技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物技术领域，具体涉及一种粉状毕赤酵母高密度发酵工艺方法，该发酵培养基成分简单，成本低，采用
葡萄糖流加方式促进菌体积累，适用于粉状毕赤酵母的高密度发酵生产。
背景技术
[0002] 粉状毕赤酵母作为发酵工业菌种具有非常特殊的优越性，它不仅可以为
饲料工业提供优质活性蛋白源，为生物
肥料产业提供重要的菌种，还能高效分泌甘油等工业原材料与产品，因此大
力发展粉状毕赤酵母产业有非常广阔的市场前景。目前市场上的粉状毕赤酵母菌接种剂主要是粉剂，接种时需要大量的粉状毕赤酵母活菌，因此研究粉状毕赤酵母高密度发酵具有非常重要的现实意义。
[0003] 目前，国内对粉状毕赤酵母的研究不多，其主要集中在胁迫诱导产生高活性3-
磷酸甘油脱氢酶（GPD1）或者基因改造GPD1，使其分泌甘油的
水平提高。张洁等（2006）研究了鲁氏酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因在粉状毕赤酵母中的表达，并分别比较了重组菌和野生菌在不同盐浓度下的细胞密度，其胁迫下的OD值都不高。高亮等人（2011）研究粉状毕赤酵母对
土壤盐
碱性有好的改良效果，以及对根结
线虫有较强的抑制作用，并验证了其生物菌剂对黄瓜的产量有明显的提高效应。而专
门研究粉状毕赤酵母高密度发酵的报道几乎没有。
[0004] 毕赤酵母是近年来被广泛用来作为表达外源蛋白的载体，粉状毕赤酵母作为毕赤酵母家族中的一员具有举足轻重的作用。目前粉状毕赤酵母存在发酵液菌浓低、发酵周期较长、培养基成本高等一系列问题，开发粉状毕赤酵母高密度发酵廉价的、实用性较强的技术平台对粉状毕赤酵母菌剂的大面积推广具有重要的意义。
[0005] 本发明对粉状毕赤酵母的发酵培养基和培养条件进行了优化，得到了成分较简单的培养基配方，同时，采用流加葡萄糖以促进菌体积累，为粉状毕赤酵母高密度培养提供了方法，也为甘油的生物合成及其他方面的应用奠定了
基础。
发明内容
[0006] 针对
现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于提供了一种配方设计合理、且能够提高菌体生物量的粉状毕赤酵母高密度发酵培养基。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供了一种上述培养基的制备方法。
[0008] 本发明的第三个目的在于提供了一种利用上述培养基对粉状毕赤酵母进行高密度发酵的方法。
[0009] 本发明适用于获取生物量更高的粉状毕赤酵母高密度发酵，特别是本发明提供一种可以获取粉状毕赤酵母的高密度补料发酵方法。
[0010] 为实现本发明的第一个目的，本发明采取的技术方案为：
[0011] 对于粉状毕赤酵母高密度发酵工艺的发酵培养基，其原料配方如下： [0012] 蛋白胨5～20g，
[0013] 葡萄糖10～100g，
[0016] 玉米浆2～30g，
[0017] 加蒸馏水补充至1000mL。
[0018] 为了实现本发明的第二个目的，本发明采取的技术方案为：
[0019] 上述粉状毕赤酵母的发酵控制方法的发酵培养基，其制备方法如下： [0020] 1、将蛋白胨5～20g、磷酸二氢钾1～6g、
硫酸镁0.1～2g、玉米浆2～30g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并补充至900mL，用5～8mol/L的NaOH调整pH到6.0～6.8，在103.4kPa压力、115～121℃
温度下灭菌20～30min得培养基；
[0021] 2、称取葡萄糖10～100g，加蒸馏水溶解并补充至100mL，在103.4kPa
蒸汽压力、110～117℃温度下灭菌30min，得葡萄糖溶液；
[0022] 3、将步骤2得到的葡萄糖溶液加入到灭过菌的步骤1的培养基中，得到粉状毕赤酵母高密度发酵培养基。
[0023] 为了实现本发明的第三个目的，本发明采取的技术方案为：
[0024] 一种利用上述培养基对粉状毕赤酵母进行高密度发酵的方法，其步骤如下： [0025] （1）制备一级
种子：取斜面保存的粉状毕赤酵母如粉状毕赤酵母ACCC21153或ACCC20026（不限于该菌株，现有报道的或常用的或商业上可以购买得到的粉状毕赤酵母菌株均可以作为本发明的实施菌株）在YEPD培养基平板上划线，置28℃
培养箱倒置培养12h，出现游离单菌落，得到一级种子；
