IL-36γ作为动脉粥样硬化的标志物
阅读：934发布：2021-04-12
专利汇可以提供IL-36γ作为动脉粥样硬化的标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提出了一种动脉粥样硬化 生物 标志物。根据本发明的 实施例 ，所述动脉粥样硬化生物标志物具有下列序列的至少之一：(1)SEQ ID NO:1所示的 氨 基酸序列；(2)与(1)具有至少70％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少85％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少95％同一性的氨基酸序列，更优选地，具有至少99％同一性的氨基酸序列。 发明人 在实验中发现，IL-36γ在动脉粥样硬化斑 块 中高表达，IL-36γ的表达 水 平高低与动脉粥样硬化的严重程度一致，可作为动脉粥样硬化的一种重要的生物标志物。，下面是IL-36γ作为动脉粥样硬化的标志物专利的具体信息内容。
1.一种动脉粥样硬化生物标志物，其特征在于，具有下列序列的至少之一：
(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(2)与(1)具有至少70％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少85％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少95％同一性的氨基酸序列，更优选地，具有至少99％同一性的氨基酸序列。
2.IL-36γ作为动脉粥样硬化生物标志物的用途。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括：特异性检测IL-36γ的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括选自特异性检测IL-36γ的抗体、引物和探针的至少之一。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物具有SEQ ID NO:2～3所示的核苷酸序列。
6.特异性检测IL-36γ的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测动脉粥样硬化。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂包括选自特异性检测IL-36γ的抗体、引物和探针的至少之一。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述引物具有SEQ ID NO:2～3所示的核苷酸序列。
9.IL-36γ拮抗剂或其功能类似物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防动脉粥样硬化。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述治疗或预防动脉粥样硬化是通过阻断动脉粥样硬化的早期形成阶段实现的，
任选地，所述治疗或预防动脉粥样硬化是通过抑制单核细胞/巨噬细胞募集和/或巨噬细胞泡沫细胞的形成和/或降低巨噬细胞泡沫细胞内游离胆固醇和胆固醇酯的水平实现的。
11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述IL-36γ拮抗剂包括选自沉默IL-36γ的shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR/Cas9和锌指核酸酶的至少之一。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述shRNA具有SEQ ID NO:4～5所示的核苷酸序列。
IL-36γ作为动脉粥样硬化的标志物
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及IL-36γ作为动脉粥样硬化的标志物及IL-36γ拮抗剂或其功能类似物在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用，更具体地，本发明涉及动脉粥样硬化生物标志物、IL-36γ作为动脉粥样硬化生物标志物的用途、试剂盒、IL-36γ在制备试剂盒中的用途以及IL-36γ拮抗剂或其功能类似物在制备药物中的用途。
背景技术
[0002] 根据《柳叶刀》杂志发表的全球疾病负担研究2016系列报告(Global Burden of Disease Study 2016,GBD)显示，心脑血管疾病、肿瘤、慢性呼吸系统疾病是2016年造成最多死亡人数的首要原因【参见：Collaborators,G.B.D.C.o.D.,Global,regional,and national age-sex specific mortality for 264causes of death,1980-2016:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.Lancet,2017.390(10100):p.1151-1210.】。心血管疾病已成为全世界范围内威胁人类健康的头号杀手。
