铜蓝蛋白联合多奈哌齐的应用
阅读：479发布：2021-04-13
专利汇可以提供铜蓝蛋白联合多奈哌齐的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 药品应用领域， 铜 蓝蛋白联合多奈哌齐，在制备 预防 或/和改善或/和 治疗 阿尔茨海默症的药物中的应用；或/和在制备益智类补充剂或药物方面的应用。本发明中 血浆 中参与调节体内 金属离子 平衡的铜蓝蛋白能提高多奈哌齐治疗动物痴呆模型的自理能 力 以及学习和记忆能力，可以起到增强记忆力、提高认知功能的作用。 发明人 发现铜蓝蛋白联合多奈哌齐能够显著改善痴呆动物模型的学习记忆能力。筑巢实验结果表明铜蓝蛋白联合多奈哌齐能够提高痴呆动物模型的筑巢能力，提示痴呆动物的自理能力提高。 水 迷宫实验结果表明铜蓝蛋白能够提高痴呆动物模型的学习记忆能力。，下面是铜蓝蛋白联合多奈哌齐的应用专利的具体信息内容。
1.铜蓝蛋白联合多奈哌齐，在制备预防或/和改善或/和治疗痴呆和/或认知功能障碍的药物中的应用；或/和在制备益智类补充剂或药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铜蓝蛋白来自哺乳动物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述铜蓝蛋白来自健康人。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述铜蓝蛋白的制备原料包括健康人血清。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述痴呆和/或认知功能障碍为阿尔茨海默症或轻度认知障碍。
6.一种用于预防或/和改善或/和治疗痴呆和/或认知功能障碍的联合用药物，包括：预防或/和改善或/和治疗有效量的铜蓝蛋白、以及预防或/和改善或/和治疗有效量的多奈哌齐。
7.根据权利要求6所述的联合用药物，所述铜蓝蛋白和所述多奈哌齐分别使用；优选地，所述铜蓝蛋白通过静脉注射使用，所述多奈哌齐通过口服使用。
铜蓝蛋白联合多奈哌齐的应用
技术领域
背景技术
[0002] 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)又称老年性痴呆，是一种由神经元丢失导致的脑中枢神经系统退行性疾病，在老年人群中该病的发病率约为4％-8％。1906年，德国神经病理学家阿尔茨海默首次报告了一例具有进行性记忆力下降表现的51岁女性患者。1910年，以命名和分类大脑疾病著称的精神病学家Emil Kraepelin提议将此病命名为阿尔茨海默病。该病常见的临床表现为进行性记忆力和认知力减退、语言障碍、精神运动异常等，对患者的正常生活造成严重影响，同时也给家庭和社会带来沉重的负担。2010年，WHO报道全球痴呆患者为3500万，中国为540万。自2010年起，全世界痴呆总人口每20年将翻一倍。
《世界阿尔茨海默病2015报告》指出，到2050年，全球AD的患病人数将增加至1.3亿。AD的发病机制复杂，包括淀粉样蛋白沉淀，脑内金属离子动态失衡，线粒体功能障碍等引起的神经递质减少以及神经元凋亡，涉及多种分子信号通路。
《世界阿尔茨海默病2015报告》指出，到2050年，全球AD的患病人数将增加至1.3亿。AD的发病机制复杂，包括淀粉样蛋白沉淀，脑内金属离子动态失衡，线粒体功能障碍等引起的神经递质减少以及神经元凋亡，涉及多种分子信号通路。
[0004] 近年来有研究把来自于年轻小鼠的血浆重复的注射进老年小鼠，发现血浆可以通过调节参与海马认知的经典分子通路而提高记忆功能。而血浆组成极其复杂，包括蛋白质、脂类、无机盐、糖、氨基酸、代谢废物以及大量的水。
[0005] 因此，目前的科研和实践中，需要找出血浆中具有改善学习记忆能力以及治疗老年性痴呆的成分，并与一线药物联用。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种铜蓝蛋白与多奈哌齐的联合应用。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] 铜蓝蛋白联合多奈哌齐，在制备预防或/和改善或/和治疗痴呆和/或认知功能障碍的药物中的应用；或/和在制备益智类补充剂或药物方面的应用。
[0010] 在优选的实施方式中，所述铜蓝蛋白来自健康人。
[0011] 在优选的实施方式中，所述铜蓝蛋白的制备原料包括健康人血清。
[0012] 在优选的实施方式中，所述痴呆和/或认知功能障碍为阿尔茨海默症或轻度认知障碍。
[0013] 一种用于预防或/和改善或/和治疗痴呆和/或认知功能障碍的联合用药物，包括：预防或/和改善或/和治疗有效量的铜蓝蛋白、以及预防或/和改善或/和治疗有效量的多奈哌齐。
[0014] 在优选的实施方式中，所述铜蓝蛋白和所述多奈哌齐分别使用；优选地，所述铜蓝蛋白通过静脉注射使用，所述多奈哌齐通过口服使用。
