生物材料
阅读：44发布：2020-05-11
专利汇可以提供生物材料专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于制备包含无机材料和有机材料的复合 生物 材料 的方法，所述方法包括：(a)提供第一浆组合物，其包含液体载体、无机材料和有机材料；(b)提供用于所述浆的模具；(c)使所述浆沉淀在所述模具中；(d)将沉淀在所述模具中的浆冷却至所述液体载体转化为多个固体晶体或颗粒的 温度 ；(e)通过 升华 和/或 蒸发 移除所述多个固体晶体或颗粒的至少一些，以留下含有无机材料和有机材料的多孔 复合材料 ；和(f)从所述模具中取出所述材料。，下面是生物材料专利的具体信息内容。
1.一种用于制备包含无机材料和有机材料的复合生物材料的方法，所 述方法包括：
(a)提供第一浆组合物，其包含液体载体、无机材料和有机材料；
(b)提供用于所述浆的模具；
(c)使所述浆沉积在所述模具中；
(d)将沉积在所述模具中的浆冷却至所述液体载体转化为多个固体 晶体或颗粒的温度；
(e)通过升华和/或蒸发除去至少一些所述多个固体晶体或颗粒，以 留下含有无机材料和有机材料的多孔复合材料；和
(f)从所述模具中取出所述材料。
2.根据权利要求1的方法，其中所述无机材料包括磷酸钙材料。
3.根据权利要求2的方法，其中所述磷酸钙材料包括透钙磷石。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述有机材料包含胶原蛋白 (包括重组人(rh)胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明质酸、 壳聚糖、和包含胶原蛋白的部分多肽序列的合成多肽中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述无机材料包括磷酸钙材 料，所述有机材料包括胶原蛋白和任选的糖胺聚糖，和其中所述多孔复 合材料包含所述磷酸钙材料和胶原蛋白以及任选的糖胺聚糖。
6.根据权利要求5的方法，其中所述第一浆包含胶原蛋白和所述磷酸 钙材料的共沉淀物。
7.根据权利要求5的方法，其中所述第一浆包含胶原蛋白、所述磷酸 钙材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。
8.根据权利要求5-7任一项的方法，其中所述磷酸钙材料包括透钙磷 石。
9.根据前述权利要求任一项的方法，还包括：
提供第二浆组合物，其包含液体载体和有机材料以及任选的无机材料； 和
在所述冷却步骤之前，在沉积所述第一浆组合物之前或之后将所述第二 浆组合物沉积在所述模具中。
10.根据权利要求9的方法，其中所述有机材料包含胶原蛋白(包括重 组人(rh)胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明质酸、壳聚糖、 和包含胶原蛋白的部分多肽序列的合成多肽中的一种或多种。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述第二浆组合物包含无机材料， 优选磷酸钙材料。
12.根据权利要求9-11任一项的方法，其中所述第二浆组合物包含液体 载体、胶原蛋白、任选的磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖。
13.根据权利要求12的方法，其中所述第二浆组合物包含胶原蛋白和糖 胺聚糖的共沉淀物，或胶原蛋白和磷酸钙材料的共沉淀物，或胶原蛋白、 糖胺聚糖和磷酸钙材料的三元共沉淀物。
14.根据权利要求12或13的方法，其中所述第二浆组合物包含为透钙 磷石的磷酸钙材料。
15.根据权利要求9-14任一项的方法，其中所述第一和第二浆组合物作 为第一和第二层沉积在所述模具中。
16.根据权利要求12-15任一项的方法，其中所述方法导致多层材料的 形成，其中至少一层包含含有胶原蛋白、磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖 的多孔复合材料。
17.根据权利要求16的方法，其中由所述第二浆组合物得到的层是多孔 的。
18.根据权利要求9-17任一项的方法，其中在将所述第一和第二浆组合 物沉积在所述模具中后，在冷却步骤之前，静置所述模具的内含物长达 24小时。
19.根据权利要求18的方法，其中静置所述模具的内含物的步骤在1～ 200kPa，优选50～150kPa，更优选50～101.3kPa的压力下进行。
20.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述液体载体包括水。
21.根据前述权利要求任一项的方法，其中在所述冷却步骤之前沉积在 所述模具中的浆的温度为2到40℃，优选4到37℃，更优选20到37 ℃。
22.根据前述权利要求任一项的方法，其中冷却沉积在所述模具中的浆 的步骤进行到≤0℃的温度。
23.根据权利要求22的方法，其中冷却沉积在所述模具中的浆的步骤进 行到-100到0℃、优选-80到-10℃、更优选-40到-20℃的温度。
24.根据前述权利要求任一项的方法，其中以0.02到10℃/分钟，优选 0.02到6.0℃/分钟，更优选0.2到2.7℃/分钟的冷却速率，进行冷却沉 积在所述模具中的浆的步骤。
25.根据前述权利要求任一项的方法，其中沉积在所述模具中的浆的厚 度为0.1到500mm，优选0.5到20mm，更优选1.0到10mm。
26.根据前述权利要求任一项的方法，其中在沉积到所述模具中之前， 所述浆的粘度为0.1到50Pa·s，优选0.1到10Pa·s，更优选0.5到5Pa·s。
27.根据前述权利要求任一项的方法，其中在0到0.08kPa，优选0.0025 到0.08kPa，更优选0.0025到0.04kPa的压力下，进行通过升华除去至少 一些所述固体晶体或颗粒的步骤。
28.根据前述权利要求任一项的方法，其中通过升华除去至少一些所述 固体晶体或颗粒的步骤进行长达120小时，优选12到72小时，更优选24 到36小时。
29.根据前述权利要求任一项的方法，其中在-10到60℃，优选0到40 ℃，更优选20到37℃下，进行通过升华除去至少一些所述固体晶体或颗 粒的步骤。
30.根据权利要求5-8和12-29中任一项的方法，还包括交联所述多孔 复合生物材料中的所述胶原蛋白和所述一种或多种糖胺聚糖的步骤。
31.根据权利要求2-8和11-30中任一项的方法，还包括将所述多孔复 合生物材料中的至少一些磷酸钙材料转化成不同的磷酸钙相的步骤。
32.根据权利要求31的方法，其中所述磷酸钙材料包括透钙磷石，并且 被转化成磷酸八钙和/或磷灰石。
33.一种合成的复合生物材料，其中至少部分所述生物材料由包含磷酸 钙材料，和胶原蛋白(包括重组人(rh)胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋 白、乙酰透明质酸、壳聚糖或包含胶原蛋白的部分多肽序列的合成多肽 中之一的多孔共沉淀物形成，其中大孔尺寸范围(孔径)优选为1到1000 微米，优选200到600微米。
34.根据权利要求33的合成的复合生物材料，其中至少部分所述生物材 料由包含磷酸钙材料和胶原蛋白的多孔共沉淀物形成。
35.一种合成的复合生物材料，其中至少部分所述生物材料由包含磷酸 钙材料，和胶原蛋白(包括重组人(rh)胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋 白、乙酰透明质酸、壳聚糖和包含胶原蛋白的部分多肽序列的合成多肽 中的两种或多种的多孔三元共沉淀物形成，其中所述大孔尺寸范围(孔 径)优选为1到1000微米，更优选200到600微米。
36.根据权利要求35的合成的复合生物材料，其中至少部分所述生物材 料由包含胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料的多孔三元共沉淀物形成。
37.一种合成的复合生物材料，包含：第一层，其由包含胶原蛋白和磷 酸钙材料以及任选的糖胺聚糖的多孔材料形成；和第二层，其连接到所 述第一层，并且由包含胶原蛋白，或胶原蛋白与糖胺聚糖的共沉淀物， 或胶原蛋白与磷酸钙材料的共沉淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙 材料的三元共沉淀物的材料形成。
38.根据权利要求37的生物材料，其中所述第一层由权利要求33或36 中任一项所定义的材料形成。
39.根据权利要求37或38的生物材料，其中所述第一和第二层是整体 形成的，优选通过液相共合成法形成。
40.根据权利要求33-39中任一项的生物材料，其中所述第一和第二层 通过相互扩散层彼此连接。
41.根据权利要求33-39中任一项的生物材料，其中所述第一和第二层 通过中间层彼此连接。
42.根据权利要求33-41中任一项的生物材料，其中所述第二层是多孔 的或无孔的。
43.根据权利要求33-42中任一项的生物材料，包含一个或多个连接到 所述第一和/或第二层的另外的层，每个所述另外的层由包含胶原蛋白， 或胶原蛋白与糖胺聚糖的共沉淀物，或胶原蛋白与磷酸钙材料的共沉淀 物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和至少一种磷酸钙材料的三元共沉淀物的材 料形成。
44.根据权利要求43的生物材料，其中所述第一和第二层以及所述一个 或多个另外的层是整体形成的。
45.根据权利要求43或44的生物材料，其中相邻的层通过相互扩散层 彼此连接。
46.根据权利要求43-45中任一项的生物材料，其中所述一个或多个另 外的层中的至少一个是多孔的或无孔的。
47.根据权利要求33-46中任一项的生物材料，其中所述材料包含胶原 蛋白和糖聚胺糖，和其中所述胶原蛋白和糖胺聚糖是交联的。
48.根据权利要求33-47中任一项的生物材料，其中所述材料包含胶原 蛋白，和其中所述胶原蛋白以1到99wt％，优选5到90wt％，更优选 15到60wt％的量存在于所述材料中。
49.根据权利要求33-48中任一项的生物材料，其中所述材料包含糖胺 聚糖，和其中所述糖胺聚糖以0.01到20wt％，优选1到5.5wt％的量 存在于所述材料中。
50.根据权利要求33-49中任一项的生物材料，其中所述材料包含胶原 蛋白，和其中如果所述磷酸钙包含透钙磷石，则胶原蛋白和透钙磷石的 重量比为10∶1到1∶100，优选重量比为5∶1到1∶20。
51.根据权利要求33-49中任一项的生物材料，其中所述材料包含胶原 蛋白，和其中如果所述磷酸钙材料包含磷酸八钙，则胶原蛋白和磷酸八 钙的重量比为10∶1-1∶100，优选重量比为5∶1-1∶20。
52.根据权利要求33-51中任一项的生物材料，其中所述材料包含胶原 蛋白和糖胺聚糖，并且其中胶原蛋白和糖胺聚糖的重量比为8∶1到30∶1。
53.一种合成的骨材料、骨植入物、骨移植物、骨替代物、骨支架、填 充物、涂料或粘固粉，其包含权利要求33-52中任一项所定义的生物材 料。
54.一种用于组织工程的整体或分层的骨支架，其包含权利要求33-52 中任一项所定义的生物材料。
55.一种可通过权利要求1-32中任一项定义的方法得到的多孔复合生 物材料。
技术领域
本发明涉及用于生物医学应用的合成骨材料领域，具体涉及用于组 织工程的包含胶原蛋白、磷酸钙和任选的糖胺聚糖的多孔整体式和多孔 分层式支架。
背景技术
天然骨是胶原蛋白、包括糖胺聚糖的非胶原蛋白有机相、和磷酸钙 的复合生物材料。其复合的分层结构产生了特殊的机械性质，包括高的 硬度、强度和断裂韧性，这些性质使骨可以承受日常经受的生理应力。 本领域的研究人员面临的挑战是制备组成和结构会使得天然骨在人体 或动物体内在合成材料内部或周围生长的合成材料。
已经发现，骨通过身体环境中形成的骨类磷灰石层直接结合人体内 的磷酸钙(称为生物活性的性质)。另一方面，已知胶原蛋白和包括胶 原蛋白和其它生物有机物例如糖胺聚糖的共聚物是多种细胞类型附着 和增殖的最佳基质，所述多种细胞类型包括人体内负责骨的生成和维持 的那些细胞。
羟磷灰石是最普遍用作骨替代材料中的成分的磷酸钙。但是，和例 如透钙磷石、磷酸三钙和磷酸八钙等其它形式的磷酸钙材料相比，羟磷 灰石是相对不可溶的材料。由于该材料在人体中的再吸收速率特别低， 所以当制备生物材料时，磷灰石相对低的溶解度是不利的。
例如羟磷灰石的磷酸钙是机械上的刚性材料。但是，和天然骨相比， 它们是相对脆性的。胶原蛋白是机械上的韧性材料，但是与天然骨相比 具有相对较低的刚性。包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共聚物的材料比单独 的胶原蛋白具有更高的韧性和刚性，但是，与天然骨相比，仍然具有较 低的刚性。
之前制备机械韧性高于羟磷灰石且硬度超过胶原蛋白及胶原蛋白 与糖胺聚糖共聚物的人工骨替代材料的尝试包括通过机械混合结合胶 原蛋白和磷灰石。这种机械方法记载于EP-A-0164 484中。
最新的进展包括，通过机械混合羟磷灰石、胶原蛋白和4-硫酸软骨 素来制备包含这些组分的骨替代材料。该技术描述在EP-A-0214070中。 该文献还描述了4-硫酸软骨素与胶原蛋白的脱水热交联。已经发现，包 含磷灰石、胶原蛋白和4-硫酸软骨素的材料具有良好的生物相容性。将 磷灰石与胶原蛋白和任选的4-硫酸软骨素机械混合，基本上形成胶原蛋 白/4-硫酸软骨素包覆的磷灰石颗粒。已经发现，尽管该材料是生物相 容性的，但是在人体或动物体内产生有限的天然骨内生长，而且不能重 建合成材料的磷酸钙相。
由外伤、畸形或疾病所损伤的骨部位的修复给骨科医生带来了特殊 的挑战，这是因为与皮肤、神经和大多数其它组织类型中的缺损不同， 骨骼的缺损包括多种截然不同的组织类型(即骨、软骨、腱和韧带)， 涉及承受通常机械负荷的部位，并跨越矿化组织至未矿化组织之间的界 面(例如韧带插入点，骨/软骨界面的“潮标”)。
现有的临床方法或使用非可再吸收的修复植入物、自体同源的或异 源的组织移植物、化学药剂、细胞移植或这些方法的组合来解决骨骼缺 损的修复。虽然这些方法在单一组织类型的治疗中取得了一些成功，但 是在涉及矿化和未矿化组织之间的界面例如关节连接处缺损的情况下， 例如会导致至多是不完全的愈合。此外，即使最成功的现有治疗也要求 或从供体部位获得组织和/或缝合骨、软骨、韧带或腱。前者方法遭受 供体部位缺乏和供体部位发病之苦，而后者则难于实施，并且产生为缝 合孔形式的另外的缺损。
术语复合支架(composite scaffold)和分层支架(layered scaffold) 是同义的，指的是包括两层或多层的支架，其中每层的材料组成基本上 与其相邻层的材料组成不同。术语单层支架(single-layered scaffold) 或整体式支架(monolithic scaffold)是同义的，指的是只包含一层的支 架，其中每层内的材料组成大体上是整体均匀的。
少数最新的尝试试图开发采用多孔的分层支架治疗或只涉及软骨 或同时涉及骨和软骨的关节连接处缺损的组织工程策略。这些构想试图 同时诱导骨和软骨的再生，但是对每个使用单独的支架(Niederauer et al.，2000；Schaefer et al.，2000；Gao et al.，2001；Gao et al.，2002； Schaefer et al.，2002；Sherwood et al.，2002；Hung et al.，2003；Hunziker and Driesang，2003)。
分层支架的附加特征是它们拥有通过将骨层直接固定到软骨下的 骨板上来实现无缝合固定的潜力。如果软骨部保持牢固地固定至骨部， 就不需要另外的固定。无缝合固定也可以使得涉及腱和韧带到骨的插入 点的缺损治疗成为可能。
尽管这种新方法有前景，但是有两个缺点可能限制迄今为止所报告 的分层支架的有效性。第一个缺点涉及用于该支架各层的材料。可再吸 收的合成聚合物是用于软骨层的唯一材料，其通常也是许多这些支架中 骨部的成分。尽管容易制造，但是已知合成聚合物对细胞附着和增殖的 促进不及如胶原等天然聚合物，并且当其降解时会释放出高浓度的酸。 此外，对于必需修复腱或韧带的应用，不管其交联的方式如何，可再吸 收的合成聚合物没有足够的强度和刚性来承受机能恢复训练期间施加 的甚至是减少的负荷。
常规的分层支架的第二个缺点涉及各层之间的界面。天然的关节连 接处和腱/韧带插入点的特征在于矿化和未矿化区之间胶原纤维蛋白的 连续性。得到的平滑过渡的系统(软界面)给这些部位提供内在的机械 稳定性，使得它们承受生理负荷而没有机械故障。与此相反，大多数现 有的分层支架含有硬界面，其在两种不同材料之间形成明显边界。缝合 (Schaefer et al.，2000)、用纤维蛋白粘合剂粘接(Gao et al.，2001)和 其它技术(Gao et al.，2002；Hung et al.，2003)已经用来强化该界面。 但是，在甚至是对照动物模型中仍然报道界面剥离。这些缝合和粘接方 法复杂，重现性差。
之前的工作已经开发出通过其可以控制冷冻干燥方案的参数以生 产胶原蛋白和一种或多种糖胺聚糖(GAGs)的多孔支架的方法(Yannas et al.，1989；O′Brien et al.，2004；O′Brien et al.，2005；Loree et al 1989)。 这些技术允许支架的特征例如孔径大小和长宽比以受控方式改变，已知 该参数对外伤或伤口部位的愈合反应具有显著的影响。但是，对于涉及 骨骼和肌骨骼缺陷的损伤的治疗，必需开发技术来生产材料组成和机械 特征与骨的材料组成和机械特征紧密配合的多孔支架，这与未矿化的胶 原蛋白-GAG支架相反。
已经发现，骨通过身体环境中形成的骨类磷灰石层直接结合人体内 的磷酸钙(称为生物活性的性质)。另一方面，已知胶原蛋白和包括胶 原蛋白和其它生物有机物例如糖胺聚糖的共聚物是多种细胞类型附着 和增殖的最佳基质，所述多种细胞类型包括人体内负责骨的生成和维持 的那些细胞。
羟磷灰石是最普遍用作骨替代材料中的成分的磷酸钙。但是，和例 如透钙磷石、磷酸三钙和磷酸八钙等其它形式的磷酸钙材料相比，羟磷 灰石是相对不可溶的材料。由于该材料在人体中的再吸收速率特别低， 所以当制备生物材料时，磷灰石相对低的溶解度是不利的。
例如羟磷灰石的磷酸钙是机械上的刚性材料。但是，和天然骨相比， 它们是相对脆性的。胶原蛋白是机械上的韧性材料，但是与天然骨相比 具有相对较低的刚性。包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共聚物的材料比单独 的胶原蛋白具有更高的韧性和刚性，但是，与天然骨相比，仍然具有较 低的刚性。
之前制备机械韧性高于羟磷灰石且硬度超过胶原蛋白及胶原蛋白 与糖胺聚糖共聚物的人工骨替代材料的尝试包括通过机械混合结合胶 原蛋白和磷灰石。这种机械方法记载于EP-A-0164 484中。
最新的进展包括，通过机械混合羟磷灰石、胶原蛋白和4-硫酸软骨 素来制备包含这些组分的骨替代材料。该技术描述在EP-A-0214070中。 该文献还描述了4-硫酸软骨素与胶原蛋白的脱水热交联。已经发现，包 含磷灰石、胶原蛋白和4-硫酸软骨素的材料具有良好的生物相容性。将 磷灰石与胶原蛋白和任选的4-硫酸软骨素机械混合，基本上形成胶原蛋 白/4-硫酸软骨素包覆的磷灰石颗粒。已经发现，尽管该材料是生物相 容性的，但是在人体或动物体内产生有限的天然骨内生长，而且不能重 建合成材料的磷酸钙相。
由外伤、畸形或疾病所损伤的骨部位的修复给骨科医生带来了特殊 的挑战，这是因为与皮肤、神经和大多数其它组织类型中的缺损不同， 骨骼的缺损包括多种截然不同的组织类型(即骨、软骨、腱和韧带)， 涉及承受通常机械负荷的部位，并跨越矿化组织至未矿化组织之间的界 面(例如韧带插入点，骨/软骨界面的“潮标”)。
现有的临床方法或使用非可再吸收的修复植入物、自体同源的或异 源的组织移植物、化学药剂、细胞移植或这些方法的组合来解决骨骼缺 损的修复。虽然这些方法在单一组织类型的治疗中取得了一些成功，但 是在涉及矿化和未矿化组织之间的界面例如关节连接处缺损的情况下， 例如会导致至多是不完全的愈合。此外，即使最成功的现有治疗也要求 或从供体部位获得组织和/或缝合骨、软骨、韧带或腱。前者方法遭受 供体部位缺乏和供体部位发病之苦，而后者则难于实施，并且产生为缝 合孔形式的另外的缺损。
术语复合支架(composite scaffold)和分层支架(layered scaffold) 是同义的，指的是包括两层或多层的支架，其中每层的材料组成基本上 与其相邻层的材料组成不同。术语单层支架(single-layered scaffold) 或整体式支架(monolithic scaffold)是同义的，指的是只包含一层的支 架，其中每层内的材料组成大体上是整体均匀的。
少数最新的尝试试图开发采用多孔的分层支架治疗或只涉及软骨 或同时涉及骨和软骨的关节连接处缺损的组织工程策略。这些构想试图 同时诱导骨和软骨的再生，但是对每个使用单独的支架(Niederauer et al.，2000；Schaefer et al.，2000；Gao et al.，2001；Gao et al.，2002； Schaefer et al.，2002；Sherwood et al.，2002；Hung et al.，2003；Hunziker and Driesang，2003)。
分层支架的附加特征是它们拥有通过将骨层直接固定到软骨下的 骨板上来实现无缝合固定的潜力。如果软骨部保持牢固地固定至骨部， 就不需要另外的固定。无缝合固定也可以使得涉及腱和韧带到骨的插入 点的缺损治疗成为可能。
尽管这种新方法有前景，但是有两个缺点可能限制迄今为止所报告 的分层支架的有效性。第一个缺点涉及用于该支架各层的材料。可再吸 收的合成聚合物是用于软骨层的唯一材料，其通常也是许多这些支架中 骨部的成分。尽管容易制造，但是已知合成聚合物对细胞附着和增殖的 促进不及如胶原等天然聚合物，并且当其降解时会释放出高浓度的酸。 此外，对于必需修复腱或韧带的应用，不管其交联的方式如何，可再吸 收的合成聚合物没有足够的强度和刚性来承受机能恢复训练期间施加 的甚至是减少的负荷。
常规的分层支架的第二个缺点涉及各层之间的界面。天然的关节连 接处和腱/韧带插入点的特征在于矿化和未矿化区之间胶原纤维蛋白的 连续性。得到的平滑过渡的系统(软界面)给这些部位提供内在的机械 稳定性，使得它们承受生理负荷而没有机械故障。与此相反，大多数现 有的分层支架含有硬界面，其在两种不同材料之间形成明显边界。缝合 (Schaefer et al.，2000)、用纤维蛋白粘合剂粘接(Gao et al.，2001)和 其它技术(Gao et al.，2002；Hung et al.，2003)已经用来强化该界面。 但是，在甚至是对照动物模型中仍然报道界面剥离。这些缝合和粘接方 法复杂，重现性差。
之前的工作已经开发出通过其可以控制冷冻干燥方案的参数以生 产胶原蛋白和一种或多种糖胺聚糖(GAGs)的多孔支架的方法(Yannas et al.，1989；O′Brien et al.，2004；O′Brien et al.，2005；Loree et al 1989)。 这些技术允许支架的特征例如孔径大小和长宽比以受控方式改变，已知 该参数对外伤或伤口部位的愈合反应具有显著的影响。但是，对于涉及 骨骼和肌骨骼缺陷的损伤的治疗，必需开发技术来生产材料组成和机械 特征与骨的材料组成和机械特征紧密配合的多孔支架，这与未矿化的胶 原蛋白-GAG支架相反。
发明内容
本发明旨在解决至少一些与现有技术相关的问题。
一种制备包含无机材料和有机材料的复合生物材料的方法，其包 括：
(a)提供第一浆组合物，其包含液体载体、无机材料和有机材料；
(b)提供用于所述浆的模具；
(c)使所述浆沉积在所述模具中；
(d)将沉积在所述模具中的浆冷却至所述液体载体转化为多个固体 晶体或颗粒的温度；
(e)优选通过升华和/或蒸发移除至少一些所述多个固体晶体或颗 粒，以留下含有无机材料和有机材料的多孔复合材料；和
(f)将所述材料从所述模具中移走。
此处所用的术语生物材料指的是可与人体或动物体生物相容的材 料。
此处所用的术语浆包括浆、溶液、悬浮液、胶体和分散体。
所述无机材料会通常包括磷酸钙材料。
所述有机材料会通常包括生物有机物，例如一种能溶解或悬浮在含 水介质中以形成浆的物质。例子包括白蛋白、糖胺聚糖、乙酰透明质酸、 壳聚糖、和包含胶原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的一种或多种。胶 原蛋白是优选的材料，任选地与糖胺聚糖一起使用。
此处使用的术语胶原蛋白包括重组人(rh)胶原蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述无机材料包括磷酸钙材料，所述有 机材料包括胶原蛋白和任选的糖胺聚糖。这产生包含所述磷酸钙材料和 胶原蛋白以及任选的糖胺聚糖的多孔复合材料。优选地，所述第一浆包 含胶原蛋白和磷酸钙材料的共沉淀物。更优选地，所述第一浆包含胶原 蛋白、磷酸钙材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。
作为选择，所述第一浆可以只包含胶原蛋白和磷酸钙材料及任选的 糖胺聚糖的机械混合物。可以通过例如EP-A-0164484和EP-A-0214070 中描述的常规技术来生产该浆。虽然可以使用机械混合物形成所述浆， 但是优选胶原蛋白和所述磷酸钙材料的共沉淀物或胶原蛋白、磷酸钙材 料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。
所述磷酸钙材料，可以选自，例如透钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰石 中的一种或多种。所述磷酸钙材料优选包含透钙磷石。
所述浆的pH优选为2.5到6.5，更优选为2.5到5.5，还更优选为 3.0到4.5，并且还更优选为3.8到4.2。
所述浆组合物可以包含一种或多种糖胺聚糖。所述浆组合可以包含 一种或多种磷酸钙材料。
不排除在前体浆中存在其它物质(例如银、硅、二氧化硅、食盐、 糖等)。
