本发明主要涉及进行聚合酶链式反应（PCR）的系统，更具体地，涉及在DNA或RNA样品上直接进行PCR而不必将样品从原来的细胞结构中分离的方法及设备。

聚合酶链式反应是一种在热稳定的DNA聚合酶（典型的为Taq聚合酶），四种DNA核苷酸碱基和二种或更多种单链DNA引物的存在下，通过热循环一个或多个该DNA（模板DNA）的分子的方法制备极其大量双链DNA片段的忠实拷贝的过程（扩增）。这些引物是长度约20碱基的短片段，其碱基顺序与构成双链模板的两条互补DNA单链的5′末端是互补的。

PCR是一种极其有价值而且应用广泛的技术，并且导致了分子生物学领域的革命。该技术在美国专利No.4，683，195、4，683，202和4，965，188中有详细的公开。直至现在，反应是在小的反应管中于溶液中进行的，其中待扩增的DNA是悬浮着的。用于这种过程的设备公开于美国专利No.5，038，852和1992年4月20日提出的美国专利申请No.07/871，274。

最近发现，有可能应用PCR去扩增细胞内的特异的DNA片段，而不必首先将DNA从细胞中抽提出来。该技术叫原位PCR。细胞可以是单细胞，或部分组织样品。在绝大多数情况下，是在显微镜上的载玻片上的细胞或组织薄切片上进行原位PCR的。细胞或组织通常用福尔马林或其他试剂处理而固定，从而保留其形态，便于处理后识别。

如果被选择的DNA片段是以这样的方式扩增的，那么被扩增 的产物DNA就能被选择性地染色，其后对PCR处理过的细胞显微镜检查就能鉴别出组织样品中含有特定的DNA片段（甚至在细胞内仅局限存在）的那一种细胞（如果存在的话）。如果存在的话使细胞中的扩增DNA变得可见可以通过两种方法中的任一种达到。一种方法是使用互补的单链DNA探针，探针上附着有标记分子。该探针会与扩增样品中特异DNA顺序（如果存在的话）杂交，多余的探针和标记物被洗去。接着留有标记分子的部位通过显影剂处理而变得可见。这种使之可见的技术叫“原位杂交”，或原位扩增DNA的“间接测定”。

另一种使之可见的方法是在PCR过程中，使用包括附着有标记分子的经修饰的DNA核苷酸碱基在内的PCR试剂。许多携带标记分子的经修饰的碱基会通过DNA聚合酶直接掺入扩增产物。接着与前面一样用显影剂处理载玻片，便使扩增DNA的部位置变得可见了。这种技术叫原位扩增DNA的“直接掺入测定”。

在两种方法中，典型地，显影剂包括偶合于某分子的上一种酶，例如碱性磷酸酶，该分子牢固和特异地与扩增DNA或杂交探针上的标记分子结合;以及一种底物，酶可以将其转变成不溶的，强吸收的染料。如果扩增DNA上的标记分子是生物素，那么典型的与酶偶合的结合分子是抗生物素蛋白。如果标记分子是地高辛，那么结合分子是抗一地高辛抗体。两类显影剂都已用于两种原位杂交的间接测定和直接掺入测定。标记分子上的标记物可以是显色性，荧光性或放射性的。

测定原位扩增DNA的两种方法都是非常敏感的，能测到每个细胞中10～几百个扩增DNA片段的拷贝。两种方法都需要在原位PCR热循环结束之后进行某些载玻片的PCR后处理。

完整细胞的原位PCR的热循环方法因细胞来源的不同而有差异。不形成组织的细胞，例如白细胞和多种培养细胞（如HeLa细 胞），并不一定需要特殊的仪器操作来进行原位PCR循环。Hasse等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87，4971-4975（1990），报导，这样的固定细胞的悬浮液可以在正常用于液相PCR的相同反应管中进行热循环，然后，细胞涂布于载玻片上以便测定扩增产物。

然而，更常用是这样的细胞可以在载玻片上进行热循环。它们通过离心涂布于载玻片上，产生所谓的“细胞旋转”（cytospin）制备物。使细胞涂布有助于固定方法及其他前PCR样品处理。这并不需要额外多费功夫，因为否则的话为了使载玻片上的扩增产物变得可见，细胞旋转步骤在随后也是必需的。细胞旋转与载玻片上的组织一样，被扩增。

当待研究的是组织切片中的细胞时，它们必须被直接在表面上扩增，因为否则的话，薄切片将不能显示组织的形态。与这些组织的热循环相关的主要问题在于维持组织形态以及细胞形态，抑制样品上的PCR反应混合物的蒸发，以及获得均一的，重复性高的结果。

为了在玻璃质的显微镜载玻片上固定的细胞或组织样品上进行原位PCR，人们必须使用经处理的载玻片，使得细胞会粘于载玻片上而不会被PCR过程或随后为了使扩增DNA变得可见而进行处理的过程中所用的水溶性试剂冲洗掉或漂浮掉。典型地，用将3-氨基丙基三乙氧基硅烷分子共价结合于其表面的方式处理过硅化载玻片符合要求，或者，使用聚（赖氨酸）或凝胶/铬明矾涂层。

接着，带有待扩增样本的载玻片区域必须用过量的，含有适当浓度的DNA聚合酶，核苷酸，引物和其他成份的PCR试剂覆盖。然后，载玻片和试剂在典型的温度范围，近90℃和68℃之间，有时也可低至37℃，典型地进行10-30次循环，在每个循环中的两个或三个选定的温度的任一处都停留至少一分钟的若干分之一或更长。

为了使原位PCR成功，有几个在热循环中必须达到的重要要求。其一是水从试剂中的蒸发必须几乎被完全防止。在不降低扩增产量或降低特异性的情况下，不超过最适试剂浓度的约5%的变化是可以容忍的。另一个要求是在反应过程中，任何对PCR反应有害的物质不能与试剂接触。还有一点是加热时试剂释放出的气泡或溶解气体不妨碍液体试剂进入到待反应的整个区域。

最后，有关原位PCR的出版物已表明，为了保持高特异的扩增，对反应进行“装配”（assemble）常常是重要的，以便实现“热启动”或其化学等价的启动。在物理热启动中，整了试剂既不经“装配”也不首先与样品DNA接触，直到反应所需的全部成分都处于高温才进行装配和接触。温度必须足够高，使得甚至是引物的部分杂交都不能发生于任何位置（除了在所期望的模板位置），尽管细胞的整个基因组是能与引物非特异地部分杂交。温度也必须高得足以防止。引物分子互相结合，形成可扩增的产物，叫“引物二聚物”。这种可靠的起始温度典型地在68℃～75℃之间，而且通常比PCR中所用的退火温度高10℃左右。

