[0002] 本申请是2008年3月28日提交的在审美国
专利申请号11/813,276的部分后续申请案,其为2005年12月30日提交的
国际申请号为PCTUS 2005/047461、
国际公布号为WO 2006/074089的依据35U.S.C.§371的美国国家阶段申请,本申请要求享有2004年12月30日提交的美国临时申请顺序号60/640,890的优先权,以上每一项申请为所有目的以其整体在此引作参考。
发明领域
[0003] 本发明总体而言涉及用于提高动物生活质量的方法,尤其涉及用含有ω-3多不饱和
脂肪酸的食品组合物来提高老龄动物或超老龄动物的生活质量。
[0004] 发明背景
[0005] 伴侣动物例如狗和猫根据其生命阶段(年龄)、大小、身体组成和品种常常需要不同的饮食。可基于年龄将狗和猫的营养物需求分为三个不同的生命阶段:成长中的狗(或猫)、成年狗(或猫)和老龄狗(或猫)。可进一步将最后一类即老龄狗(或猫)分为两个阶段,包括老龄(或中老龄)和超老龄(或衰老老龄(geriatric))。进一步将狗分为中型犬和大型犬两类。
[0006] 包括ω-3和ω-6多不
饱和脂肪酸在内的必需脂肪酸是动物健康的关键营养物。然而,动物不能产生这些营养物,或所产生的量不足以引发益处,因此必须在动物饮食中消耗。参见例如Hornstra,G.等,″Essential fatty acids in pregnancy and early human development(在妊娠和人的早期发育中的必需脂肪酸)″,Eur.J.Obs.& Gyn.and Reprod.Biology,61:57-62(1995)。先前业已假定二十二
碳六烯酸(″DHA″)这种ω-3多不饱和脂肪酸在提高老龄小鼠的迷宫学习能
力和脑功能方面有效。参见Lim,S.-Y.,″Intakes of dietary docosahexaenoic acid ethyl ester and egg phosphatidylcholine improve maze-learning ability in young and old mice(饮食中的二十二碳六烯酸乙酯和蛋黄磷脂酰胆
碱的摄取改善青年小鼠和老龄小鼠的迷宫学习能力)″,J.Nutr.,130:
1629-1632(2000)。
[0007] Rogers论述了抗
氧化剂减慢认知功能退化(尤其是在老龄动物中)的可能用途的原理。参见Rogers,P.,″A healthy body,a healthy mind:long-term impact ofdiet on mood and cognitive function(健康的身体健康的心态:饮食对情绪和认知功能的长期影响)″,Proceedings of the Nutrition Society,60:135-143(2001)。
[0008] 尽管进行了关于改进认知能力的研究及开发,仍需要提高老龄动物生活质量的方法,这通过老龄和超老龄动物中的以下特性来测量:例如提高警觉性、增加活力、软骨保护、保持肌肉质量、提高消化率和改善
皮肤及
毛皮品质。如先前所报道,可给予本文所述超老龄
宠物食品组合物以实现该结果。另外,我们在本文报道了意想不到的发现,即在基因组
水平反映了通过给予本文公开的宠物食品组合物实现的老龄和超老龄动物生活质量的提高。具体而言,如下文
实施例所详述,
基因芯片数据表明编码与若干
生物学途径相关的
蛋白质的基因的表达被改变,即总体而言,通过将本文所述超老龄宠物食品组合物给予动物,大多数生物学途径得到有利改变,所述生物学途径例如血凝和血小板激活和聚集、骨及肌肉完整性、炎性反应、软骨降解和
疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和分解、糖酵解、糖异生、戊糖
磷酸途径和
电子传递。
[0009] 发明简述
[0010] 本发明提供用于改进老龄和超老龄动物生活质量的方法,所述方法通过给动物饲喂包含至少约9%重量的蛋白质、至少约5%重量的脂肪和至少约0.05%重量的至少一种ω-3多不饱和脂肪酸的组合物来实现。
[0011] 在一个实施方案中,所述方法包括给动物饲喂有效提高动物生活质量的量的组合物,其中通过改善选自以下的一种或多种特性来证明生活质量提高:警觉性、活力、软骨保护、肌肉质量保持、消化性和皮肤及毛皮品质。
[0012] 在另一实施方案中,所述方法包括给动物饲喂包含选自二十二碳六烯酸(″DHA″)和二十碳五烯酸(″EPA″)的至少一种ω-3多不饱和脂肪酸的组合物。在又一实施方案中,所述方法包括给动物饲喂进一步包含至少一种抗
氧化剂和至少一种选自胆碱、锰、甲硫
氨酸、半胱氨酸、L-肉毒碱、赖氨酸及其混合物的营养物的组合物。
[0013] 在一个实施方案中,本发明包括给动物饲喂有效改进或提高动物的生活质量的量的组合物,其中通过改善选自以下的一种或多种生物学途径来证明生活质量提高:血凝和血小板激活和聚集、骨和肌肉的完整性、炎性反应、软骨降解和疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和降解、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径和电子传递。
[0014] 在另一实施方案中,所述方法包括给动物饲喂有效提高动物的生活质量的量的组合物,其中通过编码与选自以下的生物学途径关联或相关的蛋白质的一种或多种基因的表达的变化来证明生活质量提高:血凝和血小板激活和聚集、骨和肌肉的完整性、炎性反应、软骨降解和疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和降解、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径和电子传递。
[0015] 在再一实施方案中,本发明涉及
治疗罹患与选自以下的生物学途径关联或相关的病症或
疾病的动物的方法:血凝和血小板激活和聚集、骨和肌肉的完整性、炎性反应、软骨降解和疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和降解、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径和电子传递,所述方法包括给予所述动物本文公开的组合物。在一个实施方案中,所述组合物包括至少约9%重量的蛋白质、至少约5%重量的脂肪和至少约0.05%重量的至少一种ω-3多不饱和脂肪酸。在另一实施方案中,所述组合物包含选自二十二碳六烯酸(″DHA″)和十二碳五烯酸(″EPA″)的至少一种ω-3多不饱和脂肪酸。在再一实施方案中,所述组合物进一步包含至少一种抗氧化剂和至少一种选自胆碱、锰、甲硫氨酸、半胱氨酸、L-肉毒碱、赖氨酸及其混合物的营养物。
[0016] 在另一实施方案中,本发明涉及测量或表征饲喂本文所述组合物的动物(尤其是老龄动物或超老龄动物)生活质量提高的方法,所述方法通过定量测定所述动物的选自表5-14中所公开的一种或多种基因的基因表达水平,并比较所述动物的所述水平与在给予
饲料组合物之前的所述动物的所述水平来实现。
[0017] 在另一实施方案中,本发明涉及通过在动物中调节表5-14中所列的一种或多种基因的表达水平(即如其中所示的上调或下调)以模拟在给予本发明宠物食品组合物后体内观察到的表达模式,来提高动物生活质量的方法。本文亦涵盖调节这些基因的表达水平可对于治疗与各种生物学途径相关的疾病或病症而言具有治疗价值。
[0018] 本发明亦涉及鉴定从饲喂本文公开的组合物获益的动物的方法,所述方法包括测量所述动物的表5-14中所列的任何一种或多种基因的基因表达水平,并将所述水平与表5-14中所观察到的基因表达水平进行比较,其中具有不同于表5-14中所观察到的基因表达水平的水平的动物被鉴定为可能从饲喂本发明组合物获益。
[0019] 本发明再一方面提供测定方法及
试剂盒,所述试剂盒包括检测来源于动物体组织样品中编码本文公开的基因的多核苷酸的表达或编码的蛋白质或其
片段水平所需的组分,所述试剂盒包括例如与所述多肽或其片段结合的
抗体,或与所述多核苷酸杂交的寡核苷酸探针。在优选实施方案中,所述试剂盒亦包括详述使用试剂盒组分的程序的
说明书。
[0020] 本发明的其它和另外的目的、特征和优势应易于为本领域技术人员所明了。
[0021] 发明详述
[0022] 定义
