甲状腺恶性肿瘤的特异性基因标志物及其应用
阅读：65发布：2021-04-14
专利汇可以提供甲状腺恶性肿瘤的特异性基因标志物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及医疗检测领域，具体涉及甲状腺 恶性 肿瘤 的特异性基因标志物及其应用。本发明基于加权基因共表达网络分析方法，结合临床病例，发现甲状腺恶性肿瘤与17个基因标志物的异常表达具有特异性相关，可作为特异性基因检测标志物集。 发明人 通过大量的独立临床病理样本验证，进一步确定其中5个特征性基因的特异性突变位点作为 分子诊断 标记物。本发明涉及的基因诊断标记物集对于甲状腺恶性肿瘤的早期分子精确诊断具有重要的临床应用价值，可用于制备检测临床穿刺活检细胞学不确定的恶性甲状腺结节的分子 诊断 试剂 盒 ，尤其对于恶性甲状腺结节 细针穿刺 活检细胞学结果不确定患者的早期精准分子诊断具有重要的临床应用价值。，下面是甲状腺恶性肿瘤的特异性基因标志物及其应用专利的具体信息内容。
1.一种用于检测受试者中甲状腺恶性肿瘤风险的基因标志物集，所述基因标志物集包括SEQ ID NO:1 17所示的一个或多个基因。
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2.一种用于测定权利要求1所述基因标志物集的试剂盒，其特征在于，包含根据SEQ ID NO:1 17所示的基因设计的用于PCR扩增的引物。
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3.一种用于测定权利要求1所述基因标志物集的试剂盒，其特征在于，包含根据SEQ ID NO:1 17所示的基因设计的一种或多种探针。
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4.如权利要求2 3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于获取受试者中甲~
状腺恶性肿瘤检测筛查辅助评估或甲状腺恶性肿瘤风险评估信息的收集。
5.如权利要求1所述的基因标志物集的应用，其特征在于，所述基因标志物集应用于制备用于诊断受试者是否患有甲状腺恶性肿瘤或者是否具有形成甲状腺恶性肿瘤的风险的试剂。
6.根据权利要求5所述的基因标志物集的应用，其特征在于，所述诊断包括将待测样品的DNA测序序列定位到基因标志物集上，并基于定位结果获得基因谱。
7.如权利要求1所述的基因标志物集的应用，其特征在于，所述基因标志物集应用于制备诊断或治疗甲状腺恶性肿瘤的药物。
8.一种用于检测受试者中甲状腺恶性肿瘤风险的基因标志物特异性突变位点，其特征在于，所述特异性突变位点包括FN1(R534P；R2381I；D2376N)，PROS1(K200I；Q571K)，TENM1(V1278L；S1131F)，SCEL(T320S)和/或SLC34A2(T688M；C622R；A200G)。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求8所述的特异性突变位点中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒应用于恶性甲状腺肿瘤的人群筛查或基因诊断。
甲状腺恶性肿瘤的特异性基因标志物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医疗检测领域，具体涉及甲状腺恶性肿瘤的特异性基因标志物及其应用。
背景技术
[0002] 甲状腺癌是内分泌系统中最常见恶性肿瘤之一，发病率在世界范围内迅速上升。建立准确的早期诊断方法，干预甲状腺肿瘤向恶性肿瘤的进程非常重要。目前，细针穿刺活检是甲状腺结节临床评估中最准确及经济的方法，被美国甲状腺协会推荐为标准化临床操作。然而，在细针穿刺活检中，约有30%的临床病例的细胞学检验结果明显不确定，被测样本标记为不确定或疑似的恶性肿瘤，需要进行部分或完全甲状腺切除，并完成进一步的组织学病理检查、判读。虽然后续的术后病理评估结果显示只有6 30%的细胞学检验结果不确定~
的病例最终被确诊为恶性肿瘤，但是这使得该临床手术效率极低、非特异性高、医疗成本偏高。