在PCR中能实现“化学热启动”的一种方法是通过在试剂中加入热不稳定成分如单链结合蛋白（SSB），它防止任何由聚合酶产生的延伸，直至反应混合物在第一个PCR循环中被加热到某温度，该温度高得足以防止非特异杂交，同时也破坏了热不稳定SSB组分。另一种实现化学热启动的方法是用尿嘧啶替代dUTP，并在试剂中加入热不稳定的酶UNG（尿嘧啶-N-糖基化酶），它会破坏在第一个PCR循环之前在低温保温时形成的任何的PCR的产物。

还有一种实现化学热启动的方法是在加入到试剂之前将Taq聚合酶与Taq抗体相混合。这样的一种Taq单克隆抗体最近由Kodak  Clinical  Products  Division的John  Findlay博士于1992  San  Diego会议：Genetic  Recognition，十一月  18-20，1992，在题为 “Development  of  PCR  for  In  Vitro  Dignostics”，的论文中宣布。Taq抗体与Taq聚合酶结合并抑制其在常温下发挥其功能。然而，一旦加热受抑制的Taq聚合酶至近95℃，则Taq抗体，一种正常蛋白，即变性了，释放出Taq聚合酶并允许其在PCR过程中正常作用。

这些类型的化学热启动需要在试剂中包含有一种通常是昂贵的组份（如UNG或Taq抗体），而且对于PCR的操作可能会设置一些不合需要的限制，例如在试剂制备好之后在一段相对短暂的时间界限前，其必须被使用或者是较低的扩增效率。因此，如果一切可能的话，通常优选进行物理热启动。

今天使用原位PCR的技术人员常常是用他们在自己的实验室中发展起来的各种不同的方式来达到上述的要求。他们用原位PCR获得的信息常常不能以其他的方式获得，因而他们经历了异乎寻常的烦扰及技术投资来获得信息便显得如此有价值。

如Komminoth等人，在Diagnostic  Molecular  Pathology  1，＃2，85-97（1992）中所教授的那样。一种相当普通的策略是将一个盖玻片盖住待扩增的样品，并用指甲油（nail  polish）或类似的粘附剂封住，对于这样的布置发生渗漏是不足为奇的，因为指甲油不能牢牢地粘附于组织样品。因为所有含试剂的部件都是刚性的，因此在变性温度（典型的为94℃）产生的高压会使指甲油移位。硬的盖玻片如果与细胞接触的话还会破坏脆弱的下面的细胞的形态。这种方法不适于方便的热启动。另一个缺点在于需要在循环之后用氯仿处理装置以溶解指甲油。

这些载玻片通常位于热循环仪器的样品板（block）上，这些循环器并不是明确地为载玻片而设计的。这了获得好的热接触，Komminoth等人在循环器的样品隔间覆盖物和载波片之间使用垫片，以便将载玻片压向样品区。此外，现有的在加热区带有适用于 反应器的小孔的热循环器不能均匀地热接触，对载玻片没有温度的均匀性。

一种相关技术由Chiu等人，J.Histochemistry  and  Cytochemistry  40，＃3，331-341（1992）所揭示，他们在分隔间的载玻片上培养待研究的细胞，并在同一载玻片上对细胞进行原位PCR。在培养之后，去除样品隔墙，但是载玻片以及隔间之间的垫片被保留在载玻片上。为了进行原位PCR，细胞先用含2.5%热琼脂糖的PCR反应混合物覆盖，然后将玻片用Saran包裹纸（wrap）密封地包裹起来。这种方法提供了一种韧性的细胞覆盖物，覆盖物置于防止细胞损伤的垫片上。Saran包裹物提供了蒸发控制手段。整个装置置于样品间的长槽中的注水的Perkin-Elmer  Cetus  DNA热循环仪上，在循环之前，用塑料膜和塑料盖覆盖装置。

Nuovc等人，American  Journal  of  Pathology  139，＃6，1239-1244（1992），用韧性的，热稳定的聚丙烯制得的盖玻片覆盖样品。典型地，盖玻片通过每个角落的一滴指甲油而固定于所期望的组织切片上。载玻片典型地是置于放在Perkin-Elmer  Cetus  DNA热循环仪的样品区上的铝“船”中。该“船”主要起保留矿物油的功能，矿物油随后加入载玻片装置中以防止试剂的蒸发。在用不含Taq  DNA聚合酶的PCR反应混合物覆盖样品之后，样品温度典型地升至约65℃，接着稍提起盖玻片，以便将Taq  DNA聚合酶加入反应混合物从而引发PCR反应。

提升盖玻片的能力使得热启动在原位PCR扩增中的特异性和特异的PCR产物的获得方面表现出重大的改进。在加入酶之后，将预热的矿物油加到盖玻片的顶部和边缘。部分油也通过毛细作用被吸到盖玻片下。它的存在减少了盖玻片下的PCR试剂的液滴的直径，同时也降低了对PCR试剂液滴的精确定位的控制。该方法获得了出色的结果，但是需要一个或多个技术高超的操作人员，而且该 方法繁复，不适于大量的载玻片。

另一种用于热循环和减少蒸发和浓缩问题的方法是将载玻片置于塑料袋中并且在空气炉型的热循环器中进行热循环。例如，Staskus等人，Microbial  Pathogenesis  1991，11，67-76（1991）和Emberto等人，Proc.Natl  Acad，Sci，U.S.A.90，357-361（1993）用盖玻片覆盖组织，然后在将载玻片置于在空气炉型热循环仪中的热可封闭的塑料小袋中之前用矿物油覆盖。空气炉方法避免了水从固定于盖玻片上的样品上蒸发的可能问题，因为整个装置在热循环中大体是等温的。

空气炉法的主要缺点是该系统的差的热传递性能导致很慢的热循环次数。这样的系统也沉淀表现出炉中样品与样品之间的温度均一性差。

总而言而之，没有一种现存的方法揉合了所有所期望的性能，如热均一性好，不用矿物油进行蒸发控制，试剂体积小，保持细胞形态，能热启动和能方便地在水平放置之外热循环大量的载玻片。今天，几乎所有的人将制备好的载玻片放在矿物油中以防热循环过程中水从试剂中蒸发掉。

