天然骨是胶原蛋白、非胶原蛋白有机相(包括糖胺聚糖)以及磷酸 钙的生物复合物。其复杂的分层结构导致出色的机械性质,包括高硬度、 高强度和高断裂韧度,其进而使得骨能够承受它们每日所经受的生理压
力。本领域的研究人员所面临的挑战是制备一种合成材料,其具有允许 在人或动物体内天然骨生长于所述合成材料内和其周围的组成和结构。
已经观察到骨通过在身体环境中形成的类骨
磷灰石层直接与人体 内的磷酸钙结合(此性质称为生物活性)。另一方面,已知胶原蛋白与 包含胶原蛋白和其它生物有机物(例如糖胺聚糖)的共聚物是多种细胞 类型(包括负责人体中骨的形成和维持的那些细胞类型)进行粘附和增 殖的最佳基质。
羟磷灰石是最常用作骨替代材料之成分的磷酸钙。然而,与其它形 式的磷酸钙材料(例如透钙磷石、磷酸三钙和磷酸八钙)相比较而言, 它是相对难溶的材料。由于磷灰石材料在体内的重吸收速率特别慢,因 此在制备
生物材料时磷灰石的相对低
溶解度可能是不利的。
磷酸钙(例如羟磷灰石)是机械硬度高的材料。然而,与天然骨相 比较而言它们相对较脆。胶原蛋白是机械韧度高的材料,但是与天然骨 相比较而言其硬度相对较低。相比于单独的胶原蛋白,包含胶原蛋白与 糖胺聚糖之共聚物的材料的韧度和硬度较高,但是与天然骨相比较而言 其硬度仍然相对较低。
之前对制备韧度大于羟磷灰石、硬度大于胶原蛋白及胶原蛋白和糖 胺聚糖之共聚物的合成骨替代材料的尝试包括通过机械混合合并胶原 蛋白和磷灰石。这种机械方法描述于EP-A-0164484中。
后来的发展包括通过机械混合羟磷灰石、胶原蛋白和4-
硫酸软骨素 来制备包含这些成分的骨替代材料。这种方法描述于EP-A-0214070中。 该文献还描述了胶原蛋白和4-硫酸软骨素的脱
水热交联。发现包含磷灰 石、胶原蛋白和4-硫酸软骨素的材料具有良好的
生物相容性。机械混合 磷灰石与胶原蛋白以及任选地4-硫酸软骨素基本上形成被胶原蛋白/4- 硫酸软骨素包裹的磷灰石颗粒。还发现尽管这种材料是生物相容性的, 但是其在人或动物体内产生有限的天然骨的体内(in-growth)生长,并 且不重建所述合成材料的磷酸钙相。
以前的工作已经开发了可用于控制
冷冻干燥方案参数以制备胶原 蛋白和一种或多种糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)之多孔支架 的手段。这些技术允许以受控方式改变支架特征(例如孔径和长宽比), 其已知是对外伤或损伤部位处的愈合响应具有显著影响的参数。然而, 为了
治疗涉及骨骼和肌肉骨骼缺损的损伤,需要开发制备所具有的材料 组成和机械特性与骨十分接近(这与非矿化的胶原蛋白-GAG支架不同) 的多孔支架的技术。
申请人于2006年3月6日提交的较早的国际
专利申请 PCT/GB2006/000797涉及用于生物医学应用的材料,具体而言涉及含有 例如胶原蛋白、磷酸钙和任选地糖胺聚糖的多孔整体式支架和多孔分层 支架。PCT/GB2006/000797的内容还在本文所附的附录中进行阐述以利 于更好地理解本发明。
用于组织工程的先进支架材料的持续应用和开发表明具有开发分 层支架材料的需求。体内许多相关的生理部位包括一种或多种组织类型 之间的界面。已经注意到具体的组织类型和细胞类型需要开发具体的支 架结构;通常生物活性支架结构在不同组织之间、不同细胞之间、以及 不同用途之间可以有显著的不同[1]。这些现象表明为了治疗更复杂组织 中的损伤部位和涉及界面损伤(即软骨的损伤经常还损伤下面的骨,骨 或肌肉止点附近的
腱和韧带损伤)的部位,需要开发在支架结构中具有 梯度界面和突变界面的支架。
特别的,由于外伤、畸形或
疾病而被损伤的骨骼部位的修复带来了 一系列特定的挑战。与
皮肤、神经和大多数其它组织缺损不同,骨骼缺 损涉及多种不同的组织类型(即骨、软骨、腱和韧带),涉及承受日常 机械负荷的部位以及涉及矿化与非矿化组织之间的横跨界面(例如韧带 止点,骨/软骨界面的“潮标”)。
当前的支架制造技术不包括使用参数(例如物理结构、机械性质或 化学组成)的突变梯度(sharp gradient)来制备支架的合适方案。数 量有限的近期努力力求开发出使用多孔分层支架来治疗涉及单独软骨 或涉及骨和软骨二者的损伤(例如关节缺损)。这些构建物力求同时诱 导骨和软骨的再生,但是各自使用分开的支架[2-9]。
尽管该新方法很有前景,但是两个主要的缺点可能限制了迄今为止 所报道的多层支架的有效性。第一个缺点涉及用于支架各个层的材料。 可再吸收的合成
聚合物是用于软骨层的唯一材料,并且在许多这些支架 中也经常是骨部分的成分。尽管合成聚合物易于制备,但是已知其对细 胞粘附和增殖的益处比天然聚合物(例如胶原蛋白)要小,并且当它们 降解时可释放高浓度的潜在细胞毒性的酸物质。此外,对于必须进行腱 或韧带修复的应用而言,可再吸收的合成聚合物(不论它们的交联方式 如何)的强度和硬度不足以承受甚至在康复锻炼中所施加的降低的负 荷。
现有多层支架的第二个缺点涉及各个层之间的界面。在体内,观察 到胶原蛋白原
纤维跨越许多组织(例如天然关节和腱/韧带止点)之间 界面的连续性。所得的平滑过渡体系(软界面)赋予这些部位以固有的 机械
稳定性,使得它们能承受生理负荷而没有机械故障。相反,大多数 现有的分层支架含有硬界面,在两种不同的材料之间形成明显的分界 线。缝合[7]、纤维蛋白
粘合剂粘合[3]以及其它技术[4,5]用于强化该界 面,然而,甚至在受控动物模型中也报道了界面脱粘现象。还值得指出 的是这些缝合和粘合方法是精细的并且重现性差,因此在临床环境中可 能不实用。
很明显需要新的技术来进一步扩展制备用于多种用途的具有明确 的非均一性质的分层支架结构的能力。首先关心的是开发适当的技术来 制备具有适当层间结合的分层支架结构。这对于用在重机械负荷之下从 而增加层间分离机会的区域中的支架而言是尤其重要的问题。
另外至关重要的是开发用于制备基于胶原蛋白的分层多孔支架的 技术。在大量不同的组织工程研究中已经将基于胶原蛋白的支架成功地 用作天然细胞外基质的类似物;传统上通
过冷冻干燥制备基于胶原蛋白 的支架。在适当的
温度条件下
固化胶原蛋白、其它可用
蛋白质以及液体 载体的混悬液,得到由胶原蛋白纤维所围绕的相互穿插的
冰晶网络。然 后将冷冻的混悬液
升华,除去冷冻的液体载体,得到多孔的支架结构。 所述支架的孔尺寸由浆的冷冻过程决定。该制备技术的显著优点是在整 个支架中观察到胶原蛋白纤维的连续性。然而,为了制备孔径和形状差 异很大的分层支架,需要非常小心地控制所述温度环境。此外,当设法 在一步固化步骤中同时形成所有结构时,由于混悬液混杂在一起而使得 制备具有显著不同性质(例如化学组成、交联
密度和材料性质)的支架 变得非常困难。
本发明扩展了PCT/GB2006/000797中所述的工作并且其目的在于 解决与
现有技术相关的一些问题。
因此,本发明提供一种用于制备复合生物材料的方法,其包括: 提供基本上是固体的第一成分,其包含胶原蛋白、糖胺聚糖、
白蛋白、 透明质酸(hyaluronan)、壳聚糖和含有胶原蛋白多肽序列之一部分的 合成多肽中的一种或多种以及任选地无机材料,所述成分至少具有多孔 的表面部分;
提供一种
流体组合物,其包含胶原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白、透明质酸、 壳聚糖和含有胶原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一种或多种 以及液体载体和任选地无机材料;
将所述流体组合物与所述第一成分的所述多孔表面部分相
接触;
将所述流体组合物冷却至使得所述液体载体转变成多个固体晶体或颗粒 的温度;
通过升华和/或
蒸发除去至少一些所述多个固体晶体或颗粒。
所述方法还可以包括:
提供基本上是固体的第二成分,其包含胶原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白、 透明质酸、壳聚糖和含有胶原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一 种或多种以及任选地无机材料,所述成分至少具有多孔的表面部分;
将所述流体组合物放入所述第一成分和所述第二成分之间使得其与所 述多孔表面部分相接触;
将所述第一成分和所述第二成分之间的所述流体组合物冷却至使得所 述液体载体转变成多个固体晶体或颗粒的温度;
通过升华和/或蒸发除去至少一些所述多个固体晶体或颗粒,以得到所 述第一成分和所述第二成分之间的
中间层。
本文所用的术语生物材料意指能与人体或动物体生物相容的材料。
本文所用的术语浆(slurry)包括浆、溶液、混悬液、胶体和分散 体系。
本文所用的术语胶原蛋白包括重组人(rh)胶原蛋白。
本文所用的术语成分指独特区域,例如具有特定化学性质、结构性 质和/或材料性质的支架的独特区域。术语支架指最终的多成分支架结 构。
术语复合支架和分层支架是同义的,是指含有两层或更多层的支 架,其中每层的材料组成通常基本上不同于其相邻层的材料成分。术语
单层支架或整体式(monolithic)支架是同义的,是指仅仅含有一层的 支架,其中每层中的材料组成大体是均一的。
本文所用的术语多孔意指可含有大孔和/或小孔的材料。所述孔可在 表面上以及可延伸到材料本体内。大孔隙度通常指大于约10微米尺度 上的孔相关的特征。小孔隙度通常指小于约10微米尺度上的孔相关的 特征。应当理解所述材料内可以存在开放孔和闭合孔的任意组合。例如, 所述材料通常既含有大孔又含有小孔。所述大孔隙度通常是开放孔的, 尽管可能存在闭合孔成分。
本发明的方法包含可以任何次数重复应用的一系列步骤以制备含 有一系列独立成分的多孔复合/分层支架。这些独立成分可彼此分开进 行制备,然后通过任何次数重复的共合成过程连接在一起以形成具有不 同结构特征、机械特征和/或组成特征(例如孔径、相对密度、孔形、 硬度、化学组成、交联密度、降解速率)之区域的单个复合/分层支架。
在组装较大的复合/分层支架结构之后,可进行任何次数的制造后加 工步骤,包括物理交联技术(例如脱水热交联、紫外交联)、化学交联 技术(例如基于
碳二亚胺的交联、基于戊二
醛的交联)或使用混合酶制 剂(enzyme cocktail)(例如胶原蛋白酶、分散酶)部分降解支架。在 使用涉及支架水化的任何处理之后,可使
用例如冷冻干燥法除去液体成 分。
优选地,本发明实现了具有例如可模拟在体内所见的支架成分层之 间胶原蛋白原纤维连续性之连续(软)界面的制备。本
发明人发现这解 决了与在制造后将不同相缝合或粘合在一起相关联的问题。
本发明的方法提供了不需要在基本上相同时间从液态形成所述个 体支架成分的优点。这与将所有浆分层并固化在一起的液相共合成是不 同的。
以固体形式或基本为固体的形式提供第一成分和第二成分(如果存 在的话)。
所述第一成分和/或所述第二成分通常包含胶原蛋白和任选地糖胺 聚糖。
所述第一成分和/或所述第二成分通常包含无机材料,例如磷酸钙材 料。实例包括透钙磷石、磷酸八钙和磷灰石中的一种或多种。
磷灰石是一类含有钙和
磷酸盐的矿物质,其具有以下通式: Ca5(PO4)3(X),其中X可以是通常为OH-、F-和Cl-的离子以及本领域技 术人员公知的其它离子。术语磷灰石还包括取代的磷灰石,例如
硅取代 的磷灰石。术语磷灰石包括羟磷灰石(磷灰石的具体实例)。羟磷灰石 还可以被其它物质(例如硅)取代。
在本发明的一个优选方面,所述第一成分和/或所述第二成分由胶原 蛋白和磷酸钙材料的共沉淀物形成。在本发明的另一个优选方面,所述 第一成分和/或所述第二成分由胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物形成。
有利地,所述第一成分和/或所述第二成分由胶原蛋白、磷酸钙材料 和糖胺聚糖的三元共沉淀物形成。
在一个优选实施方案中,所述第一成分包含胶原蛋白和糖胺聚糖以 及任选地磷酸钙材料,所述第二成分(如果存在的话)包含胶原蛋白、 糖胺聚糖和磷酸钙材料。
所述流体组合物通常包含胶原蛋白和任选地糖胺聚糖。
所述流体组合物还可包含无机材料,例如磷酸钙材料。实例包括透 钙磷石、磷酸八钙和磷灰石中的一种或多种。