[0026] （2）制备二级种子：用接种环取一环步骤（1）的一级种子的单菌落，接入装有30～50mL YEPD液体培养基（葡萄糖20g/L；蛋白胨20g/L；酵母粉10g/L）的250mL三
角瓶中，在
28～40℃条件下，150～200r/min下振荡培养，当菌体OD600达到10.0～12.0时即得二级种子；
[0027] （3）发酵培养：取步骤（2）的二级种子以V/V计为1%～5%的接种量接入装有30～50mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为28～40℃，转速为150～
200r/min，发酵周期为20～30h，得到粉状毕赤酵母菌；或
[0028] 取步骤（2）的二级种子液以V/V计为1%～5%的接种量接入装有按V/V计的40%～60%发酵培养基的
发酵罐中，控制发酵温度为28～40℃，通
风比1-3.5VVM，起始转速为
300r/min，每隔4h转速提升100r/min，提高至700r/min保持不变，发酵周期为20～30h，得到粉状毕赤酵母菌；或
[0029] 取步骤（2）的二级种子液以V/V计为1%～5%的接种量接入装有按V/V计的40%～60%发酵培养基的发酵罐中，控制发酵温度为28～40℃，
通风比1-3.5VVM，起始转速为300r/min，每隔4h转速提升100r/min，提高至700r/min保持不变。在此发酵条件下培养10～16h后开始补料，之后每隔2h进行一次补料，共补料5次，同时通过手动流加5～
8mol/L NaOH溶液使发酵液pH保持在6.0左右，发酵周期为20～30h，得到粉状毕赤酵母菌；
[0030] 其中，发酵补料分批发酵时所用补料葡萄糖的配置方法为：称取葡萄糖50～200g，加蒸馏水溶解并补充至200mL，在103.4kPa
蒸汽压力、110～117℃温度下灭菌20～
30min，每1L发酵液每次加入量为20mL， 使发酵体系中葡萄糖浓度为2～15g/L。 [0031] 本发明设计的粉状毕赤酵母高密度补料发酵方法有如下特点：传统的粉状毕赤酵母发酵较多直接采用酵母粉作为氮源的YEPD培养基进行发酵培养。本发明在实验过程中发现菌体生长过程能利用葡萄糖代谢产生乳酸，使发酵液pH迅速降低，从而抑制菌体生长，但粉状毕赤酵母能够耐受12%的高盐，因而可以在发酵过程中用一定浓度的NaOH调节发酵液pH保持在6.0左右，以促进菌体生长。本发明在实验过程中通过在发酵过程中定时取样测定pH、OD600和残糖含量，发现葡萄糖在14小时已经完全消耗完毕，因此在消耗完的前1小时，采用流加的方式补充葡萄糖作为发酵的
碳源，以利于菌体继续生长。 [0032] 经相关的试验与对比可见，本发明利用玉米浆替代原始培养基中的酵母粉，采用葡萄糖流加补料方式的高密度发酵方法效率更高，生产成本更低，具有比现有粉状毕赤酵母发酵技术更高的生物量。
[0033] 本发明最终粉状毕赤酵母菌体生物量OD600可达85.0～95.0，菌数为30.0～35.0亿/mL，含酵母菌体50.0～60.0g/L，远高于高密度发酵的30g/L的水平，而用常规的YEPD发酵，OD600为15.0～25.0，菌数为6.0～8.0亿/mL。
[0034] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
[0035] 1、本发明提供了粉状毕赤酵母的发酵培养基，降低了培养基的生产成本； [0036] 2、粉状毕赤酵母是好
氧菌，高通风比提高了菌体生物量；
[0037] 3、NaOH溶液调节pH，有效缓解低酸环境菌体生长缓慢，且产生的高盐浓度能有效降低杂菌的污染，在菌剂生产过程中能得到高纯度的菌体；
[0038] 4、采用葡萄糖补料的方法进行发酵，延长了对数期的时间，促进了菌体的积累。
附图说明
[0039] 图1为粉状毕赤酵母ACCC21153在YEPD培养基中的种子液生长曲线； [0040] 图2为发酵过程中不补糖不控pH条件下菌体生长情况。图中：
[0041] ■-菌体生物量；
[0042] ▼-发酵液pH；
[0043] ◇-发酵液残留葡萄糖浓度。
[0044] 图3为发酵过程中控制pH与补糖条件下的菌体生长情况。图中：
[0045] ■-菌体生物量；
[0046] ▼-发酵液pH；
[0047] ◇-发酵液残留葡萄糖浓度。
具体实施方式
[0048] 下面
申请人将结合具体的
实施例对本发明的技术方案做详细的阐述，但以下内容不在任何意义上解释为对本发明