油层是一个主要的麻烦，因为在热循环之后以及在用测定试剂进一步处理之前必须小心而完全地用额外步骤将其去除。油有时也是那些会抑制PCR的污染物的载体。

在实验工作我们发现，当样品上的水溶试剂的容纳（containment）是通过将塑料盖玻片盖在样品上并在角落或四周用粘附剂粘于载玻片而实现时，表面张力作用和气体的淘析使得液体试剂在循环中四处流动。因此，这些方法常常不是完全可靠的。通常，它们要求载玻片呈水平，从而限制了其在热循环中放置的方式。通过封闭性的粘附剂图在盖玻片周围而将试剂密封于盖玻片下的努力常常失败，因为仅使用粘附剂是不可能或难以做到密不透 风。此外，载玻片表面至少在盖玻片的周边的部分通常为一薄层样品覆盖因此，对载玻片的粘附性差。

因此，很需要一种新且改良的用于操作原位PCR的完善的样品容纳装置。也需要一套装置，它能为样品提供对试剂合适的物理容量，以物理式地保护，该装置能防止热循环过程中试剂和样品的蒸发。也需要一种装置，它不必使用油，也不使用粘附剂，而且也不需要载玻片在热循环过程中保持水平。

下面将阐述的本发明符合上述要求。根据本发明的容纳装置含有常用的玻璃载玻片，其上面有含靶核酸的组织样品，一个覆盖在样品上的柔软的盖件和固定装置，它机械式地固定于载玻片从而将试剂和样品保留在载玻片之上和盖件之下。

在根据本发明的装置中，试剂被薄的，柔性的，被机械夹于载玻片的盖件所包含，处于与样品标本的被选择出的部分接触之中。盖膜可以是不透明的或透明的，因为与其说要透过装置中的玻璃还不如说要通过盖件观察试剂，而且盖件必须与PCR试剂及样品不起化学反应。一个位于盖膜周围的通常为环形密封环将盖件压于载玻片，得到密不透风的密封。压力由弹性夹和横梁装置维持。载玻片上的被扩增样品可以在盖件和固定组件去除后用习用的方法通过显微镜观察。

该装置使得载玻片上的完整反应的装置快速、方便和可重复，而且只需要最少的技术。装置操作程序能轻易地与物理热启动相匹配。最后，本发明的系统适合习用的显微镜测定技术。

本发明的这些以及其他特征，目的和优点，能够通过结合附图阅读下面详细的描述而变得更明显。

图1是一根据本发明的样品容纳装置的透视图;

图2是一颠倒过来看的图1所示的该装置的部件分解视图，以及组装的方法;

图3是一颠倒过来看的图1所示的装置的部分放大顶视图;

图4是一沿图3中4-4线所作的装置的截面视图;

图5是一沿图3的5-5线所作的装置截面图;

图6是一根据本发明的弹性卡夹之一的端视图;

图7是一图6所示的弹性卡夹的顶视图;

图8是一根据本发明的装置中使用的较佳横梁的底视图;

图9是一图8所示横梁的侧视图;

图10是一在图8中沿着10-10线所作的横梁的截面视图;

图11是本发明容纳装置的手工装配安装用具一透视图;

图12是根据本发明的容纳装置的机械装置设备的一透视图;

图13是从图12的设备中分离出来的夹钳装置的一透视图;

图14是一现有热循环仪的槽式配接板的顶视图;

图15是一图14所示槽式配接板的截面视图;

图16是一热循环仪的透视图，而该装置具有适合于接纳根据本发明的样品容纳装置的改进的热交换区;

图17是一图16所示的热循环仪热交换区放大的部分截面视图;

图18是根据本发明的一横梁和盖件的第一可替换实施例的顶视图;

图19是根据本发明的一横梁和盖件的第二可替换实施例的顶视图;

图20是根据本发明的一装配好的容纳装置的截面视图，装置包括一在图18-19中所示的可替换的横梁和一可替换的盖件;

图21是一图20中所示容纳装置沿着21-21线所作的放大的部分截面视图;

图22是根据本发明装配到载玻片上的容纳装置的端视图，该装置采用了横梁和盖件的第三可替换的较佳实施例;

图23是一图22中所示的，按23-23线所作的本发明的部分截面视图;

图24是一图22中所示的，沿线24-24所作的部分截面视图。

在图1中示出了根据本发明的容纳装置10，它容纳固定在玻璃载玻片14上的含靶核酸的样品12及样品12上的试剂13。该装置10包括载玻片14、一盖住样品12的柔性盖件16和一把盖件16夹紧到载玻片14上的固定组件18。

在图1的透视图中示出了这个装置10的组合，图2表示各个部件的一分解视图，图3表示图1所示的组合装置经放大的一俯视图，而图4和5则表示图3所示的装置10的截面视图。

约一滴试剂13，其通过周围的柔性密封件或密封垫封入盖件16和载玻片14之间的容积中。密封件可件是一分离部件或可以是一盖件16的整体部分。密封口最好是盖件16的柔性边沿部分19，而该盖件则由在化学上与PCR试剂相容的弹性材料制成。在最佳实施例中，盖件是由硅橡胶制成的。盖件是足够宽的，并且受到刚性密封环20以每单位面积足够大的力紧压住载玻片14，因此即使密封环下的载玻片表面复盖着一薄层样品12的细胞或组织，但在热循环过程中也很少有水，液体或蒸汽可从盖件16下的空隙中溢出。甚至在沸腾温度条件下，仍能保持密封垫密封。

把柔性盖件16加工成形，以使在放松后柔性盖件在接触试剂的一侧上为微微下凹的。盖件凹度可加以选择，以限定密封环20将盖件16的边缘部分19紧压住载玻片14时盖件16和载玻片之间可保留的试剂的容积。一般，对于直径约12毫米的圆形盖来说，其容积约为10微升。容积可以如下方式进行选择。若容积太大，所需的试剂13的量将不必要地耗费且需用稍长时间来加热和冷却。若容积太小，那么盖件之下的表面容积比将变成不适当的大，并且由于表面上酶的吸收而具有较大不良扩增的危险，或通过部件或样品12 上抑制性污染的痕量而毒化试剂13。

一般，待检验样品12的受关注的区域直径不大于10毫米。载玻片的清洁区红25毫米×27毫米，因为通常把其一端用作标记而冻结起来。由于把仅几个微米厚组织片段（部分）精确地沉积在载玻片的预先位置是十分困难的，所以使盖件16能[安置在清洁区的任何地方是最好的。此外，在载玻片上可以有超过一个受关注的区域，因这对于在载玻片上能放置多于一个样品和装置10是一好处，如图1所示。