[0015] 相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0016] 本发明中血浆中参与调节体内金属离子平衡的铜蓝蛋白能提高多奈哌齐治疗动物痴呆模型的自理能力以及学习和记忆能力，可以起到增强记忆力、提高认知功能的作用。发明人发现铜蓝蛋白联合多奈哌齐能够显著改善痴呆动物模型的学习记忆能力。筑巢实验结果表明铜蓝蛋白联合多奈哌齐能够提高痴呆动物模型的筑巢能力，提示痴呆动物的自理能力提高。水迷宫实验结果表明铜蓝蛋白能够提高痴呆动物模型的学习记忆能力。
附图说明
附图说明
[0017] 图1：检测例1中筑巢行为学实验检测铜蓝蛋白与多奈哌齐联合使用(铜蓝蛋白活性为1.02unit/mg)处理小鼠前后筑巢行为得分。(***p<0.0001vs.WT_PBS+PBS,#p<0.05vs.TG_PBS+PBS,##p<0.01vs.TG_PBS+PBS,###p<0.0001vs.TG_PBS+PBS)[0018] 图2：检测例1中水迷宫行为学实验检测铜蓝蛋白与多奈哌齐联合使用(铜蓝蛋白活性为1.02unit/mg)处理小鼠的记忆改善情况。其中，A部分为小鼠在隐藏平台训练阶段上台时间，B部分为小鼠在测试阶段在目标象限所处时间百分比。(***p<0.0001vs.WT_PBS+PBS,#p<0.05vs.TG_PBS+PBS,###p<0.001vs.TG_PBS+PBS)
[0019] 图3：实施例1中实验时间轴示意图。
具体实施方式
[0020] 为了更好地对本发明的技术特征和效果进行说明，下面采用具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
[0021] 本发明提供铜蓝蛋白联合多奈哌齐，在制备预防或/和改善或/和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用；或/和铜蓝蛋白在制备益智类补充剂或药物方面的应用。
[0022] 所述铜蓝蛋白的制备原料包括健康人血清。
[0023] 本发明人从动物试验水平检测了铜蓝蛋白和多奈哌齐联用对5×FAD转基因(APP)小鼠的记忆力改善情况，结果表明，铜蓝蛋白明显提高多奈哌齐对痴呆模型小鼠的记忆力的改善作用。
[0024] 本发明所用铜蓝蛋白由健康人血清为原料，根据论文《铜蓝蛋白的分离纯化及其性质与功能基团研究》(褚波，2006)中描述的方法所得。所得铜蓝蛋白活性为1.02unit/mg。
[0025] 下面通过实施例对本发明铜蓝蛋白的制备、鉴定和应用进行说明。以下实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，请参照SambrookJ等主编，科学出版社，2017，分子克隆实验指南(第四版)或相应产品的说明书。以下实施例中使用的原代海马细胞是按照如下参考文献培养的：Guo,W.,Y.Ji,et al.(2014)."Neuronal activity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions."J Cell Sci 127(Pt 10):2249-2260。
[0026] 实施例1
[0027] 本实施例的铜蓝蛋白是参考上述论文第17-32页的方法得到，将3.1.5.1的猪血清替换为健康人的血清，得到透析液；再将透析液经过DEAE-Sepharose(方法如3.1.5.2所述)、羟基磷灰石吸附层析(方法如3.1.5.3所述)、Superdex-200凝胶过滤层析(方法如3.1.5.4所述)后获得的比活性最高的组分作为铜蓝蛋白纯品。再将该铜蓝蛋白纯品采用过滤除菌，滤膜为0.22μm低蛋白吸附的PVDF膜，压力为5bar，得到灭菌后的铜蓝蛋白。
[0028] 本实施例是将灭菌后的铜蓝蛋白(CP溶液)与多奈哌齐(DPZ)的联合应用对5xFAD模型鼠筑巢能力和学习记忆能力的检测。
[0029] 本实施例分组和给药方式如下：
[0030]
[0031]
[0032] 其中，组1-3的PBS注射量为均5ml/kg。
[0033] 本实施例的时间轴如图3所示，筑巢实验一共进行2次，第一次是实验开始之前，其作用主要是设置基线，观察给药前后是否有改善，第二次是实验第23-24天，每次每组均进行该实验；实验第25-30天进行水迷宫实验。
[0034] 检测1：筑巢行为学实验检测：
[0035] (1)厨房纸剪成细的长条后揉皱，空笼中加入1cm左右高的木屑垫料，在垫料上均匀撒入3-4g剪碎的厨房纸，放入一只5×FAD转基因(APP)小鼠或野生型(WT)对照小鼠。
[0036] (2)48小时后观察筑巢情况并评分。评分标准如下：
[0037] 0分：小鼠没有动过筑巢材料，筑巢材料保持放入时原样。
[0038] 1分：虽然筑巢材料被小鼠动过，但在笼中没有明显形成巢的位置，筑巢材料分散在笼中。