[0003] 在各类心血管疾病中，动脉粥样硬化(atherosclerosis)是最常见也是危害最为严重的一种。在40岁以上的人群中，约95％会出现不同程度血管损伤，并且动脉粥样硬化的检出率随着年龄的增长而不断增加。可以说动脉粥样硬化是伴随着我们每个人一生的风险。动脉粥样硬化及其相关的并发症是由饮食、生活方式等环境因素，遗传因素，免疫功能紊乱等多种因素共同作用的结果。
[0004] 传统的观点认为动脉粥样硬化是一种由于脂质在主动脉血管壁被动积累导致的代谢疾病。随着对动脉粥样硬化过程的研究越来越深入，现在观点认为动脉粥样硬化是一种慢性炎症疾病，并不能简单地将其归结为一类脂质代谢异常引发的疾病。巨噬细胞是组成动脉粥样硬化斑块最主要的细胞成分之一，在动脉粥样硬化的发生发展过程中的作用极其重要。动脉粥样硬化过程可以看做由病原体性质的脂蛋白“入侵”动脉壁引起的巨噬细胞和淋巴细胞的免疫反应过程。其最为关键的触发因素是脂质在内皮下沉积，引发单核细胞进入血管内膜并分化为巨噬细胞。巨噬细胞吞噬脂质变为泡沫细胞(foam cell)并引发炎症反应。脂肪条纹为动脉粥样硬化过程中肉眼可见的最早病变，主要成分即为内皮下累积的充盈胆固醇的巨噬细胞，也就是泡沫细胞。
[0005] 然而动脉粥样硬化的发病机制和治疗方案仍有待科研工作者不断地探索。
发明内容
[0007] 本发明从小鼠模型、细胞模型多个层面系统研究里惊喜地发现，IL-36γ对动脉粥样硬化过程具有显著地调控作用，发现IL-36γ能够显著促进动脉粥样过程及巨噬细胞的募集和泡沫细胞的形成。
[0008] 为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种动脉粥样硬化生物标志物。根据本发明的实施例，所述动脉粥样硬化生物标志物具有下列序列的至少之一：(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(2)与(1)具有至少70％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少85％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地，具有至少95％同一性的氨基酸序列，更优选地，具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0009]MRGTPGDADGGGRAVYQSMCKPITGTINDLNQQVWTLQGQNLVAVPRSDSVTPVTVAVITCKYPEALEQGRGDPIYLGIQNPEMCLYCEKVGEQPTLQLKEQKIMDLYGQPEPVKPFLFYRAKTGRTSTLESVAFPDWFIASSKRDQPIILTSELGKSYNTAFELNIND(SEQ ID NO:1)。
[0010] 发明人在实验中发现，IL-36γ在动脉粥样硬化斑块中高表达，IL-36γ的表达水平高低与动脉粥样硬化的严重程度一致，可作为动脉粥样硬化早期的一种重要的生物标志物。
[0011] 在本发明的第二方面，本发明提出了IL-36γ作为动脉粥样硬化生物标志物的用途。如前所述，IL-36γ在动脉粥样硬化斑块中高表达，IL-36γ的表达水平高低与动脉粥样硬化的严重程度一致，以IL-36γ的表达水平作为动脉粥样硬化严重程度的检测指标，具有可信度高的优势。
[0012] 在本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：特异性检测IL-36γ的试剂。IL-36γ在动脉粥样硬化斑块中高表达，IL-36γ的表达水平高低与动脉粥样硬化的严重程度一致，根据本发明实施例的试剂盒中含有特异性检测IL-36γ的试剂，能够检测出IL-36γ的表达量，进而通过比较待测样本中IL-36γ的表达量与对照样本(确定没有患动脉粥样硬化的样本)的表达量，来判断待测样本是否患有动脉粥样硬化。
[0013] 根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0014] 所述试剂的种类不受特别显著，只要能够实现特异性检测IL-36γ的表达量即可，本领域技术人员可以理解的是，“表达量”既可指绝对表达量也可指相对表达量，可以以所述对照样本中IL-36γ表达量作为基准，相对表示待测样本中IL-36γ的表达量，也可以以管家基因的表达量为基准，相对表示IL-36γ的表达量。根据本发明的具体实施例，所述试剂包括选自特异性检测IL-36γ的抗体、引物和探针的至少之一。例如，当采用特异性检测IL-36γ的抗体对IL-36γ进行检测时，可以通过蛋白质印迹法、流式细胞术等方法进行检测，当采用特异性检测IL-36γ的引物对IL-36γ进行检测时，可以通过实时定量PCR的方法检测IL-36γ的mRNA的表达量，当采用特异性检测IL-36γ的探针对IL-36γ进行检测时，可采用Northern blot的方法检测IL-36γ的mRNA的表达量。