请求保护范围的限制。在下面的实施例中所使用的粉状毕赤酵母菌株ACCC21153和ACCC20026为商业购买的粉状毕赤酵母菌株（购自：北京，中国农业微生物菌种保藏管理中心，http://www.accc.org.cn），在具体应用中不限于该菌株，现有报道的或常用的或商业上可以购买得到的粉状毕赤酵母菌株均可以作为本发明的实施菌株。实施例1是粉状毕赤酵母ACCC21153摇瓶发酵生长情况， 实施例2是粉状毕赤酵母ACCC21153粉状发酵罐分批发酵生长情况，实施例3是粉状毕赤酵母ACCC21153发酵罐分批补料发酵生长情况，实施例4是粉状毕赤酵母ACCC20026发酵罐分批补料发酵生长情况。 [0049] 实施例1：粉状毕赤酵母ACCC21153摇瓶发酵培养
[0050] 1、粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的制备
[0051] （1）按下列配方备料
[0052] 将蛋白胨15g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.45g、玉米浆（工业级，蛋白含量≥45%、酸度≤14%、亚
硫酸盐≤0.3%、灰分≤10%）15g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并补充至1000mL，用5～8mol/L氢氧化钠调整pH到6.0，分装于250mL摇瓶，装液量为30mL，在
103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌30min；
[0053] （2）称取葡萄糖48g，用蒸馏水溶解并补充至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌30min得葡萄糖溶液；
[0054] （3）取步骤（2）的葡萄糖溶液2.0mL加入到灭过菌的步骤（1）的培养基中，得到粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基。
[0055] 2、摇瓶发酵培养
[0056] A、斜面种子活化
[0057] 取斜面保存的粉状毕赤酵母ACCC21153在YEPD培养基平板上划线，置28℃培养箱倒置培养24h，出现游离单菌落。
[0058] B、摇瓶种子制备
[0059] 用接种环取一环步骤A的活化种子的单菌落，接入装有30mL YEPD培养基（葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L）的250mL三角瓶中，在28℃条件下，150r/min下振荡培养，当菌体OD600达到10.0～12.0时即得摇瓶种子（粉状毕赤酵母ACCC21153在YEPD培养基中的种子液生长曲线见附图1）。
[0060] C、发酵培养
[0061] 将摇瓶种子液按3%的接种量接入装有30mL步骤1制备的粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的250mL摇瓶中，控制摇床温度28℃，转速180r/min，发酵至24h结束，此时粉状毕赤酵母ACCC21153的有效活菌数为12.7亿/mL，菌体OD600是35.332。 [0062] 实施例2：粉状毕赤酵母ACCC21153发酵罐分批发酵培养
[0063] 1、粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的制备
[0064] （1）按下列配方备料
[0065] 将蛋白胨8g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、玉米浆15g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并补充至900mL，用5～8mol/L氢氧化钠调整pH到6.4，在103.4kPa蒸汽压力、121℃下灭菌20min；
[0066] （2）葡萄糖溶液配置及灭菌同实施例1；
[0067] （3）将步骤（2）的葡萄糖溶液全部加入到灭过菌的步骤（1）的培养基中，得到粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基。
[0068] 2、发酵罐发酵培养
[0069] A、斜面种子活化
[0070] 同实施例1；
[0071] B、摇瓶种子制备
[0072] 用接种环取一环步骤A的活化种子的单菌落，接入装有50mL YEPD培养基的250mL三角瓶中，在30℃条件下，180r/min下振荡培养，当菌体OD600达到10.0～12.0时即得摇瓶种子；
[0073] C、发酵培养