至少一些所述多个固体晶体或颗粒可以通过升华和/或蒸发除去，以 留下包含胶原蛋白、磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖的多孔复合材料。优 选的方法是升华。
步骤(d)和(e)可能受到冻干技术的影响。如果所述液体载体是水，所 述升华步骤包括降低模具周围环境的压力，将浆冷冻至水/冰/水蒸气系 统的三相点以下，然后在获得的真空压力下将温度升至比固体-蒸气转 化温度更高的温度。当周围的液体蒸气分压低于当前温度下冻结液体分 压时，所述产品中的冰通过升华直接转化为蒸气。该温度通常升至0℃ 或以上。进行该步骤以通过升华从所述冷冻浆中除去冰晶体。
冻干参数可以被调整，以控制所需的孔径大小和长宽比。一般地， 较慢的冷却速率和较高的最终冻结温度(例如以大约0.25℃每分钟冷却 至约-10℃的温度)有利于形成具有更大长宽比的大孔，而较快的冷却 速率和较低的最终冻结温度(例如以大约2.5℃每分钟冷却至约-40℃的 温度)有利于形成等轴的小孔。
此处所用的术语“模具”意欲包括任何能够成形、容纳或支持所述 浆组合物的模具、容器或基质。因此，最简单形式的模具可只包括支承 表面。所述模具可以是任何所需的形状，并且可以由包括聚合物(例如 聚砜、聚丙烯、聚乙烯)，金属(例如不锈钢、钛、钴铬)，陶瓷(例如 氧化铝、氧化锆)，玻璃陶瓷，和玻璃(例如硼硅酸盐玻璃)的任何适 合的材料制成。
本申请人2004年10月28日提交的较早的申请PCT/GB04/004550 描述了胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物和其制备方法。 PCT/GB04/004550的内容在此通过引用并入本文。在附录1中提供 PCT/GB04/004550的副本。
PCT/GB04/004550中描述的方法包括：提供包含胶原蛋白、钙源和 磷源以及糖胺聚糖的酸性水溶液；和将所述胶原蛋白、透钙磷石和糖胺 聚糖一起从所述水溶液中沉淀出来，以形成三元共沉淀物。
术语共沉淀物指的是两种或三种化合物的沉淀，其中所述化合物基 本上同时从相同的溶液/分散体中沉淀。其区别于由所述成分的机械混 合形成的材料，尤其是当这些成分单独地从例如不同的溶液中沉淀时。 所述共沉淀物的微结构明显不同于由其成分的机械混合形成的材料。
在制备所述共沉淀物的过程中，所述钙源优选选自硝酸钙、醋酸钙、 氯化钙、碳酸钙、钙醇盐、氢氧化钙、硅酸钙、硫酸钙、葡萄糖酸钙和 肝素钙盐中的一种或多种。肝素钙盐可以源于猪的肠粘膜。合适的钙盐 可商业得到，例如从Sigma-Aldrich公司得到。磷源优选选自磷酸二氢 铵、磷酸氢二铵、磷酸、二水合正磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O，有时 被称为GPR Sorensen盐)和磷酸三甲酯，磷酸的碱金属盐(例如钠或 钾)，磷酸的碱土金属盐(例如镁或钙)中的一种或多种。
糖胺聚糖是含有长的无支链聚糖的大分子族，所述聚糖含有重复的 二糖单元。优选地，所述糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素 (dermatin)、肝素、硫酸肝素、硫酸角蛋白和透明质酸中的一种或多 种。硫酸软骨素可以是4-硫酸软骨素或6-硫酸软骨素，两者都可商业得 到，例如从Sigma-Aldrich公司得到。所述6-硫酸软骨素可以源于鲨鱼 软骨。透明质酸可以源于人的脐带。肝素可以源于猪的肠粘膜。
所述胶原蛋白可以是可溶或不可溶的，并可以源于任何动物的任何 组织，并且可以用许多常规技术提取。
沉淀可以通过在酸性水溶液中结合所述胶原蛋白、钙源、磷源和糖 胺聚糖，然后使所述溶液静止直到出现沉淀，搅拌溶液，用碱滴定液例 如氨水滴定，加入成核剂例如预制的透钙磷石，改变钙源加入的速率， 或这些或本领域中公知的许多其它技术的任意组合来实现。
将会理解，其它的成分可以存在于所述浆中。例如，可以任选地将 生长因子、基因、药物或其它生物活性物质单独地或以组合加入到浆中。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法还有利地包括：提供 第二浆组合物，其包括液体载体和有机材料及任选的无机材料；和
在所述冷却步骤之前，在沉积所述第一浆组合物之前或之后将所述 第二浆组合物沉积在所述模具中。
如前所述，所述有机材料将通常包含胶原蛋白(包括重组人(rh) 胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明质酸、壳聚糖和包含胶原蛋 白的部分多肽序列的合成多肽的一种或多种。
所述第二浆组合物可以包含无机材料，例如磷酸钙材料。
优选地，所述第二浆组合物包含液体载体、胶原蛋白、任选的磷酸 钙材料和任选的糖胺聚糖。在这个实施方案中，所述第二浆组合物优选 包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，或胶原蛋白和磷酸钙材料的共沉 淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料的三元共沉淀物。已经关于 所述第一浆的制备讨论过共沉淀。
作为选择，所述第二浆可以只包含胶原蛋白和任选的一种或两种磷 酸钙材料和糖胺聚糖的机械混合物。已经关于所述第一浆的制备讨论过 机械混合物。
如果存在，所述第二浆中的磷酸钙材料可以选自透钙磷石、磷酸八 钙和/或磷灰石的一种或多种。
所述第一和第二浆组合物将通常作为第一和第二层沉积在模具中。 例如，将所述第一浆沉积在模具中，然后是第二浆。然后可以对所述模 具中内含物进行步骤(d)、(e)和(f)。相应地，该方法可以用于形成多层 材料，其中至少一层优选包含含有胶原蛋白、磷酸钙材料和任选的糖胺 聚糖的多孔复合材料。所述第二浆组合物得到的层可以是多孔的或无孔 的层。如果期望多孔层，则所述孔可以通过升华和/或蒸发在第二浆内 形成的多个固体晶体或颗粒来产生。已经关于第一浆讨论过这种技术， 并且优选包括冻干技术。
所述方法在液相中进行，这样有助于在第一浆层和第二浆层之间的 扩散。
可以以任何成层顺序或几何的方式沉积所述层。例如，所述层可以 垂直地(即一层位于另一层上面)、水平地(即一层在另一层旁边)和/ 或放射状地(一个球形层在下一个层的上面)定位。
根据本发明的浇铸方法能够制造用于组织工程的多孔单层和多孔 分层支架。
在所述第一和第二浆组合物沉积在模具中后，所述模具的内含物优 选在冷却步骤之前静置多至24小时。这样是有利的，因为其允许在相 邻的层之间不同浆组分的相互扩散。这会导致层间结合强度的增加。
所述第一浆中的液体载体优选包含水。所述第二浆中的液体载体也 优选包含水。
将会理解，可以在所述冷却步骤之前，在沉积所述第一和/或第二浆 组合物之前或之后，在模具中沉积其它的浆层。
冷却步骤之前沉积在模具中的浆的温度一般会影响浆的粘度。如果 温度过高，则会导致浆的粘度过低，这可导致一旦沉积第二浆，则所述 第一和第二层的完全相互混合(因而是不期望的)。也应该注意，太高 的温度可能导致胶原蛋白变性。另一方面，过低的温度可能导致浆粘度 过高，而不能有效地展开、平滑或成形，并且可能有过早形成冰结晶体 的风险。相应地，本发明人发现在冷却步骤之前沉积在模具中的第一浆 的温度优选从2至40℃，更优选从4至37℃，还更优选从20至37℃。 如果使用多层的浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。
沉积在模具中的第一浆的冷却步骤优选进行到≤0℃的温度。更优 选地，冷却步骤进行到-100至0℃的温度，优选从-80至-10℃，更优选 从-40至-20℃。如果使用多层浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。
沉积在模具中的第一浆的冷却步骤优选以0.02-10℃/分钟的冷却速 率进行，更优选0.02-6.0℃/分钟，还更优选0.2-2.7℃/分钟。如果使用多 层浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。
一般地，较慢的冷却速率和较高的最终冻结温度(例如以大约0.25 ℃每分钟的速率冷却至-10℃的温度)有利于形成具有较大的长宽比的 大孔，而较快的冷却速率和较低的最终冻结温度(例如以大约2.5℃每 分钟的速率冷却至-40℃的温度)有利于形成等轴的小孔。
沉积在模具中的浆的冷却步骤优选在1～200kPa，更优选50～ 150kPa，仍更优选50～101.3kPa的压力下进行。如果使用多层浆组合 物，则这些范围也适用于另外的浆。本发明人发现，低于50kPa的压力 可能导致在浆中形成气泡，而高于200kPa的压力可能引起相邻层的过 度混合。
沉积在模具中的第一浆的厚度优选0.1～500mm，更优选0.5～20 mm，还更优选1.0～10mm。如果使用多层浆组合物，则这些范围也适 用于另外的浆。厚度超过500mm的层可能难以完全固化，而厚度小于 0.1mm的层可几乎瞬间冻结，使之难以准确控制冰结晶体成核和生长 的进程。
所述第一浆在被沉积到模具中之前的粘度优选为0.1～50Pa·s，更 优选0.1～10Pa·s，还更优选0.5～5Pa·s。如果使用多层浆组合物，则 这些范围也适用于另外的浆。具有过高粘度的浆可能难以展开、平滑和 成形，而具有过低粘度的浆可能导致一旦沉积第二浆则所述第一层和第 二层就完全相互混合(因而是不期望的)。
通过升华除去第一浆中至少一些固体晶体或颗粒的步骤优选在0～ 0.08kPa，更优选0.0025～0.08kPa，还更优选0.0025～0.04kPa的压力下 进行。如果使用多层浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。比水的 三相点压力(约0.08kPa)高的压力可能有发生融化而不是升华的风险， 而过低的压力则难以实现，并且不一定促进升华。
关于通过升华除去第一浆中至少一些固体晶体或颗粒的步骤，如果升 华的持续时间过短，残留的水和溶剂可引起所述支架壁的再溶解，进而危 及所述孔结构。相应地，本发明人发现，该步骤优选进行多至96小时，更 优选12～72小时，还更优选24～36小时。如果使用多层浆组合物，则这 些范围也适用于另外的浆。
通过升华除去第一浆中至少一些固体晶体或颗粒的步骤优选在-10至 60℃，更优选0～40℃，还更优选20～37℃，还更优选25～37℃的温度 下进行。如果使用多层浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。如果 在升华期间的温度过低，完成升华所需的时间可能变得过长，而过高的 温度(即高于40℃)可具有胶原蛋白变性的风险。
如果所述材料包含胶原蛋白和糖胺聚糖，则根据本发明的方法还可 以包括使多孔复合生物材料中的胶原蛋白和糖胺聚糖交联的步骤。通常 在升华后从模具中移走所述材料后进行交联。交联可以通过以下方式实 现：对共沉淀物进行γ射线辐照，紫外线辐照，脱水热处理，用例如葡 萄糖、甘露糖、核糖和蔗糖的简单的糖进行非酶糖化的一种或多种、使 该三元共沉淀物与戊二醛、碳二亚胺(例如乙基二甲氨基丙基碳二亚胺) 和/或去甲二氢愈创木酸中的一种或多种接触，或上述方法的任意组合。 在本领域中这些都是常规方法。
如果所述材料包含磷酸钙，则根据本发明的方法还可以包括将所述 多孔复合生物材料中的至少一些磷酸钙材料转化成另一种磷酸钙相的 步骤。例如，该方法可以包括将所述多孔复合生物材料中的至少一些透 钙磷石转化成磷酸八钙和/或磷灰石。所述透钙磷石到磷酸八钙和/或磷 灰石的转化优选通过水解实现。相转换将通常在从模具中移走所述材料 (和任选的交联)之后进行。
磷灰石是包含钙和磷酸盐的矿物类，并具有通式Ca5(PO4)3(X)， 其中X可以是离子，其通常为OH-、F-和Cl-，以及本领域的技术人员 熟知的其它离子。术语磷灰石也包括取代的磷灰石，例如硅取代的磷灰 石。所述术语磷灰石包括羟磷灰石，它是磷灰石的一个具体实例。所述 羟磷灰石也可以被其它物质例如硅取代。
如上所述，在所述冷却步骤之前，在沉积所述第一和/或第二浆组合 物之前或之后，可以在模具中沉积其它的浆层。所述其它的浆层通常也 会包含例如液体载体、胶原蛋白、任选的磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖。 模具中的内含物优选在冷却步骤之前静置多至24小时，以便允许相邻 的层之间的各种浆组分的相互扩散。
相应地，本发明提供了用于制备包含一个、二个或更多层的复合生 物材料的方法。所述层中的至少一个优选包括胶原蛋白、磷酸钙材料和 优选的糖胺聚糖的多孔生物复合物。优选所有的层包含胶原蛋白。
根据本发明的复合生物材料可用于制造，例如多孔的单层支架，或 其中至少一层是多孔的多层支架。根据本发明的复合生物材料被有利地 用于肌骨骼和牙科应用的组织再生支架。
根据本发明的方法优选包括将胶原蛋白作为有机成分引入所述第 一和第二层中(优选胶原蛋白是第一和第二层中的主要有机成分)。如 果存在另外的层，则所述方法优选包括将胶原蛋白作为有机成分引入这 些其它层的一层或多层中(也优选胶原蛋白是所述一个或多个其它层的 主要有机成分)。所述方法包括在液体相中同时制造所有的层和从而制 造它们之间的界面。这样导致层与层间通过相互扩散产生强的界面。术 语相互扩散指的是当两种组成不同的浆整体接触放置时，由于分子扩散 或布朗运动而发生的混合。
在第二方面中，本发明提供了合成的复合生物材料，其中至少部分 生物材料由包含磷酸钙材料和胶原蛋白(包括重组人(rh)胶原蛋白)、 糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明质酸、壳聚糖或包含胶原蛋白的部分多肽 序列的合成多肽的一种或多种的多孔共沉淀物形成，其中大孔尺寸范围 (孔径)优选为1～1000微米，更优选200～600微米。所述材料优选 包含胶原蛋白。所述磷酸钙材料优选选自透钙磷石、磷酸八钙和/或磷 灰石的一种或多种。所述多孔材料优选包含胶原蛋白和磷酸钙材料的共 沉淀物。这已经关于本发明的第一方面描述过。
此处所用的术语多孔指的是所述材料可以包含大孔和/或微孔。大孔 隙率通常指的是与尺度大于约10微米的孔相关的特征。
微孔隙率通常指的是与尺度小于约10微米的孔相关的特征。将会 理解所述材料内可能有开放小室和闭合小室的任意组合。例如，所述材 料一般会含有大孔和微孔。所述大孔隙率一般是开放小室的，尽管可能 有闭合的小室部分。
根据本发明第二方面的多孔材料中大孔的尺寸范围(孔径)通常是 从1至1200微米，优选从10至1000微米，更优选从100至800微米， 还更优选从200至600微米。
根据本发明第二方面的多孔材料中的平均长宽比优选从1至50，更 优选从1至10，最优选约1。
根据本发明第二方面的多孔材料中的孔径分布(平均孔径的标准偏 差)优选从1至800微米，更优选从10到400微米，还更优选从20到 200微米。
根据本发明第二方面的多孔材料中的孔隙率优选从50至99.9体积 ％，更优选从70至98体积％。
根据本发明第二方面的多孔材料中的开放小室的孔隙率的百分比 (作为总的开放和闭合小室的孔的总数的百分比来测量)优选从1至 100％，更优选从20至100％，还更优选从90至100％。
在第三方面中，本发明提供了合成的复合生物材料，其中至少部分 生物材料由包含磷酸钙材料和两种或多种胶原蛋白(包括重组人(rh) 胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明质酸、壳聚糖和包含胶原蛋 白的部分多肽序列的合成多肽的多孔材料形成。所述材料优选包含胶原 蛋白和糖胺聚糖。所述磷酸钙材料优选选自透钙磷石、磷酸八钙和/或 磷灰石的一种或多种。所述多孔材料优选包含胶原蛋白、糖胺聚糖和磷 酸钙材料的三元共沉淀物。这已经关于本发明的第一方面描述过。根据 本发明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范围(孔径)也适用于所述第 三方面。其平均长宽比范围、孔径大小分布、孔隙率和开放小室孔隙率 百分比同样如此。
第四方面中，本发明提供了一种合成的复合生物材料，其包括：第 一层，其由根据本发明第二或第三方面的复合生物材料形成；和连接至 所述第一层的第二层，其由包含胶原蛋白，或胶原蛋白与糖胺聚糖的共 沉淀物，或胶原蛋白与磷酸钙材料的共沉淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖 和磷酸钙材料的三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸钙材料优选选自透 钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰石的一种或多种。
所述第一和第二层优选整体地形成。有利地，这可以通过涉及液相 共合成的方法实现。这包括任何方法，其中通过在从所述浆除去液体载 体之前，将各层的包含前体的浆以整体彼此接触的方式放置，来形成包 含多层的材料的密实或多孔相邻层，和其中优选基本上同时从所有层中 除去所述液体载体。在除去液体载体之前(即，仍然在液体相中)，将 所述前体浆以整体接触方式放置允许相邻的浆之间发生相互扩散。这在 所得材料的相邻层之间的界面处形成相互扩散区域，其中的材料组成为 所述相邻层的材料组成的中间值。相互扩散区域的存在可赋予相邻层之 间的界面机械强度和稳定性。相应地，所述第一和第二层优选通过相互 扩散层彼此连接。
作为选择，所述第一和第二层可以通过中间层相互连接。术语中间 层指的是单独地沉积于两个其它层之间，用于提高层间结合强度或阻止 所得支架的相邻层之间的细胞、分子或流体通过，并且可以例如包含胶 原蛋白、糖胺聚糖、纤维蛋白、抗血管生成药物(例如苏拉明(suramin))、 生长因子、基因或任何其它成分的任何层。中间层通过以下事实区别于 相互扩散层：中间层作为组成不同于其相邻层的组成的浆而单独地沉 积，而相互扩散层只是由于相邻层之间的相互扩散而形成的。
所述第一层是多孔的。优选第二层也是多孔的，尽管如果需要，可 以是无孔的或基本上无孔的层。
根据本发明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范围(孔径)也适用 于根据本发明第四方面的实施方案中的第一和/或第二层。其平均长宽 比范围、孔径分布、孔隙率和开放小室孔隙率百分比同样如此。
在任意的所述第二、三和四方面中，所述生物材料可以包含连接至 所述第一和/或第二层的一个或多个其它的层，其中所述其它层中的每 一层优选由包含胶原蛋白，或胶原蛋白与糖胺聚糖的共沉淀物，或胶原 蛋白与磷酸钙材料的共沉淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料的 三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸钙材料优选选自透钙磷石、磷酸八 钙和/或磷灰石中的一种或多种。所述第一和第二层及所述一个或多个 其它的层优选整体的方式形成，并且相邻的层优选通过通常由液相共合 成形成的相互扩散层彼此连接。一般地，所述其它层中的至少一个将会 是多孔的。此外，根据本发明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范围(孔 径)也适用于这些其它层的一个或多个。其平均长宽比范围、孔径分布、 孔隙率和开放小室孔隙率百分比同样如此。
相邻层之间的孔径大小差可以在几乎可忽略到大至+/-1000微米之 间变化。
除非另有说明，下列描述适用于本发明的任意方面。
如果材料包含胶原蛋白和糖胺聚糖，则可以交联所述胶原蛋白和糖 胺聚糖。
所述胶原蛋白优选以从1至99wt％，优选从5至90wt％，更优选 从15至60wt％的量存在于所述材料中。
所述糖胺聚糖优选以从0.01至20wt％，更优选从1至12wt％，还 更优选从1至5.5wt％的量存在于所述材料中。
如果所述材料包含透钙磷石，则胶原蛋白和透钙磷石的重量比优选 从10∶1至1∶100，更优选从5∶1至1∶20。
如果所述材料包含磷酸八钙，则胶原蛋白和磷酸八钙的重量比优选 为10∶1至1∶100，更优选从5∶1至1∶20。
胶原蛋白和糖胺聚糖的重量比优选为从8∶1至30∶1。
根据本发明的生物材料可以用作替代骨或牙科材料。相应地，本 发明提供了包含此处描述的生物材料的合成骨材料、骨植入物、骨移植 物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固粉。
所述生物材料有利地以多层支架的形式提供。具体地，本发明提 供了用于肌骨骼和牙科应用的组织再生支架。根据本发明的多层(即两 层或多层)支架可以在例如骨/软骨界面(例如关节连接)、骨/腱界面(例 如腱插入点)、骨/韧带界面(例如韧带插入点)、和牙齿/韧带界面(例 如牙齿/牙周韧带结合点)中找到应用。
尽管本发明主要涉及用于组织工程应用的支架，但是根据本发明 的材料可以用于制造在体内保持很长时间的植入物。例如，腱和韧带应 用可能必需的半永久性植入物。
本发明还提供可通过此处描述的方法获得的多孔复合生物材料。 合成方法
现在将通过实施例来进一步说明本发明。优选的合成方法包括一 系列步骤，其可以整体或部分地应用以生产具有一个层或多个层的多孔 支架，其中至少一个层优选包含胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料的三 元共沉淀物。
步骤0：制备浆
可以利用本发明人2004年10月28日提交的较早的专利申请 PCT/GB04/004550中概述的方法来实现矿化的胶原蛋白/GAG/透钙磷 石浆的制备。PCT/GB04/004550的内容在此通过引用并入本文。 PCT/GB04/004550的副本提供在附录1中。
可以利用Yannas et al.，1989；O′Brien et al.，2004；O′Brien et al.， (2005)；Loree et al.，(1989)中概述的方法来实现未矿化的胶原蛋白/GAG 浆的制备。
在该阶段通过机械混合，可以任选地将生长因子、基因、药物或 其它生物活性物质单独地或以组合加入所述浆中，以促使它们并入所述 支架中。在支架具有多于一层的情况下，并入一层中的生物活性物质不 需要与并入下一层中的生物活性物质相同。
步骤I：浇铸
步骤I-a：浇铸第1层
步骤I-b：浇铸第2层
步骤I-c：浇铸第3层
步骤I-n：浇铸第n层
所述浇铸步骤包括将溶液、悬浮液、胶体或分散体形式(其中水 构成主要稀释剂)的浆连续沉积到模具中，其中至少一种浆包含胶原蛋 白、一种或多种糖胺聚糖和磷酸钙透钙磷石的三元共沉淀物，并且所有 的浆包含胶原蛋白。
所述模具可以是任何期望的形状，可以由包括聚合物(例如聚砜、 聚丙烯、聚乙烯)，金属(例如不锈钢、钛、钴、铬)，或陶瓷(例如氧 化铝、氧化锆)，玻璃陶瓷，或玻璃(例如硼硅酸盐玻璃)的任意的许 多材料制成。
可以专门地构造所述模具用于促进层化。适合的设计的例子示于 图1和2。
例如，所述层可以垂直地(即一层位于另一层上面)、水平地(即 一层在另一层旁边)、和/或放射状(一个球形层在下一个的上面)地定 位。
在所述支架包括一层的情况下，待浇铸的单层包含含有胶原蛋白、 磷酸钙材料(优选透钙磷石)和任选的糖胺聚糖的共沉淀物的浆。优选 地，所述浆包含含有胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物。 该层的优选厚度列于表1的适当部分中。
在所述支架包括两层的情况下，待浇铸的所述层中的至少一层包 含含有胶原蛋白、磷酸钙材料(优选透钙磷石)和任选的糖胺聚糖的共 沉淀物的浆。优选地，所述浆包含含有胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖 的三元共沉淀物。该层的优选厚度列于表1的适当部分中。另一层包括 含有胶原蛋白、任选的磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖的浆。该浆组合物 优选包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，或胶原蛋白与磷酸钙材料 (比如透钙磷石)的共沉淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料(优 选透钙磷石)的三元共沉淀物。
可以根据需要包括其它层，并且这些其它层优选由包含胶原蛋白、 任选的磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖的浆形成。所述其它的浆组合物优 选包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，胶原蛋白和磷酸钙材料(例如 透钙磷石)的共沉淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料(优选透 钙磷石)的三元共沉淀物。
每个后续层中的浆的组成可以是相同的，稍微变化的，或显著变 化的，条件是胶原蛋白和优选的糖胺聚糖存在于每一层中，并且所述层 中的至少一层也包含磷酸钙材料，例如透钙磷石。
步骤II：相互扩散
所述共扩散步骤包括允许浇铸的、分层的浆的各层相互扩散。进 行这一步步骤，以使得在相邻层之间的浆组分相互扩散，从而增加固化 和升华后层间的结合强度。所述相互扩散步骤的优选条件列于表2中的 适当部分。
步骤III：控制冷却
所述控制冷却步骤包括将含有浆的模具置于环境中，然后以控制 速率冷却至低于0℃的最终温度。进行该步骤，以引发和控制浆内冰结 晶体成核和生长的速率。然后，通过升华除去冰结晶体，留下多孔的支 架。所述冰结晶体网络的结构将决定支架的最终孔结构。冷却的优选参 数列于表3中。
步骤IV：退火
所述退火步骤包括使得浆在控制冷却步骤的最终温度下保持给定 的时间。进行该步骤以确保浆完全或基本完全冻结。退火的优选参数列 于表4。
步骤V：升华