[0015] 根据本发明的实施例，所述引物具有SEQ ID NO:2～3所示的核苷酸序列。
[0016] CAGGCCCTTGTGACAGTTCCA(SEQ ID NO:2)。
[0017] TTAGCAGCAAAGTAGGGTGTCCATTA(SEQ ID NO:3)。
[0018] 根据本发明实施例的上述引物，在以管家基因如β-actin基因的表达量为基准的前提下，进行实时定量PCR可实现IL-36γ的mRNA的表达量的相对定量。
[0019] 在本发明的第四方面，本发明提出了特异性检测IL-36γ的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测动脉粥样硬化。IL-36γ在动脉粥样硬化斑块中高表达，IL-36γ的表达水平高低与动脉粥样硬化的严重程度一致，特异性检测IL-36γ的试剂所制备的试剂盒可用于动脉粥样硬化的有效检测。
[0020] 根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0021] 根据本发明的实施例，所述试剂包括选自特异性检测IL-36γ的抗体、引物和探针的至少之一。
[0022] 根据本发明的实施例，所述引物具有SEQ ID NO:2～3所示的核苷酸序列。
[0023] 在本发明的第五方面，本发明提出了IL-36γ拮抗剂或其功能类似物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防动脉粥样硬化。如前所述，IL-36γ在动脉粥样硬化斑块中高表达，IL-36γ的表达水平高低与动脉粥样硬化的严重程度一致。发明人在实验中发现，在动脉粥样硬化小鼠模型中注射IL-36γ，IL-36γ可显著促进动脉粥样硬化过程，而如果注射了IL-36γ拮抗剂，如IL-36γ受体拮抗剂，可以用于抑制IL-36γ与IL-36γ受体结合，而抑制IL-36γ功能的发挥，或IL-36γ抗体，可以用于中和内源IL-36γ表达，如果注射IL-36γ功能类似物，可竞争性抑制IL-36γ功能的发挥，那么小鼠动脉粥样硬化的发展受到抑制。利用IL-36γ拮抗剂或其功能类似物制备的药物，可用于动脉粥样硬化的有效治疗或预防。
[0024] 根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0025] 根据本发明的实施例，所述治疗或预防动脉粥样硬化是通过阻断动脉粥样硬化的早期形成阶段实现的。发明人发现，在动脉粥样硬化小鼠模型中注射重组IL-36γ，IL-36γ可显著促进动脉粥样硬化的早期发展过程，IL-36γ拮抗剂或其功能类似物所制备的药物可有效阻断动脉粥样硬化的早期形成阶段，进而用于动脉粥样硬化的有效治疗或预防。
[0026] 根据本发明的实施例，所述治疗或预防动脉粥样硬化是通过抑制单核细胞/巨噬细胞募集和/或巨噬细胞泡沫细胞的形成和/或降低巨噬细胞泡沫细胞内游离胆固醇和胆固醇酯的水平实现的。发明人发现，在动脉粥样硬化小鼠模型中注射重组IL-36γ，小鼠腹腔巨噬细胞迁移数目明显增多；同时，发明人通过建立巨噬细胞泡沫细胞形成的体外模型，发现IL-36γ能够显著促进oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成，细胞内游离胆固醇和胆固醇酯水平显著上调。IL-36γ拮抗剂或其功能类似物所制备的药物可有效阻断动脉粥样硬化的早期形成阶段，抑制单核细胞/巨噬细胞募集和/或巨噬细胞泡沫细胞的形成和/或降低巨噬细胞泡沫细胞内游离胆固醇和胆固醇酯的水平。
[0027] IL-36γ拮抗剂的选择不受特别限制，只要能够有效拮抗IL-36γ的功能即可，即既可通过降低IL-36γ的活性或使IL-36γ失活实现，也可通过抑制IL-36γ的表达实现。根据本发明的具体实施例，所述IL-36γ拮抗剂包括选自沉默IL-36γ的shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR/Cas9和锌指核酸酶的至少之一。进而根据本发明实施例的IL-36γ拮抗剂可实现IL-36γ的沉默或抑制，进而有效抑制了IL-36γ的功能。
[0028] 根据本发明的实施例，所述shRNA具有SEQ ID NO:4～5所示的核苷酸序列。
[0029] GCTGTTATCACATGCAAGTAT(SEQ ID NO:4)。
[0030] CGTCTATCAATCAATGTGTAA(SEQ ID NO:5)。
[0031] 根据本发明实施例的上述shRNA可实现IL-36γ的特异性沉默。