的病例最终被确诊为恶性肿瘤，但是这使得该临床手术效率极低、非特异性高、医疗成本偏高。
[0003] 生物标志物是由基因突变、基因重组、基于RNA的检测、基因表达谱和免疫组织化学的基因序列产生的，是传统癌症病理评估的有力辅助手段，并已参与临床诊断与治疗中。甲状腺癌是由甲状腺滤泡细胞或滤泡旁细胞产生的内分泌肿瘤，现有报道表明甲状腺癌与一些关键信号通路基因的体细胞突变/删除、或基因重排有关，如BRAF、RAS、NTRK1酪氨酸激酶和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路关键效应因子的突变。随着对甲状腺肿瘤形成的深入了解，基于基因突变的通用生物标志物发现的研究从单一突变转向了分子标记基因或多个突变体。然而，传统的基因突变分子标志物分析不能够可靠地将某些人群中的具恶化特征的标本分离出来，迫切需要新分子标志物以增强突变分析的准确性。
[0004] 近年来，为加强甲状腺癌患者的治疗和保健管理，通过分析甲状腺结节的遗传和表达谱，发现适用的、特异的分子生物标志物进行早期诊断已成为趋势。在众多的计算机化方法中，加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis, WGCNA)被认为是通过基因表达谱分析发现基于功能特征的基因共表达网络最有用的方法之一。在揭示肝癌、肺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤的早期诊断、癌症相关通路或精准治疗靶点的候选生物标志物的发现中具有重要意义。然而到目前为止，在发掘和筛选能够显著检测出恶性甲状腺癌的临床诊断中，尤其是细针穿刺活检细胞学结果不确定的恶性甲状腺肿瘤病理样本的特征性异常表达基因和/或基因特异性突变位点的相关研究还未见报道。
发明内容
[0006] 本发明是基于发明人的以下科学研究结果和数据而作出的：本发明人基于WGCNA的生物信息学分析法，对265例临床细胞学检测结果不确定的组织病理学恶性的甲状腺结节的基因表达谱进行显著相关基因分析从而发现与恶性甲状腺瘤发生显著性相关的基因共表达模块。该模块中含有24个特征性基因；发明人经独立样本数据库验证，24个特征性基因中17个基因的异常表达与恶性甲状腺肿瘤具有显著相关性。发明人将分子精准检测受试者中甲状腺恶性肿瘤风险的基因定义为基因标志物集，所述基因标志物集包括由SEQ ID NO:1-17所示的一个或多个基因，即选自CCND1、CITED1、CLDN1、CLDN16、FBXO2、FN1、FRMD3、GABRB2、KRT19、LIPH、MDK、PROS1、RXRG、SCEL、SLC34A2、STK32A和/或TENM1中的一种或多种；所述的基因标志物集可用于分子精准检测受试者中甲状腺恶性肿瘤风险。对上述基因标志物集进行独立数据的进一步验证，发现用于预测受试者中甲状腺肿瘤风险的基因标志物的特异性突变位点，所述基因标志物的特异性突变位点包括FN1(R534P；R2381I；D2376N)，PROS1(K200I；Q571K)，TENM1(V1278L；S1131F)，SCEL(T320S)和SLC34A2(T688M；C622R；A200G)。进一步，发明人通过大量的独立临床病理样本验证了上述的5个特征性基因的特异性突变位点与恶性甲状腺瘤具有显著的相关性，表明上述的5个特征性基因的特异性突变位点可作为鉴定恶性甲状腺肿瘤的特异性分子诊断标记物。基于所述的5个特征性基因的特异性突变位点可以在分子水平精准的评估甲状腺恶性肿瘤的风险。基于此，本发明提供一种分子精准检测甲状腺恶性肿瘤试剂盒的基因标记物集标准，所述试剂盒包括上述的特异性突变位点中的一种或多种标记物，所述试剂盒可应用于甲状腺恶性肿瘤的人群筛查或基因诊断。
[0007] 进一步的，本发明所述基因标志物集用于筛选治疗或预防甲状腺恶性肿瘤的药物的用途。
[0008] 进一步的，本发明还提供了一种用于测定基因标志物集的试剂盒，其包含根据SEQ ID NO:1 17所示的基因设计的用于PCR扩增的引物。~
[0009] 进一步的，本发明还提供了一种用于测定基因标志物集的试剂盒，其包含根据SEQ ID NO:1 17所示的基因设计的一种或多种探针。~