所述升华步骤包括当冻结的浆大致维持在控制冷却和退火步骤的 最终温度时，将模具和冻结浆周围环境中的压力降低至低于水/冰/水蒸 气系统的三相点，然后将温度升至高于在获得的真空压力下的固体-蒸 气转化温度的温度(通常≥0℃)。进行该步骤，以通过升华将冰结晶体 从冻结的浆中除去。作为除去水的方法，升华相对于蒸发的优点在于其 留下了精确模拟之前存在的冰结晶体网络结构的空的空间(即孔)网络。 如果允许冰融化，则冰结晶体网络会丧失其形状，并且损害所得到的孔 网络结构。所述升华步骤的优选参数示于表5。
步骤VI：交联
如果需要，所述方法也可以包括交联步骤以交联胶原蛋白和糖胺 聚糖。这记载于本发明人2004年10月28日提交的较早的专利申请 PCT/GB04/004550中。PCT/GB04/004550的内容在此通过引用并入本 文。PCT/GB04/004550的副本提供在附件1中。
实施例
实施例1：胶原蛋白/GAG/CaP的单层支架
材料
胶原蛋白：I型，从牛腱获得的微原纤维胶原蛋白，Integra Life Sciences Plainsboro，NJ，USA；GAG：源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素， 钠盐，Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；钙源：(i)氢氧化钙 (Ca(OH)2)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；(ii)硝酸钙 (Ca(NO3)2·4H2O)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；磷源：正 磷酸(H3PO4)，BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)；交 联剂：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(＝EDAC)， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；N-羟基琥珀酰亚胺(＝NHS) Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)。
程序
步骤0：制备浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟，将3.8644g胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1383摩尔/ 升的H3PO4中，以产生高粘性的胶原蛋白分散体。平行地，在室温下使 得0.3436g6-硫酸软骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩尔/升H3PO4 中，通过周期性振摇分散溶解的GAG，以便生产GAG溶液。90分钟 后，在15,000rpm的连续均质下，以大约0.5mL/分钟的速率将14.3mL 所述GAG溶液加入到混合的胶原蛋白分散体中，然后另外混合得到的 高粘性胶原蛋白/GAG分散体90分钟。混合90分钟之后，在30分钟时 间和15000rpm的恒定混合下，将1.804g Ca(OH)2和0.780g Ca(NO3)2·4H2O加入所述高粘性胶原蛋白/GAG分散体中，生成pH约 4.0的胶原蛋白/GAG/CaP浆。使得所述胶原蛋白/GAG/CaP浆在搅拌板 上在25℃下保持48小时混合，然后在4℃下放置12小时。然后冷却的 浆在25Pa的压力下在真空烧瓶中脱气25小时。
步骤1：浇铸
使用自动吸移管管理器将15mL未矿化的胶原蛋白/GAG/CaP浆 浇铸到长50mm、宽30mm和深10mm的聚砜模具中。使用手动吸移 管管理器从所述浆中除去所有的大气泡。
步骤II：相互扩散
由于实施例I的支架只包括一层，所以相互扩散的步骤是不必要 的。
步骤III：控制冷却
将所述模具和浆放入VirTis Genesis冷冻干燥器(配有温控的不 锈钢架)中，并且所述冷冻干燥器的架温以约2.4℃每分钟的速率从4 ℃降低至-20℃。
步骤IV：退火
所述冷冻干燥器的架温保持在-20℃下10小时。
步骤V：升华
当仍处于-20℃的架温时，将低于25Pa的真空(约200毫托)施 加到容纳所述模具和(目前冻结的)浆的室中。然后将所述室的温度升 至37℃，并且允许升华持续36小时。然后除去所述真空，温度恢复至 室温，留下胶原蛋白/GAG/CaP的单层支架，尺寸为50mm×30mm× 10mm。
步骤V+I：交联
支架在40mL去离子水中水合20分钟。将20mL的0.035摩尔/ 升EDAC和0.014摩尔/升NHS的溶液加入到容纳所述支架和去离子 水的容器中，允许所述支架在室温和轻度搅拌下交联2小时。除去所述 EDAC溶液，用磷酸缓冲溶液(PBS)漂洗支架，然后使得在37℃和中 度搅拌下在新鲜的PBS中培养2小时。在PBS中两个小时后，通过使 得在37℃和中度搅拌下在去离子水中培养两个10分钟间隔来漂洗所述 支架。然后通过以大约2.4℃每分钟的速率从室温控制冷却至-20℃冷冻 干燥所述支架，来除去任何残余的水，随后在-20℃退火约5小时，然 后在37℃下低于25Pa升华，生成交联的胶原蛋白/GAG/CaP支架，尺 寸大致为50mm×30mm×10mm。
所得单层支架的X射线显微断层图像、扫描电镜图像、离子分布 图和压缩机械行为示于图3-10。图3显示了通过X射线显微断层照相 术看到的通过上述步骤生产的支架的9.5mm×9.5mm圆柱部分的外形。 值得注意的是整个支架中材料组成和孔隙率基本均匀的性质。相同支架 的连续横截面示于图4，再次说明了所述支架孔结构的均匀性；高度的 孔互联性、等轴孔形态和大的(平均直径500微米)大孔尺寸在图4中 也很明显。在图5中，SEM显微照片再次显示了大孔的形态，同时也 显示了有限的微孔的存在，其可在某些大孔的壁内看见。所述支架壁区 域的高(4000×)放大率二次(即外形敏感的)和反向散射的(即组成 敏感的)电子图像(图6)表明所述支架壁的组成均匀性，尽管存在处 于尺寸约为1-2微米的突出瘤状体的形式有限的拓扑变化。图7中的钙 和磷图证实了整个支架中组成基本均匀的结论，其中两种元素均匀地分 布在整个支架中。图8显示了干燥状态下的单层支架，并图解说明它们 能够用普通的外科工具例如手术刀、剃刀和圆锯刀片(在角膜移植中使 用的环形切割工具)切成任何期望的形状，而不会破碎、裂开或失去完 整性；图8也图解说明了干的单层支架在镇静钢珠负载重力下的承载力。 在图9中显示了在干燥状态下的单层支架的行为。这种行为显示了典型 的多孔质固体变形的三个阶段，其具有弹性模量762+/-188kPa和压缩 屈服应力85.2+/-11.7kPa。重要的是注意到所述干支架的屈服强度使得 它们承受有力的拇指压力(例如在插入缺陷部位时)，其在施加强有力 的拇指压力(例如外科医生改变植入物的形状)时仍不会形成永久性的 变形。在图10中显示了在水合状态下的单层支架的压缩变形。和干燥 状态下一样，水合的矿化胶原蛋白/GAG支架在压缩负荷下显示出三个 阶段的机械行为，但是其弹性模量(4.12+/-0.76kPa)和屈服应力 (0.29+/-0.11kPa)比相应的干支架性能低大约一个数量级。此外，在 塌陷平台区观察到了的压缩应力释放之后粘弹性形变恢复的证据。
实施例II：双层矿化-未矿化支架
材料
胶原蛋白(用于矿化的浆)：从牛腱获得的I型微原纤维胶原蛋白， Integra Life Sciences Plainsboro，NJ，USA；
GAG(用于矿化的浆)：从鲨鱼软骨获得的6-硫酸软骨素，钠盐， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)。
II型胶原蛋白
+GAG(用于未矿化的浆)：从猪的软骨中溶解的II型胶原蛋白和 GAG(胶原蛋白/GAG)浆，Gelstlich Biomaterials(Wolhusen， Switzerland)。
钙源：(i)氢氧化钙(Ca(OH)2)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；(ii)硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；磷源：正磷酸(H3PO4)，BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)；交联剂：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(＝EDAC)， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；N-羟基琥珀酰亚胺(＝NHS) Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)
步骤0：制备浆
制备矿化的浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟，将3.8644g的胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1383摩 尔/升的H3PO4中，以产生高粘性胶原蛋白分散体。平行地，在室温下 将0.3436g6-硫酸软骨素(GAG)溶解在14.3mL的0.1383摩尔/升的 H3PO4中，通过周期性振摇分散溶解的GAG，以产生GAG溶液。90 分钟后，在15000rpm的持续均质下，以大约0.5mL/分钟的速率将14.3 mL的GAG溶液加入到混合的胶原蛋白分散体中，然后另外混合得到 的高粘性胶原蛋白/GAG分散体90分钟。混合90分钟之后，在30分钟 时间和15000rpm的恒定混合下，将1.804g Ca(OH)2和0.780g Ca(NO3)2·4H2O加入高粘性胶原蛋白/GAG分散体中，生成pH约为4.0 的胶原蛋白/GAG/CaP浆。冷却的浆在25Pa压力下在真空瓶中脱气25 小时，使用均质器再混合30分钟，然后再次脱气48小时。
制备未矿化的浆
从冰箱中取出II型胶原蛋白/GAG浆并允许恢复到室温。
步骤I：浇铸
将2.5mL未矿化的II型胶原蛋白/GAG浆放入组合聚砜模具的底 部，所述底部长50mm，宽30mm，深2mm。用剃刀将所述浆平整为 平坦的表面。将也由聚砜制成的长50mm宽30mm深6mm的上部环 固定到容纳所述平整的未矿化浆的模具底部。将9mL矿化的胶原蛋白 /GAG/CaP浆以均匀分布的方式置于所述平整的未矿化层上和之前空的 的上部环内。利用手动吸移管管理器从所述浆中除去所有大的气泡。
步骤II：相互扩散
在放入冷冻干燥器之前，使得所述分层的浆保持在室温和室压下 共4个小时。
步骤III：控制冷却
将所述模具和分层的浆放入VirTis Genesis冷冻干燥器(配有温 控的不锈钢架)中，并且所述冷冻干燥器的架温以约-2.4℃每分钟的速 率从4℃降低至-40℃。
步骤IV：退火
所述冷冻干燥器的架温保持在-40℃下10小时。
步骤V：升华
仍处于-40℃的架温时，将低于25Pa的真空(约200毫托)施加 到容纳所述模具和(目前冻结的)分层浆的室中。然后所述室的温度升 至37℃，并且允许升华持续36小时。然后除去所述真空，温度恢复至 室温，留下胶原蛋白/GAG/CaP的双层支架，尺寸为50mm×30mm× 8mm，由2mm厚的未矿化层和6mm厚的矿化层构成。
步骤VI：交联
支架在32mL去离子水中水合20分钟。将18mL的0.035摩尔/ 升EDAC和0.014摩尔/升NHS溶液加入到容纳所述支架和去离子水 的容器中，并且使得所述支架在室温和轻度搅拌下交联2小时。除去所 述EDAC溶液，然后用磷酸缓冲溶液(PBS)漂洗支架，然后允许在 37℃和中度搅拌下在新鲜的PBS中培养2小时。在PBS中两个小时后， 通过允许在37℃和中度搅拌下在去离子水中培养两个10分钟间隔来漂 洗所述支架。然后通过以大约-2.4℃每分钟的速率从室温控制冷却至-20 ℃来冷冻干燥所述支架，以除去任何残余的水，然后在-20℃退火5小 时，最终在低于25Pa和37℃下升华24小时，生成交联的分层的胶原 蛋白/GAG/CaP支架，尺寸约为50mm×30mm×8mm，由2mm厚的 未矿化层和6mm厚的矿化层组成。
所得双层支架的X射线显微断层图像、扫描电镜图像、和离子分 布图示于图11-17。图11显示了通过上述步骤生产的双层支架的9.5mm ×9.5mm圆柱部分的X射线显微断层图象。其不透明的下部区域显示 了矿化层，而更透明的上部区域代表未矿化层。可以看出，在孔隙率和 组成方面，两层都大致均匀。图12中的连续横截面显示所述矿化层中 的平均大孔尺寸为约400微米，而未矿化层中的那些在700微米的级别 上；矿化和未矿化层中的孔都显示出等轴形态。图13中的SEM图像显 示了未矿化层的俯视图，其说明几乎没有微孔隙率存在的证据，而图14 中显示的界面区的图像证实没有将所述矿化和未矿化层分开的任何大 空隙或其它间断。在图15中显示了双层支架在压缩负荷下的行为。在 施加压缩负荷后，柔性的未矿化层开始压缩，在不足以在矿化支架内引 起任何显著变形的应力下导致软骨区室的几乎完全的压缩。当负荷释放 后，所述未矿化的胶原蛋白/GAG层几乎立刻恢复至原来的形状(图 15d)。图16图解说明了双层支架在水合状态下的机械行为。一旦水合， 所述未矿化的胶原蛋白/GAG层在低幅负荷下可以被压缩(图16a-c)。 与干燥状态不同，所述水合的未矿化区室在第一次施加压缩负荷之后 (图16d)没有完全恢复其原始厚度，而是在所述矿化区室的横截面上 下垂。但是在初始压缩后，未矿化层在随后每次施加压缩负荷之后恢复 到其压缩厚度(图16d)。在图17中，通过模拟说明了双层支架的未矿 化层附着到包含关节连接处的骨和软骨界面的外科缺损的壁上的能力。 图17中的载波片与骨软骨缺损的壁相似，所述未矿化层附着到这个表 面的能力表明这些支架填充这些缺损到它们外围而不会在支架的未矿 化层和相邻的关节软骨之间留下空隙的能力。
实施例III：三层矿化-未矿化的矿化支架
材料
胶原蛋白(用于矿化的浆)：源于牛腱的I型微原纤维胶原蛋白， Integra Life Sciences(Plainsboro，NJ，USA)
GAG(用于矿化的浆)：源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素，钠盐， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)。
钙源：(i)氢氧化钙(Ca(OH)2)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；(ii)硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；磷源：正磷酸(H3PO4)，BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
胶原蛋白(用于未矿化的胶原蛋白-GAG浆)：从猪的真皮中溶解 的85％I型，15％III型胃蛋白酶Japan Meat Packers(Osaka，Japan)
GAG(用于未矿化的浆)：源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素，钠盐， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)。
用于未矿化胶原蛋白和GAG的稀释剂：冰醋酸(CH3COOH)， Fischer Scientific(Loughborough，UK)；交联剂：去甲二氢愈创木酸 (NDGA)，Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；磷酸二氢钠 (NaH2PO4)，BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)；氯 化钠(NaCl)，Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)
步骤0：制备浆
制备矿化的浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟，将3.8644g的胶原蛋白分散在于冰浴中冷却的171.4mL的0.1383 摩尔/升的H3PO4中，以制备高粘性的胶原蛋白分散体。平行地，在室 温下将0.3436g6-硫酸软骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩尔/升 H3PO4中，通过周期性振摇分散溶解的GAG，以产生GAG溶液。90 分钟后，将14.3mL所述GAG溶液在15,000rpm的持续均质下以大约 0.5mL/分钟的速率加入混合的胶原蛋白分散体中，然后另外混合得到的 高粘性胶原蛋白/GAG分散体90分钟。混合90分钟之后，在30分钟时 间和15000rpm的恒定混合下，将1.804g Ca(OH)2和0.780g Ca(NO3)2·4H2O加入所述高粘性胶原蛋白/GAG分散体中，生成pH约 4.0的胶原蛋白/GAG/CaP浆。然后冷却的浆在25Pa的压力下在真空烧 瓶中脱气25小时，使用均质器再次混合30分钟，然后再次脱气48小 时。
制备未矿化的浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟，将1.9322g I/III型胶原蛋白分散在于冰浴中冷却的171.4mL的0.05 摩尔/升的醋酸中，以制备高粘性胶原蛋白分散体。平行地，在室温下 将0.1718g6-硫酸软骨素(GAG)溶解到28.6mL的0.05摩尔/升醋酸中， 通过周期性振摇分散溶解的GAG，以生成GAG溶液。90分钟后，在 15,000rpm的持续均质下以大约0.5mL/分钟的速率，将所述14.3mL GAG溶液加入混合的胶原蛋白分散体中，并另外混合得到的高粘性胶 原蛋白/GAG分散体90分钟。
步骤I：浇铸
将3.5mL矿化的胶原蛋白/GAG/CaP浆置于组合聚砜模具的底 部，所述底部长50mm，宽30mm，深3mm。所述浆用剃刀平整为平 面。一个也由聚砜制成的长50mm宽30mm深5mm的中间环连接到 容纳所述平整的矿化浆的模具底部。将7.5 mL未矿化的胶原蛋白/GAG 浆以均匀分布的方式置于所述平整的未矿化层上并在之前空的中间环 内。将一个也由聚砜制成的长50mm宽30mm深3mm的上部环连接 到所述平整的未矿化浆之上的模具的中间部分。将3.5mL矿化的胶原 蛋白/GAG/CaP浆以均匀分布的方式置于所述平整的未矿化层上并在之 前空的上部环内。利用手动吸移管管理器从所述浆中除去所有大的气 泡。
步骤II：相互扩散
在放入冷冻干燥器之前，允许所述三层浆保持在室温和室压下20 分钟。
步骤III：控制冷却
将所述模具和三层浆置于VirTis AdVantage冷冻干燥器(配有温 控的不锈钢架)中，并且所述冷冻干燥器的架温以约-2.4℃每分钟的速 率从4℃降低至-40℃。
步骤IV：退火
保持所述冷冻干燥器的架温在-40℃下10小时。
步骤V：升华
当仍处于-40℃的架温时，将低于25Pa的真空(约200毫托)施 加到容纳所述模具和(目前冻结的)三层浆的室中。然后所述室的温度 升至37℃，并且允许升华持续36小时。然后除去所述真空，温度恢复 至室温，留下尺寸为50mm×30mm×11mm的三层支架，由5mm厚的 未矿化中间层和环绕它的两个3mm厚的矿化层组成。
步骤VI：交联
将三层支架在0.1摩尔/升NaH2PO4和0.15摩尔/升NaCl的磷酸 盐缓冲液(PBS；pH7.0)中水合30分钟。将NDGA悬浮在1N NaOH 中，并加入到PBS中生成3mg/mL的NGDA在PBS中的溶液；然后在 搅拌下在该溶液中水合支架24小时。从NGDA-PBS溶液移走所述三层 支架，并用去离子水冲洗。然后通过以大约2.4℃每分钟的速率从室温 控制冷却至-20℃冷冻干燥所述支架，以除去任何残余的水，然后在-20 ℃退火5小时，并最终在37℃下在低于25Pa下升华24小时，得到干 燥交联的支架。然后在浓度为0.1mg/mL的NDGA中进行随后的处理。 然后在70％乙醇中清洗支架6小时，随后在室温在PBS中清洗24小时。 然后通过以大约2.4℃每分钟的速率从室温控制冷却至-20℃来冷冻干燥 所述支架第二时间，以除去任何残余的水，然后在-20℃退火5小时， 并最终在37℃下在低于25Pa下升华24小时。
下列表中的参数可以单独地或以组合应用到本发明的任意方面， 除非另有说明。
表1：浇铸的优选参数
表2：相互扩散的优选参数
表3：控制冷却的优选参数
表4：退火的优选参数
表5：升华的优选参数
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本发明在很多领域找到了应用，以举例的方式提供下列应用。
关节软骨修复产品：双层支架
双层支架具有提高现有的将源自骨髓的干细胞补充至关节软骨创 伤部位的首要外科手术疗效的潜力。例如，作为干燥的2cm×2cm×1cm 的干燥、真空包装、γ灭菌的类似于聚苯乙烯泡沫的块状物递送，这些 支架可以利用手术刀或其它工具切割，简单地用拇指或钝器压力轻易地 插入缺损处，并且直接结合到所述部位，而不用缝合或胶粘。
髌韧带供体部位的修复产品：三层支架
三层支架具有在前十字韧带(ACL)重建期间增强髌韧带(髌骨 腱)再生的潜力，减轻前膝痛并降低髌韧带断裂和膝盖骨折的风险。
腱修复产品：双层支架
具有扩大的未矿化成分的双层支架具有提高肌腱套(rotator-cuff) 手术期间腱修复疗效和解决现在尚无有效解决方案的小腱应用的潜力。
还在大型家畜的基础上研究了本发明，总结如下。
试验1：绵羊骨缺损模型
本发明使之可以生产分层的组织再生支架，其一侧的结构和组成 模拟骨，另一侧上为未矿化组织(例如软骨、韧带、腱)，在其间具有 平滑稳定的界面。此外，本发明还提供了系统地改变这种植入物的骨区 室矿物相的化学组成的能力。
动物：骨骼成熟的Texcel陆地绵羊(雌性)。
缺损：外侧股骨髁上的直径9mm、深9mm的松质骨缺损
植入时间：6周
实验组：每个实验组的6个植入物被以相同的植入类型对侧地植 入同一动物的每一侧。
对照组：
正对照：用从胫骨粗隆收获的多孔自体移植物填充四个部位。
负对照：用包含完全不含矿物相(即只含有ChondroMimetic骨 质侧的有机成分)的植入物的对照植入物填充四个部位。
研究目的：鉴别化学组成不同的四个实验植入组的性能差别，并 将这些植入组中最期望的组确定为ChondroMimetic骨区室的最终组 成。
重大发现：三个实验组都没有引发任何种类的不良免疫响应；所 有三个实验组和未矿化的负对照组通过细胞介导的直接取代机理支持 骨的内生长；三个实验组之间没有观察到显著的统计上的差别；并且在 全部三个实验组中观察到的骨形成比负对照组中的骨形成高出显著的 统计水平。
植入物设计的应用：该项研究所涉及的直接取代机理表明：与在 传统的骨移植替代物中观察到的典型的外加机理相比，所述骨形成的机 理更接近于在胎儿和新生动物(包括人)的生长面上出现的模板骨形成。 在未矿化的对照组中存在的这种取代机理表明：所述植入物的有机组分 赋予了这种特性。
所述植入物的孔径大小应该通过降低植入物的骨区室的平均孔径 来改变，以解释这种取代机理。
所述三个实验组的骨形成行为没有显著的统计差异表明：处理参 数可以用来识别最适合的植入物的矿物组成。
试验2：公山羊的骨软骨缺损模型
该项研究的目的在于评估作为增强骨髓刺激术(软骨下钻孔)效 果的方法的ChondroMimetic的性能。
动物：骨骼成熟的西班牙山羊(雌性)。
缺损：直径4mm、深6mm的骨软骨缺损(1个在滑车沟内；1 个在外侧髁上)。
植入时间：16周
实验组：ChondroMimetic工作原型的6个植入物。
对照组：模拟传统的软骨下钻孔(即不含植入物)的6个缺损。
研究目的：评估ChondroMimetic作为骨髓刺激辅助物的性能。
发现：外科医生关于ChondroMimetic的处理性能的反馈无一例 外地是压倒性的正面的。
附录1
2004年10月28日提交的PCT/GB04/004550的说明书文本
本发明涉及用于生物医学应用的人工骨、牙科材料和再生支架领 域，尤其涉及包含胶原蛋白、磷酸钙材料和一种或多种糖胺聚糖的人工 骨、牙科材料和再生支架及其前体。
天然骨是胶原蛋白、包括糖胺聚糖的非胶原蛋白有机相和磷酸钙 的生物复合材料。其复杂的分层结构产生了出色的机械性能，包括高的 刚性、强度和破裂韧性，从而使骨能够承受日常经受的生理应力。本领 域的研究人员面临的挑战是：制造组成和结构允许天然骨可以在人体或 动物体中在合成材料里面和周围生长的合成材料。
已经发现，骨通过人体环境中形成的骨状磷灰石层直接连接到人 体内的磷酸钙(称为生物活性的性能)。另一方面，已知胶原蛋白和包含 胶原蛋白和例如糖胺聚糖的其它生物有机物质的共聚物是多种细胞类 型附着和增殖的最佳基质，所述细胞类型包括在人体中负责骨的生成和 维持的那些细胞。
羟磷灰石是最通常用作骨替代材料的成分的磷酸钙。但是，与例 如透钙磷石、磷酸三钙和磷酸八钙等其它形式的磷酸钙材料相比，羟磷 灰石是相对不可溶的材料。由于该材料在人体中的再吸收速率特别低， 所以当制备生物材料时，磷灰石相对低的溶解度是不利的。
例如羟磷灰石的磷酸钙是机械上的刚性材料。但是，和天然骨相 比，它们是相对脆性的。胶原蛋白是机械上的韧性材料，但是与天然骨 相比具有相对较低的刚性。包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共聚物的材料比 单独的胶原蛋白具有更高的韧性和刚性，但是，与天然骨相比，仍然具 有较低的刚性。
之前制备机械韧性高于羟磷灰石且硬度超过胶原蛋白及胶原蛋白 与糖胺聚糖共聚物的人工骨替代材料的尝试包括通过机械混合结合胶 原蛋白和磷灰石。这种机械方法记载于EP-A-0164 484中。
该技术最新的进展包括，通过机械混合羟磷灰石、胶原蛋白和4- 硫酸软骨素来制备包含这些组分的骨替代材料。该技术描述在 EP-A-0214070中。该文献还描述了4-硫酸软骨素与胶原蛋白的脱水热 交联。已经发现，包含磷灰石、胶原蛋白和4-硫酸软骨素的材料具有良 好的生物相容性。将磷灰石与胶原蛋白和任选的4-硫酸软骨素机械混 合，基本上形成胶原蛋白/4-硫酸软骨素包覆的磷灰石颗粒。已经发现， 尽管该材料是生物相容性的，但是在人体或动物体内产生有限的天然骨 内生长，而且不能重建合成材料的磷酸钙相。