[0023] 考虑的是,本文所述发明不限于所述的具体方法、方案和试剂,因为它们可变化。亦应理解的是,本文所用术语仅为了阐述具体实施方案的目的,并非意欲以任何方式限制本发明范围。
[0024] 除非另外定义,否则本文所用所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员所通常理解的相同的含义。尽管在实行或试验本发明时可使用与本文所述相似或等同的任何方法及材料,但现在阐述优选的方法、设备及材料。为阐明及公开在出版物中所报道的可用于本发明的材料和方法的目的,本文提及的所有出版物皆在此引作参考。
[0025] 在实施本发明过程中,可使用分子生物学的很多常规技术。这些技术众所周知,并在例如以下文献中有解释:Current Protocols in Molecular Biology,第1、II和III卷,1997(F.M.Ausubel主编);Sambrook等,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;DNA Cloning:A Practical Approach,第I和II卷,1985(D.N.Glover主编);Oligonucleotide Synthesis,1984(M.L.Gait 主 编 );Nucleic Acid Hybridization,1985,(Hames 和Higgins);Transcription and Translation,1984(Hames 和 Higgins 主 编 );Animal Cell Culture,1986(R.I.Freshney 主编);Immobilized Cell and Enzymes,1986(IRL Press);Perbal,1984,A Practical Guide to Molecular Cloning;丛书,Methods in Enzymology (Academic Press,Inc.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells,1987(J.H.Miller和M.P.Calos主编,Cold Spring Harbor Laboratory);和Methods in Enzymology第154卷和第155卷(分别由Wu和Grossman和Wu主编)。
[0026] 除非上下文明确表明不是这样,否则本文和所附
权利要求中所用的单数形式不定冠词和″所述″包括复数提及物。
[0027] 术语″老龄″或″中老龄″指动物的生命阶段。对于小型或中型犬而言,″老龄″生命阶段为约7到约10岁年龄。对于猫而言,″老龄″生命阶段为约7到约12岁年龄。对于大型犬而言,超过5岁年龄代表下文所述″超老龄″。
[0028] 术语″超老龄″或″衰老老龄″指动物的特定生命阶段。对于小型或中型犬,超老龄阶段为大于10岁年龄的任何年龄。对于大型犬,超老龄阶段为大于5岁年龄的任何年龄。对于猫而言,超老龄阶段为大于12岁年龄的任何年龄。
[0029] 术语″大型(larrge breed)″犬意指成年时体重超过55磅的犬。
[0030] 术语″中型(regular breed)″犬意指成年时体重小于55磅的犬。
[0031] 术语″小型(small breed)″犬意指成年时体重小于20磅的犬。
[0032] 术语″超老龄宠物食品组合物″指本文公开的任何及所有的宠物食品组合物。
[0033] 本文所用术语″碳水化合物″包括
水解时被代谢以提供
能量的多糖(例如
淀粉和糊精)和糖(例如
蔗糖、乳糖、麦芽糖、
葡萄糖和果糖)。适于包含在本文公开的组合物中的碳水化合物实例包括但不限于玉米、
高粱、小麦、
大麦和大米。
[0034] 术语″抗氧化剂″意指能够与自由基反应并中和所述自由基的物质。所述物质的阐释性实例包括β-胡萝卜素、硒、辅酶Q10(泛醌)、梅毒螺旋
体素(luetin)、生育三烯酚类、大豆异黄
酮、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、
牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸、维生素E、维生素C、硫辛酸和L-肉毒碱。含有有用水平的一种或多种抗氧化剂的食品的实例包括但不限于
银杏、绿茶、花椰菜、柑桔果肉、葡萄渣、西红柿渣、胡萝卜、菠菜和各种各样的水果餐及蔬菜餐。本领域技术人员应该理解,尽管本文可以以″ppm″表示抗氧化剂单位,但对于既定抗氧化剂例如维生素E在合适及习惯时,亦可以以″IU/kg″来表示抗氧化剂的适当量。
[0035] 术语基因表达的″有利变化″或可“有利地改变”基因表达等术语,指基因表达改变(例如上调或下调mRNA水平)以便由该基因编码的蛋白质水平可相应地改变,因而相关的生物学途径可更可能正常发挥作用,并且反映例如可能代表超老龄动物的途径中的病理学变化的趋向性更小。通常基因表达的有利变化涉及改善动物健康和/或减少动物疾病倾向。本文所用测量基因表达″水平″的差异等术语,指例如表征与对照水平相比动物基因的表达是否上调或下调。
[0036] 本文所用″改善″或″提高″动物生活质量指改善或提高选自以下的一种或多种特性:警觉性、活力、软骨保护、肌肉质量保持、消化率和皮肤和毛皮品质。另外,亦涵盖改善/提高血凝和血小板激活和聚集、骨和肌肉的完整性、炎性反应、软骨降解和疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和降解、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径和电子传递。
[0037] 特性或生物学途径的″改善″或″提高″指改变所述特性或生物学途径,以便特性或途径存在出现和/或正常起作用的趋向而较少反映例如可代表超老龄动物的特性或途径的病理变化的趋向。
[0038] 本文所用″治疗″罹患疾病或病症的动物的方法亦意味着包括防止和/或也改善疾病或病症的方法。
[0039] 发明
[0040] 本发明提供用于改善或提高老龄动物或超老龄动物生活质量的方法。所述方法包括给动物饲喂包含至少约9%重量的蛋白质、至少约5%重量的脂肪和至少约0.05%重量的ω-3多不饱和脂肪酸的组合物。所述方法用于在老龄动物或超老龄动物中提高警觉性、改进活力、保护软骨、保持肌肉质量、提高消化率和改进皮肤及毛皮品质。所述方法亦用于改进动物的选自以下的一种或多种生物学途径:血凝和血小板激活和聚集、骨和肌肉的完整性、炎性反应、软骨降解和疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和降解、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径和电子传递途径,所述改善亦由基因组水平的整体有利变化来反映。本文亦涵盖用于治疗罹患与这些生物学途径关联或相关的病症或疾病的动物的方法,所述方法包括给予本发明组合物。
[0041] 不依附任何理论,本发明益处可为来自将ω-3多不饱和脂肪酸加入到老龄动物或超老龄动物饮食中的生理学作用的结果。类似地,抗氧化剂、胆碱和其它营养物可在提高老龄动物或超老龄动物的生活质量中起作用。
[0042] 尽管本发明方法可通过提高所有上述特性或改进所有上述生物学途径来改善动物的生活质量,但不必证明每一个特性或途径实质上改善来达到本文所定义的″提高的生活质量″。
[0043] 当将组合物给予老龄动物或超老龄动物时,动物获得提高的生活质量,例如呈现或获得以下的一种或多种:提高警觉性、增加活力、保护软骨、保持肌肉质量、提高消化率、改善皮肤及毛皮品质,以及改善例如血凝和血小板激活和聚集、骨和肌肉的完整性、炎性反应、软骨降解和疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和降解、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径和电子传递途径,其如在基因组水平的总体有利变化所显示。用于测定这些生活质量量度的方法为技术人员所知。例如,可通过各种手段测量警觉性,所述手段包括代谢和抗氧化剂标记分析以及通过宠物主人参与的随
访问题的临床研究。可能的代谢标记可包括生长素释放肽、GLP-1、甲状腺