[0032] 所述IL-36γ功能类似物的选择不受特别限制，只要可通过竞争性抑制抑制IL-36γ功能的发挥即可。
[0034] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0035] 图1是根据本发明实施例的IL-36γ在动脉粥样硬化斑块中高表达的结果图；
[0036] 图2是根据本发明实施例的采用主动脉整体固定和油红O染色方法后，注射重组IL-36γ实验组小鼠主动脉弓斑块面积比例显著高于对照组小鼠的结果图；
[0037] 图3是根据本发明实施例的采用主动脉切片和HE染色方法后，注射重组IL-36γ实验组小鼠主动脉根部斑块面积显著高于对照组小鼠的结果图；
[0038] 图4是根据本发明实施例的注射重组IL-36γ实验组小鼠腹腔巨噬细胞迁移数目明显增多；
[0039] 图5是根据本发明实施例的IL-36γ显著促进oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成的结果图；以及
[0040] 图6是根据本发明实施例的IL-36γ显著促进巨噬细胞内游离胆固醇和胆固醇酯水平的结果图。
具体实施方式
[0041] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0042] 实施例1IL-36γ在动脉粥样硬化斑块中高表达
[0043] 为了研究IL-36γ在动脉粥样硬化过程的作用，发明人首先检测了IL-36γ在动脉粥样硬化斑块中的表达情况。目前公认的用于研究动脉粥样硬化比较理想的小鼠模型ApoE-/-小鼠，在普通饮食情况下即会患有明显的高胆固醇血脂症自发动脉粥样硬化，在胆固醇/高脂饮食情况下会患有严重的高胆固醇血脂症并产生很多并发症。
[0044] 发明人检测了IL-36γ在动脉粥样硬化易发部位小鼠主动脉弓中的表达情况。分别分离正常饮食的C57BL/6小鼠、高脂饮食的C57BL/6小鼠、正常饮食的ApoE-/-小鼠、高脂饮食的ApoE-/-小鼠主动脉组织，提取组织总RNA，用实时定量PCR法检测IL-36γ的mRNA水平。正常饮食的C57BL/6小鼠、高脂饮食的C57BL/6小鼠没有出现明显的动脉粥样硬化斑块，正-/- -/-
常饮食的ApoE 小鼠主动脉已出现了明显的动脉粥样硬化斑块，而高脂饮食的ApoE 小鼠主动脉动脉粥样硬化程度更为严重。检测发现，结果参见图1：相比于没有动脉粥样硬化斑块的正常饮食的C57BL/6小鼠组织、高脂饮食的C57BL/6小鼠，IL-36γ的mRNA水平在出现了动脉粥样硬化斑块的正常饮食ApoE-/-小鼠组织中表达显著增高，在高脂饮食的ApoE-/-小鼠主动脉组织中表达水平进一步增高。*P<0.05，**P<0.01；n.s.，没有差别，统计学分析采用学生t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。以上结果提示IL-36γ的表达水平高低与动脉粥样硬化严重程度一致，可作为动脉粥样硬化过程检测的标志物。
常饮食的ApoE 小鼠主动脉已出现了明显的动脉粥样硬化斑块，而高脂饮食的ApoE 小鼠主动脉动脉粥样硬化程度更为严重。检测发现，结果参见图1：相比于没有动脉粥样硬化斑块的正常饮食的C57BL/6小鼠组织、高脂饮食的C57BL/6小鼠，IL-36γ的mRNA水平在出现了动脉粥样硬化斑块的正常饮食ApoE-/-小鼠组织中表达显著增高，在高脂饮食的ApoE-/-小鼠主动脉组织中表达水平进一步增高。*P<0.05，**P<0.01；n.s.，没有差别，统计学分析采用学生t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。以上结果提示IL-36γ的表达水平高低与动脉粥样硬化严重程度一致，可作为动脉粥样硬化过程检测的标志物。
[0045] 实验方法：
[0046] 1.1组织分离及RNA的提取
[0047] (1)小鼠经高脂饮食诱导后麻醉处死，摘除脏器；
[0048] (2)取下整根主动脉并去除主动脉周围脂肪组织；
[0050] (4)匀浆化处理：加入适量TRIzol(Invitrogen)，用移液器反复吹打；
[0051] (5)相分离：室温放置5分钟，加入0.2ml氯仿，剧烈甩动15秒，室温静置2分钟，4℃，12000rpm离心15分钟；
[0052] (6)RNA沉淀：离心后取最上层上清至新的离心管中，加入0.5mL异丙醇，室温静置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟；
[0053] (7)RNA洗涤：去掉上清，加入1ml 75％乙醇，振荡，4℃，7000rpm离心5分钟；
[0054] (8)稍晾干RNA，加入30μL DEPC水，65℃水浴10分钟使其完全溶解。
[0055] 1.2RNA逆转录
[0056] 使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix逆转录反应试剂盒(Toyobo，FSQ-201)，按照试剂盒说明操作。
