一种螺旋霉素的微生物转化方法
专利汇可以提供一种螺旋霉素的微生物转化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种螺旋霉素的 微 生物 转化方法，其酰化酶的微生物变株具有专一性和较强酰化4″-羟基的酶活性，将底物螺旋霉素加入对数生长期的上述变株培养物中，酰化过程不加任何前体和辅酶。这种微生物转化方法定向性好，反应条件较温和，可避免化学转化带来的劳动保护与环境污染问题。由于用螺旋霉素粗品即可转化，转化率可达75%以上，酶源丰富，故适于工业化生产。，下面是一种螺旋霉素的微生物转化方法专利的具体信息内容。
1、一种螺旋霉素微生物转化的方法，该方法包括的步骤是：
(1)、酰化反应所用底物为螺旋霉素，产生酰化酶的无活性变株68T100(即Streptomyces myarofaciens var ys-col)(该菌株的保藏号为CGM CC No.0128)作酶源；
(2)培养条件和方法：培养基组份为淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、(NH4)2So4、酵母粉、CaCo2、磷酸盐和MgSo4等作为培养种子和发酵菌株，温度27-29℃，pH自然pH，其过程是：斜面→种子→发酵，到对数生长期加入螺旋霉素进行酰化反应；
(3)、酰化反应到一定时期分离酰化产物作薄层定性和定量和鉴别；
其特征是：(a)、产生酰化酶较强的无活性变株，此菌株能定向酰化螺旋霉素4″-位羟基，而不涉及其它羟基；
(b)、采用一般发酵方法进行培养，不需要加任何前体和辅酶，只加底物螺旋霉素，即可定向转化成4″-位丙酰螺旋霉素单一组份；
(c)、发酵培养基：淀粉1～3%、葡萄糖1～3%、(NH4)2SO40.1～0.5%、酵母粉0.3～0.8%、黄豆饼粉0.5～2.0%、K2HPO40.05%、MgSO40.02%、CaCO20.3～0.8%组成自然PH；
(d)、酰化条件：在发酵过程中，俟菌种生长到对数生长期将螺旋霉素溶后加入发酵液进行动态酰化，条件是温度为27-29℃，PH6～6.5时间48～72小时；
(e)、产物分离：用一般溶媒法分离丙酰螺旋霉素，通过硅酸柱层析进行纯化，得到纯4″-O-螺旋霉素。
本发明涉及生物技术的一种微生物酶的转化方法。
临床使用的螺旋霉素属于16-员大环内酯抗生素，其化学结构式为：
改变螺旋素的化学结构，可以改善其疗效和毒性，例如用化学方法进行酰化反应将螺旋霉素改造成乙酰螺旋霉素，它的体内外活性及临床疗效优于螺旋霉素，毒性有所降低，现已广泛用于临床。化学改造的丙酰螺旋霉素和其它酰基螺旋霉素已有文献报导，但它们存在一定缺点，如酰化反应定向性差，当进行4″-位羟基酰化时，碳霉糖胺的2′-位羟基也同时被酰化，虽经甲醇解可除去2′-位上的酰基，但其中仍含有双酰基衍生物，以致影响了质量（1）。但是，用微生物方法改造转化螺旋霉素为酰基螺旋霉素的，目前只见日本专利（52-82790）报导，它是通过筛选获得菌株，使螺旋霉素4″-位羟基酰化为酰基螺旋霉素，其酰化产物的活性与原螺旋霉素差别不大，而酰化反应必须加进相应的酰基辅酶A。目前尚未见有生产的报导。
本发明是，首先有目的地挑选可能具有专性和较酰化4″-羟基的酶的微生物;其次要求该微生物必须是无抗菌活性的变株。根据这个原则，考虑了与螺旋霉素同 族的麦迪霉素，它的碳霉糖上的4-碳的羟基酰化反应是在发酵过程中进行。可见，该抗生素的产生菌具有较强的酰化4-位羟基的酶，但是它产生的麦迪霉素影响分离和纯化。因此，选用麦迪霉素产生菌的无活性变株作为筛选对象，即可为生产创造条件。本发明选用的68T100变株为麦迪霉素产生菌68T100（即Streptomyces myarofaciens var ys-col-，CGMCC No.0128）。68T100变株图1a的获得方法是：以麦迪霉素产生菌1748斜面制成孢子悬液，将适宜浓度的孢子涂布在合成培养基平皿上，在41.5℃高温进行培养，待菌落长出后，移单菌落于含有培养基的钢管内，继续培养8天，再将钢管移于含有八叠球菌的平板上检定抗菌活性，以无活性菌落接种斜面，进行体液复试，如仍不出现抑菌圈，此菌落即为无活性变株。
