向上 述电极系供给试液的试液供给通路的盖件、在上述电极系上或其近旁形成的至少 含酶和电子介质的反应层、以及在上述反应层中或在与上述试液供给通路的上述 反应层隔离的地方设置的2价金属的水溶性盐。

在本发明的优选的生物传感器中，上述金属盐与反应层隔离。

图1是本发明的一个实施例中除去了反应层的生物传感器的平面示意图。

图2是本发明的另一实施例中除去了反应层和2价金属的水溶性盐的生物传 感器的分解立体图。

图3是将同一生物传感器的盖板与隔板重合的盖件的立体图，与图2成上下倒 置关系。

图4是同一生物传感器主要部分的垂直剖视图。

图5是本发明的一个实施例中生物传感器对于标准试液的应答特性图。

图6是本发明的另一实施例中生物传感器对于标准试液的应答特性图。

图7是本发明的又一实施例中生物传感器对于标准试液的应答特性图。

如上所述，本发明的生物传感器在反应层中或其近旁具有2价金属的水溶性 盐。当将血液等试液加至传感器中时，若试液供给通路上存在金属盐，则试液在 将上述金属盐溶解的同时导入反应层中。当反应层含金属盐时，试液在到达反应 层后，金属盐即溶解在试液中。溶解的金属盐离解，生成2价金属离子。该金属 离子被在纯化或长时间的贮存过程中金属离子脱落的酶吸收。其结果，出现酶的 立体结构再构筑或活性恢复等情况。由此，由于可促进反应层中含有的酶的活 性，使传感器的酶加载量减至最小，因此，可制造廉价的传感器。

此类金属盐最好是选自钙盐、镉盐、锰盐、镁盐和锶盐中的至少一种。这些 盐最好是上述金属的氯化物、硝酸盐或硫酸盐。

由于上述金属盐而结构或活性恢复的酶的例子有脱氢酶和氧化酶。脱氢酶 中，尤其是葡萄糖脱氢酶在添加2价金属离子(尤其是钙离子)时，酶的活性提 高，可得到特别良好的应答特性。葡萄糖氧化酶是较合适的氧化酶。

上述金属盐中许多是吸湿性的。由于将吸湿性的金属盐加载在反应层中或反 应层表面后，在传感器贮存期间，金属盐吸收空气中的水分而溶解，因此，有时 会出现反应层的一部分溶解的情况。其结果，反应层所含的酶呈不稳定的状态， 引起变性等活性劣化。因此，在这种情况下，最好将金属盐与反应层隔离设置。 通过将金属盐与反应层隔离设置，可提高传感器在有水分的气氛中的稳定性。另 一方面，在无需考虑水分的气氛中贮存传感器的情况下，例如在用铝层压膜之类 的气密性薄膜包装传感器时，也可将金属盐加载在反应层中。如上所述，是在反 应层还是在与反应层隔离的地方或在上述两处设置金属盐，最好根据贮存气氛决 定。

此外，供给试液时，由于上述金属盐容易溶解，最好将金属盐以加载在亲水 性高分子中的状态设置在传感器内。作为所述亲水性高分子的例子，羧甲基纤维 素由于水溶性非常大而在这方面是较理想的。此外，羟乙基纤维素、羟丙基纤维 素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、聚乙烯 基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚赖氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明胶及其衍生物、 丙烯酸及其盐、甲基丙烯酸及其盐、淀粉及其衍生物、马来酸酐及其盐、琼脂糖 凝胶及其衍生物也是合适的亲水性高分子。

在本发明中，2价金属的水溶性盐的量在该盐溶解在供给至传感器的试液中 时，2价金属的浓度最好在0.01-2mg/ml之间。上述浓度的下限值是金属(例 如钙)结合到酶上所需的最低限度的浓度。此外，若浓度超过2mg/ml，则试液 注入传感器时，反应层不能迅速地溶解在试液中。

本发明的传感器尤其适用于血液中底物的定量。在此类传感器中，加载在反 应层单位面积(1mm2)上的酶量为1-50μg/mm2。因此，以反应层的单位面积 计，2价金属的水溶性盐的量为0.003-0.6μg/mm2。