本发明旨在解决至少一些与现有技术相关的问题。
第一方面，本发明提供一种制备包含胶原蛋白、透钙磷石和一种 或多种糖胺聚糖的复合材料的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含胶原蛋白、钙源和磷源以及一种或多种糖胺聚糖的酸性 水溶液；和
从该水溶液中一起沉淀胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚 糖以形成三元共沉淀物。
术语三元共沉淀物包含三种化合物的沉淀，其中，基本上同时从 相同的溶液/分散体中沉淀所述化合物。这应与机械混合这些组分形成 的材料不同，特别是与例如在不同溶液中单独沉淀出的这些组分不同。 共沉淀物的微结构明显不同于机械混合其组分形成的材料。
在第一方面中，所述溶液优选具有2.5～6.5的pH，更优选2.5～ 5.5。更优选地，所述溶液具有3.0～4.5的pH。进而更优选地，所述溶 液具有3.8～4.2的pH。最优选地，所述溶液具有约为4的pH。
所述钙源优选选自硝酸钙、醋酸钙、氯化钙、碳酸钙、钙醇盐、 氢氧化钙、硅酸钙、硫酸钙、葡萄糖酸钙和肝素的钙盐中的一种或多种。
肝素的钙盐可以得自猪的肠粘膜。合适的钙盐可自Sigma-Aldrich Inc.商业得到。
所述磷源优选选自磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸、二水合正磷 酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O，有时称为GPR Sorensen盐)和磷酸三甲酯、 磷酸的碱金属(例如Na或K)盐、磷酸的碱土金属(例如Mg或Ca)盐中 的一种或多种。
糖胺聚糖是含有长的无支链多糖的大分子族，所述多糖含有重复 的二糖单元。优选地，所述一种或多种糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸 皮肤素、肝素、硫酸肝素、硫酸角质素和透明质酸。硫酸软骨素可以是 4-硫酸软骨素或6-硫酸软骨素，它们都可以从Sigma-Aldrich Inc.商业 得到。6-硫酸软骨素可以得自鲨鱼软骨。透明质酸可以源于人的脐带， 肝素可以源于猪的肠粘膜。
优选地，在三元共沉淀物的沉淀中，所述溶液具有4.0～50℃的温 度。更优选地，所述溶液具有15～40℃的温度。所述溶液可以在室温， 即20～30℃，优选20～27℃的温度。最优选地，该温度为约25℃。
所述水溶液中钙离子的浓度通常为0.00025～1摩尔/升，优选 0.001～1摩尔/升。当所述方法还包括另外的过滤和/或低温干燥的步骤 时，所述水溶液中的钙离子浓度更优选为0.05～0.5摩尔/升(例如0.08～ 0.25摩尔/升)，最优选0.1～0.5摩尔/升。当所述方法还包括另外的冷冻 干燥和任选的注塑成型的步骤时，所述水溶液中的钙离子浓度更优选为 0.01～0.3摩尔/升，最优选0.05～0.18摩尔/升。
优选地，所述溶液包含磷酸根离子，溶液中磷酸根离子的浓度通 常为0.00025～1摩尔/升，优选0.001～1摩尔/升。当所述方法还包括另 外的过滤和/或低温干燥的步骤时，溶液中磷酸根离子的浓度更优选为 0.05～0.5摩尔/升，进而更优选0.1～0.5摩尔/升，例如0.1～0.35摩尔/ 升。当所述方法还包括另外的冷冻干燥和任选的注塑成型的步骤时，溶 液中磷酸根离子的浓度更优选为0.01～0.3摩尔/升，进而更优选0.05～ 0.18摩尔/升。
优选地，在沉淀之前，溶液中胶原蛋白与一种或多种糖胺聚糖的 总量的重量比为8∶1～30∶1。更优选地，胶原蛋白与一种或多种糖胺聚 糖总量的重量比为10∶1～12∶1，最优选该比例为11∶1～23∶2。
优选地，三元共沉淀物中胶原蛋白与透钙磷石的重量比为10∶1～ 1∶100，更优选5∶1～1∶20，进而更优选3∶2～1∶10，最优选3∶2～1∶4。
在沉淀之前，所述溶液中胶原蛋白的浓度通常为1～20g/L，更优 选1～10g/L。当所述方法还包括过滤和/或低温干燥的步骤时，所述溶 液中胶原蛋白的浓度更优选为1～10g/L，进而更优选1.5～2.5g/L，最 优选1.5～2.0g/L。当所述方法包括冷冻干燥和任选的注塑成型时，在 沉淀之前，所述溶液中胶原蛋白的浓度优选为5～20g/L，更优选5～12 g/L，最优选9～10.5g/L。
在沉淀之前，所述溶液中一种或多种糖胺聚糖的总浓度通常为 0.01～1.5g/L，更优选0.01～1g/L。当所述方法还包括另外的过滤和/ 或低温干燥的步骤时，所述溶液中一种或多种糖胺聚糖的总浓度更优选 为0.03～1.25g/L，进而更优选0.125～0.25g/L，最优选0.13～0.182g/L。
当所述方法还包括另外的冷冻干燥和任选的注塑成型的步骤时， 所述溶液中一种或多种糖胺聚糖的总浓度更优选为0.15～1.5g/L，进而 更优选0.41～1.2g/L，最优选0.78～0.96g/L。
优选所述溶液包含钙离子，胶原蛋白与钙离子的重量比通常为 1∶40～500∶1。当所述方法还包括另外的过滤和/或低温干燥的步骤时， 胶原蛋白与钙离子的比更优选为1∶40～250∶1，进而更优选1∶13～5∶4， 最优选1∶13～1∶2。当所述方法还包括另外的冷冻干燥和任选的注塑成 型的步骤时，胶原蛋白与钙离子的比更优选为1∶8～500∶1，进而更优选 5∶12～30∶1，最优选5∶5～5∶1。
沉淀可以通过以下方法实现：在酸性水溶液中混合胶原蛋白、钙 源、磷源和一种或多种糖胺聚糖；或使溶液静止直到沉淀发生，搅拌溶 液，使用例如氨的碱性滴定剂滴定，加入例如预制透钙磷石的成核剂； 改变钙源的加入速率；和这些方法的任意组合。
在第二方面，本发明提供一种制备包含胶原蛋白、磷酸八钙和一 种或多种糖胺聚糖的复合生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的复合材料， 和
通过水解将复合材料中的至少一部分透钙磷石转化为磷酸八钙。
术语生物材料包含与人体或动物体可生物相容的材料。
在第二方面中，所述复合材料优选包含或基本上由以下物质组成： 含有胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述 三元共沉淀物可以利用这里所述的与本发明第一方面有关的方法形成。
优选地，透钙磷石水解为磷酸八钙的步骤包括：使所述三元共沉 淀物与水溶液接触，所述水溶液的pH等于或大于磷酸八钙比透钙磷石 在热力学上更稳定的pH。优选地，该水溶液具有6～8的pH。更优选 地，该水溶液具有6.3～7的pH。最优选地，该水溶液具有约6.65的 pH。所述水溶液可以包括，例如用滴定剂、缓冲液、用另一种含钙化 合物和/或含磷化合物所饱和的溶液控制pH的去离子水。优选的水溶液 包含使用氨滴定到所需pH的醋酸。
优选地，透钙磷石水解为磷酸八钙的步骤在20～50℃的温度下进 行，更优选30～40℃，进而更优选36～38℃，最优选约37℃。
优选地，透钙磷石水解为磷酸八钙的步骤进行12～144小时，更 优选18～72小时，最优选24～48小时。
在第三方面，本发明提供一种制备包含胶原蛋白、磷灰石和一种 或多种糖胺聚糖的复合生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的复合材料， 和
通过水解将复合材料中的至少一些透钙磷石转化为磷灰石。
磷灰石是一类包含钙和磷酸根的矿物质，它具有通式： Ca5(PO4)3(X)，其中X可以是离子，通常为OH-、F-和C1-以及本领域 技术人员熟知的其它离子。磷灰石也包括取代的磷灰石，例如硅取代的 磷灰石。磷灰石包括羟磷灰石，羟磷灰石是磷灰石的具体例子。羟磷灰 石也可以用硅取代。
在第三方面中，复合材料优选包含或基本由以下物质组成：包含 胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元 共沉淀物可以按照这里所述的与本发明第一方面有关的方法形成。
优选地，透钙磷石水解为磷灰石的步骤包括：使所述三元共沉淀 物与水溶液接触，所述水溶液的pH等于或大于磷灰石比透钙磷石热力 学上更稳定的pH。优选地，为了将透钙磷石转化为磷灰石，该水溶液 具有6.65～9，更优选7～8.5，进而更优选7.2～8.5的pH。所述水溶液 可以包括，例如用滴定剂、缓冲液、用另一种含钙化合物和/或含磷化 合物饱和的溶液控制pH的去离子水。
优选地，透钙磷石水解为磷灰石的步骤在20～50℃的温度下进 行，更优选30～40℃，进而更优选36～38℃，最优选约37℃。
优选地，透钙磷石水解为磷灰石的步骤进行12～288小时，更优 选18～72小时，最优选24～48小时的时间。
提高透钙磷石向磷酸八钙和/或磷灰石转化速率的方法包括提高(i) 温度、(ii)溶液中透钙磷石的浓度、和或(iii)搅拌速度。
需制备同时包含磷灰石和磷酸八钙的根据本发明的生物材料。可 以结合本发明第二和第三方面的方法，以制备同时包含磷酸八钙和磷灰 石的材料。三元共沉淀物中的透钙磷石可以先转化为磷酸八钙，然后磷 酸八钙可以部分地转化为磷灰石。通常在8.0或8.0以上的pH下水解 约12小时，透钙磷石或磷酸八钙全部或接近全部(即至少98％)转化为 磷灰石。因此，可以通过水解小于12小时的时间来实现材料中透钙磷 石和/或磷灰石的部分转化。
优选地，磷酸八钙水解为磷灰石的步骤在6.65～10，更优选7.2～ 10，进而更优选8～9的pH下进行。
优选地，磷酸八钙水解为磷灰石的步骤在20～50℃的温度下进 行，更优选30～40℃，进而更优选36～38℃，最优选约37℃。
优选地，磷酸八钙水解为磷灰石的步骤进行2～144小时的时间， 更优选12～96小时，最优选24～72小时。
在本发明的第二和第三方面中，透钙磷石向磷酸八钙和/或磷灰石 的转化优选在30～40℃的温度下进行。更优选地，该转化在36～38℃ 的温度下进行。最优选地，该转化在约37℃的温度下进行。
优选地，本发明的方法还包括交联三元共沉淀物中的一种或多种 糖胺聚糖和胶原蛋白的步骤。关于三元共沉淀物，它包括包含胶原蛋白、 透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的三元共沉淀物和该共沉淀物的衍生 物。该衍生物包括其中至少一部分透钙磷石已转化为磷酸八钙和/或磷 灰石的共沉淀物，和已经成形或模制、或进行了任何另外的化学或机械 处理的共沉淀物。可以使用任何常规技术实现交联。
优选地，至少一些透钙磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石，在透钙 磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石之前使糖胺聚糖与胶原蛋白交联。该 交联可以通过下列方法实现：对三元共沉淀物进行γ射线辐照，紫外线 辐照，脱水热处理，用例如葡萄糖、甘露糖、核糖和蔗糖的简单糖进行 非酶糖化的一种或多种，使该三元共沉淀物与戊二醛、乙基二甲氨基丙 基碳二亚胺和/或去甲二氢愈创木酸中的一种或多种接触，或这些方法 的任意组合。在本领域中这些都是常规方法。
优选地，如果至少一些透钙磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石，则 在透钙磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石之后使糖胺聚糖和胶原蛋白交 联。透钙磷石转化为磷灰石和/或磷酸八钙之后的交联可以通过上述的 一种或多种方法，或通过脱水热处理，或这些方法的任意组合来实现。 脱水热处理包括使基材在升高的温度下经历低压环境。脱水热处理的温 度可以为95℃～135℃。如果需要使脱水热处理通常在18～36小时完 成，则该温度可优选为100℃～110℃，最优选105℃～110℃。如果需 要使脱水热处理通常在4～8小时完成，则该温度可优选为120℃～135 ℃，最优选125℃～135℃。
优选地，在透钙磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石之前和之后都使 胶原蛋白和糖胺聚糖交联。
本发明的方法可以包括以下步骤：使复合生物材料成形为适合用 作骨或牙科替代物的结构。可以在形成三元共沉淀物之后，但是在可能 发生透钙磷石的任何转化或胶原蛋白与糖胺聚糖交联发生之前进行该 步骤。
可替代地，可以在透钙磷石转化为磷灰石和/或磷酸八钙或胶原蛋 白与糖胺聚糖的交联之后，进行生物材料的成形步骤。
优选地，使用选自以下的技术使复合材料成形：(i)过滤和/或低温 干燥，(ii)冷冻干燥，(iii)注塑成型和(iv)冷压。温度为15℃～40℃，最 优选35℃～40℃的过滤和/或低温干燥通常产生致密颗粒形式的材料。 冷冻干燥通常产生开放的多孔形式。根据所用模头(dye)的形状，注 塑成型可以产生多种形状/形态的材料。冷压通常产生致密的丸状形式。
本发明还提供适合转化为合成生物材料的前体材料，所述前体材 料包含复合材料，所述复合材料包含胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种 糖胺聚糖。优选地，所述复合材料包含或基本上由以下物质组成：包含 胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元 共沉淀物可以通过根据本发明第一方面的方法制备。
本发明还提供包含胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的 复合生物材料，该生物材料可以通过这里描述的本发明的方法得到。
本发明还提供包含胶原蛋白、磷酸八钙和一种或多种糖胺聚糖的 复合生物材料，该生物材料可以通过根据本发明第二方面的方法得到。
本发明还提供包含胶原蛋白、磷灰石和一种或多种糖胺聚糖的复 合生物材料，该生物材料可以通过根据本发明第三方面的方法得到。
本发明还提供包含胶原蛋白、糖胺聚糖和透钙磷石的三元共沉淀 物的复合生物材料。
本发明还提供包含一种和多种磷酸钙材料的颗粒、胶原蛋白和一 种或多种糖胺聚糖的生物材料，其中所述胶原蛋白和所述一种或多种糖 胺聚糖交联并形成基质，所述磷酸钙材料的颗粒分散在所述基质中，所 述磷酸钙材料选自透钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰石中的一种或多种。
如果没有其它说明，下面的描述与根据本发明的复合生物材料的 所有方面都相关。
优选使胶原蛋白和一种或多种糖胺聚糖交联。
胶原蛋白优选以5(干)重量％～90(干)重量％的量存在于所述材料 中，更优选15(干)重量％～60(干)重量％，更优选20(干)重量％～40(干) 重量％。
优选地，一种或多种糖胺聚糖以0.01(干)重量％～12(干)重量％的 量存在于所述材料中，更优选1(干)重量％～5.5(干)重量％，最优选 1.8(干)重量％～2.3(干)重量％。
优选地，如果所述材料包含透钙磷石，则胶原蛋白与透钙磷石的 重量(干)比为10∶1～1∶100，更优选重量(干)比为5∶1～1∶20，最优选重量 (干)比为3∶2～1∶10，例如重量(干)比为3∶2～1∶4。
优选地，如果所述材料包含磷酸八钙，则胶原蛋白与磷酸八钙的 重量(干)比为10∶1～1∶100，更优选重量(干)比为5∶1～1∶20，最优选重量 (干)比为3∶2～1∶10。
优选地，胶原蛋白与一种或多种糖胺聚糖的总量的重量(干)比为 8∶1～30∶1，更优选重量(干)比为10∶1～30∶1，进而更优选重量(干)比为 10∶1～12∶1，最优选重量(干)比为11∶1～23∶2。
本发明的复合生物材料可以用作骨或牙科的替代材料。
本发明还提供了包含本发明的复合生物材料的人工骨材料、骨植 入物、骨移植物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固剂。术语涂 料包括任何包含本发明的生物材料或前体的涂料。涂料可以施用于修复 件、骨或任何欲用在人体或动物体中的基材的外表面或内表面上，该涂 料中包含颗粒材料。本发明的组合物可以用于矿化生物材料的体内和体 外修复，包括但不局限于骨和牙科材料。本发明的生物材料可以用于同 种异体移植物和自身移植物的生长。
根据本发明的包含磷酸八钙的生物材料可以不含或基本不合任意 前体透钙磷石相。在该生物材料的磷酸钙材料的总量中，该生物材料可 以包含小于2重量％的透钙磷石。
磷酸钙材料可以包含或基本上由相纯的磷酸八钙或磷灰石组成。 相纯是指优选含有至少98％，更优选至少99％和最优选至少99.5％的 所需相(用X射线衍射测定)。可代替地，根据生物材料的所需性能，该 生物材料可以包含磷酸八钙和磷灰石的混合物。
本发明的包含透钙磷石的材料可以用作制备生物材料的前体材 料，或本身适合用作生物材料。
本发明的方法可以使用遵从下列顺序的方法来进行，其可以整体 地或部分地应用来制备胶原蛋白、一种或多种糖胺聚糖和一种或多种磷 酸钙组分的生物复合物。下列说明是以举例的方式提供，可适用于本发 明方法的任何方面。
I：在酸性pH下的胶原蛋白、GAG和磷酸钙透钙磷石的三元共沉 淀
进行该步骤，以通过溶液沉淀同时形成复合物的三种(或三种以上) 组分，和控制三种(或三种以上)各个相的比例。通过改变pH、温度、老 化时间、钙离子浓度、磷离子浓度、胶原蛋白浓度和GAG浓度中的一 个或多种来实现对复合物的组成性能(尤其是胶原蛋白：GAG∶CaP的比) 的控制。pH可以保持恒定(例如使用缓冲液、恒pH滴定或其它方法) 或使其变化。可能的次级(污染物)相包括其它酸性磷酸钙(例如三斜磷钙 石、磷酸氢钙)和包括滴定的副产物和加入反应物的混合物(例如磷酸铵、 硝酸铵)。在该步骤中也可以加入辅助交联(例如葡萄糖、核糖)或增加体 内响应(例如生长因子、基因转录因子、硅、促尿钠排泄肽)的添加剂。
II：净形状的形成
进行该步骤以制备最终复合物形式的所需结构，特别强调对孔结 构的控制。该技术的例子包括过滤和低温干燥(产生致密颗粒形式)、冷 冻干燥(产生开放的多孔形式)、注塑成型(根据模头类型产生多种形状) 和冷压(产生致密的丸状形式)。
III：第一交联
可以进行该步骤以优选确保：当放在pH升高的溶液中时，复合物 的GAG含量不会迅速流失，而且提高复合物的机械和降解性能。该技 术的例子包括低温物理技术(例如γ射线辐照、紫外线辐照、脱水热处 理)、化学技术(例如用简单糖、戊二醛、乙基二甲氨基丙基碳二亚胺、 去甲二氢愈创木酸的非酶糖化)、或组合方法(例如同时的非酶糖化和γ 射线辐照)。在需要转化为磷酸八钙时(即步骤IV中)，有利地在低于约 37℃的温度下进行第一交联，以防止透钙磷石相转化为其脱水形式，三 斜磷钙石，三斜磷钙石是不易水解为磷酸八钙的磷酸钙。
IV：水解
可以进行该步骤，以便从透钙磷石将CaP相(在生理pH下具有高 溶解度的相)部分地或完全地水解为磷酸八钙和/或磷灰石(在生理pH下 具有较低溶解度的相)，并基本上除去任何可溶性污染相(例如硝酸铵、 磷酸氢钙)。在水解为OCP的情况中，将选定的pH有利地保持恒定在 约6.65(使用缓冲液、恒pH滴定或其它方法)，和在约37℃温度下约24～ 48小时。如步骤I的情况，在水解步骤(步骤IV)期间也可以加入辅助交 联(例如葡萄糖、核糖)或增加体内响应(例如生长因子、基因转录因子、 硅、促尿钠排泄肽)的添加剂。
V：第二交联
进行该步骤以进一步调整复合物的机械和降解性能。可以使用上 述步骤III中列出的任何或全部交联方法以实现第二交联。
提供下列实施例和附图以帮助进一步理解本发明。实施例和附图 不应认为限定本发明的范围。实施例或附图中描述的任何特征适用于以 上说明的任何方面。
实施例1
实施例1是上述合成方法的例子，仅仅进行步骤I～III。在室温 (20～25℃)和约3.2的pH(用氨滴定来维持)下进行三元共沉淀。在本实 施例中，共沉淀物在37℃下干燥，通过脱水热处理进行交联。在本实施 例中既不进行CaP的水解转化，也不进行第二交联。
材料
胶原蛋白：再生的提取了胃蛋白酶的猪皮胶原蛋白(端胶原 (atelocollagen))；85％I型，15％III型；Japan Meat Packers(Osaka， Japan)。
GAG：来自鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素；钠盐；Sigma-Aldrich Inc(St. Louis，MO，USA)
钙源：(i)氢氧化钙Ca(OH)2；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；(ii)硝酸钙；Ca(NO3)2·4H2O；Sigma-Aldrichlnc(St.Louis，MO， USA)；
磷源：正磷酸；H3PO4；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
滴定剂：氨；NH3；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
步骤
步骤I
溶液A：
-在室温下将Ca(OH)2溶解在0.48摩尔/升的H3PO4中至0.12摩尔 /升的浓度，使用氨将得到的溶液滴定至pH＝3.2。
悬浮液B：
-将6-硫酸软骨素溶解在去离子水中至3.2g/L的浓度。然后在恒 定搅拌下，以1.5的硝酸根：氢氧根的摩尔比将Ca(NO3)2·4H2O和 Ca(OH)2加到硫酸软骨素溶液中，以制备出总钙浓度为2.4摩尔/升的悬 浮液。
-将0.144g的胶原蛋白加到20ml的溶液A中，使用均质器混合 至溶解。然后在恒定搅拌下将4mL的悬浮液B加到溶液A中。
-继续搅拌60分钟，监测pH以确保pH维持在3.15＜pH＜3.30的 范围中。然后使得到的浆在室温下老化24小时。
步骤II
-使所述浆在37℃下在空气中干燥5天，用去离子水漂洗剩余的三 元共沉淀物，接着在37℃下再干燥24小时。
-所得到的三元共沉淀物的X射线衍射谱图示于图1(Cu-K(α)射线) 中，SEM照片示于图2中。
步骤III
通过在105℃和50毫托的真空下脱水热处理(DHT)48小时，使三 元共沉淀物交联。DHT后的三元共沉淀物的TEM照片示于图3中。图 4表示DHT后的三元共沉淀物的X射线衍射谱图，表明透钙磷石相转 化为其脱水形式三斜磷钙石。
实施例2
实施例2是上述合成方法的例子，仅仅进行步骤I～IV。在室温 和pH 4.0下进行三元共沉淀。在本实施例中，通过仔细控制氢氧化钙 和硝酸钙的浓度实现pH的控制，该方法也能控制三元共沉淀物中透钙 磷石与胶原蛋白+GAG的质量比。然后将得到的三元共沉淀物冷冻至-20 ℃，放置在真空下，然后加热使游离水(即冰)升华。使用1-乙基3-(3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺处理进行第一交联。然后通过在约37℃和6.67 的pH下水解将得到的干燥三元共沉淀物转化为磷酸八钙。在本实施例 中，不进行第二交联。
材料
I型：由牛腱溶解的酸，Integra Life Sciences Plainsboro，NJ，USA
GAG：源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素；钠盐；Sigma-Aldrich Inc (St.Louis，MO，USA)
钙源：(i)氢氧化钙Ca(OH)2；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；和(ii)硝酸钙；Ca(NO3)2·4H2O；Sigma-Aldrichlnc(St.Louis，MO， USA)；
磷源：正磷酸；H3PO4；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
滴定剂：无
交联剂：(i)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(＝EDAC)； Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；和(ii)N-羟基琥珀酰亚胺 (＝NHS)；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)
步骤
步骤I
-选择透钙磷石与胶原蛋白+糖胺聚糖的目标质量比为1∶1。
-在200mL的总反应体积中，胶原蛋白+GAG的浓度设定为21 mg/mL。
-使用pH变量的经验三维图(在1.0的恒定[Ca2+]与[P]反应物离子 比下制作)，改变：(i)离子浓度(即[Ca2+]＝[H3PO4])和(ii)硝酸钙：氢氧化 钙的比，确认pH恒定为4.0的点的轨迹。这示于图5中(离子浓度和硝 酸钙∶氢氧化钙比的组合设定，以维持pH＝4.0)。
-将该点的轨迹叠加在具有相同的坐标轴的透钙磷石质量产率的 图上，确认它与21mg/mL的等值线的交叉点，使得可以设定反应物浓 度，在该反应物浓度下，在pH为4.0([Ca2+]＝[H3PO4]＝0.1383摩尔/升； Ca(NO3)2·4H2O∶Ca(OH)2＝0.1356)时，可以制备含有质量比为1∶1的磷 酸钙(21mg/mL)与胶原蛋白+GAG(21mg/mL)的三元共沉淀物浆。见图 6：确定含有质量比为1∶1的磷酸钙与胶原蛋白+GAG的三元共沉淀物 浆的pH4.0下的合成条件。
-将3.8644g的胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1383 摩尔/升的H3PO4中，使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm 下混合90分钟，制备高粘性的胶原蛋白分散体。
-在室温下将0.3436 g6-硫酸软骨素溶解在14.3mL的0.1383摩尔 /升中，通过周期振荡分散溶解的GAG，制备GAG溶液。
-90分钟后，在15000rpm的连续均质下，将14.3mLGAG溶液 以约0.5mL/分钟的速率加到搅拌的胶原蛋白分散体中，所得到的高粘 性胶原蛋白/GAG分散体总共混合90分钟。