本发明所用的该菌株已于1987年6月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.0128
本发明的要点是：（1）酰化反应，所用底物为螺旋霉素，采用一般发酵方法，酰化所用微生物为无抗菌活性变株68T100，其形态特征：在麦芽汁-酵母膏斜面上，于28℃培养生长5～7天，气生菌丝和孢子丰富，表面浅紫灰色，栗棕色素，孢子丝呈螺旋形，孢子表面光滑（图1a）;培养菌体和酰化反应条件：菌体培养是将麦芽汁-酵母膏斜面上的菌体，用挖块法接种于发酵培养基上（淀粉1～3%，葡萄糖1～3%，（NH4）2SO40.1～0.5%，酵母粉0.3～0.8%，黄豆饼粉0.5～2.0%，K2HPO40.05%、MgSO40.02%、CaCO30.3～0.8%、自然PH（简称SGYS培养基）、27-29℃）恒温培养48小时、以5%量的种子转入同样培养基，到对数生长期加400-800u/ml作为底物的螺旋霉素，开始进行酰化反应（温度27-29°，PH5.0-7.0），经24-72小时反应终止，用薄层层析和杯碟法（八叠球菌为试验菌）测定酰化产物。（2）酰化产物的分离与鉴别：酰化产物的分离，是将发酵液用NaOH调至PH8.0-8.3，用乙酸丁脂抽提，得粗品，通过硅胶柱层析进行分离纯化，得到较纯的4″-0-丙酰螺旋霉素。然后进行鉴别。
实验结果表明：用生长中细胞进行酰化反应，在薄层层析图谱上出现四个斑点（图2），它们与螺旋霉素和乙酰螺旋霉素对照，均不在同一位置，但与乙酰螺旋霉素接近略偏低，经质谱鉴别为4-0-丙酰螺旋霉素，一般发酵液中转化率为40-50%（按底物加入的量计算所得的丙酰螺旋霉素纯品，并按40公升罐实装量）。酰化产物经硅胶柱层析，所得制品为白色粉末，溶于大多数溶媒，溶点低于螺旋霉素为（122℃-125℃），〔a〕16D-43°，TLCRf值为0.59，甲醇溶液的紫外吸收峰在232nmλMEOMMAX，红外吸收光谱与螺旋霉素及乙酰螺旋霉素区别不大，元素分析c-61.9%，H-8.34%，N-3.17%理论值C-61.6%，H-8.6%，N-3.17%，分子量为954，实验所得分子量数据为954（质谱）。核磁共振谱（13C与1H）和质谱结果见表1及图3、4a、b。
表1.核磁共振中4″-0丙酰螺旋霉素
碳原子的化学位移
Cnpr-SPM-Ⅲ SPM-Ⅲ SPM-r Cnpr-SPM-Ⅲ SPM-Ⅲ SPM-r＊
δ（ppm） δ（ppm） δ（ppm） δ（ppm） δ（ppm） δ（ppm）
C1169.9 169.9 169.9 ′C1104.0 104.4 104.0
C237.5 37.2 37.2 ′C271.8 69.0 69.2
C371.8 71.6 71.7 ′C368.9 68.9 69.2
C477.6 77.6 77.8 ′C475.3 74.8 74.9
C585.1 84.6 84.5 ′C573.0 72.9 73.0
C629.4 28.9 28.9 ′C619.0 19.0 19.0
C730.4 30.1 30.2 ′C741.9 42.0 42.0
C831.8 31.8 31.9 ′C842.0 41.9 42.0
C980.3 79.5 79.7 ′C9
C10126.9 126.4 126.7″C196.2 96.2 96.4
C11135.0 135.0 135.4″C241.0 40.6 41.0
C12132.6 132.0 132.3″C369.3 69.3 69.5
C13132.2 131.6 131.9″C477.1 76.3 76.4
C1440.7 40.9 40.6 ″C563.5 65.9 66.1
C1568.9 68.7 68.9 ″C618.5 18.3 18.3
C1620.4 20.4 20.3 ″C725.9 25.4 25.4
C1742.8 42.4 42.5 ″C8174.0
C18200.6 200.9 201.3 ″C927.5
C1916.1 15.4 15.4 ″C109.2
C20170.0 170.4 170.9
C2127.7 27.6 27.7 C1100.0 100.4 100.3
C229.2 9.0 9.0 ′″C231.3 31.2 31.2