所述液体载体优选包含水。
所述流体组合物可以混悬液(例如基于胶原蛋白的混悬液或浆)的 形式提供。所述混悬液/浆还可包含糖胺聚糖和/或磷酸钙材料中的一种 或两种。
优选地,所述流体组合物是包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物和 /或胶原蛋白、磷酸钙材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物的混悬液/浆。
或者,所述浆可简单地包含胶原蛋白和磷酸钙材料以及任选地糖胺 聚糖的机械混合物。这可通过例如EP-A-0164484和EP-A-0214070中 所述的常规技术进行制备。
所述磷酸钙材料可选自例如透钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰石中的一 种或多种。所述磷酸钙材料优选包含透钙磷石。
所述混悬液/浆的pH优选为2.5至6.5,更优选为2.5至5.5,甚至 更优选为3.0至4.5,甚至更优选为3.8至4.2。
所述混悬液/浆组合物可包含一种或多种糖胺聚糖。所述浆组合物可 包含一种或多种磷酸钙材料。
所述混悬液/浆中不排除存在其它物质(例如
银、硅、
二氧化硅、餐 桌盐、糖等)。
应当理解所述混悬液/浆中可存在其它成分。例如,任选地可单独或 以组合形式将生长因子、基因、药物或其它生物活性物质添加到所述混 悬液/浆中。
至少一些所述多个固体晶体或颗粒可通过升华和/或蒸发除去以得 到所述第一成分和第二成分之间的中间层。优选的方法是升华。
在一个优选实施方案中,用于制备本发明的复合生物材料的方法包 括:
(a)提供基本上是固体的第一成分,其包含胶原蛋白(包括重组人 (recombinant human,rh)胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明质酸 (hyaluronan)、壳聚糖和含有胶原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽 中的一种或多种以及任选地无机材料,所述成分至少具有多孔的表面部 分;
(b)提供基本上是固体的第二成分,其包含胶原蛋白(包括重组人(rh) 胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明质酸、壳聚糖和含有胶原蛋白多 肽序列之一部分的合成多肽中的一种或多种以及任选地无机材料,所述 成分至少具有多孔的表面部分;
(c)提供流体组合物,其包含胶原蛋白(包括重组人(rh)胶原蛋白)、 糖胺聚糖、白蛋白、透明质酸、壳聚糖和含有胶原蛋白多肽序列之一部 分的合成多肽中的一种或多种以及液体载体,还任选地包含无机材料;
(d)将所述流体组合物放入到所述第一成分和所述第二成分之间使得 其与所述多孔表面部分相接触;
(e)将所述第一成分和所述第二成分之间的所述流体组合物冷却至使 得所述液体载体转变成多个固体晶体或颗粒的温度;
(f)通过升华和/或蒸发除去至少一些所述多个固体晶体或颗粒,以得 到所述第一成分和所述第二成分之间的中间层。
在本发明中,例如基于胶原蛋白的混悬液薄层有利地置于第一成分 和第二成分(例如支架)之间,并且使之被吸收到每个支架中前几层孔 中。然后再次将支架冷冻干燥,得到在各个不同支架成分之间相互穿插 的胶原蛋白纤维的网络。当然,必要时,该过程可重复多次。
可根据所述第一和第二成分的化学和物理性质选择所述混悬液/浆 的化学和物理性质(例如
粘度)。例如,如果所述第一和第二成分的孔 非常小,那么可选择粘度更小的混悬液/浆以保证渗透到孔内。
将所述流体组合物冷却至使得所述液体载体转变成多个固体晶体 或颗粒的温度以及通过升华和/或蒸发除去至少一些所述多个固体晶体 或颗粒的步骤可通过冷冻干燥技术进行。
如果所述液体载体是水,那么所述升华步骤包括将模具和冷冻混悬 液/浆周围环境中的压力降低至水/冰/水
蒸汽体系的
三相点以下,然后在 所达到的
真空压下将温度升高至固体-蒸汽相转变温度以上。在当前温 度下,只要环境液体蒸汽分压低于冷冻液体的分压,产物中的冰就通过 升华直接转变为蒸汽。通常将温度升高到0℃或以上。进行该步骤以通 过升华除去冷冻混悬液/浆中的冰晶。
可调节冷冻干燥参数以根据需要控制孔径和长宽比。一般而言,较 慢的冷却速率和较高的最终冷冻温度(例如以约0.25℃/分钟的速率冷却 至约-10℃的温度)有利于形成具有较高长宽比的大孔,而较快的冷却 速率和较低的最终冷冻温度(例如以约2.5℃/分钟的速率冷却至约-40℃ 的温度)有利于形成小的各方等大的孔。
可在模具中实施本发明的方法,术语模具旨在包括能成形、容纳或 支持所述第一和第二成分和流体组合物的任何模具。因此,最简单形式 的模具可简单地包括支持表面。所述模具可以是任何所需形状,并且可 由合适的材料制得(包括聚合物(例如聚砜、聚丙烯、聚乙烯)、金属 (例如不锈
钢、
钛、钴铬
合金)、陶瓷(例如氧化
铝、氧化锆)、玻璃陶 瓷以及玻璃(例如
硼酸盐玻璃))。
所述第一成分的组成通常与所述第二成分的组成不同。
所述流体组合物的组成通常与所述第一成分或所述第二成分(如果 存在的话)的组成不同。
通过本发明方法制备的复合生物材料可用于制备其中至少两层是 多孔的多层支架。优选地,所述多层的所有层均包含胶原蛋白并且任选 地还包含糖胺聚糖。优选地,其中至少一层还包含磷酸钙材料。
可通过本申请人于2006年3月6日提交的较早的
国际申请 PCT/GB2006/000797(其内容在本文所附附录中陈述)中所述方法制备 所述第一和/或第二成分。此外,所述流体组合物可以是 PCT/GB2006/000797中有关浆组合物方面所述的组合物。
本申请人于2004年10月28日提交的较早的已公开申请 PCT/GB04/004550描述了胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖的三元共沉 淀物及其制备方法。PCT/GB04/004550的内容在此通过参考并入本文。 PCT/GB04/004550中所述的方法包括:提供含有胶原蛋白、钙源和磷源 以及糖胺聚糖的酸性水溶液;胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖从所述水 溶液中一起沉淀形成三元共沉淀物。术语共沉淀物意指其中化合物基本 上在同一时间从同一溶液/分散体系中沉淀出来的两种或三种化合物的 沉淀物。其与通过机械混合所述成分而形成的材料不同,尤其在例如不 同溶液中单独沉淀这些成分的情形下更是如此。共沉淀物的微观结构基 本上不同于通过机械混合其成分而形成的材料。
在制备共沉淀物的方法中,所述钙源优选地选自下列一种或多种:
硝酸钙、
醋酸钙、
氯化钙、碳酸钙、烷醇钙、氢
氧化钙、
硅酸钙、硫酸 钙、
葡萄糖酸钙和肝素钙盐。肝素钙盐可源自猪肠粘膜。合适的钙盐可 从例如Sigma-Aldrich Inc购得。磷源优选地选自下列一种或多种:磷 酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸、正磷酸氢二钠二水合物(Na2HPO4·2H2O, 有时称为GPR Sorensen′s盐)以及磷酸三甲酯、
碱金属(例如钠或
钾) 磷酸盐、碱土金属(例如镁或钙)磷酸盐。
糖胺聚糖是包含含有重复
二糖单元的长直链多糖的一类大分子。优 选地,所述糖胺聚糖选自下列一种或多种:硫酸软骨素、硫酸皮肤素、 肝素、
硫酸肝素、硫酸
角质素和透明质酸。硫酸软骨素可以是4-硫酸软 骨素或6-硫酸软骨素,这两种软骨素均可从例如Sigma-Aldrich Inc购 得。6-硫酸软骨素可来源于鲨鱼软骨。透明质酸可来源于人脐带。肝素 可来源于猪肠粘膜。
所述胶原蛋白可以是可溶的或不溶的并且可源自任何动物中的任 何组织,并且可使用许多常规技术进行提取。
可通过以下方法进行沉淀:将胶原蛋白、钙源、磷源和糖胺聚糖合 并在酸性水溶液中,以及或者将溶液静置直到沉淀出现、搅拌溶液、用 碱性滴定剂(例如
氨)滴定、加入成核剂(例如预先制备的透钙磷石)、 改变钙源的添
加速率,或者这些技术或本领域已知多种其它技术的任意 组合。
本发明的复合生物材料有利地用作肌肉骨骼用途和牙用途的组织 再生支架。
本发明的复合生物材料可用作替代性骨材料或牙材料。因此,本发 明提供含有本文所述生物材料的合成骨材料、骨植入体、骨移
植物、骨 替代物、骨支架、填充剂、包衣(coating)或粘固剂(cement)。
可有利地以多层支架形式提供所述复合生物材料。具体而言,本发 明提供肌肉骨骼用途和牙用途的组织再生支架。本发明的多层(即两层 或更多层)支架可用于例如骨/软骨界面(例如关节)、骨/腱界面(例如 腱止点)、骨/韧带界面(例如韧带止点)以及牙/韧带界面(例如牙/牙 周韧带交界处)。
尽管本发明主要涉及组织工程用的支架,但是本发明的材料可用于 制备在体内持续存在相当长时间的植入体。例如,半永久性植入体可能 是腱和韧带应用所必需的。
现在参考两个优选的合成实施方案来描述本发明:固相共合成和固 液共合成。本发明人开发这些技术以使得能制备具有显著不同成分性质 的多成分支架。它们提供用于制备可模拟在体内所见的在支架成分层之 间具有胶原蛋白原纤维连续性的连续(软的)界面的方法。它们解决了 在制造后将不同相缝合或粘合在一起时所存在的问题。
本发明的固相共合成和固液共合成方法提供了下述优点:即不需要 在基本上同一时间由液态形成所述独立支架成分。这与其中所有浆分层 并固化在一起的液相共合成不同。
所述合成方法包含可以任何次数重复应用的一系列步骤以制备含 有一系列独立成分的多孔支架。这些独立成分可分别进行制备,然后通 过任何次数重复的共合成过程连接在一起以形成具有不同结构特征、机 械特征和/或组成特征(例如孔径、相对密度、孔形、硬度、化学组成、 交联密度、降解速率)之区域的单一复合/分层支架。
现在通过
实施例进一步描述所述固相共合成和固液共合成方法。
固相共合成
在固相共合成的情形下,分别制备所述多成分支架的每个成分层。 然后使用二次冷冻干燥分法由所述分开的成分区组装成支架结构的最 终三维基质。例如,将一薄层基于胶原蛋白的混悬液置于每个支架之间, 使得其被吸收到每个支架中前几层孔中。然后再次将所述支架冷冻干 燥,得到胶原蛋白纤维在每个不同支架成分之间互相贯穿的网络。当然, 必要时,可将该方法重复数次。
固相共合成:步骤1:浆的制备
可制备水性的基于胶原蛋白的浆的任意组合。针对I型胶原蛋白 [10,11]、II型胶原蛋白[12]、或矿化I型胶原蛋白/GAG/透钙磷石浆有 详细的制备方法(见例如PCT/GB04/004550)。
固相共合成:步骤2:多孔的基于胶原蛋白之成分的制备
可通过冷冻干燥由不同的基于胶原蛋白的浆制备每种成分。已经公 开了多种能制备具有不同平均孔径、形状和方向性之支架的冷冻干燥方 法[10,11,13-15],任意这些方法可用于形成每种支架成分。简而言之, 将每种基于胶原蛋白的混悬液置于模具中;所述模具可以是任何期望形 状并且可由任何数目的材料(即聚合物、金属、陶瓷、玻璃或玻璃陶瓷) 制备。然后通过将所述模具暴露于冷冻环境中将混悬液固化在所述模具 内;固化可快速或缓慢地以主要方向进行或均一地进行,可以任何方式 控制所述固化环境的温度以使得所述混悬液完全固化,产生胶原蛋白纤 维所围绕的互相贯穿的冰晶网络。然后将所述固化混悬液升华,除去冰 晶,得到其自身构成均一支架结构的多孔成分。
可使用不同的冷冻方案在不同的模具中由不同的混悬液制备任何 数目的独立成分。
固相共合成:步骤3:制造后加工
在冷冻干燥之后可对每种成分进行制造后加工。这些制备后加工包 括物理交联技术(即脱水热交联、紫外交联)[11,13,16-18]、化学交联 技术(即基于碳二亚胺的交联、基于戊二醛的交联)[11,16]、或使用混 合酶制剂(即胶原蛋白酶、分散酶)部分降解支架。使用涉及支架水化 的任何处理之后,可使用再次冷冻干燥法除去液体成分。此外,多种模 制容器、冷冻方案和升华方案可用于从支架中除去液体成分。