-在混合90分钟后，在15000rpm的恒定搅拌下，用30分钟时间 将1.804g的Ca(OH)2和0.780g的Ca(NO3)2·4H2O加到高粘性胶原蛋 白/GAG分散体中，制备胶原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物浆，此后向 浆中混入另外的14.3mL的0.1383摩尔/升的H3PO4。
-三元共沉淀物浆的pH约为4.0。
-使三元共沉淀物浆保持在25℃下48小时。
步骤II
-将三元共沉淀物浆置于-20℃的冷冻机中，并允许固化过夜。
-然后从冷冻机中取出冷冻的浆，置于约80毫托的真空中，使温 度升至室温，这样引起冰从浆中的升华，使其进行48小时。
-除去游离水后的胶原蛋白/GAG/透钙磷石三元共沉淀物的X射 线衍射谱图(Cu-K(α)射线)示于图7中，共沉淀物表面的SEM照片示在 图8中(CaP∶胶原蛋白+GAG＝1∶1的三元共沉淀物表面的二次电子(SE) 和反向散射电子(BSE)照片)。
步骤III
-在完全除去游离水之后，在40mL的去离子水中水合得到的1.25 g的干燥的三元共沉淀物20分钟。
-将20mL的0.035摩尔/升的EDAC和0.014摩尔/升的NHS的溶 液加到容纳三元共沉淀物和去离子水的容器中，在缓和搅拌和室温下使 三元共沉淀物交联2小时。
-除去EDAC溶液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三元共沉淀物，并 在温和搅拌下在新鲜的PBS中，在37℃下培养2小时。
-在PBS中2小时后，用去离子水漂洗三元共沉淀物，并在温和 搅拌下在37℃下培养两个10分钟的间隔。
-然后将三元共沉淀物在37℃下干燥72小时。图9表示EDAC交 联后的胶原蛋白/GAG/透钙磷石三元共沉淀物的X射线衍射谱图 (Cu-K(α)射线)。
步骤IV
-将交联的三元共沉淀物颗粒放在50mL 37℃的去离子水中，使用 氨将溶液的pH调节为6.67。
-温度和pH保持恒定48小时，此后过滤出共沉淀物，在去离子 水中漂洗，在37℃下在空气中干燥。
-转化为OCP后的共沉淀物的X射线衍射谱图表示在图10中 (EDAC交联的胶原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物在37℃和pH 6.67下 向OCP转化72小时后，形成胶原蛋白/GAG/OCP生物复合物，Cu-K(α) 射线)。
实施例3
实施例3是上述合成方法的例子，通过进行步骤I～V实施。在 室温和约4.5的pH下进行三元共沉淀。如在实施例2中，通过仔细控 制氢氧化钙和硝酸钙浓度实现pH控制，不使用滴定剂。然后将得到的 三元共沉淀物冷冻至-20℃，放置在真空下，然后加热以引起游离水(即 冰)的升华。使用1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺处理进行第一交 联。然后将得到的干燥的共沉淀物在pH 8.50和37℃下转化为磷灰石。 使用γ射线辐照进行第二交联。
材料
I型：由牛腱溶解的酸，Integra Life Sciences Plainsboro，NJ，USA
GAG：来自鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素；钠盐；Sigma-Aldrich Inc(St. Louis，MO，USA)
钙源：(i)氢氧化钙Ca(OH)2；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；和(ii)硝酸钙；Ca(NO3)2·4H2O；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；
磷源：正磷酸；H3PO4；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
滴定剂：无
交联剂：(i)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(＝EDAC)； Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；和(ii)N-羟基琥珀酰亚胺 (＝NHS)；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)
步骤
步骤I
-选择3∶1的透钙磷石与胶原蛋白+糖胺聚糖的目标质量比。
-在200mL的总反应体积中，将胶原蛋白+GAG的浓度设定为10 mg/mL。
-使用pH变量的经验三维图(在1.0的恒定的[Ca2+]与[P]反应物离 子比下)，改变：(i)离子浓度(即[Ca2+]＝[H3PO4])和(ii)硝酸钙∶氢氧化钙的 比，确认pH恒定为4.5的点的轨迹。这示于图11中(设定离子浓度和 硝酸钙∶氢氧化钙的比的组合，以保持pH＝4.5)。
-将该点的轨迹叠加在透钙磷石质量产率的图上(具有相同的坐标 轴)，确认它与30mg/mL(即3倍于胶原蛋白+GAG的浓度)的等值线的 交叉点，使得设定反应物浓度，在该反应物浓度下，在pH为 4.5([Ca2+]＝[H3PO4]＝0.1768摩尔/升；Ca(NO3)2·4H2O∶Ca(OH)2＝0.049)下， 可以制备含有质量比为3∶1的磷酸钙(30mg/mL)与胶原蛋白+GAG(10 mg/mL)的三元共沉淀物浆。这示于图12中：确定含有质量比为3∶1的磷 酸钙与胶原蛋白+GAG的三元共沉淀物浆的pH4.5下的合成条件。
-将1.837g的胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1768 摩尔/升的H3PO4中，使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm 下混合90分钟，以制备胶原蛋白分散体。
-在室温下将0.163 g6-硫酸软骨素溶解在14.3mL的0.1768摩尔/ 升的磷酸中，通过周期地振荡分散溶解GAG，以制备GAG溶液。
-90分钟后，在15000rpm的连续均质下，将14.3 mLGAG溶液 以约0.5mL/分钟的速率加到混合的胶原蛋白分散体中，所得到的胶原 蛋白/GAG分散体总共混合90分钟。
-在90分钟的混合后，在15000rpm的恒定搅拌下，在30分钟时 间将2.498g的Ca(OH)2和0.380g的Ca(NO3)2·4H2O加到胶原蛋白 /GAG分散体中，制备胶原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物浆，此后向混 合浆体中加入另外的14.3mL的0.1768摩尔/升的H3PO4。
-三元共沉淀物浆的pH约为4.5。
-使三元共沉淀物浆保持在25℃下48小时。
步骤II
-将三元共沉淀物浆置于-20℃的冷冻机中，使其冷冻过夜。
-然后从冷冻机取出冷冻的浆，放在约80毫托的真空中，使温度 升至室温，这样引起冰从浆中的升华，使其进行48小时。除去游离水 后的胶原蛋白/GAG/透钙磷石三元共沉淀物的X射线衍射谱图(Cu-K(α) 射线)示于图13中。
步骤III
-在完全除去游离水之后，使得到的1.25g的干三元共沉淀物在 40mL的去离子水中水合20分钟。
-将20mL的0.018摩尔/升EDAC和0.007摩尔/升NHS的溶液加 到含有三元共沉淀物和去离子水的容器中，在缓和搅拌和室温下使三元 共沉淀物交联2小时。
-除去EDAC溶液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三元共沉淀物，允 许在温和搅拌下在新鲜的PBS中，在37℃下培养2小时。
-在PBS中2小时后，用去离子水洗涤三元共沉淀物，并在温和 搅拌和37℃下培养两个10分钟的间隔。
-然后将三元共沉淀物在37℃下干燥72小时。EDAC交联后的胶 原蛋白/GAG/透钙磷石三元共沉淀物的X射线衍射谱图(Cu-K(α)射线) 示于图14中。
步骤IV
-将交联的三元共沉淀物颗粒置于37℃的50mL用透钙磷石预先 饱和的去离子水中，使用氨将溶液的pH调节为8.50。
-维持温度和pH恒定72小时，此后过滤出共沉淀物，在去离子 水中漂洗，在37℃下在空气中干燥。转化为磷灰石后的共沉淀物的X 射线衍射谱图示于图15中(EDAC交联的胶原蛋白/GAG/CaP三元共沉 淀物在37℃和8.50的pH下向磷灰石转化72小时后，形成胶原蛋白 /GAG/磷灰石生物复合物，Cu-K(α)射线)。
步骤V
-将干燥的胶原蛋白/GAG/Ap三元共沉淀物进行32.1kGy剂量的 γ射线辐照。图16表示γ射线辐照后的X射线衍射谱图(经γ辐照第二 交联后的EDAC交联的胶原蛋白/GAG/Ap三元共沉淀物)。
实施例4
材料
胶原蛋白：再生的提取了胃蛋白酶的猪皮胶原蛋白(端胶原)；85wt ％I型，15wt％III型；Japan Meat Packers(Osaka，Japan)。
GAG：来自鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素；钠盐；Sigma-Aldrich Inc(St. Louis，MO，USA)
钙源：(i)氢氧化钙Ca(OH)2；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；和(ii)硝酸钙；Ca(NO3)2·4H2O；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；
磷源：正磷酸；H3PO4；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
滴定剂：氨；NH3；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
步骤
步骤I
-通过在室温下将Ca(OH)2溶解在0.48摩尔/升的H3PO4中至0.12 摩尔/升的浓度，制备溶液A，将所得到的溶液滴定至pH为3.2。
-通过将6-硫酸软骨素溶解在去离子水中至3.2g/L的浓度，制备 出悬浮液B。在恒定搅拌下，以1.5的硝酸根：氢氧根的摩尔比将 Ca(NO3)2·4H2O和Ca(OH)2加到硫酸软骨素溶液中，以制备总钙浓度为 2.4摩尔/升的悬浮液。
-将0.144g的胶原蛋白加到20mL的溶液A中，使用均质器混合 至溶解。然后在恒定搅拌下将4mL的悬浮液B加到溶液A中。持续搅 拌60分钟，监测pH以确保pH维持在3.15＜pH＜3.30的范围中。然后 使所得到的浆在室温下老化24小时。
步骤II
-使所述浆在37℃下在空气中干燥5天，用去离子水漂洗剩余的三 元共沉淀物，接着在37℃下再干燥另外的24小时。
步骤III
-将共沉淀物放在稀醋酸(pH＝3.2)中，用30 kGy的γ射线辐照剂 量辐照。然后从溶液中除去交联的沉淀物，漂洗，在37℃下在空气中干 燥。
步骤IV
-将交联的共沉淀物颗粒放在37℃的50mL去离子水中，使用氨 将溶液的pH调节为6.65。维持恒定温度和pH 48小时，此后过滤出共 沉淀物，在去离子水中漂洗，在37℃下在空气中干燥。
步骤V
-将交联的水解的共沉淀物颗粒置于室温的真空箱中，施加50毫 托的真空，然后将温度升高至105℃。24小时后，将温度降至室温，并 释放真空。
图17表示刚刚进行三元共沉淀和干燥(步骤I和II)后的复合物的 X射线衍射谱图。该谱图证实主要存在的相是透钙磷石。
图18表示第一交联(步骤III)后的共沉淀物颗粒的结构的SEM显 微照片。值得注意的是颗粒微观结构的均一性质。
水解为磷酸八钙的过程(步骤IV)表示在图19的XRD谱图中。在12.5 °的透钙磷石峰强度逐渐减弱，在4.5°的磷酸八钙(OCP)的主峰增强，这 表明无机相在48小时转化为OCP。
复合物的TEM图表示在图20中。可以看出，分散在胶原蛋白 /GAG基质中的10～20nm的低长宽比的磷酸钙晶体的无规分布。
本发明的复合生物材料可以用作可生物吸收的材料。可以预期， 移植后，由该材料制备的构件将完全吸收，仅留下健康的再生组织，丝 毫不留下移植物本身。[附录1完]
一种制备包含无机材料和有机材料的复合生物材料的方法，其包 括：
(a)提供第一浆组合物，其包含液体载体、无机材料和有机材料；
(b)提供用于所述浆的模具；
(c)使所述浆沉积在所述模具中；
(d)将沉积在所述模具中的浆冷却至所述液体载体转化为多个固体 晶体或颗粒的温度；
(e)优选通过升华和/或蒸发移除至少一些所述多个固体晶体或颗 粒，以留下含有无机材料和有机材料的多孔复合材料；和
(f)将所述材料从所述模具中移走。
此处所用的术语生物材料指的是可与人体或动物体生物相容的材 料。
此处所用的术语浆包括浆、溶液、悬浮液、胶体和分散体。
所述无机材料会通常包括磷酸钙材料。
所述有机材料会通常包括生物有机物，例如一种能溶解或悬浮在含 水介质中以形成浆的物质。例子包括白蛋白、糖胺聚糖、乙酰透明质酸、 壳聚糖、和包含胶原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的一种或多种。胶 原蛋白是优选的材料，任选地与糖胺聚糖一起使用。
此处使用的术语胶原蛋白包括重组人(rh)胶原蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述无机材料包括磷酸钙材料，所述有 机材料包括胶原蛋白和任选的糖胺聚糖。这产生包含所述磷酸钙材料和 胶原蛋白以及任选的糖胺聚糖的多孔复合材料。优选地，所述第一浆包 含胶原蛋白和磷酸钙材料的共沉淀物。更优选地，所述第一浆包含胶原 蛋白、磷酸钙材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。
作为选择，所述第一浆可以只包含胶原蛋白和磷酸钙材料及任选的 糖胺聚糖的机械混合物。可以通过例如EP-A-0164484和EP-A-0214070 中描述的常规技术来生产该浆。虽然可以使用机械混合物形成所述浆， 但是优选胶原蛋白和所述磷酸钙材料的共沉淀物或胶原蛋白、磷酸钙材 料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。
所述磷酸钙材料，可以选自，例如透钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰石 中的一种或多种。所述磷酸钙材料优选包含透钙磷石。
所述浆的pH优选为2.5到6.5，更优选为2.5到5.5，还更优选为 3.0到4.5，并且还更优选为3.8到4.2。
所述浆组合物可以包含一种或多种糖胺聚糖。所述浆组合可以包含 一种或多种磷酸钙材料。
不排除在前体浆中存在其它物质(例如银、硅、二氧化硅、食盐、 糖等)。
至少一些所述多个固体晶体或颗粒可以通过升华和/或蒸发除去，以 留下包含胶原蛋白、磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖的多孔复合材料。优 选的方法是升华。
步骤(d)和(e)可能受到冻干技术的影响。如果所述液体载体是水，所 述升华步骤包括降低模具周围环境的压力，将浆冷冻至水/冰/水蒸气系 统的三相点以下，然后在获得的真空压力下将温度升至比固体-蒸气转 化温度更高的温度。当周围的液体蒸气分压低于当前温度下冻结液体分 压时，所述产品中的冰通过升华直接转化为蒸气。该温度通常升至0℃ 或以上。进行该步骤以通过升华从所述冷冻浆中除去冰晶体。
冻干参数可以被调整，以控制所需的孔径大小和长宽比。一般地， 较慢的冷却速率和较高的最终冻结温度(例如以大约0.25℃每分钟冷却 至约-10℃的温度)有利于形成具有更大长宽比的大孔，而较快的冷却 速率和较低的最终冻结温度(例如以大约2.5℃每分钟冷却至约-40℃的 温度)有利于形成等轴的小孔。
此处所用的术语“模具”意欲包括任何能够成形、容纳或支持所述 浆组合物的模具、容器或基质。因此，最简单形式的模具可只包括支承 表面。所述模具可以是任何所需的形状，并且可以由包括聚合物(例如 聚砜、聚丙烯、聚乙烯)，金属(例如不锈钢、钛、钴铬)，陶瓷(例如 氧化铝、氧化锆)，玻璃陶瓷，和玻璃(例如硼硅酸盐玻璃)的任何适 合的材料制成。
本申请人2004年10月28日提交的较早的申请PCT/GB04/004550 描述了胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物和其制备方法。 PCT/GB04/004550的内容在此通过引用并入本文。在附录1中提供 PCT/GB04/004550的副本。
PCT/GB04/004550中描述的方法包括：提供包含胶原蛋白、钙源和 磷源以及糖胺聚糖的酸性水溶液；和将所述胶原蛋白、透钙磷石和糖胺 聚糖一起从所述水溶液中沉淀出来，以形成三元共沉淀物。
术语共沉淀物指的是两种或三种化合物的沉淀，其中所述化合物基 本上同时从相同的溶液/分散体中沉淀。其区别于由所述成分的机械混 合形成的材料，尤其是当这些成分单独地从例如不同的溶液中沉淀时。 所述共沉淀物的微结构明显不同于由其成分的机械混合形成的材料。
在制备所述共沉淀物的过程中，所述钙源优选选自硝酸钙、醋酸钙、 氯化钙、碳酸钙、钙醇盐、氢氧化钙、硅酸钙、硫酸钙、葡萄糖酸钙和 肝素钙盐中的一种或多种。肝素钙盐可以源于猪的肠粘膜。合适的钙盐 可商业得到，例如从Sigma-Aldrich公司得到。磷源优选选自磷酸二氢 铵、磷酸氢二铵、磷酸、二水合正磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O，有时 被称为GPR Sorensen盐)和磷酸三甲酯，磷酸的碱金属盐(例如钠或 钾)，磷酸的碱土金属盐(例如镁或钙)中的一种或多种。
糖胺聚糖是含有长的无支链聚糖的大分子族，所述聚糖含有重复的 二糖单元。优选地，所述糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素 (dermatin)、肝素、硫酸肝素、硫酸角蛋白和透明质酸中的一种或多 种。硫酸软骨素可以是4-硫酸软骨素或6-硫酸软骨素，两者都可商业得 到，例如从Sigma-Aldrich公司得到。所述6-硫酸软骨素可以源于鲨鱼 软骨。透明质酸可以源于人的脐带。肝素可以源于猪的肠粘膜。
所述胶原蛋白可以是可溶或不可溶的，并可以源于任何动物的任何 组织，并且可以用许多常规技术提取。
沉淀可以通过在酸性水溶液中结合所述胶原蛋白、钙源、磷源和糖 胺聚糖，然后使所述溶液静止直到出现沉淀，搅拌溶液，用碱滴定液例 如氨水滴定，加入成核剂例如预制的透钙磷石，改变钙源加入的速率， 或这些或本领域中公知的许多其它技术的任意组合来实现。
将会理解，其它的成分可以存在于所述浆中。例如，可以任选地将 生长因子、基因、药物或其它生物活性物质单独地或以组合加入到浆中。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法还有利地包括：提供 第二浆组合物，其包括液体载体和有机材料及任选的无机材料；和
在所述冷却步骤之前，在沉积所述第一浆组合物之前或之后将所述 第二浆组合物沉积在所述模具中。
如前所述，所述有机材料将通常包含胶原蛋白(包括重组人(rh) 胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明质酸、壳聚糖和包含胶原蛋 白的部分多肽序列的合成多肽的一种或多种。
所述第二浆组合物可以包含无机材料，例如磷酸钙材料。
优选地，所述第二浆组合物包含液体载体、胶原蛋白、任选的磷酸 钙材料和任选的糖胺聚糖。在这个实施方案中，所述第二浆组合物优选 包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，或胶原蛋白和磷酸钙材料的共沉 淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料的三元共沉淀物。已经关于 所述第一浆的制备讨论过共沉淀。
作为选择，所述第二浆可以只包含胶原蛋白和任选的一种或两种磷 酸钙材料和糖胺聚糖的机械混合物。已经关于所述第一浆的制备讨论过 机械混合物。
如果存在，所述第二浆中的磷酸钙材料可以选自透钙磷石、磷酸八 钙和/或磷灰石的一种或多种。
所述第一和第二浆组合物将通常作为第一和第二层沉积在模具中。 例如，将所述第一浆沉积在模具中，然后是第二浆。然后可以对所述模 具中内含物进行步骤(d)、(e)和(f)。相应地，该方法可以用于形成多层 材料，其中至少一层优选包含含有胶原蛋白、磷酸钙材料和任选的糖胺 聚糖的多孔复合材料。所述第二浆组合物得到的层可以是多孔的或无孔 的层。如果期望多孔层，则所述孔可以通过升华和/或蒸发在第二浆内 形成的多个固体晶体或颗粒来产生。已经关于第一浆讨论过这种技术， 并且优选包括冻干技术。
所述方法在液相中进行，这样有助于在第一浆层和第二浆层之间的 扩散。
可以以任何成层顺序或几何的方式沉积所述层。例如，所述层可以 垂直地(即一层位于另一层上面)、水平地(即一层在另一层旁边)和/ 或放射状地(一个球形层在下一个层的上面)定位。
根据本发明的浇铸方法能够制造用于组织工程的多孔单层和多孔 分层支架。
在所述第一和第二浆组合物沉积在模具中后，所述模具的内含物优 选在冷却步骤之前静置多至24小时。这样是有利的，因为其允许在相 邻的层之间不同浆组分的相互扩散。这会导致层间结合强度的增加。
所述第一浆中的液体载体优选包含水。所述第二浆中的液体载体也 优选包含水。
将会理解，可以在所述冷却步骤之前，在沉积所述第一和/或第二浆 组合物之前或之后，在模具中沉积其它的浆层。
冷却步骤之前沉积在模具中的浆的温度一般会影响浆的粘度。如果 温度过高，则会导致浆的粘度过低，这可导致一旦沉积第二浆，则所述 第一和第二层的完全相互混合(因而是不期望的)。也应该注意，太高 的温度可能导致胶原蛋白变性。另一方面，过低的温度可能导致浆粘度 过高，而不能有效地展开、平滑或成形，并且可能有过早形成冰结晶体 的风险。相应地，本发明人发现在冷却步骤之前沉积在模具中的第一浆 的温度优选从2至40℃，更优选从4至37℃，还更优选从20至37℃。 如果使用多层的浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。
沉积在模具中的第一浆的冷却步骤优选进行到≤0℃的温度。更优 选地，冷却步骤进行到-100至0℃的温度，优选从-80至-10℃，更优选 从-40至-20℃。如果使用多层浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。
沉积在模具中的第一浆的冷却步骤优选以0.02-10℃/分钟的冷却速 率进行，更优选0.02-6.0℃/分钟，还更优选0.2-2.7℃/分钟。如果使用多 层浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。
一般地，较慢的冷却速率和较高的最终冻结温度(例如以大约0.25 ℃每分钟的速率冷却至-10℃的温度)有利于形成具有较大的长宽比的 大孔，而较快的冷却速率和较低的最终冻结温度(例如以大约2.5℃每 分钟的速率冷却至-40℃的温度)有利于形成等轴的小孔。
沉积在模具中的浆的冷却步骤优选在1～200kPa，更优选50～ 150kPa，仍更优选50～101.3kPa的压力下进行。如果使用多层浆组合 物，则这些范围也适用于另外的浆。本发明人发现，低于50kPa的压力 可能导致在浆中形成气泡，而高于200kPa的压力可能引起相邻层的过 度混合。
沉积在模具中的第一浆的厚度优选0.1～500mm，更优选0.5～20 mm，还更优选1.0～10mm。如果使用多层浆组合物，则这些范围也适 用于另外的浆。厚度超过500mm的层可能难以完全固化，而厚度小于 0.1mm的层可几乎瞬间冻结，使之难以准确控制冰结晶体成核和生长 的进程。
所述第一浆在被沉积到模具中之前的粘度优选为0.1～50Pa·s，更 优选0.1～10Pa·s，还更优选0.5～5Pa·s。如果使用多层浆组合物，则 这些范围也适用于另外的浆。具有过高粘度的浆可能难以展开、平滑和 成形，而具有过低粘度的浆可能导致一旦沉积第二浆则所述第一层和第 二层就完全相互混合(因而是不期望的)。
通过升华除去第一浆中至少一些固体晶体或颗粒的步骤优选在0～ 0.08kPa，更优选0.0025～0.08kPa，还更优选0.0025～0.04kPa的压力下 进行。如果使用多层浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。比水的 三相点压力(约0.08kPa)高的压力可能有发生融化而不是升华的风险， 而过低的压力则难以实现，并且不一定促进升华。
关于通过升华除去第一浆中至少一些固体晶体或颗粒的步骤，如果升 华的持续时间过短，残留的水和溶剂可引起所述支架壁的再溶解，进而危 及所述孔结构。相应地，本发明人发现，该步骤优选进行多至96小时，更 优选12～72小时，还更优选24～36小时。如果使用多层浆组合物，则这 些范围也适用于另外的浆。
通过升华除去第一浆中至少一些固体晶体或颗粒的步骤优选在-10至 60℃，更优选0～40℃，还更优选20～37℃，还更优选25～37℃的温度 下进行。如果使用多层浆组合物，则这些范围也适用于另外的浆。如果 在升华期间的温度过低，完成升华所需的时间可能变得过长，而过高的 温度(即高于40℃)可具有胶原蛋白变性的风险。
如果所述材料包含胶原蛋白和糖胺聚糖，则根据本发明的方法还可 以包括使多孔复合生物材料中的胶原蛋白和糖胺聚糖交联的步骤。通常 在升华后从模具中移走所述材料后进行交联。交联可以通过以下方式实 现：对共沉淀物进行γ射线辐照，紫外线辐照，脱水热处理，用例如葡 萄糖、甘露糖、核糖和蔗糖的简单的糖进行非酶糖化的一种或多种、使 该三元共沉淀物与戊二醛、碳二亚胺(例如乙基二甲氨基丙基碳二亚胺) 和/或去甲二氢愈创木酸中的一种或多种接触，或上述方法的任意组合。 在本领域中这些都是常规方法。
如果所述材料包含磷酸钙，则根据本发明的方法还可以包括将所述 多孔复合生物材料中的至少一些磷酸钙材料转化成另一种磷酸钙相的 步骤。例如，该方法可以包括将所述多孔复合生物材料中的至少一些透 钙磷石转化成磷酸八钙和/或磷灰石。所述透钙磷石到磷酸八钙和/或磷 灰石的转化优选通过水解实现。相转换将通常在从模具中移走所述材料 (和任选的交联)之后进行。