激素和/或生长激素。抗氧化剂状况潜在标记可包括血清维生素E、ORAC、谷胱甘肽过氧化物酶、烷醇(alkanels)和/或细胞损伤指示剂。此外,可通过各种手段测量活力,所述手段包括代谢和抗氧化剂标记分析以及通过宠物主人参与的随访问题的临床研究。类似地,可通过各种手段测量软骨保护,所述手段包括分析关节炎生物标记。可能的关节炎生物标记可包括II型
胶原蛋白合成、基质金属蛋白酶、骨
钙蛋白、碱性磷酸酶活性、COMP和软骨损伤碎片。可通过各种手段测量肌肉质量保持,所述手段包括分析身体组成,并可通过各种手段测量消化率,包括宠物主人参与的随访问题的临床研究和饲喂动物以测定消耗的营养物的百分比。可通过各种手段测量皮肤和毛皮品质,所述手段包括宠物主人参与的随访问题的临床研究。另外,如上所述,亦在基因组水平反映生活质量的改善,其由显示与包括以下的各种重要生物学途径相关的大多数基因表达的有利变化的基因芯片数据来证明:血凝和血小板激活和聚集、骨和肌肉的完整性、炎性反应、软骨降解及保护和疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和降解、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径和电子传递途径。在以下实施例中提供这些基因的标识。
[0044] 本发明方法用于提高人和动物的生活质量,所述动物包括灵长类(例如猴、黑猩猩等)、伴侣动物(例如狗、猫、
马等)、农场动物(例如山羊、
绵羊、猪、牛等)、实验室动物(例如小鼠、大鼠等)、
鸟类(例如家养鸟例如金丝雀、鹦鹉等和商业鸟例如鸡、鸭、火鸡等)、啮齿动物(例如仓鼠、豚鼠、沙鼠、兔、刺猬、
雪貂、毛丝鼠等)和野生动物、外来动物及动物园动物(例如狼、熊、鹿等)。在不同实施方案中,动物为猫、狗或马。
[0045] 设计本发明组合物以提高消化率和改善咀嚼性。通常基于生命阶段(年龄)、大小、身体组成和品种来调配犬和猫的食品。因此,本发明某些实施方案包括调配用于满足中型犬或小型犬、大型犬和猫之间的特定营养差异的组合物。
[0046] 本发明提供利用含有至少一种ω-3多不饱和脂肪酸的多种组合物的方法。所述组合物包括食品、补充剂(supplement)、零食(treats)和玩具(通常为咀嚼性玩具和消耗性玩具)。所述方法亦在一段时间内为
指定动物提供组合物,所述时间长至足以实现生活质量改善。在一个实施方案中,所述方法为动物提供组合物持续至少30天。
[0047] 本发明方法中使用的组合物通常具有基于干物质计算至少约0.02%(或约0.05%到约10%或约0.1%到约6%)重量的ω-3多不饱和脂肪酸含量。在某些实施方案中,所述ω-3多不饱和脂肪酸为DHA。在其它实施方案中,所述ω-3多不饱和脂肪酸为EPA。在又一些实施方案中,所述ω-3多不饱和脂肪酸包含DHA和EPA的混合物。
[0048] 在某些实施方案中,含有ω-3多不饱和脂肪酸的组合物为食品。尽管提供液体及固体两种食品,但通常优选固体食品。食品既包括干食品又包括湿食品。食品中的某些非-多不饱和脂肪酸组分及其优选比率包括在表1中所列出的那些。
[0049] 表1
[0050]
[0051] 在一个实施方案中,本发明方法包括给超老龄动物饲喂有效提高该动物的生活质量的量的组合物。所述组合物通常包含:
[0052] (a)0.02%(或约0.05%到约10%、或约0.1%到约6%)的至少一种ω-3多不饱和脂肪酸;和
[0053] (b)至少以下之一:
[0054] (i)约10%到约55%(或约18%到约30%、或约33%到约55%、或约18%到约20%、或约33%到约36%)的蛋白质;
[0055] (ii)约7%到约35%(或约18%到约35%、或约7%到约24%、或约14%到约24%、或约14%到约16%、或约18%到约24%)的脂肪;和
[0056] (iii)至少约05(或约0.05ppm或IU/kg到约7500ppm或IU/kg、或约250ppm或IU/kg到约3600ppm或IU/kg、或约250ppm或IU/kg到约1650ppm或IU/kg、或约5ppm或IU/kg到约225ppm或IU/kg、或约0.05ppm或IU/kg到约2.4ppm或IU/kg)的抗氧化剂。
[0057] 在另一实施方案中,本发明方法包括给超老龄中型犬或小型犬饲喂有效提高所述犬的生活质量的量的组合物。所述组合物通常包含:
[0058] (a)至少以下之一:
[0059] (i)至少约0.02%(或约0.02%到约0.3%、或约0.05%到约0.3%、或约0.05%到约0.2%)的DHA;和
[0060] (ii)至少约0.1%(或约0.1%到约0.5%、或约0.2%到约0.5%、或约0.2%到约0.3%)的EPA;
[0061] (b)至少约9%(或约9%到约30%、或约18%到约30%、或约18%到约20%)的蛋白质;
[0062] (c)至少约7%(或约7%到约24%、或约14%到约24%、或约14%到约16%)的脂肪;和
[0063] (d)至少以下之一:
[0064] (i)至少约250IU/kg(或约250IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1000IU/kg)的维生素E;
[0065] (iv)至少约50ppm(或约50ppm到约500ppm、或约100ppm到约500ppm、或约100ppm到约301ppm)的维生素C;
[0066] (v)至少约600ppm(或约600ppm到约2400ppm、或约1260ppm到约2400ppm、或约1260ppm到约1545ppm)的牛磺酸;
[0067] (vi)至少约50ppm(或约50ppm到约200ppm、或约100到约160、或约100到约155)的硫辛酸;和
[0068] (vii)至少约50ppm(或约50ppm到约500ppm、或约200ppm到约500ppm、或约200ppm到约350ppm)的肉毒碱。
[0069] 在另一实施方案中,本发明方法包括给超老龄大型犬饲喂有效提高所述犬的生活质量的量的组合物。所述组合物通常包含:
[0070] (a)至少以下之一:
[0071] (i)至少约0.02%(或约0.02%到约0.3%、或约0.05%到约0.3%、或约0.05%到约0.2%)的DHA和
[0072] (ii)至少约0.1%(或约0.1%到约0.5%、或约0.2%到约0.5%、或约0.2%到约0.3%)的EPA;
[0073] (b)至少约9%(或约9%到约30%、或约18%到约30%、或约18%到约20%)的蛋白质;
[0074] (c)至少约7%(或约7%到约24%、或约14%到约24%、或约14%到约16%)的脂肪;和
[0075] (d)至少以下之一:
[0076] (i)至少约250IU/kg(或约250IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1000IU/kg)的维生素E;
[0077] (viii)至少约50ppm(或约50ppm到约500ppm、或约100ppm到约500ppm、或约100ppm到约301ppm)的维生素C;
[0078] (ix)至少约600ppm(或约600ppm到约2400ppm、或约1260ppm到约2400ppm、或约1260ppm到约1575ppm)的牛磺酸;和
[0079] (x)至少约50ppm(或约50ppm到约200ppm、或约100到约160、或约100到约155)的硫辛酸;和
[0080] (xi)至少约50ppm(或约50ppm到约500ppm、或约200ppm到约500ppm、或约200ppm到约350ppm)的肉毒碱。
[0081] 在另一实施方案中,本发明方法包括给超老龄猫饲喂有效提高所述猫的生活质量的量的组合物。所述组合物通常包含:
[0082] (a)至少以下之一:
[0083] (i)至少约0.05%(或约0.05%到约0.30%、或约0.1%到约0.30%、或约0.1%到约0.2%)的DHA;和
[0084] (ii)至少约0.1%(或约0.1%到约0.5%、或约0.2%到约0.5%、或约0.2%到约0.3%)的EPA;
[0085] (b)至少约15%(或约15%到约55%、或约30%到约55%、或约33%到约36%)的蛋白质;
[0086] (c)至少约9%(或约9%到约35%、或约18%到约35%、或约18%到约24%)的脂肪;和
[0087] (d)至少以下之一:
