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靶向抗癌SOD的构建与表达的方法

阅读:333发布:2021-04-13

专利汇可以提供靶向抗癌SOD的构建与表达的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种pET-SOD工程菌的构建及其表达纯化方法,本发明通过下述技术方案予以实现:设计引物从含念珠藻CHEN Fe-SOD的pET-SOD质粒中扩增获得Fe-SOD基因;设计引物从含ScFv的T-ScFv质粒扩增获得ScFv基因;酶切Fe-SOD基因和ScFv基因后重组得到SOD-ScFv融合基因,并重组进pET28a(+)质粒载体,构建得到Pet-SOD-ScFv融合载体,转化至感受态大肠杆菌BL21,得到Pet-SOD-ScFv工程菌;加入IPTG和Fe3+诱导,SOD-ScFv获得表达。利用本发明,SOD-ScFv获得高效表达,提高了SOD对 肿瘤 细胞的识别、 定位 和透膜能 力 。,下面是靶向抗癌SOD的构建与表达的方法专利的具体信息内容。

1、一种抗癌SOD的构建的方法,其特征在于依次包括以下步骤:
(1)从含念珠藻CHEN Fe-SOD(Nostoc commune strain CHEN Fe-SOD)的 pET-SOD质粒中TD-PCR扩增获得Fe-SOD基因;
TD-PCR扩增所用引物:
SOD-Nco:5’-CATGCCATGGCATTTGTACAGCTCCCACTACCCTTTG含Nco I位点,
SOD-Sal:5’-GCGTCGACTCCGCCTCCACCAGCTTTGGCCAAGTTTTC含Sal I位点,
引物SOD-Sal去除Fe-SOD基因序列3’端的TAA终止密码子,并在其末端 加上编码GGGG的密码子,即:GGCGGAGGCGGA;
(2)以含ScFv的T-ScFv质粒为模板TD-PCR扩增获得ScFv基因;
TD-PCR扩增所用引物:
ScFv-Sal:5’-ACGCGTCGACGTCCAACTGCAGGAGTCAGG含Sal I位点,
ScFv-Not:5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATTTGATCTCGAGCTTGGTC含Not I位点;
引物ScFv-Not末端含TAG终止密码子;
(3)以Nco I,Sal I酶切步骤(1)得到的Fe-SOD基因;
(4)以Sal I,Not I酶切步骤(2)得到的ScFv基因;
(5)将步骤(3)和(4)得到的基因重组得到SOD-ScFv融合基因,并重组 进经Nco I,Not I酶切的pET28a(+)质粒载体,控制此融合基因5’端与T7 启动子之间的距离,构建得到Pet-SOD-ScFv融合载体;
(6)将Pet-SOD-ScFv融合载体转化至感受态大肠杆菌BL21,命名为 Pet-SOD-ScFv工程菌。
2、根据权利要求1所述的一种抗肺癌SOD的构建的方法,其特征在于:其 纯化方法依次包括以下步骤:
(1)离心收集菌体,声波破碎菌液,获得SOD-ScFv包涵体沉淀;
(2)将沉淀分别用包涵体裂解液I和包涵体裂解液II洗涤两次;
(3)置于含SLS的变性液中变性,并过Sephadex-G100分子筛柱,纯化融 合蛋白并加Fe3+复性。
3、根据权利要求2所述的一种抗肺癌SOD的构建的方法,其特征在于:其 中步骤(3)中的Fe3+为FeCl3。
4、根据权利要求2所述的一种抗肺癌SOD的构建的方法,其特征在于:其 中步骤(3)中的加Fe3+的量为100umol/ml培养基。
5、一种如权利要求1所述的抗肺癌SOD的表达方法,其特征包括以下步骤: 加入IPTG和Fe3+诱导表达,SOD-ScFv获得表达。
6、根据权利要求5所述的一种抗肺癌SOD的表达方法,其特征在于:在菌 液OD600为0.4时加IPTG和Fe3+。
7、根据权利要求5所述的一种抗肺癌SOD的表达方法,其特征在于:诱导 表达时间为2小时。
8、根据权利要求5所述的一种抗肺癌SOD的表达方法,其特征在于:所加 入的Fe3+为FeCl3。
9、根据权利要求5所述的一种抗肺癌SOD的表达方法,其特征在于:所加 入的Fe3+的浓度为100~300umol/ml培养基。

说明书全文

技术领域

发明涉及基因工程制药领域,特别涉及一种高定位及透膜能力的抗 癌SOD的构建及其高效表达的方法。

背景技术