另一方面，如下面的实施例所示，在试液量约为3μl的传感器中，传感器每个 触点必需的酶量为0.01-0.5mg/触点。因此，传感器每个触点使用的2价金属的 水溶性盐为0.03-6μg。

在本发明中，反应层含有电子介质。合适的电子介质可以是选自铁氰化物离 子、对苯醌及其衍生物、N-甲基吩嗪(硫酸单甲酯)盐、亚甲蓝、二茂铁及其 衍生物中的至少一种。

还有，除上述酶和电子介质之外，也可使反应层含有亲水性高分子。通过在 反应层中添加亲水性高分子，可防止反应层从电极系表面剥离。而且，亲水性高 分子还具有防止反应层表面龟裂的效果，可有效地提高生物传感器的信赖性。

所述亲水性高分子的合适例子有羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维 素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、聚乙烯 基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚赖氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明胶及其衍生物、 丙烯酸及其盐、甲基丙烯酸及其盐、淀粉及其衍生物、马来酸酐及其盐、琼脂糖 凝胶及其衍生物。

氧化电流的测定方式有仅工作电极和对应电极的二极电极方式、加入了参比 电极的三极方式，三极方式可更正确地进行测定。

下面结合具体的实施例对本发明作更详细的说明。

图1是本发明的除去了反应层的生物传感器的平面示意图。在由聚对苯二甲 酸乙二醇酯制成的电绝缘性基板1上，用网板印刷法印刷银膏，形成导线2、3。 然后，将含树脂粘合剂的碳膏印刷在基板1上，形成工作电极4。该工作电极4 与导线2接触。再在该基板1上印刷绝缘性膏，形成绝缘层6。绝缘层6覆盖工 作电极4的外围部分，由此使工作电极4露出部分的面积保持恒定。并且，将含 树脂粘合剂的碳膏印刷在基板1上时，使其与导线3接触，形成环形的对应电极 5。在由电极4和5组成的电极系上形成反应层。然后，在该反应层和与该反应 层隔离的地方中的至少一处设置2价金属的水溶性盐10。

图2是除去了反应层和2价金属的水溶性盐的生物传感器的分解立体图。按图 2中用点划线表示的位置关系安装绝缘性基板1和具有空气孔11的盖板9和隔板 8，制作生物传感器。在隔板8的狭缝13的部分，夹在基板1和盖板9之间，形 成试液供给通路。12是试液供给通路的开口部分。

图3是将隔板8和盖板9重合的盖件的立体图，与图2成上下倒置关系。14 是构成该试液供给通路的空间部分露出的面中盖板侧的面。也可在该盖件的露出 在试液供给通路上的面上设置反应层和/或盐10。

图4是本发明的生物传感器的主要部分的垂直剖视图。在按图1所示形成了电 极系的电绝缘性的基板1上形成含酶和电子介质的反应层7，在该反应层7与试 液供给通路的开口部分12之间，与反应层7隔离，加载2价金属的水溶性盐10。

实施例1

在按图1所示形成了电极系的基板1上滴加吡咯并喹啉醌-葡萄糖脱氢酶(以 下简称GDH)和铁氰化钾的混合水溶液5μl，干燥后形成反应层7。该反应层7 呈直径3.6mm的圆形，其大小基本可覆盖电极4和5。将氯化钙5mg溶解在羧 甲基纤维素水溶液(浓度0.5％)10ml中，制成溶液。将该溶液5μl滴加在基板 上10所示位置上，在50℃的温风干燥器中干燥10分钟，将2价金属的水溶性盐 10加载在基板1上。

按图2中点划线所示位置关系，将盖板9和隔板8接合在上述基板1上，制成 生物传感器。

配制葡萄糖浓度为0、200、400、600和1000mg/dl的溶液作为葡萄糖标准 液，将其从试液供给通路的开口部分12供给至传感器。并且，供给试液1分钟 后，以对应电极5作为基准，将+0.5V脉冲电压施加在工作电极4上，5秒钟后， 测定工作电极和对应电极之间流动的电流值，由此测得传感器的应答特性。其结 果见图5。

