温度/pH双敏感多肽无规共聚物及其合成方法和水凝胶体系
技术领域
[0001] 本
发明属于刺激响应
生物可降解材料技术领域，特别涉及一种温度/pH双敏感多肽无规共聚物及其合成方法和水凝胶体系。
背景技术
[0002] 刺激响应
聚合物也称为“智能”聚合物，可以响应环境刺激(如温度、pH值、离子强度、光、生物分子等)而发生化学结构或物理性质变化。在所有刺激响应性聚合物中，聚
氨基酸由于其
生物相容性和
生物可降解性而具有特殊的应用价值。
[0003] 水凝胶是通过化学或物理交联形成的三维亲水或两亲性聚合物网络，具有一定的物理刚性，可以由天然的高分子或合成的聚合物制得。水凝胶的高
含水量、可控的尺寸形态、可控的机械性能以及多来源所提供的化学多样性为其在组织工程和药物控制释放等领域提供了诱人的应用前景。
[0004] 近十年来，温敏性水凝胶作为可注射使用的活性组分储存体系而备受瞩目。Jeong等合成了聚乙二醇-b-聚(L-丙氨酸-co-L-苯丙氨酸))PEG-b-PAla-co-PLPhe)共聚物(Journal of Controlled Release，2009，137(1)：25-30)，其水凝胶在PBS中可以稳定存在，当皮下注射到小鼠体内后而在随后的16天内释放曲线是一条扩散控制释放曲线。将含有胰岛素的聚合物溶液皮下注射到糖尿病小鼠体内后，在18天内保持显著的降血糖作用。
[0005] 人体内环境复杂，刺激因素多，在温敏性聚氨基酸水凝胶的
基础上进一步引入其它刺激响应因素构建具有双重响应功能的水凝胶材料更能满足水凝胶在实际应用中的要求。许多氨基酸由于R基团带有羧基或者氨基，可以对pH的变化产生响应，而人体环境之中就有pH的变化，如正常血液pH为7.4，而
肿瘤部分pH偏低为6.8，肿瘤细胞内部更低为6.2，所以pH敏感材料能够在人体内实现刺激响应。制备温度/pH双敏感多肽水凝胶材料对于药物装载、靶向释药等领域具有重要的应用价值。
发明内容
[0006] 本发明的目的是基于以聚乙二醇单甲醚为温敏性链段、以聚谷氨酸为pH敏感性链段、以聚缬氨酸为疏水性链段，提供一种温度/pH双敏感多肽无规共聚物及其合成方法和水凝胶体系。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 一种温度/pH双敏感多肽无规共聚物，该共聚物是以聚乙二醇单甲醚为亲水性链段、以聚谷氨酸为阴离子性链段、以聚缬氨酸为疏水性链段构成的聚乙二醇-聚(谷氨酸-r-缬氨酸)多肽无规共聚物，其中，聚谷氨酸链段的含量是6.5～30.5wt％，聚缬氨酸的含量是23.2～44.1wt％，聚乙二醇单甲醚的含量是46.5～49.5wt％。
[0009] 进一步的，所述亲水性链段聚乙二醇单甲醚的数均分子量为1000。
[0010] 一种上述温度/pH双敏感多肽无规共聚物的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0011] S1：按比例称取以下材料：
[0012] 引发剂：端氨基聚乙二醇单甲醚，1g；
[0013]
溶剂：引发剂：端氨基聚乙二醇单甲醚1g；
[0014] 溶剂：三氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺混合溶剂6ml，三氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺体积比为2：1；
[0015] 反应原料：N-羧基-α-氨基-L-缬氨酸环内酸酐
单体0.72～1.29g，N-羧基-α-氨基-L-苄基谷氨酸环内酸酐单体0.26～1.32g；
[0016] S2：将称取的引发剂加入带有磁