临床上,SOD作为肿瘤治疗药物有两个难以同时克服的应用缺陷:其一SOD 对病理组织或细胞并无特异性识别能力,且对靶部位即肿瘤细胞的亲和力低, 药用趋向性不明显,对癌症缺乏特异性作用;其二,它必须进入细胞,才能发 挥其生物学作用,天然SOD由于其分子量较大而基本不能进入细胞内。ScFv在 保持抗原抗体结合特异性的同时具有较小的分子量,易于到达靶组织,是较为 理想的靶向分子。LC-1型ScFv,它可以高效作用于所有4种病理类型的肺癌细 胞,包括肺腺癌细胞,肺鳞状癌细胞,肺大癌细胞和肺小癌细胞,但不作用于 正常细胞和组织。同时,它可以识别并结合到肺癌细胞表面抗原,通过受体调 节的内吞途径而透膜。SOD-ScFv将利用ScFv对肺癌细胞的识别能力和结合能力, 靶向定位到肿瘤局部,并透膜发挥其抗肿瘤药效。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处,本发明提供一种具有高定位能力及透膜 能力的抗肺癌SOD的构建和表达方法。
其构建方法包括以下步骤:
(1)从含念珠藻CHEN Fe-SOD(Nostoc commune strain CHEN Fe-SOD)的 pET-SOD质粒中TD-PCR扩增获得Fe-SOD基因;
TD-PCR扩增所用引物:
SOD-Nco:5’-CATGCCATGGCATTTGTACAGCTCCCACTACCCTTTG含Nco I位点,
SOD-Sal:5’-GCGTCGACTCCGCCTCCACCAGCTTTGGCCAAGTTTTC含Sal I位点,
引物SOD-Sal去除Fe-SOD基因序列3’端的TAA终止密码子,并在其末端 加上编码GGGG的密码子,即:GGCGGAGGCGGA;
(2)以含ScFv的T-ScFv质粒为模板TD-PCR扩增获得ScFv基因;
TD-PCR扩增所用引物:
ScFv-Sal:5’-ACGCGTCGACGTCCAACTGCAGGAGTCAGG  含Sal I位点,
ScFv-Not:5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATTTGATCTCGAGCTTGGTC含Not I位点; 引物ScFv-Not末端含TAG终止密码子;
(3)以Nco I,Sal I酶切步骤(1)得到的Fe-SOD基因;
(4)以Sal I,Not I酶切步骤(2)得到的ScFv基因;
(5)将步骤(3)和(4)得到的基因重组得到SOD-ScFv融合基因,并重 组进经Nco I,Not I酶切的pET28a(+)质粒载体,控制此融合基因5’端与T7 启动子之间的距离,构建得到Pet-SOD-ScFv融合载体;
(6)将Pet-SOD-ScFv融合载体转化至感受态大肠杆菌BL21,命名为 Pet-SOD-ScFv工程菌。
其纯化方法依次包括以下步骤:
(1)离心收集菌体,声波破碎菌液,获得SOD-ScFv包涵体沉淀;
(2)将沉淀分别用包涵体裂解液I和包涵体裂解液II洗涤两次;
(3)置于含SLS的变性液中变性,并过Sephadex-G100分子筛柱,纯化融 合蛋白并加Fe3+复性。
其中步骤(3)中的Fe3+为FeCl3。
其中步骤(3)中的加Fe3+的量为100umol/ml培养基。
抗肺癌SOD的表达方法,包括以下步骤:
加入IPTG和Fe3+诱导表达,SOD-ScFv获得表达。
作为表达方法的一种改进,在菌液OD600为0.4时加IPTG和Fe3+。
作为表达方法的另一种改进,诱导表达时间为2小时。
作为表达方法的另一种改进,所加入的Fe3+为FeCl3。
作为表达方法的进一步改进,所加入的Fe3+的浓度为100~300umol/ml培养 基。
本发明还提供了按照上述构建所生产的pET-SOD-ScFv工程菌。
本发明具有如下优点:
1、去除了SOD序列末端的终止密码子TAA,并以4个Gly与ScFv相连接,甘 酸是侧链最短的氨基酸,这将最大可能减小SOD与ScFv的空间干扰,保证两者生 物学活性。
2、将融合蛋白基因序列克隆于pET28a(+)质粒载体的Nco I和Not I位点之 间,且融合蛋白前端不带任何信号肽序列,末端不带任何标签,这消除了多余 氨基酸残基对融合蛋白活性可能造成地潜在影响。
3、融合蛋白SOD-ScFv诱导表达过程中加入300μM FeCl3,最终SOD-ScFv 获得高效表达,表达产物占全菌蛋白79%,为国内罕见。
4、SOD-ScFv融合蛋白将两者功能合而为一。既可以提高SOD对肿瘤细胞的 识别和定位能力,即靶向性,又可以克服SOD不能透膜的局限性,因此,它将具 有比SOD更高抗肿瘤能力。
本人已申请专利“pET-SOD工程菌的构建及其高效表达”,在该申请中已详 述pET-SOD工程菌的构建及其高效表达。
附图说明
图1是SOD-ScFv融合基因序列图谱;
图1中斜体部分代表SOD,黑体部分代表ScFv;