[0074] 取步骤B的摇瓶种子按5%的接种量接入装液量为1.5L步骤1制备的粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的3L发酵罐中，控制罐温32℃，转速200r/min，通风比1-3.5VVM，起始转速为300r/min每隔4h提高转速100r/min，提高到700r/min后保持不变。发酵24h，此时粉状毕赤酵母ACCC21153有效活菌数为17.3亿/mL，此时菌体OD600是
46.787，发酵过程曲线见附图2。
[0075] 实施例3：粉状毕赤酵母ACCC21153发酵罐分批补料发酵培养
[0076] 1、粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的制备
[0077] （1）按下列配方备料
[0078] 将蛋白胨12g、磷酸二氢钾3.5g、硫酸镁0.45g、玉米浆15g混合，配制方法同实施例2，调整pH到6.4，在103.4kPa蒸汽压力、121℃下灭菌20min；
[0079] （2）称取葡萄糖40g，用蒸馏水溶解并补充至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌30min得葡萄糖溶液；
[0080] （3）将步骤（2）的葡萄糖溶液全部加入到灭过菌的步骤（1）的培养基中，得到粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基。
[0081] 2、发酵罐发酵培养
[0082] A、斜面种子活化
[0083] 同实施例1；
[0084] B、摇瓶种子制备
[0085] 用接种环取一环步骤A的活化种子的单菌落，接入装有40mL YEPD培养基的250mL三角瓶中，在30℃条件下，200r/min下振荡培养，当菌体OD600达到10.0～12.0时即得摇瓶种子；
[0086] C、补料用葡萄糖溶液的配制
[0087] 称取葡萄糖80g，加蒸馏水溶解并补充至200mL，在103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌20min得补料用葡萄糖溶液；
[0088] D、发酵培养
[0089] 将步骤B的摇瓶种子按3.5%的接种量接入装液量为1.2L步骤1制备的粉状毕赤酵母ACCC21153高密度发酵培养基的3L发酵罐中，控制罐温32℃，转速300r/min，通风比1-3.5VVM，进行发酵培养。通过级联控制滴加5～8mol/L的NaOH溶液使发酵液pH保持在
6.0，直至发酵结束。转速控制同实施例2。在发酵培养至13h时开始补料，向发酵罐中一次补入40mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2h进行一次补料，共补料5次，发酵至24h结束发酵，此时粉状毕赤酵母ACCC21153有效活菌数为28.3亿/mL，此时菌体OD600 是78.578，发酵过程曲线见附图3。
[0090] 实施例4：粉状毕赤酵母ACCC20026发酵罐分批补料发酵培养
[0091] 1、粉状毕赤酵母高密度发酵培养基的制备
[0092] （1）按下列配方备料
[0093] 将蛋白胨10g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.60g、玉米浆30g混合，配置方法同实施例1，调整pH到6.2，在103.4kPa蒸汽压力、118℃下灭菌25min；
[0094] （2）同实施例3；
[0095] （3）将步骤（2）的葡萄糖溶液全部加入到灭过菌的步骤（1）的培养基中，得到粉状毕赤酵母ACCC20026高密度发酵培养基。
[0096] 2、发酵罐发酵培养
[0097] A、斜面种子活化
[0098] 同实施例3；
[0099] B、摇瓶种子制备
[0100] 同实施例3；
[0101] C、补料用葡萄糖溶液的配制
[0102] 称取葡萄糖150g，加蒸馏水溶解并补充至200mL，在103.4kPa蒸汽压力、113℃下灭菌25min得补料用葡萄糖溶液；
[0103] D、发酵培养
[0104] 将步骤B的摇瓶种子按4%的接种量接入装液量为1.5L步骤1制备的粉状毕赤酵母ACCC20026高密度发酵培养基的3L发酵罐中，控制罐温32℃，转速300r/min，通风比1-3.5VVM，进行发酵培养。发酵液pH调节、转速调节及补料发酵同实施例3，发酵至24h结束发酵，此时粉状毕赤酵母ACCC20026有效活菌数为30.0亿/mL，此时菌体OD600是83.325。