磷灰石是包含钙和磷酸盐的矿物类，并具有通式Ca5(PO4)3(X)， 其中X可以是离子，其通常为OH-、F-和Cl-，以及本领域的技术人员 熟知的其它离子。术语磷灰石也包括取代的磷灰石，例如硅取代的磷灰 石。所述术语磷灰石包括羟磷灰石，它是磷灰石的一个具体实例。所述 羟磷灰石也可以被其它物质例如硅取代。
如上所述，在所述冷却步骤之前，在沉积所述第一和/或第二浆组合 物之前或之后，可以在模具中沉积其它的浆层。所述其它的浆层通常也 会包含例如液体载体、胶原蛋白、任选的磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖。 模具中的内含物优选在冷却步骤之前静置多至24小时，以便允许相邻 的层之间的各种浆组分的相互扩散。
相应地，本发明提供了用于制备包含一个、二个或更多层的复合生 物材料的方法。所述层中的至少一个优选包括胶原蛋白、磷酸钙材料和 优选的糖胺聚糖的多孔生物复合物。优选所有的层包含胶原蛋白。
根据本发明的复合生物材料可用于制造，例如多孔的单层支架，或 其中至少一层是多孔的多层支架。根据本发明的复合生物材料被有利地 用于肌骨骼和牙科应用的组织再生支架。
根据本发明的方法优选包括将胶原蛋白作为有机成分引入所述第 一和第二层中(优选胶原蛋白是第一和第二层中的主要有机成分)。如 果存在另外的层，则所述方法优选包括将胶原蛋白作为有机成分引入这 些其它层的一层或多层中(也优选胶原蛋白是所述一个或多个其它层的 主要有机成分)。所述方法包括在液体相中同时制造所有的层和从而制 造它们之间的界面。这样导致层与层间通过相互扩散产生强的界面。术 语相互扩散指的是当两种组成不同的浆整体接触放置时，由于分子扩散 或布朗运动而发生的混合。
在第二方面中，本发明提供了合成的复合生物材料，其中至少部分 生物材料由包含磷酸钙材料和胶原蛋白(包括重组人(rh)胶原蛋白)、 糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明质酸、壳聚糖或包含胶原蛋白的部分多肽 序列的合成多肽的一种或多种的多孔共沉淀物形成，其中大孔尺寸范围 (孔径)优选为1～1000微米，更优选200～600微米。所述材料优选 包含胶原蛋白。所述磷酸钙材料优选选自透钙磷石、磷酸八钙和/或磷 灰石的一种或多种。所述多孔材料优选包含胶原蛋白和磷酸钙材料的共 沉淀物。这已经关于本发明的第一方面描述过。
此处所用的术语多孔指的是所述材料可以包含大孔和/或微孔。大孔 隙率通常指的是与尺度大于约10微米的孔相关的特征。
微孔隙率通常指的是与尺度小于约10微米的孔相关的特征。将会 理解所述材料内可能有开放小室和闭合小室的任意组合。例如，所述材 料一般会含有大孔和微孔。所述大孔隙率一般是开放小室的，尽管可能 有闭合的小室部分。
根据本发明第二方面的多孔材料中大孔的尺寸范围(孔径)通常是 从1至1200微米，优选从10至1000微米，更优选从100至800微米， 还更优选从200至600微米。
根据本发明第二方面的多孔材料中的平均长宽比优选从1至50，更 优选从1至10，最优选约1。
根据本发明第二方面的多孔材料中的孔径分布(平均孔径的标准偏 差)优选从1至800微米，更优选从10到400微米，还更优选从20到 200微米。
根据本发明第二方面的多孔材料中的孔隙率优选从50至99.9体积 ％，更优选从70至98体积％。
根据本发明第二方面的多孔材料中的开放小室的孔隙率的百分比 (作为总的开放和闭合小室的孔的总数的百分比来测量)优选从1至 100％，更优选从20至100％，还更优选从90至100％。
在第三方面中，本发明提供了合成的复合生物材料，其中至少部分 生物材料由包含磷酸钙材料和两种或多种胶原蛋白(包括重组人(rh) 胶原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明质酸、壳聚糖和包含胶原蛋 白的部分多肽序列的合成多肽的多孔材料形成。所述材料优选包含胶原 蛋白和糖胺聚糖。所述磷酸钙材料优选选自透钙磷石、磷酸八钙和/或 磷灰石的一种或多种。所述多孔材料优选包含胶原蛋白、糖胺聚糖和磷 酸钙材料的三元共沉淀物。这已经关于本发明的第一方面描述过。根据 本发明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范围(孔径)也适用于所述第 三方面。其平均长宽比范围、孔径大小分布、孔隙率和开放小室孔隙率 百分比同样如此。
第四方面中，本发明提供了一种合成的复合生物材料，其包括：第 一层，其由根据本发明第二或第三方面的复合生物材料形成；和连接至 所述第一层的第二层，其由包含胶原蛋白，或胶原蛋白与糖胺聚糖的共 沉淀物，或胶原蛋白与磷酸钙材料的共沉淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖 和磷酸钙材料的三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸钙材料优选选自透 钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰石的一种或多种。
所述第一和第二层优选整体地形成。有利地，这可以通过涉及液相 共合成的方法实现。这包括任何方法，其中通过在从所述浆除去液体载 体之前，将各层的包含前体的浆以整体彼此接触的方式放置，来形成包 含多层的材料的密实或多孔相邻层，和其中优选基本上同时从所有层中 除去所述液体载体。在除去液体载体之前(即，仍然在液体相中)，将 所述前体浆以整体接触方式放置允许相邻的浆之间发生相互扩散。这在 所得材料的相邻层之间的界面处形成相互扩散区域，其中的材料组成为 所述相邻层的材料组成的中间值。相互扩散区域的存在可赋予相邻层之 间的界面机械强度和稳定性。相应地，所述第一和第二层优选通过相互 扩散层彼此连接。
作为选择，所述第一和第二层可以通过中间层相互连接。术语中间 层指的是单独地沉积于两个其它层之间，用于提高层间结合强度或阻止 所得支架的相邻层之间的细胞、分子或流体通过，并且可以例如包含胶 原蛋白、糖胺聚糖、纤维蛋白、抗血管生成药物(例如苏拉明(suramin))、 生长因子、基因或任何其它成分的任何层。中间层通过以下事实区别于 相互扩散层：中间层作为组成不同于其相邻层的组成的浆而单独地沉 积，而相互扩散层只是由于相邻层之间的相互扩散而形成的。
所述第一层是多孔的。优选第二层也是多孔的，尽管如果需要，可 以是无孔的或基本上无孔的层。
根据本发明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范围(孔径)也适用 于根据本发明第四方面的实施方案中的第一和/或第二层。其平均长宽 比范围、孔径分布、孔隙率和开放小室孔隙率百分比同样如此。
在任意的所述第二、三和四方面中，所述生物材料可以包含连接至 所述第一和/或第二层的一个或多个其它的层，其中所述其它层中的每 一层优选由包含胶原蛋白，或胶原蛋白与糖胺聚糖的共沉淀物，或胶原 蛋白与磷酸钙材料的共沉淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料的 三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸钙材料优选选自透钙磷石、磷酸八 钙和/或磷灰石中的一种或多种。所述第一和第二层及所述一个或多个 其它的层优选整体的方式形成，并且相邻的层优选通过通常由液相共合 成形成的相互扩散层彼此连接。一般地，所述其它层中的至少一个将会 是多孔的。此外，根据本发明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范围(孔 径)也适用于这些其它层的一个或多个。其平均长宽比范围、孔径分布、 孔隙率和开放小室孔隙率百分比同样如此。
相邻层之间的孔径大小差可以在几乎可忽略到大至+/-1000微米之 间变化。
除非另有说明，下列描述适用于本发明的任意方面。
如果材料包含胶原蛋白和糖胺聚糖，则可以交联所述胶原蛋白和糖 胺聚糖。
所述胶原蛋白优选以从1至99wt％，优选从5至90wt％，更优选 从15至60wt％的量存在于所述材料中。
所述糖胺聚糖优选以从0.01至20wt％，更优选从1至12wt％，还 更优选从1至5.5wt％的量存在于所述材料中。
如果所述材料包含透钙磷石，则胶原蛋白和透钙磷石的重量比优选 从10∶1至1∶100，更优选从5∶1至1∶20。
如果所述材料包含磷酸八钙，则胶原蛋白和磷酸八钙的重量比优选 为10∶1至1∶100，更优选从5∶1至1∶20。
胶原蛋白和糖胺聚糖的重量比优选为从8∶1至30∶1。
根据本发明的生物材料可以用作替代骨或牙科材料。相应地，本 发明提供了包含此处描述的生物材料的合成骨材料、骨植入物、骨移植 物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固粉。
所述生物材料有利地以多层支架的形式提供。具体地，本发明提 供了用于肌骨骼和牙科应用的组织再生支架。根据本发明的多层(即两 层或多层)支架可以在例如骨/软骨界面(例如关节连接)、骨/腱界面(例 如腱插入点)、骨/韧带界面(例如韧带插入点)、和牙齿/韧带界面(例 如牙齿/牙周韧带结合点)中找到应用。
尽管本发明主要涉及用于组织工程应用的支架，但是根据本发明 的材料可以用于制造在体内保持很长时间的植入物。例如，腱和韧带应 用可能必需的半永久性植入物。
本发明还提供可通过此处描述的方法获得的多孔复合生物材料。 合成方法
现在将通过实施例来进一步说明本发明。优选的合成方法包括一 系列步骤，其可以整体或部分地应用以生产具有一个层或多个层的多孔 支架，其中至少一个层优选包含胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料的三 元共沉淀物。
步骤0：制备浆
可以利用本发明人2004年10月28日提交的较早的专利申请 PCT/GB04/004550中概述的方法来实现矿化的胶原蛋白/GAG/透钙磷 石浆的制备。PCT/GB04/004550的内容在此通过引用并入本文。 PCT/GB04/004550的副本提供在附录1中。
可以利用Yannas et al.，1989；O′Brien et al.，2004；O′Brien et al.， (2005)；Loree et al.，(1989)中概述的方法来实现未矿化的胶原蛋白/GAG 浆的制备。
在该阶段通过机械混合，可以任选地将生长因子、基因、药物或 其它生物活性物质单独地或以组合加入所述浆中，以促使它们并入所述 支架中。在支架具有多于一层的情况下，并入一层中的生物活性物质不 需要与并入下一层中的生物活性物质相同。
步骤I：浇铸
步骤I-a：浇铸第1层
步骤I-b：浇铸第2层
步骤I-c：浇铸第3层
步骤I-n：浇铸第n层
所述浇铸步骤包括将溶液、悬浮液、胶体或分散体形式(其中水 构成主要稀释剂)的浆连续沉积到模具中，其中至少一种浆包含胶原蛋 白、一种或多种糖胺聚糖和磷酸钙透钙磷石的三元共沉淀物，并且所有 的浆包含胶原蛋白。
所述模具可以是任何期望的形状，可以由包括聚合物(例如聚砜、 聚丙烯、聚乙烯)，金属(例如不锈钢、钛、钴、铬)，或陶瓷(例如氧 化铝、氧化锆)，玻璃陶瓷，或玻璃(例如硼硅酸盐玻璃)的任意的许 多材料制成。
可以专门地构造所述模具用于促进层化。适合的设计的例子示于 图1和2。
例如，所述层可以垂直地(即一层位于另一层上面)、水平地(即 一层在另一层旁边)、和/或放射状(一个球形层在下一个的上面)地定 位。
在所述支架包括一层的情况下，待浇铸的单层包含含有胶原蛋白、 磷酸钙材料(优选透钙磷石)和任选的糖胺聚糖的共沉淀物的浆。优选 地，所述浆包含含有胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物。 该层的优选厚度列于表1的适当部分中。
在所述支架包括两层的情况下，待浇铸的所述层中的至少一层包 含含有胶原蛋白、磷酸钙材料(优选透钙磷石)和任选的糖胺聚糖的共 沉淀物的浆。优选地，所述浆包含含有胶原蛋白、透钙磷石和糖胺聚糖 的三元共沉淀物。该层的优选厚度列于表1的适当部分中。另一层包括 含有胶原蛋白、任选的磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖的浆。该浆组合物 优选包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，或胶原蛋白与磷酸钙材料 (比如透钙磷石)的共沉淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料(优 选透钙磷石)的三元共沉淀物。
可以根据需要包括其它层，并且这些其它层优选由包含胶原蛋白、 任选的磷酸钙材料和任选的糖胺聚糖的浆形成。所述其它的浆组合物优 选包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，胶原蛋白和磷酸钙材料(例如 透钙磷石)的共沉淀物，或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙材料(优选透 钙磷石)的三元共沉淀物。
每个后续层中的浆的组成可以是相同的，稍微变化的，或显著变 化的，条件是胶原蛋白和优选的糖胺聚糖存在于每一层中，并且所述层 中的至少一层也包含磷酸钙材料，例如透钙磷石。
步骤II：相互扩散
所述共扩散步骤包括允许浇铸的、分层的浆的各层相互扩散。进 行这一步步骤，以使得在相邻层之间的浆组分相互扩散，从而增加固化 和升华后层间的结合强度。所述相互扩散步骤的优选条件列于表2中的 适当部分。
步骤III：控制冷却
所述控制冷却步骤包括将含有浆的模具置于环境中，然后以控制 速率冷却至低于0℃的最终温度。进行该步骤，以引发和控制浆内冰结 晶体成核和生长的速率。然后，通过升华除去冰结晶体，留下多孔的支 架。所述冰结晶体网络的结构将决定支架的最终孔结构。冷却的优选参 数列于表3中。
步骤IV：退火
所述退火步骤包括使得浆在控制冷却步骤的最终温度下保持给定 的时间。进行该步骤以确保浆完全或基本完全冻结。退火的优选参数列 于表4。
步骤V：升华
所述升华步骤包括当冻结的浆大致维持在控制冷却和退火步骤的 最终温度时，将模具和冻结浆周围环境中的压力降低至低于水/冰/水蒸 气系统的三相点，然后将温度升至高于在获得的真空压力下的固体-蒸 气转化温度的温度(通常≥0℃)。进行该步骤，以通过升华将冰结晶体 从冻结的浆中除去。作为除去水的方法，升华相对于蒸发的优点在于其 留下了精确模拟之前存在的冰结晶体网络结构的空的空间(即孔)网络。 如果允许冰融化，则冰结晶体网络会丧失其形状，并且损害所得到的孔 网络结构。所述升华步骤的优选参数示于表5。
步骤VI：交联
如果需要，所述方法也可以包括交联步骤以交联胶原蛋白和糖胺 聚糖。这记载于本发明人2004年10月28日提交的较早的专利申请 PCT/GB04/004550中。PCT/GB04/004550的内容在此通过引用并入本 文。PCT/GB04/004550的副本提供在附件1中。
实施例
实施例1：胶原蛋白/GAG/CaP的单层支架
材料
胶原蛋白：I型，从牛腱获得的微原纤维胶原蛋白，Integra Life Sciences Plainsboro，NJ，USA；GAG：源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素， 钠盐，Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；钙源：(i)氢氧化钙 (Ca(OH)2)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；(ii)硝酸钙 (Ca(NO3)2·4H2O)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；磷源：正 磷酸(H3PO4)，BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)；交 联剂：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(＝EDAC)， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；N-羟基琥珀酰亚胺(＝NHS) Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)。
程序
步骤0：制备浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟，将3.8644g胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1383摩尔/ 升的H3PO4中，以产生高粘性的胶原蛋白分散体。平行地，在室温下使 得0.3436g6-硫酸软骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩尔/升H3PO4 中，通过周期性振摇分散溶解的GAG，以便生产GAG溶液。90分钟 后，在15,000rpm的连续均质下，以大约0.5mL/分钟的速率将14.3mL 所述GAG溶液加入到混合的胶原蛋白分散体中，然后另外混合得到的 高粘性胶原蛋白/GAG分散体90分钟。混合90分钟之后，在30分钟时 间和15000rpm的恒定混合下，将1.804g Ca(OH)2和0.780g Ca(NO3)2·4H2O加入所述高粘性胶原蛋白/GAG分散体中，生成pH约 4.0的胶原蛋白/GAG/CaP浆。使得所述胶原蛋白/GAG/CaP浆在搅拌板 上在25℃下保持48小时混合，然后在4℃下放置12小时。然后冷却的 浆在25Pa的压力下在真空烧瓶中脱气25小时。
步骤1：浇铸
使用自动吸移管管理器将15mL未矿化的胶原蛋白/GAG/CaP浆 浇铸到长50mm、宽30mm和深10mm的聚砜模具中。使用手动吸移 管管理器从所述浆中除去所有的大气泡。
步骤II：相互扩散
由于实施例I的支架只包括一层，所以相互扩散的步骤是不必要 的。
步骤III：控制冷却
将所述模具和浆放入VirTis Genesis冷冻干燥器(配有温控的不 锈钢架)中，并且所述冷冻干燥器的架温以约2.4℃每分钟的速率从4 ℃降低至-20℃。
步骤IV：退火
所述冷冻干燥器的架温保持在-20℃下10小时。
步骤V：升华
当仍处于-20℃的架温时，将低于25Pa的真空(约200毫托)施 加到容纳所述模具和(目前冻结的)浆的室中。然后将所述室的温度升 至37℃，并且允许升华持续36小时。然后除去所述真空，温度恢复至 室温，留下胶原蛋白/GAG/CaP的单层支架，尺寸为50mm×30mm× 10mm。
步骤V+I：交联
支架在40mL去离子水中水合20分钟。将20mL的0.035摩尔/ 升EDAC和0.014摩尔/升NHS的溶液加入到容纳所述支架和去离子 水的容器中，允许所述支架在室温和轻度搅拌下交联2小时。除去所述 EDAC溶液，用磷酸缓冲溶液(PBS)漂洗支架，然后使得在37℃和中 度搅拌下在新鲜的PBS中培养2小时。在PBS中两个小时后，通过使 得在37℃和中度搅拌下在去离子水中培养两个10分钟间隔来漂洗所述 支架。然后通过以大约2.4℃每分钟的速率从室温控制冷却至-20℃冷冻 干燥所述支架，来除去任何残余的水，随后在-20℃退火约5小时，然 后在37℃下低于25Pa升华，生成交联的胶原蛋白/GAG/CaP支架，尺 寸大致为50mm×30mm×10mm。
所得单层支架的X射线显微断层图像、扫描电镜图像、离子分布 图和压缩机械行为示于图3-10。图3显示了通过X射线显微断层照相 术看到的通过上述步骤生产的支架的9.5mm×9.5mm圆柱部分的外形。 值得注意的是整个支架中材料组成和孔隙率基本均匀的性质。相同支架 的连续横截面示于图4，再次说明了所述支架孔结构的均匀性；高度的 孔互联性、等轴孔形态和大的(平均直径500微米)大孔尺寸在图4中 也很明显。在图5中，SEM显微照片再次显示了大孔的形态，同时也 显示了有限的微孔的存在，其可在某些大孔的壁内看见。所述支架壁区 域的高(4000×)放大率二次(即外形敏感的)和反向散射的(即组成 敏感的)电子图像(图6)表明所述支架壁的组成均匀性，尽管存在处 于尺寸约为1-2微米的突出瘤状体的形式有限的拓扑变化。图7中的钙 和磷图证实了整个支架中组成基本均匀的结论，其中两种元素均匀地分 布在整个支架中。图8显示了干燥状态下的单层支架，并图解说明它们 能够用普通的外科工具例如手术刀、剃刀和圆锯刀片(在角膜移植中使 用的环形切割工具)切成任何期望的形状，而不会破碎、裂开或失去完 整性；图8也图解说明了干的单层支架在镇静钢珠负载重力下的承载力。 在图9中显示了在干燥状态下的单层支架的行为。这种行为显示了典型 的多孔质固体变形的三个阶段，其具有弹性模量762+/-188kPa和压缩 屈服应力85.2+/-11.7kPa。重要的是注意到所述干支架的屈服强度使得 它们承受有力的拇指压力(例如在插入缺陷部位时)，其在施加强有力 的拇指压力(例如外科医生改变植入物的形状)时仍不会形成永久性的 变形。在图10中显示了在水合状态下的单层支架的压缩变形。和干燥 状态下一样，水合的矿化胶原蛋白/GAG支架在压缩负荷下显示出三个 阶段的机械行为，但是其弹性模量(4.12+/-0.76kPa)和屈服应力 (0.29+/-0.11kPa)比相应的干支架性能低大约一个数量级。此外，在 塌陷平台区观察到了的压缩应力释放之后粘弹性形变恢复的证据。
实施例II：双层矿化-未矿化支架
材料
胶原蛋白(用于矿化的浆)：从牛腱获得的I型微原纤维胶原蛋白， Integra Life Sciences Plainsboro，NJ，USA；
GAG(用于矿化的浆)：从鲨鱼软骨获得的6-硫酸软骨素，钠盐， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)。
II型胶原蛋白
+GAG(用于未矿化的浆)：从猪的软骨中溶解的II型胶原蛋白和 GAG(胶原蛋白/GAG)浆，Gelstlich Biomaterials(Wolhusen， Switzerland)。
钙源：(i)氢氧化钙(Ca(OH)2)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；(ii)硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；磷源：正磷酸(H3PO4)，BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)；交联剂：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(＝EDAC)， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；N-羟基琥珀酰亚胺(＝NHS) Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)
步骤0：制备浆
制备矿化的浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟，将3.8644g的胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1383摩 尔/升的H3PO4中，以产生高粘性胶原蛋白分散体。平行地，在室温下 将0.3436g6-硫酸软骨素(GAG)溶解在14.3mL的0.1383摩尔/升的 H3PO4中，通过周期性振摇分散溶解的GAG，以产生GAG溶液。90 分钟后，在15000rpm的持续均质下，以大约0.5mL/分钟的速率将14.3 mL的GAG溶液加入到混合的胶原蛋白分散体中，然后另外混合得到 的高粘性胶原蛋白/GAG分散体90分钟。混合90分钟之后，在30分钟 时间和15000rpm的恒定混合下，将1.804g Ca(OH)2和0.780g Ca(NO3)2·4H2O加入高粘性胶原蛋白/GAG分散体中，生成pH约为4.0 的胶原蛋白/GAG/CaP浆。冷却的浆在25Pa压力下在真空瓶中脱气25 小时，使用均质器再混合30分钟，然后再次脱气48小时。
制备未矿化的浆
从冰箱中取出II型胶原蛋白/GAG浆并允许恢复到室温。
步骤I：浇铸
将2.5mL未矿化的II型胶原蛋白/GAG浆放入组合聚砜模具的底 部，所述底部长50mm，宽30mm，深2mm。用剃刀将所述浆平整为 平坦的表面。将也由聚砜制成的长50mm宽30mm深6mm的上部环 固定到容纳所述平整的未矿化浆的模具底部。将9mL矿化的胶原蛋白 /GAG/CaP浆以均匀分布的方式置于所述平整的未矿化层上和之前空的 的上部环内。利用手动吸移管管理器从所述浆中除去所有大的气泡。
步骤II：相互扩散
在放入冷冻干燥器之前，使得所述分层的浆保持在室温和室压下 共4个小时。
步骤III：控制冷却
将所述模具和分层的浆放入VirTis Genesis冷冻干燥器(配有温 控的不锈钢架)中，并且所述冷冻干燥器的架温以约-2.4℃每分钟的速 率从4℃降低至-40℃。
步骤IV：退火
所述冷冻干燥器的架温保持在-40℃下10小时。
步骤V：升华
仍处于-40℃的架温时，将低于25Pa的真空(约200毫托)施加 到容纳所述模具和(目前冻结的)分层浆的室中。然后所述室的温度升 至37℃，并且允许升华持续36小时。然后除去所述真空，温度恢复至 室温，留下胶原蛋白/GAG/CaP的双层支架，尺寸为50mm×30mm× 8mm，由2mm厚的未矿化层和6mm厚的矿化层构成。
步骤VI：交联