[0088] (i)至少约250IU/kg(或约250IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1100IU/kg)的维生素E;
[0089] (xii)至少约50ppm(或约50ppm到约300ppm、或约100ppm到约300ppm、或约100ppm到约200ppm)的维生素C;
[0090] (xiii)至少约1100ppm(或约1100ppm到约3500ppm、或约2300ppm到约3500ppm、或约2300ppm到约2350ppm)的牛磺酸;和
[0091] (xiv)至少约200ppm(或约200到约750ppm、或约400ppm到约750ppm、或约400到约525ppm)的肉毒碱;和
[0092] (xv)至少约0.05%(或约0.05%到约0.6%、或约0.1%到约0.6%、或约0.1%到约0.4%)的胱氨酸。
[0093] 在另一实施方案中,本发明方法包括给超老龄动物饲喂有效提高所述动物的警觉性和活力的量的组合物。所述组合物通常包含:
[0094] (a)0.02%(或约0.05%到约10%或约0.1%到约6%)的至少一种ω-3多不饱和脂肪酸和
[0095] (b)至少以下之一:
[0096] (xvi)约10%到约55%(或约18%到约30%、或约33%到约55%、或约18%到约20%、或约33%到约36%)的蛋白质;
[0097] (xvii)约7%到约35%(或约18%到约35%、或约7%到约24%、或约14%到约24%、或约14%到约16%、或约18%到约24%)的脂肪;
[0098] (xviii)至少约.05(或约0.05ppm到约7500ppm、或约250到约3600、或约250ppm到约1650ppm、或约5ppm到约225ppm、或约0.05ppm到约2.4ppm)的抗氧化剂;和[0099] (xix)至少约1000ppm(或约1000ppm到约5000ppm、约3300ppm到约5000ppm、或约2000ppm到约3000ppm、或约3000ppm到约4000ppm)的胆碱。
[0100] 在另一实施方案中,本发明方法包括给超老龄中型犬或小型犬饲喂有效提高所述犬的警觉性和活力的量的组合物。所述组合物通常包含:
[0101] (a)至少以下之一:
[0102] (i)至少约0.02%(或约0.02%到约0.3%、或约0.05%到约0.3%、或约0.05%到约0.2%)的DHA;和
[0103] (ii)至少约0.1%(或约0.1%到约0.5%、或约0.2%到约0.5%、或约0.2%到约0.3%)的EPA;
[0104] (b)至少约9%(或约9%到约30%、或约18%到约30%、或约18%到约20%)的蛋白质;
[0105] (c)至少约7%(或约7%到约24%、或约14%到约24%、或约14%到约16%)的脂肪;
[0106] (d)至少以下之一:
[0107] (i)至少约250IU/kg(或约250IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1000IU/kg)的维生素E;
[0108] (xx)至少约50ppm(或约50ppm到约500ppm、或约100ppm到约500ppm、或约100ppm到约301ppm)的维生素C;
[0109] (xxi)至少约600ppm(或约600ppm到约2400ppm、或约1260ppm到约2400ppm、或约1260ppm到约1545ppm)的牛磺酸;和
[0110] (xxii)至少约50ppm(或约50ppm到约200ppm、或约100到约160、或约100到约155)的硫辛酸;和
[0111] (xxiii)至少约50ppm(或约50ppm到约500ppm、或约200ppm到约500ppm、或约200ppm到约350ppm)的肉毒碱;
[0112] (e)至少约1000ppm(或约1000ppm到约3200ppm、或约2000ppm到约3200ppm、或约2000ppm到约2500ppm)的胆碱;
[0113] (f)至少约50ppm(或约50ppm到约150ppm、或约100ppm到约150ppm、或约100ppm到约110ppm)的锰;和
[0114] (g)至少约0.4%(或约0.4%到约2%、或约0.9%到约2%、或约0.9%到约1.2%)的赖氨酸;和
[0115] (h)至少约0.4%到约1.5%的甲硫氨酸。
[0116] 在另一实施方案中,本发明方法包括给超老龄大型犬饲喂有效提高所述犬的警觉性和活力的量的组合物。所述组合物通常包含:
[0117] (a)至少以下之一:
[0118] (i)至少约0.02%(或约0.02%到约0.3%、或约0.05%到约0.3%、或约0.05%到约0.2%)的DHA;和
[0119] (ii)至少约0.1%(或约0.1%到约0.5%、或约0.2%到约0.5%、或约0.2%到约0.3%)的EPA;
[0120] (b)至少约9%(或约9%到约30%、或约18%到约30%、或约18%到约20%)的蛋白质;
[0121] (c)至少约7%(或约7%到约24%、或约14%到约24%、或约14%到约16%)的脂肪;
[0122] (d)至少以下之一:
[0123] (i)至少约250IU/kg(或约250IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1000IU/kg)的维生素E;
[0124] (xxiv)至少约50ppm(或约50ppm到约500ppm、或约100ppm到约500ppm、或约100ppm到约301ppm)的维生素C;
[0125] (xxv)至少约600ppm(或约600ppm到约2400ppm、或约1260ppm到约2400ppm、或约1260ppm到约1575ppm)的牛磺酸;和
[0126] (xxvi)至少约50ppm(或约50ppm到约200ppm、或约100到约160、或约100到约155)的硫辛酸;和
[0127] (xxvii)至少约50ppm(或约50ppm到约500ppm、或约200ppm到约500ppm、或约200ppm到约350ppm)的肉毒碱;
[0128] (e)至少约1000ppm(或约1000ppm到约3200ppm、或约2000ppm到约3200ppm、或约2000ppm到约2500ppm)的胆碱;
[0129] (f)至少约50ppm(或约50ppm到约150ppm、或约100ppm到约150ppm、或约100ppm到约110ppm)的锰;和
[0130] (g)至少约0.4%(或约0.4%到约2%、或约0.9%到约2%、或约0.9%到约1.2%)的赖氨酸;和
[0131] (h)至少约0.4%到约1.5%的甲硫氨酸。
[0132] 在另一实施方案中,本发明方法包括给超老龄猫饲喂有效提高所述猫的警觉性和活力的量的组合物。所述组合物通常包含:
[0133] (a)至少以下之一:
[0134] (i)至少约0.05%(或约0.05%到约0.30%、或约0.1%到约0.30%、或约0.1%到约0.2%)的DHA;和
[0135] (ii)至少约0.1%(或约0.1%到约0.5%、或约0.2%到约0.5%、或约0.2%到约0.3%)的EPA;
[0136] (b)至少约15%(或约15%到约55%、或约30%到约55%、或约33%到约36%)的蛋白质;
[0137] (c)至少约9%(或约9%到约35%、或约18%到约35%、或约18%到约24%)的脂肪;
[0138] (d)至少以下之一:
[0139] (i)至少约250IU/kg(或约250IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1500IU/kg、或约500IU/kg到约1100IU/kg)的维生素E;
[0140] (xxviii)至少约50ppm(或约50ppm到约300ppm、或约100ppm到约300ppm、或约100ppm到约200ppm)的维生素C;
[0141] (xxix)至少约1100ppm(或约1100ppm到约3500ppm、或约2300ppm到约3500ppm、或约2300ppm到约2350ppm)的牛磺酸;和
[0142] (xxx)至少约200ppm(或约200到约750ppm、或约400ppm到约750ppm、或约400到约525ppm)的肉毒碱;和