固相共合成:步骤4:固相共合成
完成每个成分的加工之后,使用固相共合成将独立成分结合起来。 将基于胶原蛋白的混悬液薄层置于独立支架成分之间。重复该过程以将 所有独立支架成分结合成具有不同区域的较大支架。基于胶原蛋白的支 架局部水化每个支架之间的界面,暂时将所述支架粘合在一起。然后使 用多种固化和升华方案之一冷冻干燥所组装的支架;冷冻干燥之后,通 过延伸穿过支架成分支架每个界面的互相贯穿的胶原蛋白纤维网络将 所述之间成分固定在一起。
固相共合成:步骤5:制造后加工
组装了较大的支架结构之后,可使用制备后加工步骤;这种加工已 经列举在步骤3中。进行这种加工之后,可再次冷冻干燥支架以产生具 有任何不同的结构和组成性质的基于胶原蛋白的多孔支架。
固液共合成
在固液共合成的情形下,分别制备所述最终支架的一个或多个成分 层。然后使用再一次或多次额外的冷冻干燥过程组装支架结构的最终三 维基质。例如,将一薄层基于胶原蛋白的混悬液与已经制备的成分放在 一起,使得其被吸收到所述成分支架中。然后再次将所述混悬液支架系 统冷冻干燥,得到胶原蛋白纤维在每个不同支架成分之间互相贯穿的网 络。当然,必要时,可使用额外的混悬液/浆将该过程重复数次以形成 最终的支架结构。
固液共合成法和固相共合成法相似,其包括可任意次重复应用以产 生包含一系列独立多孔成分之多孔支架的一系列步骤。还与固相共合成 法相似的是,其本身包含均一多孔支架的一个或多个所述多孔成分通过 冷冻干燥技术共同结合在一起。然而,固液共合成法与固相共合成法的 不同在于:至少一个所述成分是通过冷冻干燥从置于与一个或多个之前 制备的成分完全接触的浆形成的。
固液共合成:步骤1:浆的制备
可制备水性的基于胶原蛋白的浆的任意组合。针对I型胶原蛋白 [10,11]、II型胶原蛋白[12]、或矿化I型胶原蛋白/GAG/透钙磷石浆有 详细的制备方法(见例如PCT/GB04/004550)。
固液共合成:步骤2:多孔成分的制备
可使用上述有关所述固相共合成的一种或多种冷冻干燥技术从不 同的基于胶原蛋白的浆制备一个或多个成分支架。
固液共合成:步骤3:之前制备的多孔成分的制备后加工
在与所述固相共合成相关的上述冷冻干燥之后可对每个支架成分 进行任意制备后加工步骤。
固液共合成:步骤4:固液共合成
完全加工每个支架成分之后,将一种或多种浆与之前制备的一个或 多个多孔成分完全接触;使得所述浆扩散进入其相邻的之前所制备成分 的孔中持续
指定的一段时间,使所述一种或多种浆固化,然后通过冷冻 干燥进行升华以形成与之前制备的成分整体相连的新支架成分的多相 支架。该步骤可重复任意次以制备含有任何数目成分的多相支架。
固液共合成:步骤5:制造后加工
组装了完整的支架结构之后,可应用任意制备后加工步骤;这种加 工已经列举在步骤3中。这种加工之后,可再次冷冻干燥支架以产生具 有任意不同的结构和组成性质的基于胶原蛋白的多孔支架。
本发明的方法提供在制备多成分支架上的多个优点。特别是:
-独立控制支架不同区域中的物理性质(即孔径、孔形、交联密度、 降解速率)、机械性质(即模量)、以及化学性质(即矿物质含量、胶原 蛋白含量、糖胺聚糖含量);
-通过引入胶原蛋白作为主要成分改善了细胞附着;
-由于相互连接的胶原蛋白-纤维结构穿越不同成分之间的边界导致 强界面强度;
-由于固相共合成导致支架中不同化学组成的相邻层之间的有限化 学扩散。
现在本发明将参考下述实施例和
附图以进一步描述本发明,其中:
图1显示根据实施例1C通过固相共合成制备两成分支架以形成双 层支架。上图包含未矿化的II型胶原蛋白支架,下图包含矿化的I型胶 原蛋白支架。
图2显示根据实施例1C通过固相共合成制备的分层支架中矿物质 (Ca和P)含量的元素分析。发现矿物质含量几乎全部存在于矿化区 域中(下组绿色线之间)。
图3显示根据实施例1C由矿化的I型胶原蛋白和未矿化的II型胶 原蛋白支架成分形成的分层支架中的矿物质相对浓度。
实施例
实施例1:固相共合成
A.矿化(透钙磷石)I型胶原蛋白-糖胺聚糖支架的制备
混悬液制备:
由I型胶原蛋白(Integra LifeSciences Corp.,Plainsboro,NJ,USA)、 6-硫酸软骨素(Sigma-Aldrich Inc,St.Louis,MO,USA)、正磷酸(H3PO4, BDH Laboratory Supply,Poole,UK)、氢氧化钙(Ca(OH)2, Sigma-Aldrich Inc)以及硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O,Sigma-Aldrich Inc.) 制备之前在PCT/GB04/004550中所述的矿化(透钙磷石)胶原蛋白-糖 胺聚糖混悬液。
冷冻干燥:
将10mm的矿化(透钙磷石)I型胶原蛋白-糖胺聚糖混悬液层置于 底部厚度为8mm的矩形(25mm×50mm)聚砜模具中。之前所述的温 度改变技术(temperature ramping technique)[10,15]用于固化矿化(透 钙磷石)I型胶原蛋白-糖胺聚糖混悬液:将冷冻干燥器架的温度以预定 速率(3℃/分钟)从室温骤降至-20℃,然后在-20℃保持600分钟使之 完全固化[15];完全固化后,在25℃于200毫托压强下升华冷冻的混悬 液24小时,导致形成平均孔径大于250μm的胶原蛋白-糖胺聚糖支架。
制造后加工:
从模具中取出支架并使用预定的碳二亚胺(基于液体化学品)交联 处理进行交联[16]。交联后,在磷酸盐缓冲液(PBS,Sigma-Aldrich Inc.) 和去离子水中反复清洗所述支架。将水化支架放回恒温-40℃的冷冻干 燥器中保持60分钟,然后升华(0℃,17小时,200毫托)以从支架中 除去液体成分。
B.未矿化II型胶原蛋白-糖胺聚糖支架的制备
混悬液制备:
从
冰箱中取出预先制备的未矿化II型胶原蛋白-糖胺聚糖混悬液 (Geistlich Biomaterials,Wolhusen,Switzerland)[12]并使其恢复到室 温。
冷冻干燥:
将3mm的II型胶原蛋白-糖胺聚糖混悬液层置于底部厚度为8mm 的矩形(25mm×50mm)聚砜模具中。使用之前所述的温度改变技术 [10,15]固化II型胶原蛋白-糖胺聚糖混悬液。将冷冻干燥器架的温度以 预定速率(1.4℃/分钟)从室温骤降至-40℃,然后在-40℃保持60分钟 使得完全固化[15];完全固化后,在0℃200毫托压强下升华冷冻的混 悬液17小时,导致形成平均孔径为约100μm的胶原蛋白-糖胺聚糖支架。
制造后加工
从聚砜模具中取出支架并使用之前所述的脱水热交联处理进行交 联以增加支架硬度并降低支架降解速率[11,13];简而言之,在105℃于 50毫托压强下进行脱水热交联24小时。
C.固相共合成以形成双层支架
混悬液制备:
由I型胶原蛋白(Integra LifeSciences Inc.)、醋酸(Sigma-Aldrich Inc.)、以及6-硫酸软骨素(Sigma-Aldrich Inc.)制备少量的之前所述 的未矿化I型胶原蛋白-糖胺聚糖混悬液[10、11、15]。
固相共合成:
将矿化(透钙磷石)I型胶原蛋白-糖胺聚糖支架置于在最初的支架 制备过程中所用的矩形聚砜模具中。沿矿化(透钙磷石)支架的上表面 铺一薄层矿化(透钙磷石)I型胶原蛋白-糖胺聚糖混悬液。将所述II 型胶原蛋白-糖胺聚糖支架置于所述混悬液层的顶部。通过沿界面的胶 原蛋白-糖胺聚糖混悬液水化这两种支架。
使用之前所述的温度改变技术[10,15]沿两种之前形成的支架的界 面固化I型胶原蛋白-糖胺聚糖混悬液。将冷冻干燥器架的温度以预定速 率(1.4℃/分钟)从室温降至-40℃,然后在-40℃保持60分钟使得完全 固化[15];完全固化后,在0℃于200毫托压强下升华冷冻的混悬液17 小时。
该方法制备了具有两个不同区域的分层支架(矿化I型胶原蛋白- 糖胺聚糖和未矿化II型胶原蛋白-糖胺聚糖的支架)。通过延伸穿过所述 两个初始支架之间界面的一薄层I型胶原蛋白-糖胺聚糖支架结构将所 述两个支架层固定在一起(见图1-3)。
实施例2:固液共合成
A.矿化(透钙磷石)I型胶原蛋白-糖胺聚糖支架的制备
混悬液制备:
由I型胶原蛋白(Integra LifeSciences Corp.,Plainsboro,NJ, USA)、6-硫酸软骨素(Sigma-Aldrich Inc,St.Louis,MO,USA)、正磷 酸(H3PO4,BDH Laboratory Supply,Poole,UK)、氢氧化钙(Ca(OH)2, Sigma-Aldrich Inc)以及硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O,Sigma-Aldrich Inc.) 制备之前所述(见PCT/GB04/004550)的矿化(透钙磷石)胶原蛋白- 糖胺聚糖混悬液。
冷冻干燥:
将10mm的矿化(透钙磷石)I型胶原蛋白-糖胺聚糖混悬液层置 于底部厚度为8mm的矩形(25mm×50mm)聚砜模具中。使用之前所 述的温度改变技术[10,15]固化矿化(透钙磷石)I型胶原蛋白-糖胺聚糖 混悬液。将冷冻干燥器架的温度以预定速率(3℃/分钟)从室温降至-20 ℃,然后在-20℃保持600分钟使得完全固化[15];完全固化后,在25 ℃于200毫托压强下升华冷冻的混悬液24小时,导致形成平均孔径大 于250μm的胶原蛋白-糖胺聚糖支架。
制造后加工:
从模具中取出支架并使用预定的碳二亚胺(基于液体化学品)交 联处理进行交联[16]。交联后,在磷酸盐缓冲液(PBS,Sigma-Aldrich Inc.)和去离子水中反复清洗所述支架。将水化支架放回恒温-40℃的冷 冻干燥器中,放置60分钟,然后升华(0℃,17小时,200毫托)以从 支架中除去液体成分。
B.固液共合成以形成双层支架
混悬液制备:
使在0.05M磷酸中包含I型
牛跟腱胶原蛋白混悬液的冷冻高粘度 浆(Devro Casings,Moodiesburn,Chyston,Scotland)恢复到室温。
固液共合成:
将矿化的(透钙磷石)I型胶原蛋白-糖胺聚糖多孔成分置于在最 初的支架制备过程中所用的矩形聚砜模具中。然后在矿化多孔成分的上 表面铺一层2mm的高粘度I型胶原蛋白混悬液,并通过将所述多孔成 分/浆构建物静置15分钟而使之渗入孔结构的近表面区域。
使用之前所述的温度改变技术[10,15]固化高粘度I型胶原蛋白混 悬液。将冷冻干燥器架的温度以预定速率(1.4℃/分钟)从室温降至-40 ℃,然后在-40℃保持60分钟使得完全固化[15];完全固化后,在0℃于 200毫托压强下升华冷冻的混悬液17小时。
制造后加工:
从其聚砜模具中取出所述支架并使用之前所述的碳二亚胺交联处 理进行交联[19]以增加支架硬度并降低支架降解速率。
该方法制备了具有两个不同区域(矿化I型胶原蛋白-糖胺聚糖和 未矿化II型胶原蛋白的层)的分层支架。
本发明描述了用于制备具有不同结构性质、组成性质和机械性质 的区域的大型多孔支架的新方法。第一方法涉及固相共合成。第二方法 涉及固液共合成。
固相共合成允许分别制备更大支架结构的不同成分,然后通过例 如冷冻干燥基于胶原蛋白的浆薄层形成互相贯穿的胶原蛋白纤维网络 从而连接在一起。该方法允许制备在不同区域中具有受控物理性质(即 孔径、孔形、交联密度、降解速率)、机械性质(即模量)、以及化学性 质(即矿物质含量、胶原蛋白含量、糖胺聚糖含量)的特定支架。
固液共合成允许分别制备不同的支架成分,然后通过冷冻干燥与 其它浆一起组装成更大的支架结构。该方法允许制备在不同区域中具有 受控物理性质(即孔径、孔形、交联密度、降解速率)、机械性质(即 模量)、以及化学性质(即矿物质含量、胶原蛋白含量、糖胺聚糖含量) 的特定支架。尤其重要的是使用固相共合成和固液共合成法实现了不同 支架区域之间的强界面强度,以及当支架组分之间的化学扩散不是有益 的时控制相邻支架区域之间化学扩散的能力。
参考文献
1.Yannas IV.Tissue and Organ Regeneration in Adults.New York:Springer;2001.