将盖件16夹紧到载玻片14上的新的固定组件18使盖件16有更广的可变位置。在载玻片清洁区边缘的几个毫米范围内的任何位置上所安放的样本都可能被容纳的扩增。对于密封环20来说几个毫米范围是需要的。盖件16的边沿部分19在其四周通过刚性密封环20而得以加强，并且若使盖件的两相对边缘上的密封环20紧压住载玻片14以形成充分的密封，那么该密封在盖件四周围其它各部分上将是充分的。因此，刚性密封环20可迫使盖件的周围保持在一平面上。

盖件16最好是一橡胶薄板的圆盘。刚性密封环20是一粘接到橡胶盖件16边沿19上的不锈钢环。该环20可具有矩形、不规则四边形、三角形或其它多边形横截面形状，因而，至少有一与盖件16粘接的平端。更具体地说，环20具有矩形成不规则四边形的横截面形状。“D”形横截面也是允许的。此外，环不必是圆的。它可以是长方形的或其它连续的形状，只要盖件16可对载玻片表面加以密封。因此，连接到不锈钢环20上的盘形橡胶盖件16的边沿19构成了一密封垫，该密封垫与盘的托架是连续作用的。本实施例要求橡胶薄板盖件16可防止水蒸汽通过它扩散，同时，对PCR试剂没有害处的。尽管硅橡胶对PCR无害，但它对水蒸汽则是于透过的。因此，如图4和5中所示的盖件材料既可以选硅橡胶那样的无害弹性材料 和聚丙烯那样的非渗透性弹性材料的夹层板或复合材料板，也可以选至少在非渗透性弹性材料下面用联合碳化合物公司的派雷里恩（Parylene）C那样的无害涂覆层或薄层。

盖件16必需的凹面形状可以在平的盖件16模压过程中形成或通过把盖件连接到刚性环20上时使平的盖件16变形，或通过把盖件16的外表面中央连接到固定在环20（图中未画出）的连接板上使盘的中央微微伸出环20平面而加以形成。

盖件16通过带有平行横条24的刚性横梁22相对载玻片固定，该平行横条则仅与密封环20的两相对部分接触。横梁22的横条24从一长边缘到另一长边（缘）延伸过载玻片。这样，盖件16可位于横梁22的任何地方，如图3所示。此外，沿着载片长度的任何地方都可以把横梁22夹紧到载玻片上。因此，在本发明中盖件16可安装在载玻片清洁区内的任何位置。

横梁22的横条24最好具有如图5所示的L形截面以增加其刚性。横条24通过两扁平端部26连接起来，该扁平端部通过图1、3和4所示的两卡夹28夹紧到载玻片14上。这些卡夹28各伸过载玻片14背侧30的，即装有样品12的相反侧的纵向边缘。横梁22的各端26略加以弯折以形成倾斜平面。在把卡夹28推压入应有的位置上时，它们可在这些倾斜平面端26上滑动并将相当大的压力施加在横梁22和密封环20上，以便把盖16的边沿部分19压紧且使它紧，贴住载玻片14。

虽然卡夹28和横梁22可由相对薄的材料（可能是不锈钢）制成，但它们是足够硬的，因此在组装过程中它们很少挠曲。维持夹紧力的储能最好大量地来自橡胶密封垫（在密封环20下面的盖件16的边沿19）的压缩，而不是从横梁22或夹板28的扭曲中产生。这种密封垫的有益的作用在于盖件16不论使安装在载玻片14何处，横梁22的横条24始终平行于载玻片且边沿19沿其整个周边 过量均匀地受压。将盖件16夹紧到载玻片14上的横梁22和卡夹28也是足够硬的，以便经受得住将试剂13加热到将近沸腾温度下所引起的压力增加。盖件16是柔性的，大大地减少了可在盖件下面引起的最大压力。另外，在加热期间柔性盖件16承受得住流体的膨胀，而不会使有效地加压密闭容积的载玻片14破裂。在加热循环过程中使用本发明的高度独立容纳装置可以防止或至少可使这一试剂13中的气泡形成减至最小。通过横梁施加到环20上的压力处在四磅压力的范围内且形成橡胶边沿19约20%的压缩。

图6和7示出了卡夹28之一的放大的顶视图和则视图。卡夹28是一变成“J”形的不锈钢金属片以形成一长侧壁32、一短侧壁34和一垂直连接的壁36。壁32可以设有一对实向短侧壁34的凹陷38。这些凹陷38被隔开以约束和咬住在横梁22倾斜表面端26的内缘上把卡夹28、横梁22和载玻片14锁住在一起，如图1和4所示。另一方面，凹陷38的功能可通过固定装配18部件之间突起的脊部或其它干涉机构来加以实现。

在图8、9和10中示出了横梁22的一可替换的实施例。横梁22a通常是一带有矩形开孔的冲切式矩形金属板体，该矩形金属板体形成两由横向端部26a所连接的平行横条24a。横梁22a的横条24a具有图10所示的L形截面。在装配时，由平的端部26a所连接的横条24a夹紧到上述载玻片14上。与图3至图5所示的第一横梁22的主要不同是端部26a以双弯曲部27a与横条24a连接。双弯部27a使卡夹28长的腿部能摩擦地与端部26a的表面接合。这种双弯曲部27a还差不多形成一台阶，因此，在卡夹28安装好后，装配好的载玻片和盖件装置的总厚度是最小的。

朝着端部26a近似3°的倾斜就足以在横梁端部26a、载玻片14和卡夹28之间提供必要的夹紧力，并且可确保对刚性环20施加足够的压力。这样，当采用图8-10所示的替换横梁时，在卡夹28上 的凹陷38就成为不必要的。

由于盖件16不比所必需的大，故所需的试剂容积仅是必要的，而且用密封环作不渗漏密封所需要的力也被减至最小。所有这些特性都是很有益的密封。因为它使装配成为较容易的，所以不需要大的密封力是所希望的，而必需刚性地承受得住较大力的机构会使装置变成不必要的粗厚的苯重，而倘若把苯重机构安装在边缘上的话，那么这也会限止可在循环仪中容纳的载玻片的数目。它还增加了装置的热时间常数且减慢循环过程。