[0143] (xxxi)至少约0.05%(或约0.05%到约0.6%、或约0.1%到约0.6%、或约0.1%到约0.4%)的胱氨酸;
[0144] (e)至少约1600ppm(或约1600ppm到约5000ppm、或约3300ppm到约5000ppm、或约3300ppm到约3400ppm)的胆碱;
[0145] (f)至少约50ppm(或约50ppm到约150ppm、或约100ppm到约150ppm、或约100ppm到约110ppm)的锰;和
[0146] (g)至少约0.7%(或约0.7%到约3%约、或约1.4%到约3%、或约1.4%到约1.7%)的赖氨酸;和
[0147] (h)至少约0.4%到约1.5%的甲硫氨酸。
[0148] 在另一实施方案中,本发明提供用于改进老龄或超老龄小型犬或中型犬的生活质量的方法。所述方法包括给所述犬饲喂包含以下物质的组合物:
[0149] 约60%到约70%重量的碳水化合物;
[0150] 约15%到约25%重量的选自动物蛋白和
植物蛋白的蛋白质;
[0151] 约5%到约7%重量的选自动物脂肪和植物脂肪的脂肪;
[0152] 约2.5%到约4%重量的至少一种ω-3多不饱和脂肪酸;
[0154] 约1%到约2%重量的矿物质;和
[0155] 约0.5到约1.5%重量的维生素。
[0156] 在另一实施方案中,本发明提供用于改进老龄或超老龄大型犬的生活质量的方法。所述方法包括给所述犬饲喂包含以下物质的组合物:
[0157] 约60%到约70%重量的碳水化合物;
[0158] 约15%到约25%重量的选自动物蛋白和植物蛋白的蛋白质;
[0159] 约5%到10%重量的选自动物脂肪和植物脂肪的脂肪;
[0160] 约3%到约5%重量的至少一种ω-3多不饱和脂肪酸;
[0161] 约1%到约4%重量的纤维;
[0162] 约0.5%到约1%重量的矿物质;和
[0163] 约0.75到约1.25%重量的维生素。
[0164] 在另一实施方案中,本发明提供用于改进老龄或超老龄猫的生活质量的方法。所述方法包括给所述猫饲喂包含以下物质的组合物:
[0165] 约30%到约35%重量的碳水化合物;
[0166] 约35%到约50%重量的选自动物蛋白和植物蛋白的蛋白质;
[0167] 约12%到约15%重量的选自动物脂肪和植物脂肪的脂肪;
[0168] 约1%到约2%重量的至少一种ω-3多不饱和脂肪酸;
[0169] 约1%到约5%重量的纤维;
[0170] 约1%到约2%重量的矿物质;和
[0171] 约1%到约2%重量的维生素。
[0172] 在另一实施方案中,本发明提供用于改进老龄动物或超老龄动物的生活质量的方法,所述方法包括给所述动物(例如根据可能的情况为小型犬、中型犬或大型犬或猫)饲喂包含下表IA所标示组分的组合物:
[0173] 表1A:超老龄食品化学组合物
[0174]
[0175]
[0176] *硫辛酸基于调配,没有分析值。
[0177] 用于本发明方法的组合物进一步包含至少一种选自以下的营养物:锰、甲硫氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的混合物、L-肉毒碱、赖氨酸和精氨酸。组合物中每种组分特别优选的量视多种因素而定,包括例如消费所述组合物的动物种类;包含在组合物中的具体组分;动物的年龄、体重、一般健康、性别及饮食;动物的消耗率等。因此,组分的量可在大范围内变化,甚至可偏离本文所给出的比例。
[0178] 可从多种来源获得ω-3脂肪酸。一个方便的来源是来自诸如鲱鱼(menhaden)、鲭、鲱鱼(herring)、凤尾鱼及鲑鱼等的鱼油。DHA和EPA是所述鱼油中存在的典型的脂肪酸,它们通常一起组成鱼油的大部分,例如鱼油的约25%到约38%。
[0179] 当组合物为动物食品时,优选包括避免不足并保持健康所需量的维生素和矿物质。本领域易于知道这些量。例如,美国国家研究委员会(National Research Council(NRC))提供针对农场动物的所述成分的推荐量。参见例如Nutrient Requirements of Swine(猪的营养物需求)(第10版,Nat′l Academy Press,Wash.D.C,197298)、Nutrient Requirements of Poultry(
家禽的营养物需求)(第9版,Nat′l Academy Press,Wash.D.C,1994)、Nutrient Requirements of Horses(马的营养物需求)(第5版,Nat′l Academy Press,Wash.D.C,1989)、Nutrient Requirements of Dogs and Cats(狗和猫的营养物需求)(Nat′l Academy Press,Wasn.D.C,2006)。例如,美国饲料管理官方协会(AAFCO)提供针对狗和猫的所述成分的推荐量。参见American Feed Control Officials,Inc.,Official publication,第126-140页(2003)。用作
食品添加剂的维生素实例包括维生素A、B1、B2、B6、B12、C、D、E、K、H(生物素)、K、叶酸、肌醇、烟酸和泛酸。用作食品添加剂的矿物质和微量元素实例包括钙、磷、钠、
钾、镁、
铜、锌、氯化物和
铁盐。
[0180] 本发明方法包括可进一步含有其它本领域已知的添加剂的组合物。优选地,所述添加剂以不削弱本发明提供的目的和效果的量存在。添加剂实例包括例如有稳定作用的物质、加工助剂(processing aid)、提高适口性的物质、着色物质和提供营养益处的物质。
[0181] 稳定物质包括例如趋向增加组合物保存期限的物质。所述物质的可能的合适实例包括例如
防腐剂、抗氧化剂、增效剂和螯合剂、
包装气体、稳定剂、乳化剂、
增稠剂、
胶凝剂和湿润剂。乳化剂和/或增稠剂实例包括例如明胶、
纤维素醚、淀粉、淀粉酯、淀粉醚和改良淀粉。
[0182] 用于着色、适口性(″适口增强剂″)和营养目的的添加剂包括例如:
着色剂(例如氧化铁,例如红色、黄色或棕色形式);
氯化钠、
柠檬酸钾、
氯化钾和其它食用盐;维生素;矿物质;和
调味剂。所述添加剂为本领域已知。参见例如美国专利号3,202,514。亦参见美国专利号4,997,671。调味剂包括例如奶制品调味剂(例如牛奶或奶酪)、肉类调味剂(例如熏肉、肝脏、牛肉、禽肉或鱼)、含油
树脂、频哪醇和在交易中由FEMA(调味剂提取制造协会(Flavor Extract Manufacturers Association))编号来识别的各种调味剂。调味剂帮助提供额外的适口性,其为本领域已知。参见例如美国专利号4,997,672。亦参见美国专利号5,004,624。亦参见美国专利号5,114,704。亦参见美国专利号5,532,010。亦参见美国专利号6,379,727。组合物中所述添加剂浓度通常可达至约5%重量。在某些实施方案中,所述添加剂(尤其是在所述添加剂为主要营养平衡剂时,例如维生素和矿物质)浓度为约
0%到约2.0%重量。在某些实施方案中,所述添加剂(再次尤其是在所述添加剂为主要营养平衡剂时)浓度为约0%到约1.0%重量。
[0183] 补充剂包括例如与另一饲料一起使用以改进营养平衡或整体性能的饲料。补充剂包括组合物,其作为其它饲料的补充在不稀释下饲喂,为可分别获得的动物日粮的其它部分提供自由选择,或用动物的常规饲料稀释或与其混合以形成全料。例如,AAFCO提供了关于美国饲料管理官方协会(American Feed Control Officials),Inc.Official Publication,第220页(2003)中的补充剂的论述。补充剂可呈各种形式,包括例如粉末、液体、糖浆、丸、胶囊组合物等。
[0184] 零食包括例如在非用餐时间给予动物诱使其食用的组合物。狗零食包括例如狗骨头。零食可具有营养,其中所述组合物包含一种或多种营养物,并可例如具有上述用于食品的组合物。非营养性零食包括无毒的任何其它零食。
[0185] 玩具包括例如咀嚼性玩具。狗玩具包括例如人造骨头。目前市场上有各种各样的合适玩具。参见例如美国专利号5,339,771(及美国专利号5,339,771中所公开的参考文献)。亦参见例如美国专利号5,419,283(及美国专利号5,419,283中所公开的参考文献)。本发明提供部分消耗性玩具(例如包含塑料组分的玩具)和完全消耗性玩具(例如生皮和各种人造骨头)两种。应该进一步认识到本发明提供用于人及非-人使用的玩具,尤其是用于伴侣动物、农场动物及动物园动物使用,尤其是用于狗、猫或鸟使用。