如图5所示，所得应答电流值大，且应答电流值与葡萄糖浓度的相关性具有 优异的直线关系。

此外，将制得的生物传感器在湿度20％的气氛中贮存6个月之后，用同样方 法测定传感器的应答特性。结果见图5。

如图5所示，贮存后的生物传感器的应答特性与生物传感器刚制成后的应答 特性基本无变化。 比较例1

除不将2价金属的水溶性盐加载在传感器内之外，按与实施例1同样的方法制 得传感器。并且，与实施例1同样，测定刚制成后和在20％的湿度下贮存6个 月后的生物传感器的应答特性。结果见图5。

如图5所示，所得应答电流值下降至实施例1中制得的生物传感器的约60％。 此外，贮存6个月后的生物传感器的应答电流值比刚制成后也下降许多，应答电 流值与葡萄糖浓度的相关性也显著下降。

实施例2

除滴加GDH、铁氰化钾和氯化钙的混合水溶液，干燥后形成反应层，以及不 单独将2价金属的水溶性盐加载在传感器内之外，按与实施例1同样的方法制得 生物传感器。并且，按与实施例1同样的方法测定刚制成后和在20％的湿度下 贮存6个月后的传感器的应答特性。结果见图5。

如图5所示，贮存6个月后的生物传感器的应答电流值下降至刚制成后的约 85％，应答电流值与葡萄糖浓度的相关性也略有下降。

实施例3

除酶乃使用葡萄糖氧化酶(以下简称GOX)之外，按与实施例1同样的方法 制得生物传感器。并且，按与实施例1同样的方法测定刚制成后和在20％的湿 度下贮存6个月后的传感器的应答特性。结果见图6。

如图6所示，本实施例的生物传感器具有优异的应答特性和保藏性。 比较例2

除不将2价金属的水溶性盐加载在传感器内之外，按与实施例3同样的方法制 得生物传感器。并且，按与实施例3同样的方法测定刚制成后和在20％的湿度 下贮存6个月后的传感器的应答特性。结果见图6。

如图6所示，所得应答电流值下降至实施例3制得的生物传感器的约60％。 此外，贮存6个月后的生物传感器的应答电流值也比刚制成后下降许多，应答电 流值与葡萄糖浓度的相关性也显著下降。

实施例4

除滴加GOX、铁氰化钾和氯化钙的混合水溶液，干燥后形成反应层，以及不 单独将2价金属的水溶性盐加载在传感器内之外，按与实施例3同样的方法制得 生物传感器。并且，按与实施例1同样的方法测定刚制成后和在20％的湿度下 贮存6个月后的传感器的应答特性。结果见图6。

如图6所示，贮存6个月后的生物传感器的应答电流值下降至刚制成后的约 90％，应答电流值与葡萄糖浓度的相关性也略有下降。

实施例5

除酶乃使用果糖氧化酶(以下简称FDH)之外，按与实施例1同样的方法制 得生物传感器。并且，除使用果糖作为标准试液之外，按与实施例1同样的方法 测定刚制成后和在20％的湿度下贮存6个月后的传感器的应答特性。结果见图 7。

如图7所示，所得生物传感器具有优异的应答特性和保藏性。 比较例3

除不将2价金属的水溶性盐加载在传感器内之外，按与实施例5同样的方法制 得生物传感器。并且，按与实施例5同样的方法测定刚制成后和在20％的湿度 下贮存6个月后的传感器的应答特性。结果见图7。

如图7所示，所得应答电流值下降至实施例5制得的生物传感器的约65％。 此外，贮存6个月后的生物传感器的应答电流值也比刚制成后下降许多，应答电 流值与葡萄糖浓度的相关性也显著下降。

实施例6

除滴加FDH、铁氰化钾和氯化钙的混合水溶液，干燥后形成反应层，以及不 单独将2价金属的水溶性盐加载在传感器内之外，按与实施例5同样的方法制得 生物传感器。并且，按与实施例1同样的方法测定刚制成后和在20％的湿度下 贮存6个月后的传感器的应答特性。结果见图7。

如图7所示，贮存6个月后的生物传感器的应答电流值下降至刚制成后的约 85％，应答电流值与葡萄糖浓度的相关性也略有下降。