支架在32mL去离子水中水合20分钟。将18mL的0.035摩尔/ 升EDAC和0.014摩尔/升NHS溶液加入到容纳所述支架和去离子水 的容器中，并且使得所述支架在室温和轻度搅拌下交联2小时。除去所 述EDAC溶液，然后用磷酸缓冲溶液(PBS)漂洗支架，然后允许在 37℃和中度搅拌下在新鲜的PBS中培养2小时。在PBS中两个小时后， 通过允许在37℃和中度搅拌下在去离子水中培养两个10分钟间隔来漂 洗所述支架。然后通过以大约-2.4℃每分钟的速率从室温控制冷却至-20 ℃来冷冻干燥所述支架，以除去任何残余的水，然后在-20℃退火5小 时，最终在低于25Pa和37℃下升华24小时，生成交联的分层的胶原 蛋白/GAG/CaP支架，尺寸约为50mm×30mm×8mm，由2mm厚的 未矿化层和6mm厚的矿化层组成。
所得双层支架的X射线显微断层图像、扫描电镜图像、和离子分 布图示于图11-17。图11显示了通过上述步骤生产的双层支架的9.5mm ×9.5mm圆柱部分的X射线显微断层图象。其不透明的下部区域显示 了矿化层，而更透明的上部区域代表未矿化层。可以看出，在孔隙率和 组成方面，两层都大致均匀。图12中的连续横截面显示所述矿化层中 的平均大孔尺寸为约400微米，而未矿化层中的那些在700微米的级别 上；矿化和未矿化层中的孔都显示出等轴形态。图13中的SEM图像显 示了未矿化层的俯视图，其说明几乎没有微孔隙率存在的证据，而图14 中显示的界面区的图像证实没有将所述矿化和未矿化层分开的任何大 空隙或其它间断。在图15中显示了双层支架在压缩负荷下的行为。在 施加压缩负荷后，柔性的未矿化层开始压缩，在不足以在矿化支架内引 起任何显著变形的应力下导致软骨区室的几乎完全的压缩。当负荷释放 后，所述未矿化的胶原蛋白/GAG层几乎立刻恢复至原来的形状(图 15d)。图16图解说明了双层支架在水合状态下的机械行为。一旦水合， 所述未矿化的胶原蛋白/GAG层在低幅负荷下可以被压缩(图16a-c)。 与干燥状态不同，所述水合的未矿化区室在第一次施加压缩负荷之后 (图16d)没有完全恢复其原始厚度，而是在所述矿化区室的横截面上 下垂。但是在初始压缩后，未矿化层在随后每次施加压缩负荷之后恢复 到其压缩厚度(图16d)。在图17中，通过模拟说明了双层支架的未矿 化层附着到包含关节连接处的骨和软骨界面的外科缺损的壁上的能力。 图17中的载波片与骨软骨缺损的壁相似，所述未矿化层附着到这个表 面的能力表明这些支架填充这些缺损到它们外围而不会在支架的未矿 化层和相邻的关节软骨之间留下空隙的能力。
实施例III：三层矿化-未矿化的矿化支架
材料
胶原蛋白(用于矿化的浆)：源于牛腱的I型微原纤维胶原蛋白， Integra Life Sciences(Plainsboro，NJ，USA)
GAG(用于矿化的浆)：源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素，钠盐， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)。
钙源：(i)氢氧化钙(Ca(OH)2)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；(ii)硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；磷源：正磷酸(H3PO4)，BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
胶原蛋白(用于未矿化的胶原蛋白-GAG浆)：从猪的真皮中溶解 的85％I型，15％III型胃蛋白酶Japan Meat Packers(Osaka，Japan)
GAG(用于未矿化的浆)：源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素，钠盐， Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)。
用于未矿化胶原蛋白和GAG的稀释剂：冰醋酸(CH3COOH)， Fischer Scientific(Loughborough，UK)；交联剂：去甲二氢愈创木酸 (NDGA)，Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；磷酸二氢钠 (NaH2PO4)，BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)；氯 化钠(NaCl)，Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)
步骤0：制备浆
制备矿化的浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟，将3.8644g的胶原蛋白分散在于冰浴中冷却的171.4mL的0.1383 摩尔/升的H3PO4中，以制备高粘性的胶原蛋白分散体。平行地，在室 温下将0.3436g6-硫酸软骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩尔/升 H3PO4中，通过周期性振摇分散溶解的GAG，以产生GAG溶液。90 分钟后，将14.3mL所述GAG溶液在15,000rpm的持续均质下以大约 0.5mL/分钟的速率加入混合的胶原蛋白分散体中，然后另外混合得到的 高粘性胶原蛋白/GAG分散体90分钟。混合90分钟之后，在30分钟时 间和15000rpm的恒定混合下，将1.804g Ca(OH)2和0.780g Ca(NO3)2·4H2O加入所述高粘性胶原蛋白/GAG分散体中，生成pH约 4.0的胶原蛋白/GAG/CaP浆。然后冷却的浆在25Pa的压力下在真空烧 瓶中脱气25小时，使用均质器再次混合30分钟，然后再次脱气48小 时。
制备未矿化的浆
通过使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm下混合90分 钟，将1.9322g I/III型胶原蛋白分散在于冰浴中冷却的171.4mL的0.05 摩尔/升的醋酸中，以制备高粘性胶原蛋白分散体。平行地，在室温下 将0.1718g6-硫酸软骨素(GAG)溶解到28.6mL的0.05摩尔/升醋酸中， 通过周期性振摇分散溶解的GAG，以生成GAG溶液。90分钟后，在 15,000rpm的持续均质下以大约0.5mL/分钟的速率，将所述14.3mL GAG溶液加入混合的胶原蛋白分散体中，并另外混合得到的高粘性胶 原蛋白/GAG分散体90分钟。
步骤I：浇铸
将3.5mL矿化的胶原蛋白/GAG/CaP浆置于组合聚砜模具的底 部，所述底部长50mm，宽30mm，深3mm。所述浆用剃刀平整为平 面。一个也由聚砜制成的长50mm宽30mm深5mm的中间环连接到 容纳所述平整的矿化浆的模具底部。将7.5 mL未矿化的胶原蛋白/GAG 浆以均匀分布的方式置于所述平整的未矿化层上并在之前空的中间环 内。将一个也由聚砜制成的长50mm宽30mm深3mm的上部环连接 到所述平整的未矿化浆之上的模具的中间部分。将3.5mL矿化的胶原 蛋白/GAG/CaP浆以均匀分布的方式置于所述平整的未矿化层上并在之 前空的上部环内。利用手动吸移管管理器从所述浆中除去所有大的气 泡。
步骤II：相互扩散
在放入冷冻干燥器之前，允许所述三层浆保持在室温和室压下20 分钟。
步骤III：控制冷却
将所述模具和三层浆置于VirTis AdVantage冷冻干燥器(配有温 控的不锈钢架)中，并且所述冷冻干燥器的架温以约-2.4℃每分钟的速 率从4℃降低至-40℃。
步骤IV：退火
保持所述冷冻干燥器的架温在-40℃下10小时。
步骤V：升华
当仍处于-40℃的架温时，将低于25Pa的真空(约200毫托)施 加到容纳所述模具和(目前冻结的)三层浆的室中。然后所述室的温度 升至37℃，并且允许升华持续36小时。然后除去所述真空，温度恢复 至室温，留下尺寸为50mm×30mm×11mm的三层支架，由5mm厚的 未矿化中间层和环绕它的两个3mm厚的矿化层组成。
步骤VI：交联
将三层支架在0.1摩尔/升NaH2PO4和0.15摩尔/升NaCl的磷酸 盐缓冲液(PBS；pH7.0)中水合30分钟。将NDGA悬浮在1N NaOH 中，并加入到PBS中生成3mg/mL的NGDA在PBS中的溶液；然后在 搅拌下在该溶液中水合支架24小时。从NGDA-PBS溶液移走所述三层 支架，并用去离子水冲洗。然后通过以大约2.4℃每分钟的速率从室温 控制冷却至-20℃冷冻干燥所述支架，以除去任何残余的水，然后在-20 ℃退火5小时，并最终在37℃下在低于25Pa下升华24小时，得到干 燥交联的支架。然后在浓度为0.1mg/mL的NDGA中进行随后的处理。 然后在70％乙醇中清洗支架6小时，随后在室温在PBS中清洗24小时。 然后通过以大约2.4℃每分钟的速率从室温控制冷却至-20℃来冷冻干燥 所述支架第二时间，以除去任何残余的水，然后在-20℃退火5小时， 并最终在37℃下在低于25Pa下升华24小时。
下列表中的参数可以单独地或以组合应用到本发明的任意方面， 除非另有说明。
表1：浇铸的优选参数
表2：相互扩散的优选参数
表3：控制冷却的优选参数
表4：退火的优选参数
表5：升华的优选参数
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本发明在很多领域找到了应用，以举例的方式提供下列应用。
关节软骨修复产品：双层支架
双层支架具有提高现有的将源自骨髓的干细胞补充至关节软骨创 伤部位的首要外科手术疗效的潜力。例如，作为干燥的2cm×2cm×1cm 的干燥、真空包装、γ灭菌的类似于聚苯乙烯泡沫的块状物递送，这些 支架可以利用手术刀或其它工具切割，简单地用拇指或钝器压力轻易地 插入缺损处，并且直接结合到所述部位，而不用缝合或胶粘。
髌韧带供体部位的修复产品：三层支架
三层支架具有在前十字韧带(ACL)重建期间增强髌韧带(髌骨 腱)再生的潜力，减轻前膝痛并降低髌韧带断裂和膝盖骨折的风险。
腱修复产品：双层支架
具有扩大的未矿化成分的双层支架具有提高肌腱套(rotator-cuff) 手术期间腱修复疗效和解决现在尚无有效解决方案的小腱应用的潜力。
还在大型家畜的基础上研究了本发明，总结如下。
试验1：绵羊骨缺损模型
本发明使之可以生产分层的组织再生支架，其一侧的结构和组成 模拟骨，另一侧上为未矿化组织(例如软骨、韧带、腱)，在其间具有 平滑稳定的界面。此外，本发明还提供了系统地改变这种植入物的骨区 室矿物相的化学组成的能力。
动物：骨骼成熟的Texcel陆地绵羊(雌性)。
缺损：外侧股骨髁上的直径9mm、深9mm的松质骨缺损
植入时间：6周
实验组：每个实验组的6个植入物被以相同的植入类型对侧地植 入同一动物的每一侧。
对照组：
正对照：用从胫骨粗隆收获的多孔自体移植物填充四个部位。
负对照：用包含完全不含矿物相(即只含有ChondroMimetic骨 质侧的有机成分)的植入物的对照植入物填充四个部位。
研究目的：鉴别化学组成不同的四个实验植入组的性能差别，并 将这些植入组中最期望的组确定为ChondroMimetic骨区室的最终组 成。
重大发现：三个实验组都没有引发任何种类的不良免疫响应；所 有三个实验组和未矿化的负对照组通过细胞介导的直接取代机理支持 骨的内生长；三个实验组之间没有观察到显著的统计上的差别；并且在 全部三个实验组中观察到的骨形成比负对照组中的骨形成高出显著的 统计水平。
植入物设计的应用：该项研究所涉及的直接取代机理表明：与在 传统的骨移植替代物中观察到的典型的外加机理相比，所述骨形成的机 理更接近于在胎儿和新生动物(包括人)的生长面上出现的模板骨形成。 在未矿化的对照组中存在的这种取代机理表明：所述植入物的有机组分 赋予了这种特性。
所述植入物的孔径大小应该通过降低植入物的骨区室的平均孔径 来改变，以解释这种取代机理。
所述三个实验组的骨形成行为没有显著的统计差异表明：处理参 数可以用来识别最适合的植入物的矿物组成。
试验2：公山羊的骨软骨缺损模型
该项研究的目的在于评估作为增强骨髓刺激术(软骨下钻孔)效 果的方法的ChondroMimetic的性能。
动物：骨骼成熟的西班牙山羊(雌性)。
缺损：直径4mm、深6mm的骨软骨缺损(1个在滑车沟内；1 个在外侧髁上)。
植入时间：16周
实验组：ChondroMimetic工作原型的6个植入物。
对照组：模拟传统的软骨下钻孔(即不含植入物)的6个缺损。
研究目的：评估ChondroMimetic作为骨髓刺激辅助物的性能。
发现：外科医生关于ChondroMimetic的处理性能的反馈无一例 外地是压倒性的正面的。
附录1
2004年10月28日提交的PCT/GB04/004550的说明书文本
本发明涉及用于生物医学应用的人工骨、牙科材料和再生支架领 域，尤其涉及包含胶原蛋白、磷酸钙材料和一种或多种糖胺聚糖的人工 骨、牙科材料和再生支架及其前体。
天然骨是胶原蛋白、包括糖胺聚糖的非胶原蛋白有机相和磷酸钙 的生物复合材料。其复杂的分层结构产生了出色的机械性能，包括高的 刚性、强度和破裂韧性，从而使骨能够承受日常经受的生理应力。本领 域的研究人员面临的挑战是：制造组成和结构允许天然骨可以在人体或 动物体中在合成材料里面和周围生长的合成材料。
已经发现，骨通过人体环境中形成的骨状磷灰石层直接连接到人 体内的磷酸钙(称为生物活性的性能)。另一方面，已知胶原蛋白和包含 胶原蛋白和例如糖胺聚糖的其它生物有机物质的共聚物是多种细胞类 型附着和增殖的最佳基质，所述细胞类型包括在人体中负责骨的生成和 维持的那些细胞。
羟磷灰石是最通常用作骨替代材料的成分的磷酸钙。但是，与例 如透钙磷石、磷酸三钙和磷酸八钙等其它形式的磷酸钙材料相比，羟磷 灰石是相对不可溶的材料。由于该材料在人体中的再吸收速率特别低， 所以当制备生物材料时，磷灰石相对低的溶解度是不利的。
例如羟磷灰石的磷酸钙是机械上的刚性材料。但是，和天然骨相 比，它们是相对脆性的。胶原蛋白是机械上的韧性材料，但是与天然骨 相比具有相对较低的刚性。包含胶原蛋白和糖胺聚糖的共聚物的材料比 单独的胶原蛋白具有更高的韧性和刚性，但是，与天然骨相比，仍然具 有较低的刚性。
之前制备机械韧性高于羟磷灰石且硬度超过胶原蛋白及胶原蛋白 与糖胺聚糖共聚物的人工骨替代材料的尝试包括通过机械混合结合胶 原蛋白和磷灰石。这种机械方法记载于EP-A-0164 484中。
该技术最新的进展包括，通过机械混合羟磷灰石、胶原蛋白和4- 硫酸软骨素来制备包含这些组分的骨替代材料。该技术描述在 EP-A-0214070中。该文献还描述了4-硫酸软骨素与胶原蛋白的脱水热 交联。已经发现，包含磷灰石、胶原蛋白和4-硫酸软骨素的材料具有良 好的生物相容性。将磷灰石与胶原蛋白和任选的4-硫酸软骨素机械混 合，基本上形成胶原蛋白/4-硫酸软骨素包覆的磷灰石颗粒。已经发现， 尽管该材料是生物相容性的，但是在人体或动物体内产生有限的天然骨 内生长，而且不能重建合成材料的磷酸钙相。
本发明旨在解决至少一些与现有技术相关的问题。
第一方面，本发明提供一种制备包含胶原蛋白、透钙磷石和一种 或多种糖胺聚糖的复合材料的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含胶原蛋白、钙源和磷源以及一种或多种糖胺聚糖的酸性 水溶液；和
从该水溶液中一起沉淀胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚 糖以形成三元共沉淀物。
术语三元共沉淀物包含三种化合物的沉淀，其中，基本上同时从 相同的溶液/分散体中沉淀所述化合物。这应与机械混合这些组分形成 的材料不同，特别是与例如在不同溶液中单独沉淀出的这些组分不同。 共沉淀物的微结构明显不同于机械混合其组分形成的材料。
在第一方面中，所述溶液优选具有2.5～6.5的pH，更优选2.5～ 5.5。更优选地，所述溶液具有3.0～4.5的pH。进而更优选地，所述溶 液具有3.8～4.2的pH。最优选地，所述溶液具有约为4的pH。
所述钙源优选选自硝酸钙、醋酸钙、氯化钙、碳酸钙、钙醇盐、 氢氧化钙、硅酸钙、硫酸钙、葡萄糖酸钙和肝素的钙盐中的一种或多种。
肝素的钙盐可以得自猪的肠粘膜。合适的钙盐可自Sigma-Aldrich Inc.商业得到。
所述磷源优选选自磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸、二水合正磷 酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O，有时称为GPR Sorensen盐)和磷酸三甲酯、 磷酸的碱金属(例如Na或K)盐、磷酸的碱土金属(例如Mg或Ca)盐中 的一种或多种。
糖胺聚糖是含有长的无支链多糖的大分子族，所述多糖含有重复 的二糖单元。优选地，所述一种或多种糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸 皮肤素、肝素、硫酸肝素、硫酸角质素和透明质酸。硫酸软骨素可以是 4-硫酸软骨素或6-硫酸软骨素，它们都可以从Sigma-Aldrich Inc.商业 得到。6-硫酸软骨素可以得自鲨鱼软骨。透明质酸可以源于人的脐带， 肝素可以源于猪的肠粘膜。
优选地，在三元共沉淀物的沉淀中，所述溶液具有4.0～50℃的温 度。更优选地，所述溶液具有15～40℃的温度。所述溶液可以在室温， 即20～30℃，优选20～27℃的温度。最优选地，该温度为约25℃。
所述水溶液中钙离子的浓度通常为0.00025～1摩尔/升，优选 0.001～1摩尔/升。当所述方法还包括另外的过滤和/或低温干燥的步骤 时，所述水溶液中的钙离子浓度更优选为0.05～0.5摩尔/升(例如0.08～ 0.25摩尔/升)，最优选0.1～0.5摩尔/升。当所述方法还包括另外的冷冻 干燥和任选的注塑成型的步骤时，所述水溶液中的钙离子浓度更优选为 0.01～0.3摩尔/升，最优选0.05～0.18摩尔/升。
优选地，所述溶液包含磷酸根离子，溶液中磷酸根离子的浓度通 常为0.00025～1摩尔/升，优选0.001～1摩尔/升。当所述方法还包括另 外的过滤和/或低温干燥的步骤时，溶液中磷酸根离子的浓度更优选为 0.05～0.5摩尔/升，进而更优选0.1～0.5摩尔/升，例如0.1～0.35摩尔/ 升。当所述方法还包括另外的冷冻干燥和任选的注塑成型的步骤时，溶 液中磷酸根离子的浓度更优选为0.01～0.3摩尔/升，进而更优选0.05～ 0.18摩尔/升。
优选地，在沉淀之前，溶液中胶原蛋白与一种或多种糖胺聚糖的 总量的重量比为8∶1～30∶1。更优选地，胶原蛋白与一种或多种糖胺聚 糖总量的重量比为10∶1～12∶1，最优选该比例为11∶1～23∶2。
优选地，三元共沉淀物中胶原蛋白与透钙磷石的重量比为10∶1～ 1∶100，更优选5∶1～1∶20，进而更优选3∶2～1∶10，最优选3∶2～1∶4。
在沉淀之前，所述溶液中胶原蛋白的浓度通常为1～20g/L，更优 选1～10g/L。当所述方法还包括过滤和/或低温干燥的步骤时，所述溶 液中胶原蛋白的浓度更优选为1～10g/L，进而更优选1.5～2.5g/L，最 优选1.5～2.0g/L。当所述方法包括冷冻干燥和任选的注塑成型时，在 沉淀之前，所述溶液中胶原蛋白的浓度优选为5～20g/L，更优选5～12 g/L，最优选9～10.5g/L。
在沉淀之前，所述溶液中一种或多种糖胺聚糖的总浓度通常为 0.01～1.5g/L，更优选0.01～1g/L。当所述方法还包括另外的过滤和/ 或低温干燥的步骤时，所述溶液中一种或多种糖胺聚糖的总浓度更优选 为0.03～1.25g/L，进而更优选0.125～0.25g/L，最优选0.13～0.182g/L。
当所述方法还包括另外的冷冻干燥和任选的注塑成型的步骤时， 所述溶液中一种或多种糖胺聚糖的总浓度更优选为0.15～1.5g/L，进而 更优选0.41～1.2g/L，最优选0.78～0.96g/L。
优选所述溶液包含钙离子，胶原蛋白与钙离子的重量比通常为 1∶40～500∶1。当所述方法还包括另外的过滤和/或低温干燥的步骤时， 胶原蛋白与钙离子的比更优选为1∶40～250∶1，进而更优选1∶13～5∶4， 最优选1∶13～1∶2。当所述方法还包括另外的冷冻干燥和任选的注塑成 型的步骤时，胶原蛋白与钙离子的比更优选为1∶8～500∶1，进而更优选 5∶12～30∶1，最优选5∶5～5∶1。
沉淀可以通过以下方法实现：在酸性水溶液中混合胶原蛋白、钙 源、磷源和一种或多种糖胺聚糖；或使溶液静止直到沉淀发生，搅拌溶 液，使用例如氨的碱性滴定剂滴定，加入例如预制透钙磷石的成核剂； 改变钙源的加入速率；和这些方法的任意组合。
在第二方面，本发明提供一种制备包含胶原蛋白、磷酸八钙和一 种或多种糖胺聚糖的复合生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的复合材料， 和
通过水解将复合材料中的至少一部分透钙磷石转化为磷酸八钙。
术语生物材料包含与人体或动物体可生物相容的材料。
在第二方面中，所述复合材料优选包含或基本上由以下物质组成： 含有胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述 三元共沉淀物可以利用这里所述的与本发明第一方面有关的方法形成。
优选地，透钙磷石水解为磷酸八钙的步骤包括：使所述三元共沉 淀物与水溶液接触，所述水溶液的pH等于或大于磷酸八钙比透钙磷石 在热力学上更稳定的pH。优选地，该水溶液具有6～8的pH。更优选 地，该水溶液具有6.3～7的pH。最优选地，该水溶液具有约6.65的 pH。所述水溶液可以包括，例如用滴定剂、缓冲液、用另一种含钙化 合物和/或含磷化合物所饱和的溶液控制pH的去离子水。优选的水溶液 包含使用氨滴定到所需pH的醋酸。
优选地，透钙磷石水解为磷酸八钙的步骤在20～50℃的温度下进 行，更优选30～40℃，进而更优选36～38℃，最优选约37℃。
优选地，透钙磷石水解为磷酸八钙的步骤进行12～144小时，更 优选18～72小时，最优选24～48小时。
在第三方面，本发明提供一种制备包含胶原蛋白、磷灰石和一种 或多种糖胺聚糖的复合生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的复合材料， 和
通过水解将复合材料中的至少一些透钙磷石转化为磷灰石。
磷灰石是一类包含钙和磷酸根的矿物质，它具有通式： Ca5(PO4)3(X)，其中X可以是离子，通常为OH-、F-和C1-以及本领域 技术人员熟知的其它离子。磷灰石也包括取代的磷灰石，例如硅取代的 磷灰石。磷灰石包括羟磷灰石，羟磷灰石是磷灰石的具体例子。羟磷灰 石也可以用硅取代。
在第三方面中，复合材料优选包含或基本由以下物质组成：包含 胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元 共沉淀物可以按照这里所述的与本发明第一方面有关的方法形成。
优选地，透钙磷石水解为磷灰石的步骤包括：使所述三元共沉淀 物与水溶液接触，所述水溶液的pH等于或大于磷灰石比透钙磷石热力 学上更稳定的pH。优选地，为了将透钙磷石转化为磷灰石，该水溶液 具有6.65～9，更优选7～8.5，进而更优选7.2～8.5的pH。所述水溶液 可以包括，例如用滴定剂、缓冲液、用另一种含钙化合物和/或含磷化 合物饱和的溶液控制pH的去离子水。
优选地，透钙磷石水解为磷灰石的步骤在20～50℃的温度下进 行，更优选30～40℃，进而更优选36～38℃，最优选约37℃。
优选地，透钙磷石水解为磷灰石的步骤进行12～288小时，更优 选18～72小时，最优选24～48小时的时间。
提高透钙磷石向磷酸八钙和/或磷灰石转化速率的方法包括提高(i) 温度、(ii)溶液中透钙磷石的浓度、和或(iii)搅拌速度。
需制备同时包含磷灰石和磷酸八钙的根据本发明的生物材料。可 以结合本发明第二和第三方面的方法，以制备同时包含磷酸八钙和磷灰 石的材料。三元共沉淀物中的透钙磷石可以先转化为磷酸八钙，然后磷 酸八钙可以部分地转化为磷灰石。通常在8.0或8.0以上的pH下水解 约12小时，透钙磷石或磷酸八钙全部或接近全部(即至少98％)转化为 磷灰石。因此，可以通过水解小于12小时的时间来实现材料中透钙磷 石和/或磷灰石的部分转化。
优选地，磷酸八钙水解为磷灰石的步骤在6.65～10，更优选7.2～ 10，进而更优选8～9的pH下进行。
优选地，磷酸八钙水解为磷灰石的步骤在20～50℃的温度下进 行，更优选30～40℃，进而更优选36～38℃，最优选约37℃。
优选地，磷酸八钙水解为磷灰石的步骤进行2～144小时的时间， 更优选12～96小时，最优选24～72小时。
在本发明的第二和第三方面中，透钙磷石向磷酸八钙和/或磷灰石 的转化优选在30～40℃的温度下进行。更优选地，该转化在36～38℃ 的温度下进行。最优选地，该转化在约37℃的温度下进行。
优选地，本发明的方法还包括交联三元共沉淀物中的一种或多种 糖胺聚糖和胶原蛋白的步骤。关于三元共沉淀物，它包括包含胶原蛋白、 透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的三元共沉淀物和该共沉淀物的衍生 物。该衍生物包括其中至少一部分透钙磷石已转化为磷酸八钙和/或磷 灰石的共沉淀物，和已经成形或模制、或进行了任何另外的化学或机械 处理的共沉淀物。可以使用任何常规技术实现交联。
优选地，至少一些透钙磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石，在透钙 磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石之前使糖胺聚糖与胶原蛋白交联。该 交联可以通过下列方法实现：对三元共沉淀物进行γ射线辐照，紫外线 辐照，脱水热处理，用例如葡萄糖、甘露糖、核糖和蔗糖的简单糖进行 非酶糖化的一种或多种，使该三元共沉淀物与戊二醛、乙基二甲氨基丙 基碳二亚胺和/或去甲二氢愈创木酸中的一种或多种接触，或这些方法 的任意组合。在本领域中这些都是常规方法。