2.Hunziker EB,Driesang IMK.Functional Barrier Principle for Growth-Factor-Based Articular Cartilage Repair. Osteoarthritis and Cartilage 2003;11(5):320-327.
3.Gao J,Dennis JE,Solchaga LA,Awadallah AS,Goldberg VM,Caplan AI.Tissue-Engineered Fabrication of an Osteochondral Composite Graft Using Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.Tissue Engineering 2001;7(4):363- 371.
4.Gao J,Dennis JE,Solchaga LA,Goldberg VM,Caplan AI. Repair of Osteochondral Defect with.Tissue-Engineered Two- Phase Composite Material of Injectable Calcium Phosphate and Hyaluronan Sponge.Tissue Engineering 2002;8(5):827-837.
5.Hung CT,Lima EG,Mauck RL,Taki E,LeRoux MA,Lu HH, et al.Anatomically Shaped Osteochondral Constructs for Articular Cartilage Repair.Journal of Biomechanics 2003;36:1853-1864.
6.Niederauer GG,Slivka MA,Leatherbury NC,Korvick.DL, H.H.HJ,Ehler WC,et al.Evaluation of Multiphase Implants for Repair of Focal Osteochondral Defects in Goats. Biomaterials 2000;21:2561-2574.
7.Schaefer D,Martin I,Shastri P,Padera RF,Langer R, Freed LE,et al.In Vitro Generation of Osteochondral Composites.Biomaterials 2000;21(24):2599-2606.
8.Schaefer D,Martin I,Jundt G,Seidel J,Heberer M, Grodzinsky A,et al.Tissue-Engineered Composites for the Repair of Large Osteochondral Defects.Arthritis and Rheumatism 2002;46(9):2524-2534.
9.Sherwood JK,Riley SL,Palazzolo R,Brown SC,Monkhouse DC,Coates M,et al.A Three-Dimensional Osteochondral Composite Scaffold for Articular Cartilage Repair. Biomaterials 2002;23:4739-4751.
10.O′Brien FJ,Harley BA,Yannas IV,Gibson LJ.Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen- GAG scaffolds.Biomaterials 2004;25(6):1077-1086.
11.Yannas IV,Lee E,Orgill DP,Skrabut EM,Murphy GF. Synthesis and characterization of a model extracellular matrix that induces partial regeneration of adult mammalian skin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989;86(3):933-937.
12.Gordon TD,Schloesser L,Humphries DE,Spector M. Effects of the degradation rate of collagen matrices on articular chondrocyte proliferation and biosynthesis in vitro.Tissue Eng.2004;10(7-8):1287-1295.
13.Harley BA,Spilker MH,Wu JW,Asano K,Hsu H-P,Spector M,et al.Optimal degradation rate for collagen chambers used for regeneration of peripheral nerves over long gaps. Cells Tissues Organs 2004;176(1-3):153-165.
14.Loree HM,Yannas IV,Mikic B,Chang AS,Perutz SM, Norregaard TV,et al.A freeze-drying process for fabrication of polymeric bridges for peripheral nerve regeneration.In:Proc.15th Annual Northeast Bioeng.Conf.; 1989;1989.p.53-54.
15.O′Brien FJ,Harley BA,Yannas IV;Gibson LJ.The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials 2005;26(4):433-441.
16.Lee CR,Grodzinsky AJ,Spector M.The effects of crosslinking of collagen-glycosaminoglycan scaffolds on compressive stiffness,chondrocyte-mediated contraction, proliferation,and biosynthesis.Biomaterials 2001;22:3145- 3154.
17.Yannas IV,Burke JF,Huang C,Gordon PL.Correlation of in vivo collagen degradation rate with in vitro measurements.J Biomed Mater Res 1975;9(6):623-628.
18.Yannas IV,Tobolsky AV.Cross linking of gelatine by dehydration.Nature 1967;215(100):509-510.
19.Olde Damink LHH,Dijkstra PJ,van Luyn MJA,Van Wachem PB,Nieuwenhuis P,Feijen J.Cross-linking of dermal sheep collagen using a water soluble carbodiimide.Biomaterials 1996;17:765-773.
附录
本申请人早先于2006年3月6日提交的国际专利申请 PCT/GB2006/000797的内容如下所述。
本发明涉及用于生物医学应用的合成骨材料领域,具体涉及用于 组织工程的包含胶原蛋白、磷酸钙和任选地糖胺聚糖的多孔整体式和多 孔分层式支架。
天然骨是胶原蛋白、包括糖胺聚糖的非胶原蛋白有机相、和磷酸 钙的复合生物材料。其复合的分层结构产生了特殊的机械性质,包括高 的硬度、强度和
断裂韧性,这些性质使骨可以承受日常经受的生理
应力。 本领域的研究人员面临的挑战是制备组成和结构会使得天然骨在人体 或动物体内在合成材料内部或周围生长的合成材料。
已经发现,骨通过身体环境中形成的骨类磷灰石层直接结合人体 内的磷酸钙(称为生物活性的性质)。另一方面,已知胶原蛋白和包括 胶原蛋白和其它生物有机物例如糖胺聚糖的共聚物是多种细胞类型附 着和增殖的最佳基质,所述多种细胞类型包括人体内负责骨的生成和维 持的那些细胞。
羟磷灰石是最普遍用作骨替代材料中的成分的磷酸钙。但是,和 例如透钙磷石、磷酸三钙和磷酸八钙等其它形式的磷酸钙材料相比,羟 磷灰石是相对不可溶的材料。由于该材料在人体中的再吸收速率特别 低,所以当制备生物材料时,磷灰石相对低的溶解度是不利的。
例如羟磷灰石的磷酸钙是机械上的刚性材料。但是,和天然骨相 比,它们是相对脆性的。胶原蛋白是机械上的韧性材料,但是与天然骨 相比具有相对较低的刚性。包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共聚物的材料比 单独的胶原蛋白具有更高的韧性和刚性,但是,与天然骨相比,仍然具 有较低的刚性。
之前制备机械韧性高于羟磷灰石且硬度超过胶原蛋白及胶原蛋白 与糖胺聚糖共聚物的人工骨替代材料的尝试包括通过机械混合结合胶 原蛋白和磷灰石。这种机械方法记载于EP-A-0164484中。
最新的进展包括,通过机械混合羟磷灰石、胶原蛋白和4-硫酸软 骨素来制备包含这些组分的骨替代材料。该技术描述在EP-A-0214070 中。该文献还描述了4-硫酸软骨素与胶原蛋白的脱水热交联。已经发现, 包含磷灰石、胶原蛋白和4-硫酸软骨素的材料具有良好的生物相容性。 将磷灰石与胶原蛋白和任选地4-硫酸软骨素机械混合,基本上形成胶原 蛋白/4-硫酸软骨素包覆的磷灰石颗粒。已经发现,尽管该材料是生物 相容性的,但是在人体或动物体内产生有限的天然骨内生长,而且不能 重建合成材料的磷酸钙相。
由外伤、畸形或疾病所损伤的骨部位的修复给骨科医生带来了特 殊的挑战,这是因为与皮肤、神经和大多数其它组织类型中的缺损不同, 骨骼的缺损包括多种截然不同的组织类型(即骨、软骨、腱和韧带), 涉及承受通常机械负荷的部位,并跨越矿化组织至未矿化组织之间的界 面(例如韧带止点,骨/软骨界面的“潮标”)。
现有的临床方法或使用非可再吸收的修复
植入物、自体同源的或 异源的组织移植物、化学药剂、细胞移植或这些方法的组合来解决骨骼 缺损的修复。虽然这些方法在单一组织类型的治疗中取得了一些成功, 但是在涉及矿化和未矿化组织之间的界面例如关节连接处缺损的情况 下,例如会导致至多是不完全的愈合。此外,即使最成功的现有治疗也 要求或从供体部位获得组织和/或缝合骨、软骨、韧带或腱。前者方法 遭受供体部位缺乏和供体部位发病之苦,而后者则难于实施,并且产生 为缝合孔形式的另外的缺损。
术语复合支架(composite scaffold)和分层支架(layered scaffold) 是同义的,指的是包括两层或多层的支架,其中每层的材料组成基本上 与其相邻层的材料组成不同。术语单层支架(single-layered scaffold) 或整体式支架(monolithic scaffold)是同义的,指的是只包含一层的支 架,其中每层内的材料组成大体上是整体均匀的。
少数最新的尝试试图开发采用多孔的分层支架治疗或只涉及软骨 或同时涉及骨和软骨的关节连接处缺损的组织工程策略。这些构想试图 同时诱导骨和软骨的再生,但是对每个使用单独的支架(Niederauer et al.,2000;Schaefer et al.,2000;Gao et al.,2001;Gao et al.,2002; Schaefer et al.,2002;Sherwood et al.,2002;Hung et al.,2003;Hunziker and Driesang,2003)。
分层支架的附加特征是它们拥有通过将骨层直接固定到软骨下的 骨板上来实现无缝合固定的潜力。如果软骨部保持牢固地固定至骨部, 就不需要另外的固定。无缝合固定也可以使得涉及腱和韧带到骨的止点 的缺损治疗成为可能。
尽管这种新方法有前景,但是有两个缺点可能限制迄今为止所报 告的分层支架的有效性。第一个缺点涉及用于该支架各层的材料。可再 吸收的合成聚合物是用于软骨层的唯一材料,其通常也是许多这些支架 中骨部的成分。尽管容易制造,但是已知合成聚合物对细胞附着和增殖 的促进不及如胶原等天然聚合物,并且当其降解时会释放出高浓度的 酸。此外,对于必需修复腱或韧带的应用,不管其交联的方式如何,可 再吸收的合成聚合物没有足够的强度和刚性来承受机能恢复训练期间 施加的甚至是减少的负荷。
常规的分层支架的第二个缺点涉及各层之间的界面。天然的关节 连接处和腱/韧带止点的特征在于矿化和未矿化区之间胶原纤维蛋白的 连续性。得到的平滑过渡的系统(软界面)给这些部位提供内在的机械 稳定性,使得它们承受生理负荷而没有机械故障。与此相反,大多数现 有的分层支架含有硬界面,其在两种不同材料之间形成明显边界。缝合 (Schaefer et al.,2000)、用纤维蛋白粘合剂粘接(Gao et al.,2001)和 其它技术(Gao et al.,2002;Hung et al.,2003)已经用来强化该界面。 但是,在甚至是对照动物模型中仍然报道界面剥离。这些缝合和粘接方 法复杂,重现性差。
之前的工作已经开发出通过其可以控制冷冻干燥方案的参数以生 产胶原蛋白和一种或多种糖胺聚糖(GAGs)的多孔支架的方法(Yannas et al.,1989;O′Brien et al.,2004;O′Brien et al.,2005;Loree et al 1989)。 这些技术允许支架的特征例如孔径大小和长宽比以受控方式改变,已知 该参数对外伤或伤口部位的愈合反应具有显著的影响。但是,对于涉及 骨骼和肌骨骼
缺陷的损伤的治疗,必需开发技术来生产材料组成和机械 特征与骨的材料组成和机械特征紧密配合的多孔支架,这与未矿化的胶 原蛋白-GAG支架相反。