图2是SOD-ScFv融合蛋白表达图谱;
图2中1-Marker;2-单独表达的SOD蛋白;3、4、5-[Fe3+]=300uM、200uM、 100uM时表达的SOD-ScFv融合蛋白;6-未诱导时的全菌蛋白;7-空白;8- SOD-ScFv包涵体;9-纯化后SOD-ScFv;
图3是不同浓度SOD-ScFv对SPC-A-1肺腺癌细胞的抑制试验示意图;
图4是SOD-ScFv对SPC-A-1肺腺癌细胞、AGS胃癌细胞、HepG2肝癌细胞的抑 制试验示意图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步对本发明进行描述:
实施例1、念珠藻基因组SDS-CATB制备方法:
(1)取1ml念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN)培养物,用 TE缓冲液洗涤两次,充分碾磨备用;其中TE缓冲液:Tris 50mM,EDTA 20mM, pH8。
念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN)购自中科院武汉生所FACHB。
(2)加入567μl的TE缓冲液,拌匀,于液氮中反复冻融3次。
(3)加入30μl 10%SDS和3μl 20mg/ml的蛋白酶K,混匀,37℃保 温1h。
(4)加入100μl的5mol/L NaCL,充分混匀,再加入80μl的CATB/NaCL混匀,在65℃下保温10min。
CATB/NaCL:2%CTAB、100mmoI/L Tris.HCI(pH 8.0)、20mmol/L EDTA、 1.4mol/L NaCl。
(5)加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1),混匀,离心5min。将上清液转 移至另一新管中。
(6)加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),混匀,离心5min, 将上清转移至另一新管中。
(7)加入0.6体积的异丙醇,轻轻混匀至DNA沉淀下来(30min),离心5 min,弃上清,用70%乙醇洗涤一下沉淀。离心5min。
(8)将其溶于100μl的TE中,加入RNA酶,直至终浓度50μg/ml,置于 37℃水浴30min。
(9)加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1),混匀。离心5min。转移上清液 至新管中。
(10)加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),混匀,离心5min, 将上清转移至另一新管中。
(11)加入0.6体积的异丙醇,轻轻混匀至DNA沉淀下来(30min),离心 5min,弃上清,用70%乙醇洗涤一下沉淀,离心5min。
(12)弃去上清,沉淀干,用20μl的TE缓冲溶液溶解DNA,然后加入 两倍体积无水乙醇,放入4℃箱沉淀30min.最终溶于20μl TE。
实施例2、构建pET-SOD工程菌:
(1)在无菌条件下,将念珠藻CHEN藻种2ml接入1000mlBG11培养基中, 于25℃,2000XL光照强度每天光照10小时,并摇瓶一次。培养45天后,取下 层培养物,采用Kim的SDS-CATB法抽提念珠藻基因组。
(2)查询Genbank数据库中现有物种Fe-SOD基因序列,blastn比对分析 它们的同源性,预测其进化趋势,并根据同源性最高物种(Spirulina platensis,Nostoc linckia等)的Fe-SOD基因序列设计出引物SODn: (5’-CTAGCCATGGCATTTG TACAGC-3’,含Nco I酶切位点)和SODx: 5’-CCGCTCGAGAGCTTTGGCCAAGTTTTC-3’,含Xhol I酶切位点)。以念珠藻基因 组为模板,以SODn和SODx为引物,扩增Fe-SOD基因,
PCR程序为:
第一阶段:94℃     5min,
第二阶段:94℃     50s
          50℃     60s
          72℃     60s
第二阶段循环40次,最后一个循环最后一步保持72℃ 10min;
回收PCR产物,以Nco I和Xhol I酶切,并重组至经相同酶切的pET22b(+) 质粒,SOD基因末端与6×His标签的基因序列相连,重组质粒命名为pET-SOD, 并转化感受态E.coli.BL21,通过PCR和酶切的方法筛选出阳性克隆,最后测 序确定正确的阳性克隆。
pET22b(+)质粒购自Invitrogen公司。