原位聚合酶链反应的载玻片的装配

在盖件16下适当位置装有试剂13的载玻片14上的整个容纳装置10的装配是通过一独特的程序加以完成的，该独特程序也是本发明的一部分。在一最佳实施中，使用了一手工装配的安装工具40。这种安装用具40示于图11。在另一最佳实施例中，采用一机械辅助装配的安装用具或工具。在图12中示出了这样一种工具。

在图11中所示的手工装配安装用具40基本上由一固定于底座45上的装配支柱42和一可移动地安装在底座45上的滑动导向件44组成。滑动导向件44是弹簧向上偏压的，以便在支柱42周围垂直移动。支住42的顶端具有加工成形的凹陷区域46和48可松动地容纳卡夹28和横梁22且使它们保持在载玻片14的装配位置上。支住42还具有一中心空气通孔43。

滑动导向件44是一U形体，它通常具有两位于紧靠支柱42两侧的平的盘部50。这些盘部50具有一依一定尺寸制造的通道以安放一标准显微镜载玻片。两盘部50通过整体的U形架52连接在一起。各个盘部50具有一与其下侧固定的套筒54，套筒可在固定于底座45上的配合支杆56上滑动。围绕支杆56所安装的弹簧58把导向件向上偏压到某一位置上，在此位置上，由盘部44所支持的载玻片14将位于支柱42顶端的凹陷区域46和48上面。

容纳装置10的配装方式如下。首先，把两卡夹28安装在装配支柱42顶端的凹陷区域46中，而它们的长的侧壁32向下朝向支柱42。然后，将它们定位，使得它们相对的两短侧壁34之间的间隔正好比标准的一英寸显微镜载玻片的宽度稍度一点。接着，将横梁22安放在装配支柱上并进入凹陷区域46间，而其横条边缘如图2向上且横条24处于凹陷区域48中。各部件的尺寸是这样的，即由横梁22的端部26所形成的各倾斜表面的部分处在卡夹28的长侧壁32的顶端。这样，构成了卡夹28与横梁22的初始啮合。

在另一方面，可以提供由微弱粘附力保持初始接合和适当间隔关系的横梁22和卡夹28的预装配结合来减少制备装置的所必需的操作量。另外，如果卡夹28由磁不锈钢制成，那么埋在装配支柱中的小永义磁铁可以以最少操作自动地把卡夹放在适当位置。

然后，在密封环20固定到边沿部分19上后，把盖件16安装在横梁22的横条24之间，而凹部、盖件16的密封垫侧向上，密封环20搁靠在横梁22的横条24上。接着，使盖件16定位，并使盖件对准载玻片14上受关注的（含有试样）的区域的中心。盖件的尺寸是那样的，即其边沿19，也就是密封垫或密封表面以大于装配好后密封垫将受压缩的量突出于横梁22的横条上，因而即使在边沿受到挤压后，横梁22将令人满意地实际上不接触载玻片14，如图4和5所示。

于是，把一滴试剂13滴放在盖件16上。最好使用一可用手调整移送所需试剂容量的吸液管，以便把一滴液的试剂滴送到接近凹部表面的中心。由于盖件的表面只可部分地湿润，故扩散不明显。它还很好的停滞在盖件16的边沿19上方。

然后，将具有至少一个预先固定在其上的试样12的载玻片14安放在装置的安装用具的滑动导向件44上，样品侧向下、直接位于试剂13液滴上。先使滑动导向部件44定位，以使载玻片的底部总 是由弹簧58保持在试剂滴13的顶端以上至少几毫米处。通过将载玻片14纵向滑动使其定位，以便使待处理的样品区域对准盖件16上的液滴中心。这可透过载玻片14的后部观察得到（后部现在处在上端）。正如通常作法，如若所受关注的区域（部位）随在载玻片14的背部30上的链式标志而进行旋转，那末使操作变得极其容易。

接着，使用者可把一手指（戴了手套的）放在直接位于装置支柱42上的载玻片14的背部，以足够大的力直接揿压以克服向上推压的弹簧58的弹性力且使滑动导向件44下移。这使载玻片14的样品侧与试剂液滴13接触，并且迫使液滴13扩散散布在边沿19内的载玻片14和盖件表面上。试剂液滴的容积已经被选定为稍大于盖件16的凹入表面和与其边沿19接触的面（载玻片表面）之间的容积。因此，在载玻片表面刚好与边沿19进行接触之前，该液滴达到和越过边沿19的边缘。在载玻片14和盖件边沿19形成密封前，以上所述作用将所有或几乎所有空气从盖件下排出。对于少量试剂的过度容量通过盖件16的边沿19流出是可接受的。流出的试剂（它）最后会完全变干。在载玻片14上的另一向下力开始将边沿19压紧。

当边沿19已经部分地受到挤压时，载玻片14的背侧30应该恰好处在或低于各卡夹28短的侧壁34的底缘。此时，操作者用它的另一手（戴手套的）大姆指和手指在载玻片14的边缘上和在横梁22的端部26上彼此相对地挤压两卡夹28直到卡板28以其相对载玻片14的边缘垂直连接壁36而停止为止。这种作用完成了盖件16边沿19的挤压。由于使横梁22的端部26啮合的诸小棘爪38，和/或因为横梁部各端26上的倾斜表面切线角度小于卡夹28和横梁端部26向摩擦系数，故卡夹28保持安装就位直到有意加以移去为止。

在根据本发明的装配好的装置10中，载玻片14和盖件16之间所截留容积完全由不可压缩试液13所填满。因此，因要把盖件16 的边沿部分19紧压到（反应）结束，故盖件本身最好是柔性的，它能够扩张以调节装入的试剂量而在压力上增加不大，否则，这会使装配成为很困难的。为什么盖件16应该是柔性的另一原因是在把试剂13加热到接近或超过其沸点的温度时，它发生膨胀、其蒸汽气上升，其中所熔解的气体趋向于从溶液中出来。如果盖件不是全部柔性的情况下，在其内的压力可能升高到足以将载玻片或盖件密封破坏且造成试剂的丢失。然而，足以容纳任何形成的气体气泡的容积的少量可塑性可使压力不升高太多。一般来说，压力将升高到只稍大于试剂蒸汽压超过外部大气压力的量。这将确保装置甚至在高空（高的海拔）还能很好工作，在高空上，游离的试剂的沸点变成低于PCR变性温度。