本发明旨在解决至少一些与现有技术相关的问题。
一种制备包含无机材料和有机材料的复合生物材料的方法,其包 括:
(a)提供第一浆组合物,其包含液体载体、无机材料和有机材料;
(b)提供用于所述浆的模具;
(c)使所述浆沉积在所述模具中;
(d)将沉积在所述模具中的浆冷却至所述液体载体转化为多个固 体晶体或颗粒的温度;
(e)优选通过升华和/或蒸发移除至少一些所述多个固体晶体或颗 粒,以留下含有无机材料和有机材料的多孔
复合材料;和
(f)将所述材料从所述模具中移走。
此处所用的术语生物材料指的是可与人体或动物体生物相容的材 料。
此处所用的术语浆包括浆、溶液、悬浮液、胶体和分散体。
所述无机材料会通常包括磷酸钙材料。
所述有机材料会通常包括生物有机物,例如一种能溶解或悬浮在 含水介质中以形成浆的物质。例子包括白蛋白、糖胺聚糖、透明质酸、 壳聚糖、和包含胶原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的一种或多种。胶 原蛋白是优选的材料,任选地与糖胺聚糖一起使用。
此处使用的术语胶原蛋白包括重组人(rh)胶原蛋白。
在一个优选的实施方案中,所述无机材料包括磷酸钙材料,所述 有机材料包括胶原蛋白和任选地糖胺聚糖。这产生包含所述磷酸钙材料 和胶原蛋白以及任选地糖胺聚糖的多孔复合材料。优选地,所述第一浆 包含胶原蛋白和磷酸钙材料的共沉淀物。更优选地,所述第一浆包含胶 原蛋白、磷酸钙材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。
作为选择,所述第一浆可以只包含胶原蛋白和磷酸钙材料及任选 地糖胺聚糖的机械混合物。可以通过例如EP-A-0164484和 EP-A-0214070中描述的常规技术来生产该浆。虽然可以使用机械混合 物形成所述浆,但是优选胶原蛋白和所述磷酸钙材料的共沉淀物或胶原 蛋白、磷酸钙材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。
所述磷酸钙材料,可以选自,例如透钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰 石中的一种或多种。所述磷酸钙材料优选包含透钙磷石。
所述浆的pH优选为2.5到6.5,更优选为2.5到5.5,还更优选为 3.0到4.5,并且还更优选为3.8到4.2。
所述浆组合物可以包含一种或多种糖胺聚糖。所述浆组合可以包 含一种或多种磷酸钙材料。
不排除在前体浆中存在其它物质(例如银、硅、
二氧化硅、食盐、 糖等)。
至少一些所述多个固体晶体或颗粒可以通过升华和/或蒸发除去, 以留下包含胶原蛋白、磷酸钙材料和任选地糖胺聚糖的多孔复合材料。 优选的方法是升华。
步骤(d)和(e)可能受到冻干技术的影响。如果所述液体载体是水, 所述升华步骤包括降低模具周围环境的压力,将浆冷冻至水/冰/水蒸气 系统的三相点以下,然后在获得的真空压力下将温度升至比固体-蒸气 转化温度更高的温度。当周围的液体蒸气分压低于当前温度下冻结液体 分压时,所述产品中的冰通过升华直接转化为蒸气。该温度通常升至0 ℃或以上。进行该步骤以通过升华从所述冷冻浆中除去冰晶体。
冻干参数可以被调整,以控制所需的孔径大小和长宽比。一般地, 较慢的冷却速率和较高的最终冷冻温度(例如以大约0.25℃每分钟冷却 至约-10℃的温度)有利于形成具有更大长宽比的大孔,而较快的冷却 速率和较低的最终冷冻温度(例如以大约2.5℃每分钟冷却至约-40℃的 温度)有利于形成等轴的小孔。
此处所用的术语“模具”意欲包括任何能够成形、容纳或支持所 述浆组合物的模具、容器或基质。因此,最简单形式的模具可只包括支 承表面。所述模具可以是任何所需的形状,并且可以由包括聚合物(例 如聚砜、聚丙烯、聚乙烯),金属(例如
不锈钢、钛、钴铬),陶瓷(例 如氧化铝、氧化锆),玻璃陶瓷,和玻璃(例如硼硅酸盐玻璃)的任何 适合的材料制成。
本申请人2004年10月28日提交的较早的申请PCT/GB04/004550 描述了胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物和其制备方法。 PCT/GB04/004550的内容在此通过引用并入本文。
PCT/GB04/004550中描述的方法包括:提供包含胶原蛋白、钙源 和磷源以及糖胺聚糖的酸性水溶液;和将所述胶原蛋白、透钙磷石和糖 胺聚糖一起从所述水溶液中沉淀出来,以形成三元共沉淀物。
术语共沉淀物指的是两种或三种化合物的沉淀,其中所述化合物 基本上同时从相同的溶液/分散体中沉淀。其区别于由所述成分的机械 混合形成的材料,尤其是当这些成分单独地从例如不同的溶液中沉淀 时。所述共沉淀物的微结构明显不同于由其成分的机械混合形成的材 料。
在制备所述共沉淀物的过程中,所述钙源优选选自硝酸钙、醋酸 钙、氯化钙、碳酸钙、钙醇盐、氢氧化钙、硅酸钙、硫酸钙、
葡萄糖酸 钙和肝素钙盐中的一种或多种。肝素钙盐可以源于猪的肠粘膜。合适的 钙盐可商业得到,例如从Sigma-Aldrich公司得到。磷源优选选自磷酸 二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸、二水合正磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O, 有时被称为GPR Sorensen盐)和磷酸三甲酯,磷酸的碱金属盐(例如 钠或钾),磷酸的碱土金属盐(例如镁或钙)中的一种或多种。
糖胺聚糖是含有长的无支链聚糖的大分子族,所述聚糖含有重复 的二糖单元。优选地,所述糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素 (dermatin)、肝素、硫酸肝素、硫酸角蛋白和透明质酸中的一种或多 种。硫酸软骨素可以是4-硫酸软骨素或6-硫酸软骨素,两者都可商业得 到,例如从Sigma-Aldrich公司得到。所述6-硫酸软骨素可以源于鲨鱼 软骨。透明质酸可以源于人的脐带。肝素可以源于猪的肠粘膜。
所述胶原蛋白可以是可溶或不可溶的,并可以源于任何动物的任 何组织,并且可以用许多常规技术提取。
沉淀可以通过在酸性水溶液中结合所述胶原蛋白、钙源、磷源和 糖胺聚糖,然后使所述溶液静止直到出现沉淀,搅拌溶液,用碱滴定液 例如
氨水滴定,加入成核剂例如预制的透钙磷石,改变钙源加入的速率, 或这些或本领域中公知的许多其它技术的任意组合来实现。
将会理解,其它的成分可以存在于所述浆中。例如,可以任选地 将生长因子、基因、药物或其它生物活性物质单独地或以组合加入到浆 中。
在一个优选的实施方案中,根据本发明的方法还有利地包括:提 供第二浆组合物,其包括液体载体和有机材料及任选地无机材料;和
在所述冷却步骤之前,在沉积所述第一浆组合物之前或之后将所 述第二浆组合物沉积在所述模具中。
如前所述,所述有机材料将通常包含胶原蛋白(包括重组人(rh) 胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明质酸、壳聚糖和包含胶原蛋白的 部分多肽序列的合成多肽的一种或多种。
所述第二浆组合物可以包含无机材料,例如磷酸钙材料。
优选地,所述第二浆组合物包含液体载体、胶原蛋白、任选地磷 酸钙材料和任选地糖胺聚糖。在这个实施方案中,所述第二浆组合物优 选包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物,或胶原蛋白和磷酸钙材料的共 沉淀物,或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料的三元共沉淀物。已经关 于所述第一浆的制备讨论过共沉淀。
作为选择,所述第二浆可以只包含胶原蛋白和任选地一种或两种 磷酸钙材料和糖胺聚糖的机械混合物。已经关于所述第一浆的制备讨论 过机械混合物。
如果存在,所述第二浆中的磷酸钙材料可以选自透钙磷石、磷酸 八钙和/或磷灰石的一种或多种。
所述第一和第二浆组合物将通常作为第一和第二层沉积在模具 中。例如,将所述第一浆沉积在模具中,然后是第二浆。然后可以对所 述模具中内含物进行步骤(d)、(e)和(f)。相应地,该方法可以用于形成 多层材料,其中至少一层优选包含含有胶原蛋白、磷酸钙材料和任选地 糖胺聚糖的多孔复合材料。所述第二浆组合物得到的层可以是多孔的或 无孔的层。如果期望多孔层,则所述孔可以通过升华和/或蒸发在第二 浆内形成的多个固体晶体或颗粒来产生。已经关于第一浆讨论过这种技 术,并且优选包括冻干技术。
所述方法在液相中进行,这样有助于在第一浆层和第二浆层之间 的扩散。
可以以任何成层顺序或几何的方式沉积所述层。例如,所述层可 以垂直地(即一层位于另一层上面)、水平地(即一层在另一层旁边) 和/或放射状地(一个球形层在下一个层的上面)
定位。
根据本发明的浇铸方法能够制造用于组织工程的多孔单层和多孔 分层支架。
在所述第一和第二浆组合物沉积在模具中后,所述模具的内含物 优选在冷却步骤之前静置多至24小时。这样是有利的,因为其允许在 相邻的层之间不同浆组分的相互扩散。这会导致层间结合强度的增加。
所述第一浆中的液体载体优选包含水。所述第二浆中的液体载体 也优选包含水。
将会理解,可以在所述冷却步骤之前,在沉积所述第一和/或第二 浆组合物之前或之后,在模具中沉积其它的浆层。
冷却步骤之前沉积在模具中的浆的温度一般会影响浆的粘度。如 果温度过高,则会导致浆的粘度过低,这可导致一旦沉积第二浆,则所 述第一和第二层的完全相互混合(因而是不期望的)。也应该注意,太 高的温度可能导致胶原蛋白变性。另一方面,过低的温度可能导致浆粘 度过高,而不能有效地展开、平滑或成形,并且可能有过早形成冰结晶 体的
风险。相应地,本发明人发现在冷却步骤之前沉积在模具中的第一 浆的温度优选从2至40℃,更优选从4至37℃,还更优选从20至37 ℃。如果使用多层的浆组合物,则这些范围也适用于另外的浆。
沉积在模具中的第一浆的冷却步骤优选进行到≤0℃的温度。更优 选地,冷却步骤进行到-100至0℃的温度,优选从-80至-10℃,更优选 从-40至-20℃。如果使用多层浆组合物,则这些范围也适用于另外的浆。
沉积在模具中的第一浆的冷却步骤优选以0.02-10℃/分钟的冷却 速率进行,更优选0.02-6.0℃/分钟,还更优选0.2-2.7℃/分钟。如果使用 多层浆组合物,则这些范围也适用于另外的浆。
一般地,较慢的冷却速率和较高的最终冷冻温度(例如以大约0.25 ℃每分钟的速率冷却至-10℃的温度)有利于形成具有较大的长宽比的 大孔,而较快的冷却速率和较低的最终冷冻温度(例如以大约2.5℃每 分钟的速率冷却至-40℃的温度)有利于形成等轴的小孔。
沉积在模具中的浆的冷却步骤优选在1~200kPa,更优选50~ 150kPa,仍更优选50~101.3kPa的压力下进行。如果使用多层浆组合 物,则这些范围也适用于另外的浆。本发明人发现,低于50kPa的压力 可能导致在浆中形成气泡,而高于200kPa的压力可能引起相邻层的过 度混合。
沉积在模具中的第一浆的厚度优选0.1~500mm,更优选0.5~20 mm,还更优选1.0~10mm。如果使用多层浆组合物,则这些范围也适 用于另外的浆。厚度超过500mm的层可能难以完全固化,而厚度小于 0.1mm的层可几乎瞬间冻结,使之难以准确控制冰结晶体成核和生长 的
进程。
所述第一浆在被沉积到模具中之前的粘度优选为0.1~50Pa·s,更 优选0.1~10Pa·s,还更优选0.5~5Pa·s。如果使用多层浆组合物,则 这些范围也适用于另外的浆。具有过高粘度的浆可能难以展开、平滑和 成形,而具有过低粘度的浆可能导致一旦沉积第二浆则所述第一层和第 二层就完全相互混合(因而是不期望的)。
通过升华除去第一浆中至少一些固体晶体或颗粒的步骤优选在0~ 0.08kPa,更优选0.0025~0.08kPa,还更优选0.0025~0.04kPa的压力下 进行。如果使用多层浆组合物,则这些范围也适用于另外的浆。比水的 三相点压力(约0.08kPa)高的压力可能有发生融化而不是升华的风险, 而过低的压力则难以实现,并且不一定促进升华。
关于通过升华除去第一浆中至少一些固体晶体或颗粒的步骤,如果 升华的持续时间过短,残留的水和
溶剂可引起所述支架壁的再溶解,进而 危及所述孔结构。相应地,本发明人发现,该步骤优选进行多至96小时, 更优选12~72小时,还更优选24~36小时。如果使用多层浆组合物,则 这些范围也适用于另外的浆。
通过升华除去第一浆中至少一些固体晶体或颗粒的步骤优选在-10 至60℃,更优选0~40℃,还更优选20~37℃,还更优选25~37℃的 温度下进行。如果使用多层浆组合物,则这些范围也适用于另外的浆。 如果在升华期间的温度过低,完成升华所需的时间可能变得过长,而过 高的温度(即高于40℃)可具有胶原蛋白变性的风险。
如果所述材料包含胶原蛋白和糖胺聚糖,则根据本发明的方法还 可以包括使多孔复合生物材料中的胶原蛋白和糖胺聚糖交联的步骤。通 常在升华后从模具中移走所述材料后进行交联。交联可以通过以下方式 实现:对共沉淀物进行γ射线辐照,紫外线辐照,脱水
热处理,用例如 葡萄糖、甘露糖、核糖和
蔗糖的简单的糖进行非酶
糖化的一种或多种、 使该三元共沉淀物与戊二醛、碳二亚胺(例如乙基二甲氨基丙基碳二亚 胺)和/或去甲二氢愈创木酸中的一种或多种接触,或上述方法的任意 组合。在本领域中这些都是常规方法。
如果所述材料包含磷酸钙,则根据本发明的方法还可以包括将所 述多孔复合生物材料中的至少一些磷酸钙材料转
化成另一种磷酸钙相 的步骤。例如,该方法可以包括将所述多孔复合生物材料中的至少一些 透钙磷石转化成磷酸八钙和/或磷灰石。所述透钙磷石到磷酸八钙和/或 磷灰石的转化优选通过
水解实现。相转换将通常在从模具中移走所述材 料(和任选地交联)之后进行。
磷灰石是包含钙和磷酸盐的矿物类,并具有通式Ca5(PO4)3(X), 其中X可以是离子,其通常为OH-、F-和Cl-,以及本领域的技术人员 熟知的其它离子。术语磷灰石也包括取代的磷灰石,例如硅取代的磷灰 石。所述术语磷灰石包括羟磷灰石,它是磷灰石的一个具体实例。所述 羟磷灰石也可以被其它物质例如硅取代。