力搅拌的反应容器中，并将反应容器减压抽成
真空；
[0017] S3：向反应容器中加入称量的三氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺混合溶剂，使端氨基聚乙二醇单甲醚溶解；
[0018] S4：待端氨基聚乙二醇单甲醚完全溶解后，加入称量的N-羧基-α-氨基-L-缬氨酸环内酸酐和N-羧基-α-氨基-L-苄基谷氨酸环内酸酐混合单体，然后将反应容器置于一定温度的油浴中，使混合单体进行开环共聚合反应；
[0019] S5：将反应产物用
冰冻乙醚进行沉淀处理，然后过滤，并在真空烘箱中干燥至恒重，获得聚乙二醇-聚(苄基谷氨酸-r-缬氨酸)无规共聚物；
[0020] S6：按比例称取以下材料：
[0021] 反应物：步骤S5所得聚乙二醇-聚(苄基谷氨酸-r-缬氨酸)无规共聚物、溴化氢乙
酸溶液；
[0022] 溶剂：三氟乙酸；
[0023] S7：将聚乙二醇-聚(苄基谷氨酸-r-缬氨酸)无规共聚物加入带有搅拌子的反应容器中，加入三氟乙酸，开启搅拌，使聚乙二醇-聚(苄基谷氨酸-r-缬氨酸)无规共聚物完全溶解；
[0024] S8：置冰浴反应条件，向反应容器中加入溴化氢乙酸溶液，进行脱保护反应；
[0025] S9：将步骤S8的反应产物进行溶解/沉淀处理，然后过滤，并在真空烘箱中干燥至恒重，获得聚乙二醇单甲醚-聚(谷氨酸-r-缬氨酸)多肽无规共聚物。
[0026] 上述温度/pH双敏感多肽无规共聚物的合成方法，所述步骤S4中，混合单体进行开环共聚合反应时，油浴温度为25～40℃。
[0027] 上述温度/pH双敏感多肽无规共聚物的合成方法，所述步骤S4中，混合单体进行开环共聚合反应的反应时间为18～24h。
[0028] 进一步地，所述步骤S8中，脱保护反应时间为4～7h，进一步优选为6h。
[0029] 一种温度/pH双敏感水凝胶体系，由上述温度/pH双敏感多肽无规共聚物制备而成，该温度/pH双敏感水凝胶体系中，温度/pH双敏感多肽无规共聚物的浓度浓度为4～13wt％，pH值为6.2～7.4。
[0030] 在本发明的创新在于：选用谷氨酸作为pH敏感单元，能够在与肿瘤组织相关的较窄的pH范围(6.2～7.4)内实现显著的pH敏感效应，在肿瘤
治疗或肿瘤
切除后续防复发的化疗具有潜在应用价值。
[0031] 本发明的有益效果是：
[0032] 1、本发明制备的温度/pH双敏感多肽无规共聚物，以聚乙二醇单甲醚为温敏性链段、聚谷氨酸为pH敏感性链段、聚缬氨酸为疏水性链段构成，以该多肽无规共聚物所制备的温度/pH双敏感性聚乙二醇-聚(谷氨酸-r-缬氨酸)水凝胶体系，是一种聚多肽-聚醚水凝胶，在室温或室温以下以可流动的溶液形式存在，
粘度小，在人体温度附近可以发生溶胶-凝胶转变，具有良好的生物相容性、可
生物降解性和可注射性，可原位形成凝胶作为药物载体；
[0033] 2、本发明提供的多肽无规共聚物所制备的水凝胶体系含有阴离子，能够响应环境的pH变化表现出不同的凝胶性能，在低pH(pH6.2)下凝胶稳定存在，在高pH(pH7.4)下凝胶易分散，可作为的药物靶向释放载体。
附图说明
[0034] 图1为
实施例1获得的温度/pH双敏感多肽无规共聚物P1所制备的浓度为13wt％、pH为7.4的温度/pH双敏感水凝胶体系在20℃和37℃时的粘度对比图；
[0035] 图2为本发明实施例1获得的温度/pH双敏感多肽无规共聚物P1和实施例1获得的温度/pH双敏感多肽无规共聚物P2在pH7.4、不同浓度的温度/pH双敏感水凝胶体系的溶胶-凝胶转变
相图；
[0036] 图3为实施例1获得的温度/pH双敏感多肽无规共聚物P1在不同pH、不同浓度的温度/pH双敏感水凝胶体系的溶胶-凝胶转变相图。