在图12中示出了一机械辅助装配用具或工具80。这种工具除了实际上省去了用手指装卸本装置外与图11所示的工具相类似。尤其是若要完成物理热启动的话，这种工具80是最好的。在图12中所示的工具80具有一底座45和一象图11所示的安装到其上的支柱42，并且利用一形状有点与图11所示的导向件44类似的滑动导向件82。此外，工具80具有一压臂84和一卡夹安装机构86，因而，在装置操作过程中使用者不必实际接触固定装置18的热部件（或成分）。

滑动导向件82具有一对依一定尺寸制成的间隔的平盘部88以接纳载玻片14。两盘部通过整体的U形支架90加以连接，这种U形支架90可绕着水平轴销92转动。轴销92由约同支柱42的顶端一样高度的两固定支座94水平地支承在底座45上。

在臂84的一端也以枢轴安装在轴销92的支架90内。压臂84中一扁平、细长件并在支柱42的顶端上方设有一通常的矩形开孔96，而支柱的顶端则接纳和支承横梁22和卡夹28。当将压臂84从支柱42上方下放到载玻片14上时，开孔96使对载玻片14上的盖 件16，横梁22和样品12能进行观察。在压臂94紧贴住载玻片14时一绕着开孔96的橡胶垫片98则用来防止载玻片破裂。压臂84最好是向弹性偏压时，以使它保持抬起（离开）直到需要的位置为止。同样，载玻片导向件82弹性向上偏压以使载玻片14保持在横梁22、卡夹28、盖件16和试剂液滴13上直至压臂被放入，使固定组件18最后安装到载玻板14上。压臂84和载玻片导向件82可以设有安装在轴销90上的普通弹簧（图中未画出）或弹簧可从底座45中伸出以提供所需的向上偏压。

卡夹安装机构86最好为一对安装在支柱42上的负荷弹簧钳100，该弹簧钳具有两各弯向凹入区域（部位）46的相对钳爪102，凹入区域则在紧邻安装在导向件82中的载玻片14的边缘处旋转一卡夹该弹簧钳还有一构成整体的、相对的钳柄部104。弹簧钳100的相对钳柄部104用手工挤压在一起而把卡夹28从载玻片边缘和横梁22的端部26上方推压到载玻片的两侧边上，从而完成了容纳装置10的装配。各弹簧钳枢轴地安装在一固定的轴销106上，该轴销穿过支柱42的侧壁正处在钳爪102和卡夹28之间的接触点下。

在图13中以透视方法独立地示出了卡夹安装机构84。各L形钳爪102具有一短腿，该短腿可装配入支柱42顶端的凹入区域46之一中。各平的柄部104绕着支柱42的两邻接侧围起来。在各钳柄部104和支柱42（未画出）之间安装的弹簧（未画出）使弹簧钳100的柄部104和钳爪部102向外偏置，以使固定卡夹28能安装在凹陷部分46中。在相对柄部104挤合在一起时，端部（钳爪）102彼此相对移动，使卡夹28压在载玻片14上。

工具80以如下方式进行操作。卡夹28如前所述安装在凹陷部分46中。将横梁22，密封环20，盖件16和试剂13顺序地安放在支柱42上，然后，将一其上放有试样12的载玻片14放在导向件82的盘部86上，并使试样侧朝下且使域样垂直处于盖件16中的试剂 13的上面。于是，压臂94绕着枢轴相对于载玻片向下转动，以将载玻片14降到盖件16上且使试剂和酶散布于载玻片14上的试样上。当压臂94充分地压降下来后，挤压弹簧钳100，使钳爪102彼此相对移动，把固定卡夹28推压到载玻片14和横梁端部26上。再者，将整个载玻片容纳装置10从工具80上移去，把它放置在一改进的热循环仪上且进行以上所述的热循环。

热启动应用

为了实现使用本发明的热启动，我们只需要将一加热系统加装到手工装配安装用具40上或机械辅助工具80上且使已加热的容器蓄有系统的部件。此外，如上所述，某些载玻片和固定装置部件可以暂时组装在一起且在安装用具上放置和在所有容纳装置部件最后连结之前给予加热。

下列说明适用于图11所示的手工加热装配安装用具40和类似于图12所示的机械辅助装配工具80。装配支柱42设有透过它的一垂直孔或空气通孔43，通孔经底部同周围的空气交换。在电源接通后，一内部恒温控制加热器使支柱42柱体温度保持在约75℃，这比热启动温度在近似70℃要热。这种加热器可以是一在中心孔43周围缠绕的阻抗线圈，或可以简单将加热器埋在底座45或支柱42中。为了有助于加热垂直通孔中上升的空气可以在孔43的内部设置助片。对流可维持一象在烟囱中那样的热空气的提升圆柱，它可在最后装配前洗涤安装在支柱42的顶端上的横梁22和盖件16。横梁22和卡夹28也通过与金属装配支柱42接触而加以加热。

在一经加热载体中存放着待处理的一些载玻片14，而该载体使载玻片保持在约75℃。卡夹28，盖件16和横梁22可在工作场所的小型加热容器中进行贮存且用镊子来装卸。对于把两预加热卡夹，一横梁22和一盖件16安装到已加热的装配支柱42上所需的时间一般可为10至15秒。对于使用一预热的移液管夹端输送预热的试 剂13的时间小于10秒。在把预热载玻片推压下之前已加热的试剂13需要接触不超过又一10秒，使它密封和把固定组件18的诸部件夹紧在一起。几秒钟以后，装配好的载玻片可退回到其已加热载体上，决不要冷至70℃以下。因为暴露时间是如此短，所以由于蒸发试剂浓度（变化）应该是最小的。

一确切的物理性热启动可仅通过把装配工具加热和把载玻片、诸容纳部件、试剂和诸吸管尖端储藏在装置工作部分的加热载体中而加以获得。其它程序上的变化是不必要的。这种程序随图12所示的装配工具80的使用而得到简化，因为排除了已加热部件的储存和正加热部件和导向件82接触。对于热启动而言如果诸部件通过粘结剂固定在一起，那么也可使用卡夹28和横梁22的预装配，粘结剂在环境温度下是很坚硬的，使装配和装运方便，但这在热启动温度下易于削弱最终装配。

容纳装置10的诸卡夹28伸出载玻片14的边缘外，而占有其背面30向个毫米。由于这个原因，任何一种放有新的容纳装置的热循环仪的平热交换表面必须设有一些槽，槽的浓度略小于1毫米，宽为3毫米以容纳卡夹28。