[0010] 进一步的，本发明所述测定基因标志物集的试剂盒，用于获取受试者中甲状腺恶性肿瘤检测筛查辅助评估或甲状腺恶性肿瘤风险评估信息的收集，尤其用于甲状腺结节细针穿刺活检细胞学结果不确定患者的肿瘤风险评估信息的收集。
[0011] 进一步的，本发明还提供了所述基因标志物集的应用，包括其在制备预测受试者中甲状腺恶性肿瘤风险的试剂中的应用，还包括在制备用于诊断受试者是否患有甲状腺恶性肿瘤或者是否具有形成甲状腺恶性肿瘤的风险的试剂中的应用；所述诊断包括将待测样品的DNA测序序列定位到基因标志物集上，并基于定位结果获得基因谱。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中采用的WGCNA分析法能够将功能模块基因从整个转录基因组中稳健、灵敏地检测出来，而无需预滤波以防止引起选择性偏倚或丢失有用信息。通过无监督聚类和构建基因模块，发现与靶标特征表型相关的网络和特征基因。所构建出来的基因共表达模块由一组基因组成；组内的这些基因保持一致的表达关系，并且共享独立于先验定义的基因组或通路的共同生物调节功能。本发明基于加权基因共表达网络分析得到恶性甲状腺疾病中
17个标志性基因的异常表达，在扩大验证临床样本量后进一步发现其中的5个特征性基因的特异性突变位点；本发明的基因标志物集对于甲状腺恶性疾病的早期检测具有重要的价值；尤其对于甲状腺结节细针穿刺活检细胞学结果不确定患者的早期精准分子诊断具有重要的临床应用价值。
附图说明
17个标志性基因的异常表达，在扩大验证临床样本量后进一步发现其中的5个特征性基因的特异性突变位点；本发明的基因标志物集对于甲状腺恶性疾病的早期检测具有重要的价值；尤其对于甲状腺结节细针穿刺活检细胞学结果不确定患者的早期精准分子诊断具有重要的临床应用价值。
附图说明
[0013] 图1是WGCNA分析细胞学结果不确定样本的工作流程图；图2是样本系统树图及临床特征热图；
图3是基因共表达网络的热图；
图4是基因系统树图和模块簇的组织病理学特征图；
图5是模块--临床特征的相关性关联图；
图6是各模块基因显著性图；
图7是各模块之间的相关性热图；
图8是根据基因间表达量进行经聚类分析得到的各模块间的相关性图；
图9是蓝色模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图10是绿色模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图11是黄色模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图12是绿松石模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图13是灰色模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图14是恶性甲状腺肿瘤中异常表达的标志性基因图；
图15是15个发生改变的基因的oncoprint图表；
图16是5个基因在组织病理学恶性组中显著高表达的图。
图3是基因共表达网络的热图；
图4是基因系统树图和模块簇的组织病理学特征图；
图5是模块--临床特征的相关性关联图；
图6是各模块基因显著性图；
图7是各模块之间的相关性热图；
图8是根据基因间表达量进行经聚类分析得到的各模块间的相关性图；
图9是蓝色模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图10是绿色模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图11是黄色模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图12是绿松石模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图13是灰色模块的基因显著性与模块身份的散点图；
图14是恶性甲状腺肿瘤中异常表达的标志性基因图；
图15是15个发生改变的基因的oncoprint图表；
图16是5个基因在组织病理学恶性组中显著高表达的图。
具体实施方式
[0014] 下面结合附图，进一步阐释本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