[0039] 2分：有明显巢的位置，巢扁平，中间没有明显凹陷。
[0040] 3分：有明显巢的位置，巢中间稍有凹陷，高度低于小鼠背部弓起后1/2。
[0041] 4分：有明显巢的位置，巢中间有凹陷，高度为小鼠背部弓起后1/2。
[0042] 5分：有明显巢的位置，巢中间有凹陷，高度高于小鼠背部弓起后1/2。
[0043] 测试结果见图1。第1组(WT_PBS+PBS)得分为4.32±0.22，第2组(TG_PBS+PBS)得分为0.57±0.21，第3组(TG_PBS+15mg/kg CP)得分为1.58±0.43，第4组(TG_0.1mg/kg DPZ+PBS)得分为0.55±0.17，第5组(TG_0.3mg/kg DPZ+PBS)得分为0.83±0.35，第6组(TG_1mg/kg DPZ+PBS)得分为1.69±0.33，第7组(TG_0.1mg/kg DPZ+15mg/kg CP)得分为1.67±0.23，第8组(TG_0.3mg/kg DPZ+15mg/kg CP)得分为1.84±0.29，第9组(TG_1mg/kg DPZ+
15mg/kg CP)得分为3.23±0.26，可见从阿尔茨海默症模型小鼠的筑巢能力上评估，注射铜蓝蛋白能够显著提高多奈哌齐的作用；类似地，同时注射1mg/kg多奈哌齐和铜蓝蛋白的结果也要好于只注射铜蓝蛋白。
15mg/kg CP)得分为3.23±0.26，可见从阿尔茨海默症模型小鼠的筑巢能力上评估，注射铜蓝蛋白能够显著提高多奈哌齐的作用；类似地，同时注射1mg/kg多奈哌齐和铜蓝蛋白的结果也要好于只注射铜蓝蛋白。
[0044] 小鼠的筑巢能力转化到人类指人类对日常生活的自理能力，由此可见，注射铜蓝蛋白可以明显提高多奈哌齐在阿尔茨海默症模型小鼠的日常生活自理能力上的改善作用。
[0045] 检测2：Morris水迷宫测试(水迷宫行为学实验检测)。
[0046] (1)水迷宫实验记录潜伏期的长短测定小鼠的空间辨别能力。水迷宫装置由直径120cm、高50cm的圆形水池和可移动的直径10cm的平台组成，水池的上方装有摄像头并与电脑自动记录仪连接，水温保持(22±3)℃。
[0047] (2)第1-5天训练为隐藏平台训练，平台放置于固定位置并低于水面1cm，加入钛白粉使平台不可见，将小鼠头朝池壁轻轻随机放入水池中4个象限之一，每次试验每只小鼠游泳60s，让其找到水中平台，让其停留5s；若小鼠入水后未能找到平台，则将时间记录为60s，并且将其人为放置在平台上20s，每只小鼠每天重复4次试验。
[0048] (3)最后一次定位航行实验结束后24h，撤出平台，将小鼠放入水中追踪器运动轨迹60s，测试小鼠60s内的运动轨迹、潜伏期及穿过原先放置平台位置象限次数及时间作为空间记忆形成指标，并进行组间对比。
[0049] 注意：整个测试过程中保持实验室内灯光、物品摆放等室内环境一致，以排除环境的干扰。
[0050] 测试结果见图2。其中，A部分为小鼠在隐藏平台训练阶段上台时间，B部分为小鼠在测试阶段在目标象限所处时间百分比。
[0051] A部分中，在隐藏平台训练阶段，对比WT_PBS+PBS组，TG_PBS+PBS和TG_0.1mg/ml DPZ+PBS以及TG_0.3mg/ml DPZ+PBS组学习曲线(逃离潜伏期)第2，3，4天差异显著，后面趋于一致，WT_PBS+PBS组和WT_PBS+15mg/kg CP及各剂量DPZ+CP组学习曲线(逃离潜伏期)相近。所有小鼠在测试之前都学会记住隐藏平台的位置。
[0052] B部分中，各组在目标象限所处时间百分比依次为：第1组(WT_PBS+PBS)为32.1±0.26，第2组(TG_PBS+PBS)为18.8±3.1，第3组(TG_PBS+15mg/kg CP)为27.9±1.3，第4组(TG_0.1mg/kg DPZ+PBS)为18.9±3.8，第5组(TG_0.3mg/kg DPZ+PBS)为21.6±3.1，第6组(TG_1mg/kg DPZ+PBS)为26.9±2.1，第7组(TG_0.1mg/kg DPZ+15mg/kg CP)为26.7±2.4，第8组(TG_0.3mg/kg DPZ+15mg/kg CP)为27.4±0.21，第9组(TG_1mg/kg DPZ+15mg/kg CP)为33.3±2.2(P<0.05vs第3组和第6组)。可见对于阿尔茨海默症模型小鼠来说，注射多奈哌齐联合铜蓝蛋白治疗，能提高单独使用多奈哌齐和单独使用铜蓝蛋白时5×FAD转基因(APP)小鼠在目标象限所处时间；尤其是CP与低剂量DPZ联用增强了DPZ效果，CP与高剂量DPZ联用分别显著增加DPZ以及CP效果。
[0053] 由此可见，在改善阿尔茨海默症模型小鼠的认知水平上，联合使用铜蓝蛋白能提高多奈哌齐的作用。
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