[0186] ″食品″为用于目标接受动物(例如家猫或家狗)的营养全面的饮食。″营养全面的饮食″是包括足以依靠饮食来维持健康动物的正常健康的营养物的饮食。本发明方法利用意欲不被任何特定的蛋白质或脂肪成分列表或产品形式限制的组合物。可用常规宠物
食品加工将组合物制备为例如干燥形式、罐装形式、湿形式或中等水分形式。在某些实施方案中,水分含量为组合物总重量的约10%到约90%。在其它实施方案中,水分含量为组合物总重量的约65%到约75%。
[0187] 在制备用于本发明方法的组合物时,例如通常可将任何成分(例如鱼油)在加工制剂期间掺入到组合物中,例如在混合组合物的其它组分期间和/或在其之后。可用常规手段将这些组分分配到组合物中。在一个实施方案中,让
磨碎的动物蛋白及禽蛋白组织与其它成分混合,所述其它成分包括鱼油、谷粒、其它营养平衡成分、特定目的的添加剂(例如维生素和矿物质混合物、无机盐、纤维素和甜菜渣、填充剂等);亦加入对加工足够的水。这些成分优选在适于加热并同时混合组分的容器中混合。可用任何合适的方式实现加热混合物,例如通过直接
蒸汽注入或通过用配有
热交换器的容器。在加入最后的成分后,将混合物加热到约50°F(10℃)到约212°F(100℃)的
温度范围。在某些实施方案中,将混合物加热到约70°F(21℃)到约140°F(60℃)的温度范围。这些范围外的温度通常可接受,但可能在不使用其它加工助剂的情况下在工业上不能实现。当加热到合适温度时,物质通常呈
浆液形式。将该浆液填入罐中。加上盖,密封容器。然后将密封的罐置于设计为灭菌其内容物的常规设备中。这通常通过加热到大于约230°F(110℃)的温度持续一段合适时间来完成,所述时间视例如所用温度及组合物而定。
[0188] 本发明方法包括利用可用常规加工制备为干燥形式的组合物。在一个实施方案中,碾磨包括诸如动物蛋白来源、植物蛋白来源、谷粒等在内的任何干燥形式并将其混合在一起。然后加入包括脂肪、油、动物蛋白来源、水等在内的水分或液体成分,并与干燥混合物混合。然后将混合物加工为粗磨粒或类似的干碎
块。通常用
挤压加工形成粗磨粒,其中干成分和湿成分混合物在高压和高温下遭受机械力,被强迫通过小孔,由旋转刀片切割为粗磨粒。然后干燥湿粗磨粒,任选用一种或多种局部包衣来包被,所述包衣可包括例如调味剂、脂肪、油、粉末等。亦可用
烘焙加工而不是挤压从团块(dough)制备粗磨粒,其中在干热加工之前将团块置于模中。
[0189] 亦将组合物设计为易于咀嚼。通常基于生命阶段(年龄)、大小、身体组成和品种来调配犬和猫食品。在本发明方法中,组合物的某些实施方案符合超老龄中型犬或小型犬、大型犬和猫之间的特定营养差异。
[0190] 除非另外明确表明,否则本文表示的所有百分比都是以干物质重量为
基础。
[0191] 如前所述,本发明部分涉及用于提高动物的生活质量的方法。所述方法包括给老龄动物或超老龄动物饲喂有效提高警觉性、增加活力、保护软骨、保持肌肉质量、提高消化率和改善皮肤及毛皮品质的量的组合物。另外,现在本文报道我们意想不到的发现,即可在基因组水平反映通过给予本发明组合物实现的动物生活质量的提高。尽管可能以下呈提的表中所公开的任何一个基因的表达变化可导致有益或
有害生物学效应,但本文所提出的数据表明,总的来说,所观察到的表达概况与给予本文公开的饮食后体内观察到的有益生物学效应一致。具体而言,基因芯片数据表明,通过给予动物本文所述组合物,绝大部分有益地改变了编码与以下若干生物学途径关联或相关的蛋白质的基因表达:例如血凝和血小板激活和聚集、骨和肌肉的完整性、炎性反应、软骨降解和疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和降解、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径和电子传递。因此,本发明亦涉及测量或表征饲喂本文所述组合物的动物(尤其是老龄动物或超老龄动物)的生活质量提高的方法,所述方法通过定量测定所述动物的选自表5-14中所公开的一种或多种基因的基因表达水平并比较所述动物中的所述水平与在给予饲料组合物之前所述动物的所述水平来实现。可以以本领域技术人员熟悉的多种方式实施基因表达的定量测定,其包括诸如RT PCR以及基因芯片测定和RNA印迹法等技术。因此,本文涵盖可例如在测量本文公开的动物生活质量提高的方法中使用已检测的表达水平。
[0192] 本发明另一方面涉及包括以下的试剂盒:
[0193] (a)本文公开的基因的多核苷酸或其片段;
[0194] (b)与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列;
[0195] (c)由本文公开的基因编码的多肽或其片段;或
[0196] (d)针对本文公开的基因编码的多肽或其片段的抗体。
[0197] 应该理解在任何所述试剂盒中,(a)、(b)、(c)或(d)可包括基本组分。可按照常规方法来实施本文所述试剂盒及其组分(例如抗体产生)的制备。
[0198] 本文考虑的是,对于与各种生物途径相关的疾病或病症的治疗而言,调节本文公开的基因表达水平可具有治疗价值。所述测定可在逐个基因的基础上进行,而无需过度实验,例如通过评估组织以及血液样品中的表达水平,或通过测定与特定疾病状态有关并适于所述实验的细胞或细胞系中的体外表达水平。在所述实验中亦可能利用疾病的体内模型。这些特性及其它适合的另外测定应为本领域技术人员所熟悉。因此,基于本文公开的基因组数据,本发明亦涉及通过调节动物的表5-14中所列的一种或多种基因的表达水平(即如其中所示上调或下调)以模仿给予本发明宠物食品组合物后体内观察到的表达模式来提高动物的生活质量的方法。
[0199] 可通过用适于体内给予的已知基因表达调节剂来实现调节基因表达水平,所述调节剂包括但不限于针对目的基因的合适核苷酸序列的核酶、反义寡核苷酸、三螺旋DNA、RNA适配体和/或双链RNA。无需过重负担或过量实验本领域技术人员可用常规技术制备这些抑制性分子。例如,可通过将反义分子、DNA或RNA设计为本文所述基因的控制区(即启动子、增强子和内含子)来获得对基因表达的改变(例如抑制)。例如,可使用自转录起始位点例如起始位点的-10和+10
位置之间获得的寡核苷酸。然而,可使用基因的所有区域来设计反义分子以便制备与mRNA进行最强杂交的分子,并可通过为本领域技术人员所熟悉的标准测定程序来产生并鉴定所述合适的反义寡核苷酸。
[0200] 类似地,可用″三螺旋″碱基
配对方法获得对基因表达的抑制。三螺旋配对有用是因为其对双螺旋为聚合酶、转录因子或调控分子的结合提供足够空间的能力产生抑制。文献中业已阐述了用三螺旋DNA的最新治疗进展(Gee,J.E.等(1994)载于:Huber,B.E.和B.I.Carr,Molecular and Immunologic Approaches,Futura Publishing Co.,Mt.Kisco,N.Y.)。亦可将这些分子设计用于通过防止转录物与核糖体结合来阻止mRNA翻译。
[0201] 亦可用核酶(酶性RNA分子)通过催化特异性RNA裂解来调节基因表达。核酶的作用机理涉及核酶分子与互补靶标RNA的序列特异性杂交,接着内切核苷酸裂解。可使用的实例包括工程改造的″锤头″或″发夹″基序核酶分子,可将其设计为特异性并有效催化基因序列的内切核苷酸裂解。
[0202] 最开始通过扫描靶标分子的核酶裂解位点来
鉴别任何潜在的RNA靶标的特异性核酶裂解位点,所述核酶裂解位点包括以下序列:GUA、GUU和GUC。一旦鉴别后,可估计对应于含有裂解位点的靶标基因区域的15-20个核糖核苷酸短RNA序列的二级结构特征,所述结构特征可使寡核苷酸不能操作。亦可通过用核糖核酸酶保护测定检测与互补寡核苷酸杂交的可行性来评估候选靶标的合适性。
[0203] 核酶方法包括让细胞与核酶
接触,或在所述小RNA核酶分子细胞中诱导表达(Grassi 和 Marini,1996,Annals of Medicine 28:499-510;Gibson,1996,Cancer 和Metastasis Reviews 15:287-299)。可利用靶向对应于本文所述的至少一种基因的mRNA的锤头和发夹核酶的细胞内表达来抑制由所述基因编码的蛋白质。