[0057] 1.3实时定量PCR反应
[0058] 使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo，QPS-201)试剂盒CFX96real-time PCR system(Bio-rad)仪器完成。使用引物序列如下：
[0059] IL-36γ基因：
[0060] F:5'-CAGGCCCTTGTGACAGTTCCA-3'(SEQ ID NO:2)；
[0061] R:5'-TTAGCAGCAAAGTAGGGTGTCCATTA-3'(SEQ ID NO:3)；
[0062] β-actin基因：
[0063] F:5'-GAGCGTGGCTACAGCTTCAC-3'(SEQ ID NO:6)；
[0064] R:5'-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3'(SEQ ID NO:7)。
[0065] 实时定量PCR反应程序：
[0066] 预变性95℃5分钟；PCR，40个循环：95℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸20秒。
[0067] 实施例2IL-36γ促进动脉粥样硬化过程的发生
[0068] 为了进一步研究IL-36γ在动脉粥样硬化过程中的功能，发明人选用目前公认的用于研究动脉粥样硬化比较理想的小鼠模型ApoE-/-小鼠。发明人将六周龄ApoE-/-小鼠随机分成两组，实验组注射重组IL-36γ，对照组注射PBS(每周两次，连续注射六周)，并进行高脂喂养建立动脉粥样硬化模型。
[0069] 对两组小鼠进行表型分析：
[0070] A：取小鼠主动脉根进行油红O染色并进行统计分析斑块比例。如图2所示，注射重组IL-36γ实验组小鼠主动脉斑块比例显著高于对照组小鼠，二者差异有统计学意义。*P<0.05，**P<0.01；n.s.，没有差别，统计学分析采用学生t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。
[0071] 实验方法：
[0072] (1)小鼠经高脂饮食诱导后麻醉处死，摘除脏器；
[0073] (2)取下整根主动脉并去除主动脉周围脂肪组织；
[0074] (3)纵向剪开小鼠主动脉，内膜面朝下铺平；
[0075] (4)加入0.5mL 4％多聚甲醛固定4℃过夜；
[0076] (5)5mL PBS冲洗2小时；
[0077] (6)去除主动脉外膜后PBS冲洗；
[0078] (7)5mL丙二醇中室温脱水2分钟；
[0079] (8)5mL 0.5％油红O中室温染色2小时；
[0080] (9)85％丙二醇(PBS稀释)依次洗涤4次；
[0081] (10)PBS冲洗；
[0082] (11)主动脉固定后扫描拍照。
[0083] (12)计算由油红O着色的斑块面积占主动脉整体面积的比例。
[0084] B：取小鼠主动脉根部斑块切片进行HE染色并计算斑块的绝对面积。如图3所示，两组小鼠主动脉根部都出现了明显的斑块，且注射重组IL-36γ实验组小鼠斑块面积显著高于对照组小鼠，二者差异有统计学意义。说明IL-36γ可以显著促进动脉粥样硬化的发生。*P<0.05，**P<0.01；n.s.，没有差别，统计学分析采用学生t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。
[0085] 实验方法：
[0087] (2)将固定好的组织修块后放入包埋盒中；
[0088] (3)将组织酒精梯度脱水：70％、80％、90％I、90％II、95％I、95％II、100％I、100％II各10分钟；
[0089] (4)将组织二甲苯透明：二甲苯I、二甲苯II各5分钟；
[0090] (5)将组织浸蜡：蜡缸I、蜡缸II各40分钟；
[0091] (6)包埋，将组织制成蜡块；
[0092] (7)切片，厚度为3.5μm左右；
[0093] (8)烤片机过夜。
[0094] (9)切片脱蜡，二甲苯I、二甲苯II各10分钟；复水，100％I、100％II酒精各5分钟、95％、90％、80％、75％各3分钟；
[0095] (10)水冲洗3次，每次2分钟；
[0096] (11)苏木素染核10分钟；
[0097] (12)自来水洗2分钟；
[0098] (13)伊红染色2分钟；
[0099] (14)自来水洗2分钟；
[0100] (15)90％、100％酒精各2分钟；二甲苯I、二甲苯II各4分钟；
[0101] (16)中性树脂封片。
[0103] 同时，发明人将六周龄ApoE-/-小鼠随机分成两组，其中，实验组注射IL-36γ抗体中和内源IL-36γ，对照组注射同型对照抗体(每周两次，连续注射六周)；或者实验组注射IL-36γ受体拮抗剂IL-36Ra，对照组注射PBS。之后进行高脂喂养建立动脉粥样硬化模型。采用上述相同的方法对两组小鼠进行表型分析，发现相比对照组，实验组小鼠动脉粥样硬化程度明显减轻。