[0015] 实施例1本发明通过R软件（版本1.63）中的WGCNA包，利用WGCNA软件包实现加权相关网络分析的各种功能，包括网络构建、检测模块、拓扑特性计算、仿真数据、可视化以及与外部软件的接口。后续所有操作均由WGCNA软件包执行。本发明中所分析的临床病理数据来自49个广泛分布的临床站点（美国，NCBI表达谱数据库），共3789名患者，评估了共4812例甲状腺结节样本（大小>1cm）。首先，对收集的4812例甲状腺结节样本数据进行预处理检查，排除具有过量缺失值的样本，识别异常微阵列样本。预处理后，应用主成分分析（PCA）对初筛后的数据质量进行再次检验，然后对再次检验后的样本进行层次聚类，以进一步检测潜在的异常值。最后共检测出265例细胞学结果不确定样本，按照组织病理学良性或恶性被划分为细胞学不确定-组织病理学良性组（共180例）以及细胞学不确定-组织病理学恶性组（共85例）；图2是WGCNA分析细胞学结果不确定样本的工作流程图，由图2所示，对检测出的265例样本进行WGCNA分析。以细胞学良性-组织病理学良性组（共44例）作为阴性对照；细胞学恶性-组织病理学恶性组（共55例）作为阳性对照。在本申请中，选择软阈值β=7构建共表达网络，当β=7时，R2第一次达到最大值（R2=0.98），此时网络接近无尺度网络分布。
[0016] 发明人首先通过Pearson相关分析根据临床特征----组织病理学、年龄、性别对样本进行聚类，在描述基因之间的关联程度或共性时，WGCNA采取拓扑重叠（topological overlap measure，TOM）计算基因之间的关联程度，其计算得到的模块具有生物学意义。图3是265例细胞学结果不确定样本系统树图及临床特征热图；如图3所示，相关的基因被聚类到一起为邻接矩阵。图4是基因共表达网络热图；由图4可将基因和筛选模型进行可视化表示。图4中上部和左部是全基因系统发育树，不同颜色亮带表示不同的模块，每一个亮点表示每个基因与其他基因的相关性强弱，越亮表示相关性越强。通过使用动态树切割算法识别细胞学不确定样本中的共表达模块，合并相似的共表达网络。图5是基因系统树图和模块簇的组织病理学特征图；共找到6个不同的共表达模块，分别用六种不同颜色来标记：蓝色模块、绿松石模块、绿色模块、棕色模块、黄色模块和灰色模块。在鉴定模块后，用T-test计算每个基因在不同组之间的基因差异表达显著性检验p值，并将显著性p值的以10为底的对数值定义为基因显著性（gene significance，GS），再将模块显著性（module significance，MS）定义为模块包含的所有基因显著性的平均值。然后比较MS，一般MS越高说明这个模块与疾病之间的关联度越高。图6是模块--临床特征的相关性关联图；由图6可知，绿松石模块(t=-0.21，p=0.004)、蓝色模块(t=0.54，p=1e-21)以及绿色模块(t=-0.43，p=-132e )与恶性甲状腺结节状态显著相关。图7是各模块基因显著性图；从图7可以看出，蓝色模块的基因显著性最高。图8是各模块之间的相关性热图，图9是根据基因间表达量进行经聚类分析得到的各模块间的相关性图；由图8、图9可见，表示的都是模块之间的相关性。
[0017] 对于每个模块中包含的基因，我们还绘制了模块身份与基因显著性的散点图，图10是蓝色模块的模块身份与基因显著性的散点图；图11是绿色模块的模块身份与基因显著性的散点图；图12是黄色模块的模块身份与基因显著性的散点图；图13是绿松石模块的模块身份与基因显著性的散点图；图14是灰色模块的模块身份与基因显著性的散点图；图中，横轴为模块身份（MM），纵轴为基因显著性（GS）。在WGCNA中，MM用公式表达为：MM(i)=Cor(Xi, ME)，用来表示模块中基因的重要性。MM(i)的绝对值越大，说明基因i在模块中就越重要。从图10-14可知，蓝色模块中的GS和MM之间存在高度显著的相关性，表明蓝色模块的基因与恶性组织学特征显著相关。
[0018] 进一步分析与甲状腺恶性组织病理学特征呈正相关的、最显著的蓝色模块（cor=0.77，p=6.8e-6），其包含24个基因：CC2D2B、CCND1、CFH、CITED1、CLDN1、CLDN16、FBXO2、FN1、FRMD3、G0S2、GABRB2、KRT19、LIPH、MDK、NDUFC2、PPP2R2B、PROS1、RXRG、SCEL、SERGEF、SLC34A2、ST3GAL5、STK32A和TENM1。发明人验证了该24个标志基因在原样本集中的表达。