优选地，如果至少一些透钙磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石，则 在透钙磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石之后使糖胺聚糖和胶原蛋白交 联。透钙磷石转化为磷灰石和/或磷酸八钙之后的交联可以通过上述的 一种或多种方法，或通过脱水热处理，或这些方法的任意组合来实现。 脱水热处理包括使基材在升高的温度下经历低压环境。脱水热处理的温 度可以为95℃～135℃。如果需要使脱水热处理通常在18～36小时完 成，则该温度可优选为100℃～110℃，最优选105℃～110℃。如果需 要使脱水热处理通常在4～8小时完成，则该温度可优选为120℃～135 ℃，最优选125℃～135℃。
优选地，在透钙磷石转化为磷酸八钙和/或磷灰石之前和之后都使 胶原蛋白和糖胺聚糖交联。
本发明的方法可以包括以下步骤：使复合生物材料成形为适合用 作骨或牙科替代物的结构。可以在形成三元共沉淀物之后，但是在可能 发生透钙磷石的任何转化或胶原蛋白与糖胺聚糖交联发生之前进行该 步骤。
可替代地，可以在透钙磷石转化为磷灰石和/或磷酸八钙或胶原蛋 白与糖胺聚糖的交联之后，进行生物材料的成形步骤。
优选地，使用选自以下的技术使复合材料成形：(i)过滤和/或低温 干燥，(ii)冷冻干燥，(iii)注塑成型和(iv)冷压。温度为15℃～40℃，最 优选35℃～40℃的过滤和/或低温干燥通常产生致密颗粒形式的材料。 冷冻干燥通常产生开放的多孔形式。根据所用模头(dye)的形状，注 塑成型可以产生多种形状/形态的材料。冷压通常产生致密的丸状形式。
本发明还提供适合转化为合成生物材料的前体材料，所述前体材 料包含复合材料，所述复合材料包含胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种 糖胺聚糖。优选地，所述复合材料包含或基本上由以下物质组成：包含 胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元 共沉淀物可以通过根据本发明第一方面的方法制备。
本发明还提供包含胶原蛋白、透钙磷石和一种或多种糖胺聚糖的 复合生物材料，该生物材料可以通过这里描述的本发明的方法得到。
本发明还提供包含胶原蛋白、磷酸八钙和一种或多种糖胺聚糖的 复合生物材料，该生物材料可以通过根据本发明第二方面的方法得到。
本发明还提供包含胶原蛋白、磷灰石和一种或多种糖胺聚糖的复 合生物材料，该生物材料可以通过根据本发明第三方面的方法得到。
本发明还提供包含胶原蛋白、糖胺聚糖和透钙磷石的三元共沉淀 物的复合生物材料。
本发明还提供包含一种和多种磷酸钙材料的颗粒、胶原蛋白和一 种或多种糖胺聚糖的生物材料，其中所述胶原蛋白和所述一种或多种糖 胺聚糖交联并形成基质，所述磷酸钙材料的颗粒分散在所述基质中，所 述磷酸钙材料选自透钙磷石、磷酸八钙和/或磷灰石中的一种或多种。
如果没有其它说明，下面的描述与根据本发明的复合生物材料的 所有方面都相关。
优选使胶原蛋白和一种或多种糖胺聚糖交联。
胶原蛋白优选以5(干)重量％～90(干)重量％的量存在于所述材料 中，更优选15(干)重量％～60(干)重量％，更优选20(干)重量％～40(干) 重量％。
优选地，一种或多种糖胺聚糖以0.01(干)重量％～12(干)重量％的 量存在于所述材料中，更优选1(干)重量％～5.5(干)重量％，最优选 1.8(干)重量％～2.3(干)重量％。
优选地，如果所述材料包含透钙磷石，则胶原蛋白与透钙磷石的 重量(干)比为10∶1～1∶100，更优选重量(干)比为5∶1～1∶20，最优选重量 (干)比为3∶2～1∶10，例如重量(干)比为3∶2～1∶4。
优选地，如果所述材料包含磷酸八钙，则胶原蛋白与磷酸八钙的 重量(干)比为10∶1～1∶100，更优选重量(干)比为5∶1～1∶20，最优选重量 (干)比为3∶2～1∶10。
优选地，胶原蛋白与一种或多种糖胺聚糖的总量的重量(干)比为 8∶1～30∶1，更优选重量(干)比为10∶1～30∶1，进而更优选重量(干)比为 10∶1～12∶1，最优选重量(干)比为11∶1～23∶2。
本发明的复合生物材料可以用作骨或牙科的替代材料。
本发明还提供了包含本发明的复合生物材料的人工骨材料、骨植 入物、骨移植物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固剂。术语涂 料包括任何包含本发明的生物材料或前体的涂料。涂料可以施用于修复 件、骨或任何欲用在人体或动物体中的基材的外表面或内表面上，该涂 料中包含颗粒材料。本发明的组合物可以用于矿化生物材料的体内和体 外修复，包括但不局限于骨和牙科材料。本发明的生物材料可以用于同 种异体移植物和自身移植物的生长。
根据本发明的包含磷酸八钙的生物材料可以不含或基本不合任意 前体透钙磷石相。在该生物材料的磷酸钙材料的总量中，该生物材料可 以包含小于2重量％的透钙磷石。
磷酸钙材料可以包含或基本上由相纯的磷酸八钙或磷灰石组成。 相纯是指优选含有至少98％，更优选至少99％和最优选至少99.5％的 所需相(用X射线衍射测定)。可代替地，根据生物材料的所需性能，该 生物材料可以包含磷酸八钙和磷灰石的混合物。
本发明的包含透钙磷石的材料可以用作制备生物材料的前体材 料，或本身适合用作生物材料。
本发明的方法可以使用遵从下列顺序的方法来进行，其可以整体 地或部分地应用来制备胶原蛋白、一种或多种糖胺聚糖和一种或多种磷 酸钙组分的生物复合物。下列说明是以举例的方式提供，可适用于本发 明方法的任何方面。
I：在酸性pH下的胶原蛋白、GAG和磷酸钙透钙磷石的三元共沉 淀
进行该步骤，以通过溶液沉淀同时形成复合物的三种(或三种以上) 组分，和控制三种(或三种以上)各个相的比例。通过改变pH、温度、老 化时间、钙离子浓度、磷离子浓度、胶原蛋白浓度和GAG浓度中的一 个或多种来实现对复合物的组成性能(尤其是胶原蛋白：GAG∶CaP的比) 的控制。pH可以保持恒定(例如使用缓冲液、恒pH滴定或其它方法) 或使其变化。可能的次级(污染物)相包括其它酸性磷酸钙(例如三斜磷钙 石、磷酸氢钙)和包括滴定的副产物和加入反应物的混合物(例如磷酸铵、 硝酸铵)。在该步骤中也可以加入辅助交联(例如葡萄糖、核糖)或增加体 内响应(例如生长因子、基因转录因子、硅、促尿钠排泄肽)的添加剂。
II：净形状的形成
进行该步骤以制备最终复合物形式的所需结构，特别强调对孔结 构的控制。该技术的例子包括过滤和低温干燥(产生致密颗粒形式)、冷 冻干燥(产生开放的多孔形式)、注塑成型(根据模头类型产生多种形状) 和冷压(产生致密的丸状形式)。
III：第一交联
可以进行该步骤以优选确保：当放在pH升高的溶液中时，复合物 的GAG含量不会迅速流失，而且提高复合物的机械和降解性能。该技 术的例子包括低温物理技术(例如γ射线辐照、紫外线辐照、脱水热处 理)、化学技术(例如用简单糖、戊二醛、乙基二甲氨基丙基碳二亚胺、 去甲二氢愈创木酸的非酶糖化)、或组合方法(例如同时的非酶糖化和γ 射线辐照)。在需要转化为磷酸八钙时(即步骤IV中)，有利地在低于约 37℃的温度下进行第一交联，以防止透钙磷石相转化为其脱水形式，三 斜磷钙石，三斜磷钙石是不易水解为磷酸八钙的磷酸钙。
IV：水解
可以进行该步骤，以便从透钙磷石将CaP相(在生理pH下具有高 溶解度的相)部分地或完全地水解为磷酸八钙和/或磷灰石(在生理pH下 具有较低溶解度的相)，并基本上除去任何可溶性污染相(例如硝酸铵、 磷酸氢钙)。在水解为OCP的情况中，将选定的pH有利地保持恒定在 约6.65(使用缓冲液、恒pH滴定或其它方法)，和在约37℃温度下约24～ 48小时。如步骤I的情况，在水解步骤(步骤IV)期间也可以加入辅助交 联(例如葡萄糖、核糖)或增加体内响应(例如生长因子、基因转录因子、 硅、促尿钠排泄肽)的添加剂。
V：第二交联
进行该步骤以进一步调整复合物的机械和降解性能。可以使用上 述步骤III中列出的任何或全部交联方法以实现第二交联。
提供下列实施例和附图以帮助进一步理解本发明。实施例和附图 不应认为限定本发明的范围。实施例或附图中描述的任何特征适用于以 上说明的任何方面。
实施例1
实施例1是上述合成方法的例子，仅仅进行步骤I～III。在室温 (20～25℃)和约3.2的pH(用氨滴定来维持)下进行三元共沉淀。在本实 施例中，共沉淀物在37℃下干燥，通过脱水热处理进行交联。在本实施 例中既不进行CaP的水解转化，也不进行第二交联。
材料
胶原蛋白：再生的提取了胃蛋白酶的猪皮胶原蛋白(端胶原 (atelocollagen))；85％I型，15％III型；Japan Meat Packers(Osaka， Japan)。
GAG：来自鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素；钠盐；Sigma-Aldrich Inc(St. Louis，MO，USA)
钙源：(i)氢氧化钙Ca(OH)2；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；(ii)硝酸钙；Ca(NO3)2·4H2O；Sigma-Aldrichlnc(St.Louis，MO， USA)；
磷源：正磷酸；H3PO4；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
滴定剂：氨；NH3；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
步骤
步骤I
溶液A：
-在室温下将Ca(OH)2溶解在0.48摩尔/升的H3PO4中至0.12摩尔 /升的浓度，使用氨将得到的溶液滴定至pH＝3.2。
悬浮液B：
-将6-硫酸软骨素溶解在去离子水中至3.2g/L的浓度。然后在恒 定搅拌下，以1.5的硝酸根：氢氧根的摩尔比将Ca(NO3)2·4H2O和 Ca(OH)2加到硫酸软骨素溶液中，以制备出总钙浓度为2.4摩尔/升的悬 浮液。
-将0.144g的胶原蛋白加到20ml的溶液A中，使用均质器混合 至溶解。然后在恒定搅拌下将4mL的悬浮液B加到溶液A中。
-继续搅拌60分钟，监测pH以确保pH维持在3.15＜pH＜3.30的 范围中。然后使得到的浆在室温下老化24小时。
步骤II
-使所述浆在37℃下在空气中干燥5天，用去离子水漂洗剩余的三 元共沉淀物，接着在37℃下再干燥24小时。
-所得到的三元共沉淀物的X射线衍射谱图示于图1(Cu-K(α)射线) 中，SEM照片示于图2中。
步骤III
通过在105℃和50毫托的真空下脱水热处理(DHT)48小时，使三 元共沉淀物交联。DHT后的三元共沉淀物的TEM照片示于图3中。图 4表示DHT后的三元共沉淀物的X射线衍射谱图，表明透钙磷石相转 化为其脱水形式三斜磷钙石。
实施例2
实施例2是上述合成方法的例子，仅仅进行步骤I～IV。在室温 和pH 4.0下进行三元共沉淀。在本实施例中，通过仔细控制氢氧化钙 和硝酸钙的浓度实现pH的控制，该方法也能控制三元共沉淀物中透钙 磷石与胶原蛋白+GAG的质量比。然后将得到的三元共沉淀物冷冻至-20 ℃，放置在真空下，然后加热使游离水(即冰)升华。使用1-乙基3-(3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺处理进行第一交联。然后通过在约37℃和6.67 的pH下水解将得到的干燥三元共沉淀物转化为磷酸八钙。在本实施例 中，不进行第二交联。
材料
I型：由牛腱溶解的酸，Integra Life Sciences Plainsboro，NJ，USA
GAG：源于鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素；钠盐；Sigma-Aldrich Inc (St.Louis，MO，USA)
钙源：(i)氢氧化钙Ca(OH)2；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；和(ii)硝酸钙；Ca(NO3)2·4H2O；Sigma-Aldrichlnc(St.Louis，MO， USA)；
磷源：正磷酸；H3PO4；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
滴定剂：无
交联剂：(i)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(＝EDAC)； Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；和(ii)N-羟基琥珀酰亚胺 (＝NHS)；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)
步骤
步骤I
-选择透钙磷石与胶原蛋白+糖胺聚糖的目标质量比为1∶1。
-在200mL的总反应体积中，胶原蛋白+GAG的浓度设定为21 mg/mL。
-使用pH变量的经验三维图(在1.0的恒定[Ca2+]与[P]反应物离子 比下制作)，改变：(i)离子浓度(即[Ca2+]＝[H3PO4])和(ii)硝酸钙：氢氧化 钙的比，确认pH恒定为4.0的点的轨迹。这示于图5中(离子浓度和硝 酸钙∶氢氧化钙比的组合设定，以维持pH＝4.0)。
-将该点的轨迹叠加在具有相同的坐标轴的透钙磷石质量产率的 图上，确认它与21mg/mL的等值线的交叉点，使得可以设定反应物浓 度，在该反应物浓度下，在pH为4.0([Ca2+]＝[H3PO4]＝0.1383摩尔/升； Ca(NO3)2·4H2O∶Ca(OH)2＝0.1356)时，可以制备含有质量比为1∶1的磷 酸钙(21mg/mL)与胶原蛋白+GAG(21mg/mL)的三元共沉淀物浆。见图 6：确定含有质量比为1∶1的磷酸钙与胶原蛋白+GAG的三元共沉淀物 浆的pH4.0下的合成条件。
-将3.8644g的胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1383 摩尔/升的H3PO4中，使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm 下混合90分钟，制备高粘性的胶原蛋白分散体。
-在室温下将0.3436 g6-硫酸软骨素溶解在14.3mL的0.1383摩尔 /升中，通过周期振荡分散溶解的GAG，制备GAG溶液。
-90分钟后，在15000rpm的连续均质下，将14.3mLGAG溶液 以约0.5mL/分钟的速率加到搅拌的胶原蛋白分散体中，所得到的高粘 性胶原蛋白/GAG分散体总共混合90分钟。
-在混合90分钟后，在15000rpm的恒定搅拌下，用30分钟时间 将1.804g的Ca(OH)2和0.780g的Ca(NO3)2·4H2O加到高粘性胶原蛋 白/GAG分散体中，制备胶原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物浆，此后向 浆中混入另外的14.3mL的0.1383摩尔/升的H3PO4。
-三元共沉淀物浆的pH约为4.0。
-使三元共沉淀物浆保持在25℃下48小时。
步骤II
-将三元共沉淀物浆置于-20℃的冷冻机中，并允许固化过夜。
-然后从冷冻机中取出冷冻的浆，置于约80毫托的真空中，使温 度升至室温，这样引起冰从浆中的升华，使其进行48小时。
-除去游离水后的胶原蛋白/GAG/透钙磷石三元共沉淀物的X射 线衍射谱图(Cu-K(α)射线)示于图7中，共沉淀物表面的SEM照片示在 图8中(CaP∶胶原蛋白+GAG＝1∶1的三元共沉淀物表面的二次电子(SE) 和反向散射电子(BSE)照片)。
步骤III
-在完全除去游离水之后，在40mL的去离子水中水合得到的1.25 g的干燥的三元共沉淀物20分钟。
-将20mL的0.035摩尔/升的EDAC和0.014摩尔/升的NHS的溶 液加到容纳三元共沉淀物和去离子水的容器中，在缓和搅拌和室温下使 三元共沉淀物交联2小时。
-除去EDAC溶液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三元共沉淀物，并 在温和搅拌下在新鲜的PBS中，在37℃下培养2小时。
-在PBS中2小时后，用去离子水漂洗三元共沉淀物，并在温和 搅拌下在37℃下培养两个10分钟的间隔。
-然后将三元共沉淀物在37℃下干燥72小时。图9表示EDAC交 联后的胶原蛋白/GAG/透钙磷石三元共沉淀物的X射线衍射谱图 (Cu-K(α)射线)。
步骤IV
-将交联的三元共沉淀物颗粒放在50mL 37℃的去离子水中，使用 氨将溶液的pH调节为6.67。
-温度和pH保持恒定48小时，此后过滤出共沉淀物，在去离子 水中漂洗，在37℃下在空气中干燥。
-转化为OCP后的共沉淀物的X射线衍射谱图表示在图10中 (EDAC交联的胶原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物在37℃和pH 6.67下 向OCP转化72小时后，形成胶原蛋白/GAG/OCP生物复合物，Cu-K(α) 射线)。
实施例3
实施例3是上述合成方法的例子，通过进行步骤I～V实施。在 室温和约4.5的pH下进行三元共沉淀。如在实施例2中，通过仔细控 制氢氧化钙和硝酸钙浓度实现pH控制，不使用滴定剂。然后将得到的 三元共沉淀物冷冻至-20℃，放置在真空下，然后加热以引起游离水(即 冰)的升华。使用1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺处理进行第一交 联。然后将得到的干燥的共沉淀物在pH 8.50和37℃下转化为磷灰石。 使用γ射线辐照进行第二交联。
材料
I型：由牛腱溶解的酸，Integra Life Sciences Plainsboro，NJ，USA
GAG：来自鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素；钠盐；Sigma-Aldrich Inc(St. Louis，MO，USA)
钙源：(i)氢氧化钙Ca(OH)2；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；和(ii)硝酸钙；Ca(NO3)2·4H2O；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；
磷源：正磷酸；H3PO4；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
滴定剂：无
交联剂：(i)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(＝EDAC)； Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)；和(ii)N-羟基琥珀酰亚胺 (＝NHS)；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO，USA)
步骤
步骤I
-选择3∶1的透钙磷石与胶原蛋白+糖胺聚糖的目标质量比。
-在200mL的总反应体积中，将胶原蛋白+GAG的浓度设定为10 mg/mL。
-使用pH变量的经验三维图(在1.0的恒定的[Ca2+]与[P]反应物离 子比下)，改变：(i)离子浓度(即[Ca2+]＝[H3PO4])和(ii)硝酸钙∶氢氧化钙的 比，确认pH恒定为4.5的点的轨迹。这示于图11中(设定离子浓度和 硝酸钙∶氢氧化钙的比的组合，以保持pH＝4.5)。
-将该点的轨迹叠加在透钙磷石质量产率的图上(具有相同的坐标 轴)，确认它与30mg/mL(即3倍于胶原蛋白+GAG的浓度)的等值线的 交叉点，使得设定反应物浓度，在该反应物浓度下，在pH为 4.5([Ca2+]＝[H3PO4]＝0.1768摩尔/升；Ca(NO3)2·4H2O∶Ca(OH)2＝0.049)下， 可以制备含有质量比为3∶1的磷酸钙(30mg/mL)与胶原蛋白+GAG(10 mg/mL)的三元共沉淀物浆。这示于图12中：确定含有质量比为3∶1的磷 酸钙与胶原蛋白+GAG的三元共沉淀物浆的pH4.5下的合成条件。
-将1.837g的胶原蛋白分散在冰浴中冷却的171.4mL的0.1768 摩尔/升的H3PO4中，使用配备直径19mm定子的均质器在15000rpm 下混合90分钟，以制备胶原蛋白分散体。
-在室温下将0.163 g6-硫酸软骨素溶解在14.3mL的0.1768摩尔/ 升的磷酸中，通过周期地振荡分散溶解GAG，以制备GAG溶液。
-90分钟后，在15000rpm的连续均质下，将14.3 mLGAG溶液 以约0.5mL/分钟的速率加到混合的胶原蛋白分散体中，所得到的胶原 蛋白/GAG分散体总共混合90分钟。
-在90分钟的混合后，在15000rpm的恒定搅拌下，在30分钟时 间将2.498g的Ca(OH)2和0.380g的Ca(NO3)2·4H2O加到胶原蛋白 /GAG分散体中，制备胶原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物浆，此后向混 合浆体中加入另外的14.3mL的0.1768摩尔/升的H3PO4。
-三元共沉淀物浆的pH约为4.5。
-使三元共沉淀物浆保持在25℃下48小时。
步骤II
-将三元共沉淀物浆置于-20℃的冷冻机中，使其冷冻过夜。
-然后从冷冻机取出冷冻的浆，放在约80毫托的真空中，使温度 升至室温，这样引起冰从浆中的升华，使其进行48小时。除去游离水 后的胶原蛋白/GAG/透钙磷石三元共沉淀物的X射线衍射谱图(Cu-K(α) 射线)示于图13中。
步骤III
-在完全除去游离水之后，使得到的1.25g的干三元共沉淀物在 40mL的去离子水中水合20分钟。
-将20mL的0.018摩尔/升EDAC和0.007摩尔/升NHS的溶液加 到含有三元共沉淀物和去离子水的容器中，在缓和搅拌和室温下使三元 共沉淀物交联2小时。
-除去EDAC溶液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三元共沉淀物，允 许在温和搅拌下在新鲜的PBS中，在37℃下培养2小时。
-在PBS中2小时后，用去离子水洗涤三元共沉淀物，并在温和 搅拌和37℃下培养两个10分钟的间隔。
-然后将三元共沉淀物在37℃下干燥72小时。EDAC交联后的胶 原蛋白/GAG/透钙磷石三元共沉淀物的X射线衍射谱图(Cu-K(α)射线) 示于图14中。
步骤IV
-将交联的三元共沉淀物颗粒置于37℃的50mL用透钙磷石预先 饱和的去离子水中，使用氨将溶液的pH调节为8.50。
-维持温度和pH恒定72小时，此后过滤出共沉淀物，在去离子 水中漂洗，在37℃下在空气中干燥。转化为磷灰石后的共沉淀物的X 射线衍射谱图示于图15中(EDAC交联的胶原蛋白/GAG/CaP三元共沉 淀物在37℃和8.50的pH下向磷灰石转化72小时后，形成胶原蛋白 /GAG/磷灰石生物复合物，Cu-K(α)射线)。
步骤V
-将干燥的胶原蛋白/GAG/Ap三元共沉淀物进行32.1kGy剂量的 γ射线辐照。图16表示γ射线辐照后的X射线衍射谱图(经γ辐照第二 交联后的EDAC交联的胶原蛋白/GAG/Ap三元共沉淀物)。
实施例4
材料
胶原蛋白：再生的提取了胃蛋白酶的猪皮胶原蛋白(端胶原)；85wt ％I型，15wt％III型；Japan Meat Packers(Osaka，Japan)。
GAG：来自鲨鱼软骨的6-硫酸软骨素；钠盐；Sigma-Aldrich Inc(St. Louis，MO，USA)
钙源：(i)氢氧化钙Ca(OH)2；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；和(ii)硝酸钙；Ca(NO3)2·4H2O；Sigma-Aldrich Inc(St.Louis，MO， USA)；
磷源：正磷酸；H3PO4；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
滴定剂：氨；NH3；BDH Laboratory Supplies(Poole，United Kingdom)
步骤
步骤I
-通过在室温下将Ca(OH)2溶解在0.48摩尔/升的H3PO4中至0.12 摩尔/升的浓度，制备溶液A，将所得到的溶液滴定至pH为3.2。
-通过将6-硫酸软骨素溶解在去离子水中至3.2g/L的浓度，制备 出悬浮液B。在恒定搅拌下，以1.5的硝酸根：氢氧根的摩尔比将 Ca(NO3)2·4H2O和Ca(OH)2加到硫酸软骨素溶液中，以制备总钙浓度为 2.4摩尔/升的悬浮液。
-将0.144g的胶原蛋白加到20mL的溶液A中，使用均质器混合 至溶解。然后在恒定搅拌下将4mL的悬浮液B加到溶液A中。持续搅 拌60分钟，监测pH以确保pH维持在3.15＜pH＜3.30的范围中。然后 使所得到的浆在室温下老化24小时。
步骤II
-使所述浆在37℃下在空气中干燥5天，用去离子水漂洗剩余的三 元共沉淀物，接着在37℃下再干燥另外的24小时。
步骤III
-将共沉淀物放在稀醋酸(pH＝3.2)中，用30 kGy的γ射线辐照剂 量辐照。然后从溶液中除去交联的沉淀物，漂洗，在37℃下在空气中干 燥。
步骤IV
-将交联的共沉淀物颗粒放在37℃的50mL去离子水中，使用氨 将溶液的pH调节为6.65。维持恒定温度和pH 48小时，此后过滤出共 沉淀物，在去离子水中漂洗，在37℃下在空气中干燥。
步骤V
-将交联的水解的共沉淀物颗粒置于室温的真空箱中，施加50毫 托的真空，然后将温度升高至105℃。24小时后，将温度降至室温，并 释放真空。
图17表示刚刚进行三元共沉淀和干燥(步骤I和II)后的复合物的 X射线衍射谱图。该谱图证实主要存在的相是透钙磷石。
图18表示第一交联(步骤III)后的共沉淀物颗粒的结构的SEM显 微照片。值得注意的是颗粒微观结构的均一性质。
水解为磷酸八钙的过程(步骤IV)表示在图19的XRD谱图中。在12.5 °的透钙磷石峰强度逐渐减弱，在4.5°的磷酸八钙(OCP)的主峰增强，这 表明无机相在48小时转化为OCP。
复合物的TEM图表示在图20中。可以看出，分散在胶原蛋白 /GAG基质中的10～20nm的低长宽比的磷酸钙晶体的无规分布。
本发明的复合生物材料可以用作可生物吸收的材料。可以预期， 移植后，由该材料制备的构件将完全吸收，仅留下健康的再生组织，丝 毫不留下移植物本身。[附录1完]
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