根据本发明，若将一块配接板放在热循环仪部分的平的上表面上，那么现有的一些热循环仪，例如Perkin  Elmer  DNA热循环仪，Perkin  Elmer480型，或Perkin  Elmer9600型都可用来使载玻片装置热循环。在图14和15的顶视和截面视图中示出了这样一配接板110。这种配接板110具有一平的底表面112和一具有被间隔的平行槽116的上表面114。这些槽116为接纳卡夹28而依一定尺寸制作，使得槽116之间的平的表面部分118可与放在配接板上的载玻片14的玻璃表面充分接触。配接板110可用来接纳3或4块载玻片组件。

最好将象油那样的导热液或导热脂散布在上表面部分以增加在 载玻片14的背侧30和槽116之间平的热交换表面118之间的界面的热接触。在热循环仪装置和配接板110之间也应使用硅脂和矿物油以确保这种界面的良好的热接触。乙二醇或其聚合物也能有益地用来提供二个界面之间的良好热接触。乙二醇或其聚合物具有可水溶的优点，因而简化了装置部件和热循环仪装置部分的清洗。在载玻片和配接板之间及在热循环仪装置和配接板之间使用不是油、脂，就是乙二醇或其聚合物的另一优点是：液体层起到一吸紧作用，因而将载玻片固定到配接板上和装配接板保持在热循环仪装置部分适当位置上，从而使处理过程中跌落的机率减至最小。

目前的实验已经表明调节DNA热循环仪的热校准，或规定稍高的原位扩增温度，以便补偿整个系统的热量的变化可能是必要的。举例来说，已经观察到从样品区段到载玻片顶面有不到1℃的小温差。这种温差可通过使用以上所述的油、脂或乙二醇而减至最小。

DNA热循环仪的原位型式

本发明的容纳装置10适用于比上面刚提到的还要多的载玻片进行循环，因为，各个装置10其厚度均小于4毫米，可在任何实际场合加以循环，而不需要浸污在油中。例如，装置10可在改进的热循环仪部件垂直布置以接纳大量的载玻片组件。在图16中示出了一种含有一改进的金属架122的热循环仪120。金属架122含有8条狭槽124，后者处在金属隔板126之间，其中心间相距10毫米。各个狭槽124宽约5毫米，各个隔板126在各金属隔板126的左手侧上具有一平的、垂直的热交换表面128以及一对接纳卡夹28所必需的凹槽130。

图17是通过安装在一个这种狭槽124的边缘上的载玻片装置10所作的（金属）架122的一部分截面图。底槽130的顶连132加以平滑倒角，防止因载玻片14垂直移出时其碰着卡夹28。根据同样的原理，上槽130不设有上边缘。很显然，当载玻片以这种方式安装 后，我们不能依赖重力使载玻片14对着平的金属热交换表面128固定。因此，可将传统结构的小叶簧（在图中未画出）安置在各狭槽124的端部以使载玻片平缓但牢固地贴靠在垂直的金属表面128上。

再者，在载玻片14和平的金属热金属表面之间应该使用矿物油、脂、乙二醇或其它的导热液体以使传热增至最大。弹簧可在载玻片装载后加以接合，在它们卸载前加以脱开，或者可永久地安装在狭槽124中，以便将载玻片14及其装置10连接地压入与表面128接合。

当热循环完成之后，被装入的载玻片容纳装置10从其狭槽124中移出，用作进一步分析。诸容纳装置部件易于通过将卡夹28自载玻片14上滑出而加以分离。如果诸容纳装置部件和载玻片14被放入-5%的漂白剂的容器中使它们消毒，再进行淋洗和干燥的话，它们可以重复使用多次。对复复使用的限制将由盖件16和/或边沿19的磨损来确定，其状况在盖件16被夹紧到载波片14上之前和之后通过目测很检验出来。值得注意的是不像对溶液中样本所进行的PCR，对于原位PCR而言，不希望的DNA的沾污问题是要小得多。其原因是使DNA沾污不进入适当固定的细胞的内部。此外，任何沾污的DNA可在热循环后的加工步骤之前用试剂来清洗掉。有关原位PCR的这种事实使可清洗和重复使用的另件比它们在溶液中作PCR更可接受。

原位PCR的试剂

在我们的工作中，我们发现原位PCR用的最佳试剂数量与溶液中PCR用的试剂数量不同。首先，存在一表面与容积比的问题。在MicroAmpTM试管中的10微升试剂具有17毫米2左右的容器接触表面。在一载玻片14和一10毫米直径的盖件之间同样容量的试剂约有157毫米2接触表面，也就是约大9倍。因此，在原位情况下 任何由表面状况，所引起的对PCR的有害影响例如聚合酶的吸附被扩大了。如果表面条件比经仔细选择的PCR反应试管的聚丙烯材料更有害，那么这种有害影响被大大地扩大且能容易地把PCR完全摧毁。例如广泛采用的硅烷处理的玻璃载玻片实质上是一比例如聚丙烯更有害的表面。

我们还发现根据本发明对硅烷在载玻片上的PCR试剂，在容器的溶液中获得聚合酶链反应的成功扩增，我们需在反应中增加Tag聚合酶的数量，从溶液PCR中典型的每100μl2.5单位增至每100μl12.5单位。我们也发现往试剂中加入1mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）会保护PCR免受载玻片表面的影响。我们认为牛血清白蛋白（BSA）通过在所有接触的表面上迅速地形成至少一单层蛋白质而产生作用。因而，这个单层提供了一Tag聚合酶不强烈的粘附的表面。

我们已讨论过在循环过程由反应而失水。尽管工作十分小心和迅速，在热启动负荷过程中，总有一些水要失去。还有一些水汽因扩散到柔性橡胶或塑料盖件16中或甚至通过柔性橡胶或塑料盖件16的薄壁而散失掉。由于这些少量的额外损失，原位扩增的PCR试剂的配方应该是处在各组分的最佳浓度范围的最大稀释点，因为在施以热负载和循环时浓度的唯一变化，即使有的话，由于水的失去而有可能使浓度少量增加。

这样，原位聚合酶链反应装置的整体包括载玻片和容纳装置10、装配安装用具40或80、一个或多个附有容纳装置10的载玻片14的改进的热循环仪以及以上所述的改良的试剂13。这种结合的新颖和不可预料的结果是、对细胞和组织样品内的特异DNA序列的方便、可靠、灵敏的检测和定位。