[0204] 可将核酶以掺有核酶序列的RNA寡核苷酸形式直接递送到细胞中,或作为编码所需核酶RNA的表达载体引入到细胞中。核酶可以以有效催化mRNA裂解并藉此改变细胞中的mRNA丰度的足够量在体内常规表达(Cotton等,1989EMBO J.8:3861-3866)。具体而言,可将按照常规的众所周知的规则设计并例如通过标准亚磷酰胺化学合成的编码DNA序列的核酶连接到反密码子茎和编码tRNA的基因环中的限制酶位点中,然后可通过本领域常规方法转化到目的细胞中并表达。优选地,亦将诱导型启动子(例如糖皮质激素或
四环素响应元件)引入该构建体中,以便可选择性控制核酶表达。为了极致使用,可用高度活跃的组成型启动子。因为tDNA基因(即编码tRNA的基因)小、转录率高及在不同类型的组织中遍在性表达而将其用于该应用中。因此,可常规设计核酶以裂解几乎任何mRNA序列,可用编码所述核酶序列的DNA常规转化细胞,以便表达可控制的催化有效量的核酶。因此,可改变或干扰细胞中几乎任何RNA种类的丰度。
[0205] 可以与对反义核苷酸所述基本相同的方式修饰核酶序列,例如核酶序列可包含修饰的碱基部分。
[0206] 亦可将RNA适配体引入细胞中或在细胞中表达以改变RNA丰度或活性。RNA适配体为蛋白质的特异性RNA配体,例如对于Tat和Rev RNA(Good邓,1997,Gene Therapy 4:45-54),可特异性抑制其翻译。
[0207] 用常规RNAi技术亦可实现对基因表达的基因特异性抑制。存在阐述所述技术的众多参考文献,包括例如WO 99/32619;Miller等Cell Mol Neurobiol 25:1195-207(2005);Lu等Adv Genet 54:117-42(2005)。
[0208] 可用任何本领域已知的合成核酸分子的方法来制备本发明反义分子、三螺旋DNA、RNA适配体和核酶。这些方法包括化学合成寡核苷酸技术,例如固相亚磷酰胺化学合成。或者,可通过体外及体内转录编码本文所述基因的DNA序列来产生RNA分子。可按照常规方法将所述DNA序列引入到各种各样的含合适的RNA聚合酶启动子(例如T7或SP6)的载体中。或者,可用本领域技术人员熟悉的方法将以组成型或诱导型合成反义RNA的cDNA构建体引入到细胞系、细胞或组织中。可通过很多可用手段将载体引入到细胞或组织中,并可在体内、体外或离体使用。对于离体治疗,可将载体引入到采自动物的干细胞中,并克隆繁殖用于自体移植回同一动物中。可用本领域熟知的方法实现通过
转染或通过脂质体注射递送。
[0209] 本发明亦包括鉴别可能从饲喂本文公开的组合物获益的动物的方法,所述方法包括测量所述动物的表5-14中所列的任何一种或多种基因的基因表达水平,并将所述水平与表5-14中所观察到的基因表达水平进行比较,其中具有不同于表5-14中所观察到的表达水平的水平(例如上调对比下调)的动物应被鉴定为可能从饲喂本发明组合物中获益。
[0210] 本文亦涵盖的是,本发明涉及用于治疗罹患与以下多种生物学途径中的任何一种或多种关联或相关的病症或疾病的动物的方法:血凝和血小板激活和聚集、骨和肌肉的完整性、炎性反应、软骨降解和疼痛反应、DNA损伤和修复途径、神经功能、肝糖合成和降解、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径和电子传递,所述方法包括给予动物本发明食品组合物。
[0211] 本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂,因为它们可变化。另外,本文所用术语仅为了阐述特定实施方案的目的,并非意欲限制本发明范围。应以同兼而非异或来理解术语″包括″、″包含″和″含有″。
[0212] 除非另外定义,否则本文所用的所有技术及科学术语及任何首字母缩略词,都具有与本发明领域一般技术人员通常所普遍理解的一样的含义。尽管在实行或试验本发明时可使用与本文所述相似或等同的任何方法及材料,但本文阐述了优选的方法、设备及材料。
[0213] 为阐述并公开其中所报告的可能用于本发明的组合物、化合物、方法和类似资料的目的,本文提及的所有专利、专利申请及出版物在此以法律
许可的程度引作参考。然而,在此无论如何不能解释为承认本发明不早于根据先前发明的公开内容。
[0214] 本说明书公开了本发明的典型优选实施方案,尽管采用了特定术语,但它们仅以一般性及阐述性意义被使用,不是为了限制以上所附权利要求提出的本发明范围的目的。根据以上教导本发明可能有很多
修改和改变。因此,应该理解,在所附权利要求范围内可以不同于所具体阐述的来实施本发明。
实施例
[0215] 可进一步通过以下其优选实施方案的实例来阐明本发明,但除非另外明确表明,否则应该理解包括这些实施例仅为了阐明目的,并非意欲限制本发明范围。
[0216] 实施例1
[0217] 表2中阐述针对老龄或超老龄中型犬或小型犬调配的组合物。
[0218] 表2
[0219] 针对超老龄中型犬或小型犬的成分组成
[0220]成分 组合物%
碳水化合物 65.83
动物蛋白 14.31
植物蛋白 6.05
动物/植物脂肪 6.60
ω脂肪 3.38
纤维 1.42
矿物质 1.63
维生素 0.78
[0221] 实施例2
[0222] 表3中阐述针对老龄或超老龄大型犬调配的组合物。
[0223] 表3
[0224] 针对超老龄大型犬的成分组成
[0225]成分 组合物%
碳水化合物 65.15
动物蛋白 14.79
植物蛋白 6.45
动物/植物脂肪 6.23
ω脂肪 4.12
纤维 1.30
矿物质 0.91
维生素 1.05
[0226] 实施例3
[0227] 表4中阐述针对老龄或超老龄猫调配的组合物。
[0228] 表4
[0229] 针对超老龄猫的成分组成
[0230]成分 组合物%
碳水化合物 31.47
动物蛋白 25.57
植物蛋白 20.14
动物/植物脂肪 13.31
ω脂肪 1.61
纤维 4.80
矿物质 1.77
维生素 1.34
[0231] 实施例4
[0232] 对照对比超老龄宠物食品的基因组分析
[0233] 为了进一步表征本发明超老龄宠物食品组合物的营养益处,分析了来自饲喂所述组合物的动物与对照动物的基因表达概况的比较,结果在以下详述。
[0234] 材料和方法
[0235] 研究设计
[0236] 在给9只Beagle犬饲喂14天超老龄K9饮食之前及之后,按常规方法从其
抽取血液样品(总共18个样品)。将在14天试验后采集的每一个样品与其自己的对照进行比较。
[0237] 从犬血液分离淋巴细胞
[0238] 试剂
[0239] 4ml犬血、肝素或EDTA试管、Hank平衡盐溶液(Gibco 14175-095)、HEPES缓冲液(Gibco 15630-080)、Accu-Paque(Accurate 化学& Scientific Corp AN3100)。
[0240] 材料/设备
[0241] 转移移液管(VWR 14670-147)、14ml离心管w/caps、9″巴斯德移液管、1.5ml微离心管(VWR 20170-038)、离心管架、微离心管架、垃圾箱、Beckman Coulter Allegra 25R离心机、SN AJC01J015 Eppendorf离心机,5417C。
[0242] 溶液
[0243] 通过将12.8ml的HEPES缓冲溶液加到500ml的HBSS瓶中来制备Hank平衡盐溶液(HBSS)w/25mM HEPES缓冲液。在开始分离淋巴细胞之前,需要将Hank平衡盐溶液和Accu-Paque从
冰箱中取出放在室温至少30分钟。在使用后应立即将这两种溶液放回到冰箱(4℃)中。
[0244] 程序
[0245] 1.量取4ml的HBSS w/HEPES到正确编号的14ml离心管(每4ml抽取的血液一管)中。
[0246] 2.用转移移液管将4ml血液从 管转移到含有HBSSw/HEPES的14ml离心管中。
[0247] 3.用转移移液管上下吹吸30秒彻底混合样品。
[0248] 4.将9″巴斯德移液管插入到每一个14ml的离心管中。确保巴斯德移液管的底部尖端接触到离心管的底部。
[0249] 5.通过让液体在巴斯德移液管内往下流用转移移液管缓慢加入4ml的Accu-Paque,靠重力使Accu-Paque分层至稀释的血液样品以下。
[0250] 6.用
手指塞住巴斯德移液管上端慢慢移走该移液管。
[0251] 7.于室温让管以800xg离心20分钟。对于幼犬,血液需要更长的45分钟离心以使RBC从WBC充分分离。