C2362.0 62.3 62.4 ′″C318.8 18.3 18.3
′″C465.2 64.7 64.9
′″C573.8 73.6 73.7
′″C618.7 18.5 18.7
′″C741.2 40.6 41.0
′″C841.2 40.6 41.0
＊见文献资料（2）（3）
表1数据表明：酰化衍生物（即酰基螺旋霉素Ⅲ）与文献报导的（2）（3）螺旋霉素Ⅲ及其酰化衍生物的4″-位碳结合的丙酰基化学位移吻合较好，故可认为酰化衍生物的4″-位碳的羟基被丙酰基取代，即为4″-0-丙酰基螺旋霉素Ⅲ。表1中的9.2ppm，27.5ppm，174.0ppm为丙酰基团，与螺旋霉素Ⅲ比较，4″-位碳从76.2ppm位移到77.1ppm，向低场方向移动0.9ppm，与此同时，5″-位碳从65.9ppm向高场方向移动2.4ppm至63.5ppm。根据上述情况以及质谱碎片峰201m/e，表明丙酰基接于4″-位碳上。通过（图3）1H图谱分析，酰化衍生物的谱峰与它的12C-NMR的结果基本一致。其次，质谱资料（图5a，b）进一步证实，酰化产物为4″-0-丙酰螺旋霉素Ⅲ，质谱中分子离子和碎片离子具有以下结构片断：分子离子为995m/e，碎片（3）（201m/e）表明，在碳霉糖上接有丙酰基，碎片（2）（174m/e）和（4）（318m/e）说明碳霉糖胺上没有接上任何酰基基因，同时根据其它相关的碎片峰，也可说明酰化产物是单丙酰螺旋霉Ⅲ。
综合以上分析结果以及理化数据，证实螺旋素的酰化产物，主要为4″-0-丙酰螺旋素Ⅲ。酰化产物的抗菌谱和实验治疗如表2、表3所示：
表2 酰化产物的抗菌谱
试验菌 MIC Mg/ml
酰化产物 乙酰螺旋霉素 螺旋霉素
乙类链球菌A12 0.39 1.56 0.78
肺炎双球菌3 ＜0.19 ＜0.19 ＜0.19
金黄色葡萄球菌15 3.13 6.25 3.13
福氏痢疾杆菌25 12.50 25.00 12.50
大肠杆菌1515 100.00 100.00 100.00
绿脓杆菌11 ＞100.00 ＞100.00 ＞100.00
麦形杆菌9 ＞100.00 ＞100.00 ＞100.00
表2所得结果说明，酰化产物体外试验对乙类链球菌A12和金黄色葡萄球菌15均比乙酰螺旋霉素抗菌效果好。
表3 酰化产物对肺炎球菌及金黄色葡萄球菌体内活性（ED30）
试验菌 试验样品 半数有效剂量mg/kg
肺炎球菌 酰化产物 3.6
乙酰螺旋霉素 7.5
金黄色葡萄球菌15 酰化产物 128.6
乙酰螺旋霉素 209.1
小鼠口服急性毒性 转化产物的＜D503000mg/kg
表3结果说明，酰化产物对肺炎球菌金黄色葡萄球菌的体内疗效（ED50）也比乙酰螺旋霉素好。
采用本发明的优点和积极效果是：定向酰化螺旋霉素，可保证产品质量;酰化反应进行不加前体和辅酶A，要求条件比较温和;避免化学工业带来的劳动保护和环境污染问题;用螺旋霉素粗品即可转化，而且转化率可达75%以上;发酵和体提炼工艺与一般大环内酯抗生素相似，没有特殊要求;酶源丰富，适于工业生产。
附图：
图1a 无抗菌活性变株68-T100电镜形态，孢子表面光滑、无刺
图1b 1748产生菌电镜形态，孢子表面呈刺状
图2 转化产物的TIC图谱
（1）-螺旋霉素Ⅰ
（2）-螺旋霉素Ⅱ
（3）-螺旋霉素Ⅲ
（4）-丙酰螺旋霉素
（5）-乙酰螺旋霉素
（6）-乙酰螺旋霉素
1-（1）（2）（3）+（5）（6）
2-（5）（6）
3-（1）（2）（3）
4-（1）（2）（3）+（4）
Rf：0.59
紫外扫描半定量测定为75%（转化率）。
图3 4″-0-丙酰螺旋霉素Ⅲ的1HNMR光谱
图4a 4″-0-丙酰螺旋霉素Ⅲ的质谱图谱
图4b 4″-0-丙酰螺旋霉素Ⅲ的质谱裂解方式
参考文献：
[1]高平泛志等（1970）Jap.J.Antibiotics 23.429
[2]Omura S.et al（1975）J.Am.chem.Soc.97，4001-4009
[3]Omura S.et al（1984）J.Antibiotics 37（7）767
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