倘若在载玻片14的边缘之间的试样12的侧方位和间隔是恒定的话，环20可被整合入横梁22。这将简化部件结构，固定组件18和容纳装置10的装配。

容纳装置10的结构通过几个途径可加以简化。例如，横梁和固定环可被整合。本发明中的横梁和盖件的第一个可选择的具体实施例见于图18。可选择的横梁的变化描述于图19。在下面的描述中类似的数字也可被利用来描述在上面已阐述的原位PCR容纳装置中的同一或可替换的部件。

现参阅图18和19，各示出了装配到可替换盖件122上的可替换横梁120和140的顶视图。横梁120和140之间的区别仅仅是圆孔124和142的方位不同。横梁120和孔124是位于中央相比较的话，横梁140的孔142是位于紧靠横梁140的一端144。两横梁120和140的结合有可能使盖件122盖住载玻片14任何位置上安放的样品12，而这种作用仅需改变横梁140的方位或仅需选择有中心配置孔124的横梁120。在这些实施例中，密封环与横梁成一体。横梁120通常具有一圆的环部126，当容纳装置10按图20和21部分截面视图安装好后，该环部将压紧在盖件122的边沿部128。

最好，横梁120是一不锈钢板的一冲压件。横梁120具有一对平行、竖直的弯折边，弯折边形成在相对端132之间延伸的横条130，而相对端则以约3°的小角向下弯曲以与以上所述第一实施例中卡夹28相类似的方式接纳卡夹134。如图21所示，各卡夹134在安装过程中将端部132和载玻片14挤压在一起，因而将盖件122的边沿部分128压贴到载玻片14上。

这种横梁120和盖件122布置的可替换实施例的最独特特点是在边沿部分128和中心拱曲或凹面部分138之间具有一环形助或脊136，在拱曲或凹后面部138下盛放试剂混合物13。这种环形脊136最好具有一放大的鳞茎顶部137，顶部则咬入把各片件固定在一起的孔124中。盖件122和横梁120可作为分离单元加以安装，以便简化图21所示本替换实施例的容纳装置10的部件的最后组装。

横梁120可以设有切去区域139，以节约为余的金属材料。在另 一方面，这些切去区域139可以用肋或波纹板（未画出）替代以提高横梁的刚性。

现参阅图19，横梁140具有平行升高的横条边缘146和一单个切去区域148，这与在横梁120上的两个切去区域不同。横梁140可从图19所示的载玻片14的方位转动180°，使得横梁140和横梁120的结合允许覆盖载玻片14上实际上所有的各可能性的样本位置。

图18-21所示的可替换容纳装置10的装配类似于以上第一实施例所述的装配情况，只是固定环20不再需要，也不必及先将盖件122和横梁120装配在一起。如先前所述，可以利用手工或机械辅助装配工具40和和80，以便把容纳装置10安装到载玻片上和进行热启动。

图22至24表示根据本发明容纳装置10的第三个实施例，此实施例中利用了另一可替换的盖件和横梁150。在图22的顶视图中所示的这个实施例的横梁150又是一个冲压的薄片状金属片件，片件具有平行隆起的横条152和两个弯折端部154。不过，这个实施例中不设有盖件156的中心部分伸过的中心孔。代之以金属片横梁150中的环状槽或凹陷158，起到第一实施例中固定环20的作用和第二实施例中环部分126的作用。这个环状槽158被制成一定尺寸，因此盖件156的边沿部分160与槽158的下边得以充分接合。就像第二实施例的盖件那样，隆起的脊162在盖件156的边沿部分160和中心部分164之间向上突出。盖件156可以任选地包括一中心隆起物或小丘166，它是用来咬配入环状槽内中心配置的开孔168以把盖件156和横梁150固定在一起。如按所示的提供这种中心隆起物166，那么就不必在盖件156设置脊162。此外，不必模塑带凹面形中心部164的盖件156。隆起物166咬配入开孔168将使中心部对着横梁的150的中心部向上拉起，以产生容纳试剂13的必要的弯 曲。尽管在这种情况下不需要脊162，但脊162可有助于形成这种中心弯曲。

横梁150也可具有多个压入金属板材的波槽或肋条170，如图22所示以增加结构的刚性，使之能用很薄的金属板材进行制造，从而减少其热质量和整个厚度。

该可替换的第三实施例比起以前所述的实施例来具有明显的优点。由于横梁150完全覆盖在柔性盖件156上，故盖件材料对水汽扩散的不渗透以及对PCR反应无害的要求大大地得到减小。因此，这可使材料的选择范围较宽。举例来说，盖件156可以是一种硅校胶的单个模压体。不必用含有象聚丙烯那样的不渗透弹性体的硅橡胶夹层或复合材料。因为水汽通过盖件156的中心部位164扩散到密闭空间172会很快因容量很小而达到平衡，因而形成这种特征。通过取消所示的任选的隆起物166和任选的开孔168可进一步使蒸发减少。如去除中心小丘166（隆起物），隆起脊162可用来把盖件156临时紧固在横梁下应有位置上。

但是，空档区172是必需的，以使在装配卡夹28或134时边沿部分160负压过程中盖件156位移，因而起到密封作用以有效地保持试剂13针对着样品12。截留的容积172也用来控制在热循环过程中盖件156下的压力。这可减少或可防止在接近95℃的变性温度下的保温过程中在试剂中形成气泡。

在图24的部分截面示图中清楚地示出了横条152的构形。这些位于形成横梁150的金属板件边缘上的平行横条152基本上是成双的。这种结构有相当大刚性并可以使用最小厚度的板材。另外，横条成双处在边缘可使尖锐边缘存在减至最小，这种尖锐边缘用薄的金属材料可能有碍使用。同理，两横条154与可象横条152那样弯折过来。

横梁150可设有与容纳在载玻片中心位置试样同心地配置的环 状槽158。由于从图22所示的变换来看这是一种明显的变化，这种可变换就不加以图解。

虽然上述说明是本发明最佳实施例的图解说明，但应该理解到除了作特别说明外本发明的原位PCR容纳装置的发明概念可以加以实际操作。例如，横梁和凹陷或卡夹体可由硬塑料制成，或可将卡夹28之一构成横梁一端的一整体部分，因而仅需要一个卡夹28以装配在横梁22的相对端上。这样，本发明的诸实施例经历了变动、变化和改变而不偏离所附的权利要求的适当范围和明晰的含义。因此，意欲包含所有这样的改变、变动和变化，这多应看作落在所附权利要求的精神和其宽的范围内。

在本文中所援引的专利申请、专利和其它出版材料作为其完整的参考而结合在一起。