实施例3、构建T-ScFv工程菌:
(1)以杂交瘤细胞株LC-1总RNA逆转录产物cDNA(Liang CHEN,Gang LI,Lei TANG,Jue WANG,Xi Rui GE.The inhibition of lung cancer cell growth by intracellular immunization with LC-1ScFv.Cell Research (2002),12(1)47-54)为模板,以Vl-1(5’-GACATTGAGCTCACCCAGTCTC-3)和Vl-2 (5’-CTATTTGATCTCGAGCTTGGTC-3’)为轻链引物PCR扩增LC-1抗体轻链基因 Vl,以Vh-1(5’-CTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGC GGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTC-3)和Vh-2 (5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCAG-3)为重链引物PCR扩增LC-1抗体 重链基因Vh。PCR程序同实施例2。
(2)以Vl与Vh为引物,不用模板,用SOE-PCR将Vl与Vh相连,构建ScFv, SOE-PCR程序为:
第一阶段:94℃      5min,
第二阶段:94℃      50s
50℃   60s
72℃   60s
第二阶段循环5次,最后一个循环最后一步保持72℃ 10min;
以上PCR产物为模板,Vh-2和Vl-1为引物,扩增ScFv基因,PCR程序同实施 例2。
回收PCR产物,克隆至pUCm-T载体(美国,Novagen公司),构建成T-ScFv载 体,并转化感受态E.coli.DH5α,通过PCR和酶切的方法筛选出阳性克隆,最后 测序确定正确的阳性克隆。
实施例4、Pet-SOD-ScFv工程菌的构建:
(1)合成引物SOD-Nco,5’-CATGCCATGGCATTTGTACAGCTCCCACTACCCTTTG, 含Nco I位点和SOD-Sal,5’-GCGTCGACTCCGCCTCCACCAGCTTTGGCCAAGTTTTC,含 Sal I位点和GGGG密码子,从含念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN) Fe-SOD的pET-SOD质粒中TD-PCR扩增获得Fe-SOD基因,扩增条件为:
第一阶段:94℃      5min,
第二阶段:94℃      30s
          60℃      60s
          72℃      60s
第二阶段循环10次,每个循环的第二步降低1℃,至50℃;
第三阶段:94℃      30s
          50℃      60s
          72℃      60s
第三阶段循环21次,最后一个循环最后一步保持72℃ 10min;
引物SOD-Sal不含Fe-SOD基因序列3’端的TAA终止密码子,并在其末端 加上编码GGGG的密码子(GGCGGAGGCGGA),并克隆至ScFv基因的5’端。
(2)合成引物ScFv-Sal,5’-ACGCGTCGACGTCCAACTGCAGGAGTCAG G,含Sal I位点和ScFv-Not,5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATTTGATCTCGAGCTTGGTC,含Not I 和TAG中止密码子,以含ScFv的T-ScFv质粒为模板TD-PCR扩增获得ScFv基因。
扩增条件为:
第一阶段:94℃      5min,
第二阶段:94℃      30s
          65℃      55s
          72℃     60s
第二阶段循环10次,每个循环的第二步降低1℃,至55℃;
第三阶段:94℃     30s
          55℃     60s
          72℃     60s
第三阶段循环21次,最后一个循环最后一步保持72℃ 10min;
引物ScFv-Not末端贴加了TAG终止密码子,保证表达出来的融合蛋白C端不 带任何多余潜在影响蛋白活性的氨基酸残基。