具体实施方式
[0037] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结和附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0038] 实施例1
[0039] 一种温度/pH双敏感多肽无规共聚物，是以聚乙二醇单甲醚为亲水性链段、以聚谷氨酸为阴离子性链段、以聚缬氨酸为疏水性链段构成的聚乙二醇-聚(谷氨酸-r-缬氨酸)多肽无规共聚物，其中，共聚物中聚谷氨酸链段的含量是30.5wt％，聚缬氨酸的含量是23.2wt％，共聚物中亲水链段单甲醚聚乙二醇的含量是46.5wt％。
[0040] 进一步地，本实施例所述亲水性链段聚乙二醇单甲醚的数均分子量为1000。
[0041] 本实施例的温度/pH双敏感多肽无规共聚物的合成方法包括以下步骤：
[0042] S1：按比例称取材料，包括以下材料：
[0043] 引发剂：端氨基聚乙二醇单甲醚：数均分子量为1000，
质量为1.00g；
[0044] 溶剂：三氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺混合溶剂：6ml，其中，三氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺体积比为2：1；
[0045] 反应原料：N-羧基-α-氨基-L-苄基谷氨酸环内酸酐单体1.32g，N-羧基-α-氨基-L-缬氨酸环内酸酐单体0.72g；
[0046] S2：将称取的引发剂加入带有磁力搅拌的反应容器中，并将反应容器减压抽成真空；
[0047] S3：向反应容器中加入称量的三氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺混合溶剂，使端氨基聚乙二醇单甲醚溶解；
[0048] S4：待端氨基聚乙二醇单甲醚完全溶解后，加入称量的N-羧基-α-氨基-L-苄基谷氨酸环内酸酐和N-羧基-α-氨基-L-缬氨酸环内酸酐混合单体，然后将反应容器置于40℃的油浴中，使混合单体进行开环共聚合反应；
[0049] S5：待反应进行24h后，将反应产物用冰冻乙醚进行溶解/沉淀处理，然后过滤，并在真空烘箱中干燥至恒重，获得无规共聚产物聚乙二醇-聚(苄基谷氨酸-r-缬氨酸)(mPEG-PBLG/PV)；
[0050] S6：按比例称取以下材料：
[0051] 反应物：无规共聚产物mPEG-PBLG/PV、溴化氢乙酸溶液；
[0052] 溶剂：三氟乙酸。
[0053] S7：将无规共聚产物mPEG-PBLG/PV加入带有搅拌子的反应容器中，加入三氟乙酸，开启搅拌，使聚乙二醇-聚(苄基谷氨酸-r-缬氨酸)无规共聚物完全溶解；
[0054] S8：置冰浴反应条件，向容器中加入溴化氢乙酸溶液，进行脱保护反应；
[0055] S9：待反应进行预设时间后，将步骤S8的反应产物溶解/沉淀处理，然后过滤，并在真空烘箱中于一定温度下干燥至恒重的产物聚乙二醇单甲醚-聚(谷氨酸-r-缬氨酸)(mPEG-PGA/PV)。
[0056] 通过上述步骤，得到温度/pH双敏感多肽无规共聚物P1。
[0057] 进一步地，步骤S4中混合单体进行开环共聚合反应时，油浴温度还可以为：25℃、30℃、40℃。
[0058] 进一步地，步骤S4中混合单体进行开环共聚合反应的反应时间还可以为：18h、24h、36h。
[0059] 本实施例的温度/pH双敏感水凝胶体系由本实施例制得的温度/pH双敏感多肽无规共聚物制备而成，该水凝胶体系中共聚物的浓度为13wt％，溶液pH为7.4。