如上所述,在所述冷却步骤之前,在沉积所述第一和/或第二浆组 合物之前或之后,可以在模具中沉积其它的浆层。所述其它的浆层通常 也会包含例如液体载体、胶原蛋白、任选地磷酸钙材料和任选地糖胺聚 糖。模具中的内含物优选在冷却步骤之前静置多至24小时,以便允许 相邻的层之间的各种浆组分的相互扩散。
相应地,本发明提供了用于制备包含一个、二个或更多层的复合 生物材料的方法。所述层中的至少一个优选包括胶原蛋白、磷酸钙材料 和优选的糖胺聚糖的多孔生物复合物。优选所有的层包含胶原蛋白。
根据本发明的复合生物材料可用于制造,例如多孔的单层支架, 或其中至少一层是多孔的多层支架。根据本发明的复合生物材料被有利 地用于肌骨骼和牙科应用的组织再生支架。
根据本发明的方法优选包括将胶原蛋白作为有机成分引入所述第 一和第二层中(优选胶原蛋白是第一和第二层中的主要有机成分)。如 果存在另外的层,则所述方法优选包括将胶原蛋白作为有机成分引入这 些其它层的一层或多层中(也优选胶原蛋白是所述一个或多个其它层的 主要有机成分)。所述方法包括在液体相中同时制造所有的层和从而制 造它们之间的界面。这样导致层与层间通过相互扩散产生强的界面。术 语相互扩散指的是当两种组成不同的浆整体接触放置时,由于分子扩散 或
布朗运动而发生的混合。
在第二方面中,本发明提供了合成的复合生物材料,其中至少部 分生物材料由包含磷酸钙材料和胶原蛋白(包括重组人(rh)胶原蛋白)、 糖胺聚糖、白蛋白、透明质酸、壳聚糖或包含胶原蛋白的部分多肽序列 的合成多肽的一种或多种的多孔共沉淀物形成,其中大孔尺寸范围(孔 径)优选为1~1000微米,更优选200~600微米。所述材料优选包含 胶原蛋白。所述磷酸钙材料优选选自透钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰石 的一种或多种。所述多孔材料优选包含胶原蛋白和磷酸钙材料的共沉淀 物。这已经关于本发明的第一方面描述过。
此处所用的术语多孔指的是所述材料可以包含大孔和/或微孔。大 孔隙率通常指的是与尺度大于约10微米的孔相关的特征。微孔隙率通 常指的是与尺度小于约10微米的孔相关的特征。将会理解所述材料内 可能有开放小室和闭合小室的任意组合。例如,所述材料一般会含有大 孔和微孔。所述大孔隙率一般是开放小室的,尽管可能有闭合的小室部 分。
根据本发明第二方面的多孔材料中大孔的尺寸范围(孔径)通常 是从1至1200微米,优选从10至1000微米,更优选从100至800微 米,还更优选从200至600微米。
根据本发明第二方面的多孔材料中的平均长宽比优选从1至50, 更优选从1至10,最优选约1。
根据本发明第二方面的多孔材料中的
孔径分布(平均孔径的标准 偏差)优选从1至800微米,更优选从10到400微米,还更优选从20 到200微米。
根据本发明第二方面的多孔材料中的孔隙率优选从50至99.99 体积%,更优选从70至98体积%。
根据本发明第二方面的多孔材料中的开放小室的孔隙率的百分比 (作为总的开放和闭合小室的孔的总数的百分比来测量)优选从1至 100%,更优选从20至100%,还更优选从90至100%。
在第三方面中,本发明提供了合成的复合生物材料,其中至少部 分生物材料由包含磷酸钙材料和两种或多种胶原蛋白(包括重组人(rh) 胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明质酸、壳聚糖和包含胶原蛋白的 部分多肽序列的合成多肽的多孔材料形成。所述材料优选包含胶原蛋白 和糖胺聚糖。所述磷酸钙材料优选选自透钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰 石的一种或多种。所述多孔材料优选包含胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙 材料的三元共沉淀物。这已经关于本发明的第一方面描述过。根据本发 明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范围(孔径)也适用于所述第三方 面。其平均长宽比范围、孔径大小分布、孔隙率和开放小室孔隙率百分 比同样如此。
第四方面中,本发明提供了一种合成的复合生物材料,其包括: 第一层,其由根据本发明第二或第三方面的复合生物材料形成;和连接 至所述第一层的第二层,其由包含胶原蛋白,或胶原蛋白与糖胺聚糖的 共沉淀物,或胶原蛋白与磷酸钙材料的共沉淀物,或胶原蛋白、糖胺聚 糖和磷酸钙材料的三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸钙材料优选选自 透钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰石的一种或多种。
所述第一和第二层优选整体地形成。有利地,这可以通过涉及液 相共合成的方法实现。这包括任何方法,其中通过在从所述浆除去液体 载体之前,将各层的包含前体的浆以整体彼此接触的方式放置,来形成 包含多层的材料的密实或多孔相邻层,和其中优选基本上同时从所有层 中除去所述液体载体。在除去液体载体之前(即,仍然在液体相中), 将所述前体浆以整体接触方式放置允许相邻的浆之间发生相互扩散。这 在所得材料的相邻层之间的界面处形成相互扩散区域,其中的材料组成 为所述相邻层的材料组成的中间值。相互扩散区域的存在可赋予相邻层 之间的界面机械强度和稳定性。相应地,所述第一和第二层优选通过相 互扩散层彼此连接。
作为选择,所述第一和第二层可以通过中间层相互连接。术语中 间层指的是单独地沉积于两个其它层之间,用于提高层间结合强度或阻 止所得支架的相邻层之间的细胞、分子或流体通过,并且可以例如包含 胶原蛋白、糖胺聚糖、纤维蛋白、抗血管生成药物(例如苏拉明 (suramin))、生长因子、基因或任何其它成分的任何层。中间层通过 以下事实区别于相互扩散层:中间层作为组成不同于其相邻层的组成的 浆而单独地沉积,而相互扩散层只是由于相邻层之间的相互扩散而形成 的。
所述第一层是多孔的。优选第二层也是多孔的,尽管如果需要, 可以是无孔的或基本上无孔的层。
根据本发明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范围(孔径)也适 用于根据本发明第四方面的实施方案中的第一和/或第二层。其平均长 宽比范围、孔径分布、孔隙率和开放小室孔隙率百分比同样如此。
在任意的所述第二、三和四方面中,所述生物材料可以包含连接 至所述第一和/或第二层的一个或多个其它的层,其中所述其它层中的 每一层优选由包含胶原蛋白,或胶原蛋白与糖胺聚糖的共沉淀物,或胶 原蛋白与磷酸钙材料的共沉淀物,或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料 的三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸钙材料优选选自透钙磷石、磷酸 八钙和/或磷灰石中的一种或多种。所述第一和第二层及所述一个或多 个其它的层优选整体的方式形成,并且相邻的层优选通过通常由液相共 合成形成的相互扩散层彼此连接。一般地,所述其它层中的至少一个将 会是多孔的。此外,根据本发明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范围 (孔径)也适用于这些其它层的一个或多个。其平均长宽比范围、孔径 分布、孔隙率和开放小室孔隙率百分比同样如此。
相邻层之间的孔径大小差可以在几乎可忽略到大至+/-1000微米 之间变化。
除非另有说明,下列描述适用于本发明的任意方面。
如果材料包含胶原蛋白和糖胺聚糖,则可以交联所述胶原蛋白和 糖胺聚糖。
所述胶原蛋白优选以从1至99wt%,优选从5至90wt%,更优 选从15至60wt%的量存在于所述材料中。
所述糖胺聚糖优选以从0.01至20wt%,更优选从1至12wt%, 还更优选从1至5.5wt%的量存在于所述材料中。
如果所述材料包含透钙磷石,则胶原蛋白和透钙磷石的重量比优 选从10∶1至1∶100,更优选从5∶1至1∶20。
如果所述材料包含磷酸八钙,则胶原蛋白和磷酸八钙的重量比优 选为10∶1至1∶100,更优选从5∶1至1∶20。
胶原蛋白和糖胺聚糖的重量比优选为从8∶1至30∶1。
根据本发明的生物材料可以用作替代骨或牙科材料。相应地,本 发明提供了包含此处描述的生物材料的合成骨材料、
骨植入物、骨移植 物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固粉。
所述生物材料有利地以多层支架的形式提供。具体地,本发明提 供了用于肌骨骼和牙科应用的组织再生支架。根据本发明的多层(即两 层或多层)支架可以在例如骨/软骨界面(例如关节连接)、骨/腱界面(例 如腱止点)、骨/韧带界面(例如韧带止点)、和
牙齿/韧带界面(例如牙 齿/牙周韧带结合点)中找到应用。
尽管本发明主要涉及用于组织工程应用的支架,但是根据本发明 的材料可以用于制造在体内保持很长时间的植入物。例如,腱和韧带应 用可能必需的半永久性植入物。
本发明还提供可通过此处描述的方法获得的多孔复合生物材料。
合成方法
现在将通过实施例来进一步说明本发明。优选的合成方法包括一 系列步骤,其可以整体或部分地应用以生产具有一个层或多个层的多孔 支架,其中至少一个层优选包含胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料的三 元共沉淀物。
步骤0:制备浆
可以利用本发明人2004年10月28日提交的较早的专利申请 PCT/GB04/004550中概述的方法来实现矿化的胶原蛋白/GAG/透钙磷 石浆的制备。PCT/GB04/004550的内容在此通过引用并入本文。
可以利用Yannas et al.,1989;O′Brien et al.,2004;O′Brien et al., (2005);Loree et al.,(1989)中概述的方法来实现未矿化的胶原蛋白/GAG 浆的制备。
在该阶段通过机械混合,可以任选地将生长因子、基因、药物或 其它生物活性物质单独地或以组合加入所述浆中,以促使它们并入所述 支架中。在支架具有多于一层的情况下,并入一层中的生物活性物质不 需要与并入下一层中的生物活性物质相同。
步骤I:浇铸
步骤I-a:浇铸第1层
步骤I-b:浇铸第2层
步骤I-c:浇铸第3层
步骤I-n:浇铸第n层
所述浇铸步骤包括将溶液、悬浮液、胶体或分散体形式(其中水 构成主要稀释剂)的浆连续沉积到模具中,其中至少一种浆包含胶原蛋 白、一种或多种糖胺聚糖和磷酸钙透钙磷石的三元共沉淀物,并且所有 的浆包含胶原蛋白。
所述模具可以是任何期望的形状,可以由包括聚合物(例如聚砜、 聚丙烯、聚乙烯),金属(例如不锈钢、钛、钴、铬),或陶瓷(例如氧 化铝、氧化锆),玻璃陶瓷,或玻璃(例如硼硅酸盐玻璃)的任意的许 多材料制成。
可以专
门地构造所述模具用于促进层化。
例如,所述层可以垂直地(即一层位于另一层上面)、水平地(即 一层在另一层旁边)、和/或放射状(一个球形层在下一个的上面)地定 位。
在所述支架包括一层的情况下,待浇铸的单层包含含有胶原蛋白、 磷酸钙材料(优选透钙磷石)和任选地糖胺聚糖的共沉淀物的浆。优选 地,所述浆包含含有胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物。 该层的优选厚度列于表1的适当部分中。
在所述支架包括两层的情况下,待浇铸的所述层中的至少一层包 含含有胶原蛋白、磷酸钙材料(优选透钙磷石)和任选地糖胺聚糖的共 沉淀物的浆。优选地,所述浆包含含有胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖 的三元共沉淀物。该层的优选厚度列于表1的适当部分中。另一层包括 含有胶原蛋白、任选地磷酸钙材料和任选地糖胺聚糖的浆。该浆组合物 优选包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物,或胶原蛋白与磷酸钙材料 (比如透钙磷石)的共沉淀物,或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料(优 选透钙磷石)的三元共沉淀物。
可以根据需要包括其它层,并且这些其它层优选由包含胶原蛋白、 任选地磷酸钙材料和任选地糖胺聚糖的浆形成。所述其它的浆组合物优 选包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物,胶原蛋白和磷酸钙材料(例如 透钙磷石)的共沉淀物,或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料(优选透 钙磷石)的三元共沉淀物。
每个后续层中的浆的组成可以是相同的,稍微变化的,或显著变 化的,条件是胶原蛋白和优选的糖胺聚糖存在于每一层中,并且所述层 中的至少一层也包含磷酸钙材料,例如透钙磷石。
步骤II:相互扩散
所述共扩散步骤包括允许浇铸的、分层的浆的各层相互扩散。进 行这一步步骤,以使得在相邻层之间的浆组分相互扩散,从而增加固化 和升华后层间的结合强度。所述相互扩散步骤的优选条件列于表2中的 适当部分。
步骤III:受控冷却
所述受控冷却步骤包括将含有浆的模具置于环境中,然后以控制 速率冷却至低于0℃的最终温度。进行该步骤,以引发和控制浆内冰结 晶体成核和生长的速率。然后,通过升华除去冰结晶体,留下多孔的支 架。所述冰结晶体网络的结构将决定支架的最终孔结构。冷却的优选参 数列于表3中。
步骤IV:
退火所述退火步骤包括使得浆在受控冷却步骤的最终温度下保持给定 的时间。进行该步骤以确保浆完全或基本完全冻结。退火的优选参数列 于表4。
步骤V:升华
所述升华步骤包括当冻结的浆大致维持在受控冷却和退火步骤的 最终温度时,将模具和冻结浆周围环境中的压力降低至低于水/冰/水蒸 气系统的三相点,然后将温度升至高于在获得的真空压力下的固体-蒸 气转化温度的温度(通常≥0℃)。进行该步骤,以通过升华将冰结晶体 从冻结的浆中除去。作为除去水的方法,升华相对于蒸发的优点在于其 留下了精确模拟之前存在的冰结晶体网络结构的空的空间(即孔)网络。 如果允许冰融化,则冰结晶体网络会丧失其形状,并且损害所得到的孔 网络结构。所述升华步骤的优选参数示于表5。