(3)以Nco I,Sal I酶切以上Fe-SOD基因,以Sal I,Not I酶切以上ScFv 基因,重组得到SOD-ScFv融合基因,并重组至经Nco I,Not I酶切的pET28a(+) 载体(美国,Novagen公司),控制此融合基因5’端与T7启动子之间的距离,保 证融合蛋白N端不带任何潜在影响蛋白活性的氨基酸残基,并获得非常高效地表 达。构建得到Pet-SOD-ScFv融合载体,转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3),通过 PCR和酶切的方法筛选出阳性克隆,最后测序确定正确的阳性克隆。
实施例5、表达:
(1)培养pET-SOD-ScFv工程菌在1L LB培养基中,控制Kam=50PM/L,30℃ 培养至OD600=0.4时,0.5mM IPTG,300μM FeCl3条件下诱导表达2小时。
(2)5000g离心10min收集以上菌体,溶于50ml TE,于800w,超声波破碎 菌液10min,12000g离心30min收集上清和沉淀,沉淀为SOD-ScFv包涵体,分别 进行10%SDS-PAGE电泳
电泳结果表明在最佳条件:Kam=50μM/L,30℃,0.5mM IPTG,300μM FeCl3 条件下诱导表达2小时工程菌获得高效表达,其分子量约49KD,约占全菌蛋白的 79%(图2,泳道3)
实施例6:
如同实施例4步骤,其中FeCl3的量为200uM。
电泳结果表明:目标蛋白占全菌蛋白的75%,(图2,泳道4)
实施例7:
如同实施例4步骤,其中FeCl3的量为100uM。
电泳结果表明:目标蛋白占全菌蛋白的69%,(图2,泳道5)
实施例8:
如同实施例4步骤,其中不加IPTG和FeCl3。
电泳结果表明:工程菌不表达(图2,泳道6)。
实施例9、纯化、复性及保存:
(1)将实施例4获得的SOD-ScFv全部包涵体沉淀分别用50ml包涵体裂解液 I和50ml包涵体裂解液II洗涤两次,再用50ml 50mmol/L Tris-Hcl,0.3%SLS, 0.1mmol/L二硫苏糖醇的缓冲液溶解过夜。
包涵体裂解液I:1mM EDTA,5%甘油,0.5%Triton X-100;包涵体裂 解液II:包涵体裂解液I加2mol/L尿素。
(2)取10ml变性液过200ml Sephadex-G100分子筛柱,流速控制在 0.2ml/min,以2倍柱体积的TE洗脱,每份4ml分管收集,监测A280。对含蛋白洗 脱液收集管进行10%SDS-PAGE电泳。
电泳结果表明纯化后的目标蛋白比较单一,不含其它杂蛋白(图2,泳道9)。
(3)4℃下,将以上纯化获得的全部SOD-ScFv变性蛋白置于含100μM FeCl3, 不含SLS的变性缓冲液透析复性72h。获得蛋白纯品以ddH2O于4℃下透析24h,于 -80℃冻干,液氮保存;
其中步骤(2)中TE为20mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH8.0。
实施例10、SOD活性测定:
将纯化后的SOD-ScFv融合蛋白用Marklund[15]的邻苯三酚自化法测定融 合蛋白在325nm处的自氧化抑制率。控制邻苯三酚自氧化速率约0.07OD/min,抑 制率约50%,计算蛋白比活力。纯化后SOD-ScFv比活力为650U/mg。
实施例10、SOD-ScFv靶向杀伤能力测定:
将SPC-A-1肺腺癌细胞接种90μl(5×105个细胞/毫升)于96孔板,同时以 AGS胃癌细胞,HepG2肝癌细胞做对照,37℃,二氧化(5%)培养箱中培养24h。 按设定的浓度梯度(0.2μM,0.5μM,1μM,2μM)加融合蛋白10μl,对照组加 PBS,相同梯度浓度下表达获得的SOD,混匀,继续培养48h。按CCK-8试剂盒所 示,每孔加入CCK-8试剂10μl,混匀,继续培养1h,450nm下测定吸收吸光度, 进行细胞计数。
结果如图3所示:48小时后,0.2μM SOD对SPC-A-1肺腺癌细胞的抑制率为 5.3%,0.2uM SOD-ScFv对SPC-A-1肺腺癌细胞的抑制率为48.4%,IC50为0.21μ M。
而0.2uM SOD-ScFv对AGS胃癌,HepG2肝癌细胞,抑制率分别为4.6%,2.7 %(图4)。这表明了融合蛋白具有对SPC-A-1肺腺癌细胞的专一作用能力,且具 有较SOD更强的肿瘤细胞生长抑制能力。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然, 本发明不限于以上实施例子,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从 本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范 围。
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