[0060] 进一步地，所述的温度/pH双敏感水凝胶体系中温度/pH双敏感多肽无规共聚物的浓度还可以为：10wt％、11wt％、12wt％、13wt％。
[0061] 进一步地，所述的温度/pH双敏感水凝胶体系中共聚物溶液的pH值还可以为：pH6.2，pH6.8，pH7.4。
[0062] 实施例2
[0063] 一种温度/pH双敏感多肽无规共聚物，是以聚乙二醇单甲醚为亲水性链段、以聚谷氨酸为阴离子性链段、以聚缬氨酸为疏水性链段构成的聚乙二醇-聚(谷氨酸-r-缬氨酸)多肽无规共聚物，其中，共聚物中谷氨酸的含量是18.8wt％，聚缬氨酸的含量是33.2wt％，亲水链段聚乙二醇单甲醚的含量是47.9wt％。
[0064] 进一步地，所述亲水性链段单甲醚聚乙二醇的数均分子量为1000。
[0065] 本实施例温度/pH双敏感多肽无规共聚物的合成方法与实施例1相同。
[0066] 本实施例的温度/pH双敏感水凝胶体系由温度/pH双敏感聚物制备而成，该水凝胶体系中共聚物的浓度为12wt％，溶液pH为7.4。
[0067] 实施例3
[0068] 一种温度/pH双敏感多肽无规共聚物，是以聚乙二醇单甲醚为亲水性链段、以聚谷氨酸为阴离子性链段、以聚缬氨酸为疏水性链段构成的聚乙二醇-聚(谷氨酸-r-缬氨酸)多肽无规共聚物，其中，共聚物中谷氨酸的含量是12.8wt％，聚缬氨酸的含量是38.6wt％，亲水链段聚乙二醇单甲醚的含量是48.7wt％。
[0069] 进一步地，所述亲水性链段单甲醚聚乙二醇的数均分子量为1000。
[0070] 本实施例温度/pH双敏感多肽无规共聚物的合成方法与实施例1相同。
[0071] 本实施例的温度/pH双敏感水凝胶体系由温度/pH双敏感多肽无规共聚物制备而成，该水凝胶体系中共聚物的浓度为11wt％，溶液pH为7.4。
[0072] 实施例4
[0073] 一种温度/pH双敏感多肽无规共聚物，是以聚乙二醇单甲醚为亲水性链段、以聚谷氨酸为阴离子性链段、以聚缬氨酸为疏水性链段构成的聚乙二醇-聚(谷氨酸-r-缬氨酸)多肽无规共聚物，其中，共聚物中谷氨酸的含量是6.4wt％，聚缬氨酸的含量是44.1wt％，亲水链段聚乙二醇单甲醚的含量是49.5wt％。
[0074] 进一步地，所述亲水性链段聚乙二醇单甲醚的数均分子量为1000。
[0075] 本实施例的温度/pH双敏感多肽无规共聚物的合成方法包括以下步骤：
[0076] S1：按比例称取材料，包括以下材料：
[0077] 引发剂：端氨基聚乙二醇单甲醚：数均分子量为1000，质量为1.00g；
[0078] 溶剂：三氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺混合溶剂：6ml，其中，三氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺的体积比为2:1；
[0079] 反应原料：N-羧基-α-氨基-L-苄基谷氨酸环内酸酐单体0.26g和N-羧基-α-氨基-L-缬氨酸环内酸酐单体1.28g；
[0080] S2：将称取的引发剂加入带有磁力搅拌的反应容器中，并将反应容器减压抽成真空；
[0081] S3：向反应容器中加入称量的三氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂，使端氨基聚乙二醇单甲醚溶解；
[0082] S4：待端氨基聚乙二醇单甲醚完全溶解后，加入称量的N-羧基-α-氨基-L-苄基谷氨酸环内酸酐和N-羧基-α-氨基-L-缬氨酸环内酸酐混合单体，然后将反应容器置于40℃的油浴中，使混合单体进行开环共聚合反应；