步骤VI:交联
如果需要,所述方法也可以包括交联步骤以交联胶原蛋白和糖胺 聚糖。这记载于本发明人2004年10月28日提交的较早的专利申请 PCT/GB04/004550中。PCT/GB04/004550的内容在此通过引用并入本 文。
实施例
实施例1:胶原蛋白/GAG/CaP的单层支架
材料
胶原蛋白:I型,从牛腱获得的微原纤维胶原蛋白,Integra Life Sciences Plainsboro,NJ,USA;GAG:源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素, 钠盐,Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA);钙源:(i)氢氧化钙 (Ca(OH)2)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA);(ii)硝酸钙 (Ca(NO3)2·4H2O)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA);磷源:正 磷酸(H3PO4),BDH Laboratory Supplies(Poole,United Kingdom);交 联剂:1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(=EDAC), Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA);N-羟基琥珀酰亚胺(=NHS) Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA)。
程序
步骤0:制备浆
通过使用配备直径19mm
定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟,将3.8644g胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1383摩尔/ 升的H3PO4中,以产生高粘性的胶原蛋白分散体。平行地,在室温下使 得0.3436g6-硫酸软骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩尔/升H3PO4 中,通过周期性振摇分散溶解的GAG,以便生产GAG溶液。90分钟 后,在15,000rpm的连续均质下,以大约0.5mL/分钟的速率将14.3mL 所述GAG溶液加入到混合的胶原蛋白分散体中,然后另外混合得到的 高粘性胶原蛋白/GAG分散体90分钟。混合90分钟之后,在30分钟时 间和15000rpm的恒定混合下,将1.804g Ca(OH)2和0.780g Ca(NO3)2·4H2O加入所述高粘性胶原蛋白/GAG分散体中,生成pH约 4.0的胶原蛋白/GAG/CaP浆。使得所述胶原蛋白/GAG/CaP浆在搅拌板 上在25℃下保持48小时混合,然后在4℃下放置12小时。然后冷却的 浆在25Pa的压力下在真空烧瓶中脱气25小时。
步骤I:浇铸
使用自动吸移管管理器将15mL未矿化的胶原蛋白/GAG/CaP浆 浇铸到长50mm、宽30mm和深10mm的聚砜模具中。使用手动吸移 管管理器从所述浆中除去所有的大气泡。
步骤II:相互扩散
由于实施例I的支架只包括一层,所以相互扩散的步骤是不必要 的。
步骤III:受控冷却
将所述模具和浆放入VirTis Genesis冷冻干燥器(配有温控的不 锈钢架)中,并且所述冷冻干燥器的架温以约2.4℃每分钟的速率从4 ℃降低至-20℃。
步骤IV:退火
所述冷冻干燥器的架温保持在-20℃下10小时。
步骤V:升华
当仍处于-20℃的架温时,将低于25Pa的真空(约200毫托)施 加到容纳所述模具和(目前冻结的)浆的室中。然后将所述室的温度升 至37℃,并且允许升华持续36小时。然后除去所述真空,温度恢复至 室温,留下胶原蛋白/GAG/CaP的单层支架,尺寸为50mm×30mm× 10mm。
步骤V+I:交联
支架在40mL去离子水中水合20分钟。将20mL的0.035摩尔/ 升EDAC和0.014摩尔/升NHS的溶液加入到容纳所述支架和去离子 水的容器中,允许所述支架在室温和轻度搅拌下交联2小时。除去所述 EDAC溶液,用磷酸缓冲溶液(PBS)漂洗支架,然后使得在37℃和中 度搅拌下在新鲜的PBS中培养2小时。在PBS中两个小时后,通过使 得在37℃和中度搅拌下在去离子水中培养两个10分钟间隔来漂洗所述 支架。然后通过以大约2.4℃每分钟的速率从室温受控冷却至-20℃冷冻 干燥所述支架,来除去任何残余的水,随后在-20℃退火约5小时,然 后在37℃下低于25Pa升华,生成交联的胶原蛋白/GAG/CaP支架,尺 寸大致为50mm×30mm×10mm。
获取了所得单层支架的
X射线显微
断层图像、扫描电镜图像、离 子分布图和
压缩机械行为。值得注意的是整个支架中材料组成和孔隙率 基本均匀的性质。显示了相同支架的连续横截面,再次说明了所述支架 孔结构的均匀性;高度的孔互联性、等轴孔形态和大的(平均直径500 微米)大孔尺寸也很明显。SEM显微照片再次显示了大孔的形态,同 时也显示了有限的微孔的存在,其可在某些大孔的壁内看见。所述支架 壁区域的高(4000×)放大率二次(即外形敏感的)和反向散射的(即 组成敏感的)
电子图像表明所述支架壁的组成均匀性,尽管存在处于尺 寸约为1-2微米的突出瘤状体的形式有限的拓扑变化。钙和磷图证实了 整个支架中组成基本均匀的结论,其中两种元素均匀地分布在整个支架 中。干燥状态下的单层支架能够被普通的外科工具例如手术刀、剃刀和 圆锯刀片(在
角膜移植中使用的环形切割工具)切成任何期望的形状, 而不会
破碎、裂开或失去完整性。在干燥状态下的单层支架的行为显示 了典型的多孔质固体
变形的三个阶段,其具有
弹性模量762+/-188kPa 和压缩屈服应力85.2+/-11.7kPa。重要的是注意到所述干支架的屈服强 度使得它们承受有力的拇指压力(例如在插入缺陷部位时),其在施加 强有力的拇指压力(例如外科医生改变植入物的形状)时仍不会形成永 久性的变形。在水合状态下的单层支架的压缩变形显示出三个阶段的机 械行为,但是其弹性模量(4.12+/-0.76kPa)和屈服应力(0.29+/-0.11kPa) 比相应的干支架性能低大约一个数量级。此外,在塌陷平台区观察到了 的
压缩应力释放之后粘弹性形变恢复的证据。
实施例II:双层矿化-未矿化支架
材料
胶原蛋白(用于矿化的浆):从牛腱获得的I型微原纤维胶原蛋白, Integra Life Sciences Plainsboro,NJ,USA;
GAG(用于矿化的浆):从鲨鱼软骨获得的6-硫酸软骨素,钠盐, Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA)。
II型胶原蛋白
+GAG(用于未矿化的浆):从猪的软骨中溶解的II型胶原蛋白和 GAG(胶原蛋白/GAG)浆,Gelstlich Biomaterials(Wolhusen, Switzerland)。
钙源:(i)氢氧化钙(Ca(OH)2)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO, USA);(ii)硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO, USA);磷源:正磷酸(H3PO4),BDH Laboratory Supplies(Poole,United Kingdom);交联剂:1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(=EDAC), Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA);N-羟基琥珀酰亚胺(=NHS) Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA)
步骤0:制备浆
制备矿化的浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟,将3.8644g的胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1383摩 尔/升的H3PO4中,以产生高粘性胶原蛋白分散体。平行地,在室温下 将0.3436g6-硫酸软骨素(GAG)溶解在14.3mL的0.1383摩尔/升的 H3PO4中,通过周期性振摇分散溶解的GAG,以产生GAG溶液。90 分钟后,在15000rpm的持续均质下,以大约0.5mL/分钟的速率将14.3 mL的GAG溶液加入到混合的胶原蛋白分散体中,然后另外混合得到 的高粘性胶原蛋白/GAG分散体90分钟。混合90分钟之后,在30分钟 时间和15000rpm的恒定混合下,将1.804g Ca(OH)2和0.780g Ca(NO3)2·4H2O加入高粘性胶原蛋白/GAG分散体中,生成pH约为4.0 的胶原蛋白/GAG/CaP浆。冷却的浆在25Pa压力下在真空瓶中脱气25 小时,使用均质器再混合30分钟,然后再次脱气48小时。
制备未矿化的浆
从冰箱中取出II型胶原蛋白/GAG浆并允许恢复到室温。
步骤I:浇铸
将2.5mL未矿化的II型胶原蛋白/GAG浆放入组合聚砜模具的底 部,所述底部长50mm,宽30mm,深2mm。用剃刀将所述浆平整为 平坦的表面。将也由聚砜制成的长50mm宽30mm深6mm的上部环 固定到容纳所述平整的未矿化浆的模具底部。将9mL矿化的胶原蛋白 /GAG/CaP浆以均匀分布的方式置于所述平整的未矿化层上和之前空的 的上部环内。利用手动吸移管管理器从所述浆中除去所有大的气泡。
步骤II:相互扩散
在放入冷冻干燥器之前,使得所述分层的浆保持在室温和室压下 共4个小时。
步骤III:受控冷却
将所述模具和分层的浆放入VirTis Genesis冷冻干燥器(配有温 控的不锈钢架)中,并且所述冷冻干燥器的架温以约-2.4℃每分钟的速 率从4℃降低至-40℃。
步骤IV:退火
所述冷冻干燥器的架温保持在-40℃下10小时。
步骤V:升华
仍处于-40℃的架温时,将低于25Pa的真空(约200毫托)施加 到容纳所述模具和(目前冻结的)分层浆的室中。然后所述室的温度升 至37℃,并且允许升华持续36小时。然后除去所述真空,温度恢复至 室温,留下胶原蛋白/GAG/CaP的双层支架,尺寸为50mm×30mm× 8mm,由2mm厚的未矿化层和6mm厚的矿化层构成。
步骤VI:交联
支架在32mL去离子水中水合20分钟。将18mL的0.035摩尔/ 升EDAC和0.014摩尔/升NHS溶液加入到容纳所述支架和去离子水 的容器中,并且使得所述支架在室温和轻度搅拌下交联2小时。除去所 述EDAC溶液,然后用磷酸缓冲溶液(PBS)漂洗支架,然后允许在 37℃和中度搅拌下在新鲜的PBS中培养2小时。在PBS中两个小时后, 通过允许在37℃和中度搅拌下在去离子水中培养两个10分钟间隔来漂 洗所述支架。然后通过以大约-2.4℃每分钟的速率从室温受控冷却至-20 ℃来冷冻干燥所述支架,以除去任何残余的水,然后在-20℃退火5小 时,最终在低于25Pa和37℃下升华24小时,生成交联的分层的胶原 蛋白/GAG/CaP支架,尺寸约为50mm×30mm×8mm,由2mm厚的 未矿化层和6mm厚的矿化层组成。
获取了双层支架的X射线显微断层图像、扫描电镜图像、和离子 分布图。通过上述步骤生产的双层支架的9.5mm×9.5mm圆柱部分的X 射线显微断层图象包含不透明的下部区域,其显示了矿化层,而更透明 的上部区域代表未矿化层。在孔隙率和组成方面,两层都大致均匀。所 述矿化层中的平均大孔尺寸为约400微米,而未矿化层中的那些在700 微米的级别上;矿化和未矿化层中的孔都显示出等轴形态。SEM图像 显示了未矿化层的俯视图,其说明几乎没有微孔隙率存在的证据,而界 面区的图像证实没有将所述矿化和未矿化层分开的任何大空隙或其它 间断。研究了双层支架在压缩负荷下的行为。在施加压缩负荷后,柔性 的未矿化层开始压缩,在不足以在矿化支架内引起任何显著变形的应力 下导致软骨区室的几乎完全的压缩。当负荷释放后,所述未矿化的胶原 蛋白/GAG层几乎立刻恢复至原来的形状。研究了双层支架在水合状态 下的机械行为。一旦水合,所述未矿化的胶原蛋白/GAG层在低幅负荷 下可以被压缩。与干燥状态不同,所述水合的未矿化区室在第一次施加 压缩负荷之后没有完全恢复其原始厚度,而是在所述矿化区室的横截面 上下垂。但是在初始压缩后,未矿化层在随后每次施加压缩负荷之后恢 复到其压缩厚度。研究了双层支架的未矿化层附着到包含关节连接处的 骨和软骨界面的外科缺损的壁上的能力。
载玻片与骨软骨缺损的壁相 似,所述未矿化层附着到这个表面的能力表明这些支架填充这些缺损到 它们外围而不会在支架的未矿化层和相邻的关节软骨之间留下空隙的 能力。
实施例III:三层矿化-未矿化的矿化支架
材料
胶原蛋白(用于矿化的浆):源于牛腱的I型微原纤维胶原蛋白, Integra Life Sciences(Plainsboro,NJ,USA)
GAG(用于矿化的浆):源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素,钠盐, Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA)。
钙源:(i)氢氧化钙(Ca(OH)2)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO, USA);(ii)硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO, USA);磷源:正磷酸(H3PO4),BDH Laboratory Supplies(Poole,United Kingdom)
胶原蛋白(用于未矿化的胶原蛋白-GAG浆):从猪的真皮中溶解 的85%I型,15%III型胃蛋白酶Japan Meat Packers(Osaka,Japan)