[0104] 实施例3 IL-36γ促进巨噬细胞的募集
[0105] 单核细胞/巨噬细胞在动脉粥样硬化的早期阶段起到非常重要的作用。发明人检测了IL-36γ对巨噬细胞募集的调控。分离对照组和注射重组IL-36γ实验组小鼠腹腔巨噬细胞，体外Transwell迁移实验(使用8μm孔径的6.5mm直径的Transwell TM chambers，购自Corning公司)检测在oxLDL诱导下腹腔巨噬细胞的迁移情况。实验结果参考图4，相比于对照组小鼠，注射重组IL-36γ实验组小鼠腹腔巨噬细胞迁移数目明显增多，二组之间差异有统计学意义。*P<0.05，**P<0.01；n.s.，没有差别，统计学分析采用学生t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。
[0106] 实验方法：
[0107] (1)分离两组小鼠腹腔巨噬细胞；
[0108] (2)105个细胞混悬于100mLRPMI 1640培养基加入小室中，下层培养孔中加入oxLDL作为诱导剂；
[0109] (3)24小时后，固定小室中细胞，0.1％结晶紫溶液染色10分钟；
[0110] (4)取下小室底膜，随机选取四个视野计数。
[0111] 实施例4 IL-36γ促进泡沫细胞的形成
[0112] 泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化过程早期阶段非常关键的步骤。研究在抑制巨噬细胞泡沫细胞中脂质的积累和减少炎症反应的新方法可能在防治心血管疾病提供新的线索。发明人建立了巨噬细胞泡沫细胞形成的体外模型，分析了IL-36γ对动脉粥样硬化过程中的早期关键环节的调控作用。培养巨噬细胞，实验组加不同浓度IL-36γ处理，对照组加PBS处理，oxLDL诱导其形成泡沫细胞。通过油红O染色检测泡沫细胞的形成情况，同时检测细胞内游离胆固醇和胆固醇酯水平。实验结果见图5和图6。比例尺代表25μm。实验结果重复三次，*P<0.05，**P<0.01；n.s.，没有差别，统计学分析采用单因素方差分析(a one-way analysis of variance)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。
[0113] 实验结果表明：IL-36γ显著促进oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成，细胞内游离胆固醇和胆固醇酯水平显著上调。
[0114] 实验方法：
[0115] 油红O染色
[0116] (1)RAW264.7细胞铺入加了细胞爬片的12孔板中，加入不同浓度IL-36γ(分别为0，20ng/mL，50ng/mL)6小时后，加入oxLDL(20μg/mL)孵育24小时；
[0117] (2)吸弃培养基，PBS洗一次；
[0118] (3)10％中性甲醛固定10分钟；
[0119] (4)加入60％异丙醇(PBS稀释)稍洗一下；
[0120] (5)0.5％油红O溶液(sigma)与水3:2比例稀释静置10分钟后中速定性滤纸过滤；
[0121] (6)染色30分钟，注意避光；
[0122] (7)加入60％异丙醇稍洗；
[0123] (8)苏木素染核，自来水冲洗；
[0124] (9)取出爬片，使用甘油明胶封片后显微镜下拍照。
[0125] 细胞内游离胆固醇和胆固醇酯水平检测：
[0126] (1)RAW264.7细胞铺入12孔板中，加入不同浓度IL-36γ(分别为0，20ng/mL，50ng/mL)6小时后，加入oxLDL(20μg/mL)孵育24小时；
[0127] (2)使用胆固醇和胆固醇酯检测试剂盒(Biovision，#K623-100)检测细胞内总胆固醇和胆固醇酯水平，游离胆固醇水平＝总胆固醇-胆固醇酯。
[0128] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 寻找相近语义汉字对的方法和装置 | 2020-05-12 | 453 |
| 一种党参寡糖的分离纯化方法及应用 | 2020-05-13 | 449 |
| 带有集成的电磁扭矩转换器的传动装置 | 2020-05-14 | 141 |
| 包括导电胶带的太阳能电池和组件及其制造和使用方法 | 2020-05-12 | 943 |
| 专利分析中的申请人或发明人合并方法 | 2020-05-11 | 624 |
| 丹皮酚在制备治疗急性肾损伤药物方面的应用 | 2020-05-12 | 17 |
| 新大环内酯衍生物 | 2020-05-12 | 729 |
| 一种自适应的高校专利科研团队识别方法 | 2020-05-13 | 743 |
| 带有集成的电磁扭矩转换器的传动装置 | 2020-05-14 | 14 |
| 治疗脉管畸形的化合物 | 2020-05-11 | 91 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