[0083] S5：待反应进行时间24h后，将反应产物用冰冻乙醚进行溶解/沉淀处理，然后过滤，并在真空烘箱中干燥至恒重得产物聚乙二醇-聚(苄基谷氨酸-r-缬氨酸)(mPEG-PBLG/PV)；
[0084] S6：按比例称取以下材料：
[0085] 反应物：无规共聚产物mPEG-PBLG/PV、溴化氢乙酸溶液；
[0086] 溶剂：三氟乙酸。
[0087] S7：将无规共聚产物mPEG-PBLG/PV加入带有搅拌子的反应容器中，加入三氟乙酸，开启搅拌，使聚乙二醇-聚(苄基谷氨酸-r-缬氨酸)无规共聚物完全溶解；
[0088] S8：置冰浴反应条件，向容器中加入溴化氢乙酸溶液，进行脱保护反应；
[0089] S9：待反应进行预设时间后，将反应产物溶解/沉淀处理，然后过滤，并在真空烘箱中于一定温度下干燥至恒重的产物聚乙二醇单甲醚-聚(谷氨酸-r-缬氨酸)(mPEG-PGA/PV)。
[0090] 通过上述步骤，得到温度/pH双敏感多肽无规共聚物P2。
[0091] 进一步地，所述步骤S4中混合单体进行开环共聚合反应时，油浴温度还可以为：25℃、30℃、40℃。
[0092] 进一步地，所述步骤S4中混合单体进行开环共聚合反应的反应时间还可以为：18h、24h、36h。
[0093] 本实施例的温度/pH双敏感水凝胶体系由本实施例制得的温度/pH双敏感多肽无规共聚物制备而成，该水凝胶体系中共聚物的浓度为10wt％，pH值为7.4。
[0094] 进一步地，所述的温度/pH双敏感水凝胶体系中温度/pH双敏感性共聚物的浓度还可以为：4wt％、6wt％、8wt％、10wt％。
[0095] 进一步地，所述的温度/pH双敏感水凝胶体系中温度/pH双敏感性共聚物的pH值还可以为：pH6.2，pH6.8，pH7.4。
[0096] 实验验证：下面通过实验验证本发明的温度/pH双敏感水凝胶体系的性能。
[0097] 观察温度/pH双敏感多肽无规共聚物P1浓度为13wt％、pH为7.4的温度/pH双敏感水凝胶体系在20～80℃之间的粘度变化，如图1所示，在20℃时，温度/pH双敏感水凝胶体系为可流动液体，而在37℃时转化为凝胶。
[0098] 进一步地，取实施例1制得的温度/pH双敏感多肽无规共聚物P1和实施例4制得的温度/pH双敏感多肽无规共聚物P2，将P1配置成pH＝7.4，浓度为10wt％、10.5wt％、11wt％、12wt％、13wt％的温度/pH双敏感水凝胶体系；将P2配置成pH＝7.4，浓度为4wt％、6wt％、
8wt％、10wt％的温度/pH双敏感水凝胶体系，并分别测定其溶胶-凝胶热转变行为，得到其溶胶-凝胶转变相图，如图2所示。由图2可以看出，当P1浓度为13wt％、pH为7.4时，水凝胶在室温或室温以下为可流动的液体，而在人体温度时则以稳定的凝胶态存在；当P2浓度为
10wt％，pH为7.4时，水凝胶在室温或室温以下为可流动的液体，而在人体温度时则以稳定的凝胶态存在。
[0099] 进一步地，取实施例1制得的温度/pH双敏感多肽无规共聚物P1，将P1配置成pH分别为6.2、6.8、7.4，浓度分别为10wt％、10.5wt％、11wt％、12wt％、13wt％的温度/pH双敏感水凝胶体系。并分别测定其溶胶-凝胶热转变行为，得到其溶胶-凝胶转变相图，如图3所示。由图可以看出，温度/pH双敏感水凝胶体系当pH相同时，浓度越高，溶胶-凝胶转变温度越低；当浓度相同时，pH越高，溶胶-凝胶转变温度越高；要在相同的温度实现溶胶-凝胶转变，pH越高所需聚合物的浓度就越高。
[0100] 本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体
变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