GAG(用于未矿化的浆):源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素,钠盐, Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA)。
用于未矿化胶原蛋白和GAG的稀释剂:冰醋酸(CH3COOH), Fischer Scientific(Loughborough,UK);交联剂:去甲二氢愈创木酸 (NDGA),Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA);磷酸二氢钠 (NaH2PO4),BDH Laboratory Supplies(Poole,United Kingdom);氯 化钠(NaCl),Sigma-Aldrich Inc(St.Louis,MO,USA)
步骤0:制备浆
制备矿化的浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟,将3.8644g的胶原蛋白分散在于冰浴中冷却的171.4mL的0.1383 摩尔/升的H3PO4中,以制备高粘性的胶原蛋白分散体。平行地,在室 温下将0.3436g6-硫酸软骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩尔/升 H3PO4中,通过周期性振摇分散溶解的GAG,以产生GAG溶液。90 分钟后,将14.3mL所述GAG溶液在15,000rpm的持续均质下以大约 0.5mL/分钟的速率加入混合的胶原蛋白分散体中,然后另外混合得到的 高粘性胶原蛋白/GAG分散体90分钟。混合90分钟之后,在30分钟时 间和15000rpm的恒定混合下,将1.804g Ca(OH)2和0.780g Ca(NO3)2·4H2O加入所述高粘性胶原蛋白/GAG分散体中,生成pH约 4.0的胶原蛋白/GAG/CaP浆。然后冷却的浆在25Pa的压力下在真空烧 瓶中脱气25小时,使用均质器再次混合30分钟,然后再次脱气48小 时。
制备未矿化的浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟,将1.9322g I/III型胶原蛋白分散在于冰浴中冷却的171.4mL的0.05 摩尔/升的醋酸中,以制备高粘性胶原蛋白分散体。平行地,在室温下 将0.1718g6-硫酸软骨素(GAG)溶解到28.6mL的0.05摩尔/升醋酸中, 通过周期性振摇分散溶解的GAG,以生成GAG溶液。90分钟后,在 15,000rpm的持续均质下以大约0.5mL/分钟的速率,将所述14.3mL GAG溶液加入混合的胶原蛋白分散体中,并另外混合得到的高粘性胶 原蛋白/GAG分散体90分钟。
步骤I:浇铸
将3.5mL矿化的胶原蛋白/GAG/CaP浆置于组合聚砜模具的底 部,所述底部长50mm,宽30mm,深3mm。所述浆用剃刀平整为平 面。一个也由聚砜制成的长50mm宽30mm深5mm的中间环连接到 容纳所述平整的矿化浆的模具底部。将7.5mL未矿化的胶原蛋白/GAG 浆以均匀分布的方式置于所述平整的未矿化层上并在之前空的中间环 内。将一个也由聚砜制成的长50mm宽30mm深3mm的上部环连接 到所述平整的未矿化浆之上的模具的中间部分。将3.5mL矿化的胶原 蛋白/GAG/CaP浆以均匀分布的方式置于所述平整的未矿化层上并在之 前空的上部环内。利用手动吸移管管理器从所述浆中除去所有大的气 泡。
步骤II:相互扩散
在放入冷冻干燥器之前,允许所述三层浆保持在室温和室压下20 分钟。
步骤III:受控冷却
将所述模具和三层浆置于VirTis AdVantage冷冻干燥器(配有温 控的不锈钢架)中,并且所述冷冻干燥器的架温以约-2.4℃每分钟的速 率从4℃降低至-40℃。
步骤IV:退火
保持所述冷冻干燥器的架温在-40℃下10小时。
步骤V:升华
当仍处于-40℃的架温时,将低于25Pa的真空(约200毫托)施 加到容纳所述模具和(目前冻结的)三层浆的室中。然后所述室的温度 升至37℃,并且允许升华持续36小时。然后除去所述真空,温度恢复 至室温,留下尺寸为50mm×30mm×11mm的三层支架,由5mm厚的 未矿化中间层和环绕它的两个3mm厚的矿化层组成。
步骤VI:交联
将三层支架在0.1摩尔/升NaH2PO4和0.15摩尔/升NaCl的磷酸 盐缓冲液(PBS;pH7.0)中水合30分钟。将NDGA悬浮在1N NaOH 中,并加入到PBS中生成3mg/mL的NGDA在PBS中的溶液;然后在 搅拌下在该溶液中水合支架24小时。从NGDA-PBS溶液移走所述三层 支架,并用去离子水冲洗。然后通过以大约2.4℃每分钟的速率从室温 受控冷却至-20℃冷冻干燥所述支架,以除去任何残余的水,然后在-20 ℃退火5小时,并最终在37℃下在低于25Pa下升华24小时,得到干 燥交联的支架。然后在浓度为0.1mg/mL的NDGA中进行随后的处理。 然后在70%
乙醇中清洗支架6小时,随后在室温在PBS中清洗24小时。 然后通过以大约2.4℃每分钟的速率从室温受控冷却至-20℃来冷冻干燥 所述支架第二时间,以除去任何残余的水,然后在-20℃退火5小时, 并最终在37℃下在低于25Pa下升华24小时。
下列表中的参数可以单独地或以组合应用到本发明的任意方面, 除非另有说明。
表1:浇铸的优选参数
表2 交互扩散的优选参数
表3 受控冷却的优选参数
表4 退火的优选参数
表5 升华的优选参数
参考文献
Gao J,Dennis JE,Solchaga LA,Awadallah AS,Goldberg VM,Caplan AI. 2001. Tissue- Engineered Fabrication of an Osteochondral Composite Graft Using Rat Bone Marrow- Derived Mesenchymal Stem Cells.Tissue Engineering 7:363-371.
Gao J,Dennis JE,Solchaga LA,Goldberg VM,Caplan AI. 2002. Repair of Osteochondral Defect with Tissue-Engineered Two-Phase Composite Material of Injectable Calcium Phosphate and Hyaluronan Sponge. Tissue Engineering 8:827-837.
Hung CT,Lima EG,Mauck RL,Taki E,LeRoux MA,Lu HH,Stark RG,Guo XE, Ateshian GA. 2003. Anatomically Shaped Osteochondral Constructs for Articular Cartilage Repair. Journal of Biomechanics 36:1853-1864.
Hunziker EB,Driesang IMK. 2003. Functional Barrier Principle for Growth-Factor- Based Articular Cartilage Repair. Osteoarthritis and Cartilage 11:320-327.
Niederauer GG,Slivka MA,Leatherbury NC,Korvick DL,H.H.HJ,Ehler WC,Dunn C Kieswetter K.2000.Evaluation of Multiphase Implants for Repair of Focal Osteochondral Defects in Goats. Biomaterials 21:2561-2574.
O′Brien FJ,Harley BA,Yannas IV,Gibson L.2004.Influence of Freezing Rate on Pore Structure in Freeze-Dried Collagen-GAG Scaffolds. Biomaterials 25:1077-1086.
O′Brien FJ,Harley BA,Yannas IV,Gibson LJ. 2005. The Effect of Pore Size and Structure on Cell Adhesion in Collagen-GAG Scaffolds. Biomaterials 26:433-441.
HM Loree,IV Yannas,B Mikic,AS Chang,SM Perutz,TV Norregaard,and C Kararup, ‘A freeze-drying process for fabrication of polymeric bridges for peripheral nerve regeneration’Proc. 15th Annual Northeast Bioeng.Conf.P.53-54,1989.
Schaefer D,Martin I,Jundt G,Seidel J,Heberer M,Grodzinsky A,Bergin I,Vunjak- Novakovic G,Freed LE.2002.Tissue-Engineered Composites for the Repair of Large Osteochondral Defects. Arthritis and Rheumatism 46:2524-2534.
Schaefer D,Martin I,Shastri P,Padera RF,Langer R,Freed LE,Vunjak-Novakovie G. 2000.In Vitro Generation of Osteochondral Composites.Biomaterials 21:2599-2606.
Sherwood JK,Riley SL,Palazzolo R,Brown SC,Monkhouse DC,Coates M,Griffith LG,Landeen LK,Ratcliffe A.2002.A Three-Dimensional Osteochondral Composite Scaffold for Articular Cartilage Repair.Biomaterials 23:4739-4751.
Yannas IV,Lee E,Orgill DP,Skrabut EM,Murphy GF.1989.Synthesis and Characterization of a Model Extracellular Matrix that Induces Partial Regeneration of Adult Mammalian Skin.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86:933-937.
本发明在很多领域找到了应用,以举例的方式提供下列应用。
关节软
骨修复产品:双层支架
双层支架具有提高现有的将源自骨髓的干细胞补充至关节软骨创 伤部位的首要外科手术疗效的潜力。例如,作为干燥的2cm×2cm×1cm 的干燥、真空
包装、γ灭菌的类似于聚苯乙烯
泡沫的
块状物递送,这些 支架可以利用手术刀或其它工具切割,简单地用拇指或钝器压力轻易地 插入缺损处,并且直接结合到所述部位,而不用缝合或胶粘。
髌韧带供体部位的修复产品:三层支架
三层支架具有在前十字韧带(ACL)重建期间增强髌韧带(髌骨 腱)再生的潜力,减轻前膝痛并降低髌韧带断裂和膝盖骨折的风险。
腱修复产品:双层支架
具有扩大的未矿化成分的双层支架具有提高肌腱套(rotator-cuff) 手术期间腱修复疗效和解决现在尚无有效解决方案的小腱应用的潜力。
还在大型
家畜的
基础上研究了本发明,总结如下。
试验1:
绵羊骨缺损模型
本发明使之可以生产分层的组织再生支架,其一侧的结构和组成 模拟骨,另一侧上为未矿化组织(例如软骨、韧带、腱),在其间具有 平滑稳定的界面。此外,本发明还提供了系统地改变这种植入物的骨区 室矿物相的化学组成的能力。
动物:骨骼成熟的Texcel陆地绵羊(雌性)。
缺损:外侧股骨髁上的直径9mm、深9mm的松质骨缺损
植入时间:6周
实验组:每个实验组的6个植入物被以相同的植入类型对侧地植 入同一动物的每一侧。
对照组:
正对照:用从胫骨粗隆
收获的多孔自体移植物填充四个部位。
负对照:用包含完全不含矿物相(即只含有ChondroMimetic骨 质侧的有机成分)的植入物的对照植入物填充四个部位。
研究目的:
鉴别化学组成不同的四个实验植入组的性能差别,并 将这些植入组中最期望的组确定为ChondroMimetic骨区室的最终组 成。
重大发现:三个实验组都没有引发任何种类的不良免疫响应;所 有三个实验组和未矿化的负对照组通过细胞介导的直接取代机理支持 骨的内生长;三个实验组之间没有观察到显著的统计上的差别;并且在 全部三个实验组中观察到的骨形成比负对照组中的骨形成高出显著的 统计水平。
植入物设计的应用:该项研究所涉及的直接取代机理表明:与在 传统的骨移植替代物中观察到的典型的外加机理相比,所述骨形成的机 理更接近于在
胎儿和新生动物(包括人)的生长面上出现的模板骨形成。 在未矿化的对照组中存在的这种取代机理表明:所述植入物的有机组分 赋予了这种特性。
所述植入物的孔径大小应该通过降低植入物的骨区室的平均孔径 来改变,以解释这种取代机理。
所述三个实验组的骨形成行为没有显著的统计差异表明:处理参 数可以用来识别最适合的植入物的矿物组成。
试验2:公山羊的骨软骨缺损模型
该项研究的目的在于评估作为增强骨髓刺激术(软骨下钻孔)效 果的方法的ChondroMimetic的性能。
动物:骨骼成熟的西班牙山羊(雌性)。
缺损:直径4mm、深6mm的骨软骨缺损(1个在滑车沟内;1 个在外侧髁上)。
植入时间:16周
实验组:ChondroMimetic工作
原型的6个植入物。
对照组:模拟传统的软骨下钻孔(即不含植入物)的6个缺损。
研究目的:评估ChondroMimetic作为骨髓刺激辅助物的性能。
发现:外科医生关于ChondroMimetic的处理性能的反馈无一例 外地是压倒性的
正面的。