[0252] 8.用转移移液管小心移走顶层到0.5cm中间不透明层内并弃掉。
[0253] 9.用新的转移移液管小心移走中间不透明层并转移到1.5ml的微离心管中。小心不要转移任何底层。
[0254] 10.于室温让微离心管以13,200rpm离心3.5分钟。
[0255] 11.小心移走上清液,在液氮中快速冷冻剩下的沉淀(淋巴细胞)。将最终样品储存在-80℃。
[0256] RNA分离
[0257] 试剂
[0258] 去 离子 H2O、纯 乙 醇 (Sigma E7023)、RNA 储 液 (Ambion 7000)、RNA 酶缓冲液RLT、缓冲液RW1和缓冲液RPE(提供在RNeasy Mini试剂盒中)。
[0259] 设备/材料
[0260] RNeasy Mini试剂盒(Qiagen 74104)、QIAshredder离心柱(Qiagen 79656)、P1000 Pipetman移液管(Rainin)、P200 Pipetman移液管(Rainin)、100-100μl过滤的移液管头(USA Scientific 1126-7810)、1-200μl过滤的移液管头(USA Scientific1120-8810)、无菌转移移液管(VWR 14670-147)、55ml无菌试剂槽(VWR 21007-974)、
2个垃圾箱(一个用于液体,一个用于移液管头/移液管)、1.5ml无菌微离心管(VWR
20170-038)、微离心管架、永久标记、Eppendorf微型离心机,model#5417C。
[0261] 程序
[0262] 1.通过稍微融化然后轻拍微离心管移动沉淀来使管中的沉淀化开。
[0263] 2.加入适当体积的缓冲液RLT(在本情况中用600μl)。
旋涡振荡或移液管吹吸以混合。
[0264] 3.将样品转移到QIAshredder管中使样品均质化。以14,000rpm离心2分钟。弃掉离心柱但保留收集管及其内容物。
[0265] 4.将一体积(600μl)的70%
乙醇加到均质化的裂解物中,移液管吹吸混合。
[0266] 5.将600μl等份样的样品加到置于2ml收集管中的RNeasy mini柱上。轻轻合
上管,以14,000rpm离心15秒。弃掉滤液。将第二份细胞裂解物600μl等份样加到同一个离心柱中重复步骤。弃掉滤液。
[0267] 6.重新使用步骤5的收集管。将700μl缓冲液RW1加到柱中。以14,000rpm离心15秒。弃掉滤液和收集管。
[0268] 7.将柱转移到新的2ml收集管中,吸取500μl缓冲液RPE到柱中。以14,000rpm离心15秒以洗涤柱。弃掉滤液但保留收集管用于步骤8。
[0269] 8.将另一500ml缓冲液RPE加到柱中。以14,000rpm离心2分钟来干燥膜。
[0270] 9.将柱转移到新的1.5ml收集管中。将10μl的RNA储液直接吸取到膜上。以14,000rpm离心1分钟来洗脱RNA。将第二个5μl体积的RNA储液直接加到膜上,再离心
1分钟。将最终RNA洗脱物储存在-80℃。
[0271] RNA探针制备和杂交
[0272] 试剂
[0273] Ovation TM Biotin系统v1.0用于探针制备。
[0274] 方案
[0275] 用户指南(Cat#D01002,版本10/27/04,NuGEN Technologies,Inc)。如用户指南所述实施实验程序。用50ng总RNA开始所有探针制备。
[0276] 基因芯片程序
[0277] 检测所用基因芯片为犬基因组2.0阵列(Canine Genome 2.0 Array)(Affymetrix)。这种基因芯片含有44,000套探针。可自制造商获得每一独特探针的识别号的详细序列信息。
[0278] 基因表达分析
[0279] 用GCOS Affymetrix
软件(版本1.2)提供的MAS 5实施标准化。在以下实施例中包括的表中标明所分析的基因的表达水平,其中向上的箭头指基因表达″上调″或增加,向下的箭头表示基因表达″下调″。类似地,在某些表中向上或向下的箭头亦表示某些参与特定途径的蛋白质的活性增加或降低,要另外看其自身解释。
[0280] 基因目录选择
[0281] 基于18个样品中至少9个“存在”呼应(call),选择15,411个基因用于进一步分析。
[0282] 基因芯片分析结果表明,在对照和超老龄饮食处理组之间,有1088个基因存在表达差异。当由′饮食′来分组时这1088个基因的表达水平统计学上显著;用参数检测,其中不假设方差相等(Welch t-test)。未进行多次检测校正的P值截断值(cutoff)为0.01。在这些选择标准下,预期仅约154个基因偶然通过限制。以下详细论述基因组数据。
[0283] 结果
[0285] 基于基因芯片数据分析,与对照的表达水平(10个上调,其余下调)比较,1,088个基因表达水平以P<0.01的水平改变。数据表明饲喂超老龄食品的Beagle犬中35个基因表达以P<0.001的水平下调。这些下调基因中9个鉴定为与炎症及疼痛反应有关。可预期这些基因下调导致疼痛减缓、软骨保护(较少损伤)和降低炎性反应。本文公开的组合物可为治疗罹患疼痛和/或炎性疾病的动物的
治疗方案的部分。在下表5-6中提供这些基因及其推定的在炎症和疼痛反应中的作用。
[0286] 表5:参与炎症和疼痛反应的基因(P<0.001)
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0291] 表6.下调参与类二十烷酸途径(炎性反应)的酶作用的概述
[0292]
[0293]
[0294] 营养对参与心脏健康和血液
凝固的基因的作用
[0295] 以P<0.001和P<0.01的水平鉴定12个基因通过调节类二十烷酸途径和血液凝固途径与心脏健康有关。所述基因通过血小板激活和聚集造成血液凝固。通过营养下调这些基因可
预防可导致心脏或脑相关疾病的不当血凝。本发明组合物可为治疗罹患血液、心脏或脑病症或疾病的动物的治疗方案的部分。这些基因及其推定的体内作用阐述于下表7和8中。
[0296] 表7.参与心脏健康和血液凝固的基因
[0297]
[0298]
[0299]
[0300] 表8:下调参与心脏健康和血液凝固的酶的作用概述
[0301]
[0302]
[0303] 营养对参与肌肉调节及骨调节的基因的作用
[0304] 鉴定了通过调节骨骼及肌肉涉及身体组成的10个下调的基因。所述基因通过减少氧化氮的产生及肌肉糖皮质激素降解来减轻肌肉及骨骼退化。下调这些基因导致减少氧化氮的产生和糖皮质激素反应。本文公开的组合物可为治疗罹患与肌肉或骨骼关联或相关的疾病或病症的动物的治疗方案的部分。这些基因及其在肌肉及骨骼调节中的推定作用详述于下表9和10中。
[0305] 表9.参与肌肉及骨骼调节的基因
[0306]
[0307]
[0308] 表10:影响糖皮质激素受体和氧化氮产生的基因概述
[0309]
[0310]
[0311] 营养对参与DNA损伤/保护和神经功能的基因的影响
[0312] 鉴定了与DNA损伤/保护和神经功能有关的11个基因。关于后者,鉴定的基因对反弹增强(rebound potentiation)很重要;认为它们在运动学习中具有潜在的作用。有趣的是,除了γ-氨基丁酸(GABA)A受体γ2上调外,这些基因全部下调。本文公开的组合物可为治疗罹患与DNA损伤/保护和神经功能关联或相关的疾病或病症的动物的治疗方案的部分。这些基因的特性及其在DNA损伤/保护和神经功能中的推定作用详述于下表11和12中。
[0313] 表11:参与DNA损伤/保护和神经功能的基因
[0314]
[0315]
[0316]
[0317] 表12:对反弹增强和DNA完整性重要的基因的概述
[0318]
[0319]
[0320] 营养对参与葡萄糖代谢的基因的作用
[0321] 在饲喂超老龄饮食动物中有24个与葡萄糖代谢相关的基因下调,这表明这些动物利用脂肪(脂肪氧化)代替葡萄糖作为养料来源。本文公开的组合物可为糖尿病动物和/或用于动物的
肥胖症预防或治疗的治疗方案的部分。鉴定了这些下调的基因,它们在葡萄糖代谢中的推定作用详细阐述于表13和14中。
[0322] 表13.参与葡萄糖代谢的基因
[0323]
[0324]
[0325]
[0326]
[0327]
[0328]
[0329]
[0330] 表14.参与葡萄糖代谢基因概述
[0331]
[0332]