[0019] 表1.蓝色模块中含有的24个基因在原样本集中不同病例组间基因表达水平的比较基因号 分组 均值 标准差 倍数变化（恶性/良性） p值
CC2D2B 第一组 4.5471 0.0509 0 0
第二组 4.9695 0.0991 1.0929 <0.0001
第三组 4.5078 0.0696 0.9914 0.718
第四组 4.8765 0.0929 1.0725 0.002
CCND1 第一组 8.784 0.0532 0 0
第二组 9.5306 0.1062 1.085 <0.0001
第三组 8.4014 0.0939 0.9564 0.0013
第四组 10.2243 0.0925 1.164 <0.0001
CFH 第一组 6.4653 0.0806 0 0
第二组 7.1735 0.1893 1.1095 <0.0001
第三组 6.4615 0.1517 0.9994 0.9831
第四组 9.0629 0.1889 1.4018 <0.0001
CITED1 第一组 7.1338 0.0981 0 0
第二组 8.6891 0.2053 1.218 <0.0001
第三组 6.7193 0.0929 0.9419 0.0433
第四组 9.7515 0.2111 1.3669 <0.0001
CLDN1 第一组 7.6796 0.1184 0 0
第二组 9.443 0.2029 1.2296 <0.0001
第三组 7.3308 0.1857 0.9546 0.1755
第四组 11.1833 0.1335 1.4562 < 0.0001
CLDN16 第一组 6.4054 0.0821 0 0
第二组 8.2403 0.2322 1.2865 <0.0001
第三组 6.3907 0.1392 0.9977 0.9349
第四组 10.1718 0.2151 1.588 <0.0001
FBXO2 第一组 7.0883 0.0325 0 0
第二组 7.5309 0.0638 1.0624 <0.0001
第三组 7.0122 0.0454 0.9893 0.2748
第四组 7.9077 0.0839 1.1156 < 0.0001
FN1 第一组 8.8063 0.129 0 0
第二组 10.1406 0.2211 1.1515 <0.0001
第三组 9.5825 0.2684 1.0881 0.0086
第四组 12.459 0.1306 1.4148 <0.0001
FRMD3 第一组 6.9935 0.0742 0 0
第二组 7.7732 0.151 1.1115 < 0.0001
第三组 6.7098 0.0795 0.9594 0.0691
第四组 8.186 0.1337 1.1705 < 0.0001
G0S2 第一组 7.8689 0.0803 0 0
第二组 8.6001 0.139 1.0929 < 0.0001
第三组 8.2743 0.1643 1.0515 0.0266
第四组 9.2176 0.1089 1.1714 < 0.0001
GABRB2 第一组 4.8529 0.0418 0 0
第二组 6.588 0.2423 1.3575 < 0.0001
第三组 4.7676 0.0477 0.9824 0.3327
第四组 9.1577 0.2228 1.887 < 0.0001
KRT19 第一组 7.9836 0.0464 0 0
第二组 8.8815 0.1368 1.1125 < 0.0001
第三组 7.9101 0.0672 0.9908 0.4615
第四组 10.4713 0.1432 1.3116 < 0.0001
LIPH 第一组 4.6926 0.064 0 0
第二组 6.3388 0.1831 1.3508 < 0.0001
第三组 4.4334 0.0783 0.9448 0.0566
第四组 7.9835 0.1626 1.7013 < 0.0001
MDK 第一组 7.4542 0.0344 0 0
第二组 8.189 0.0768 1.0986 < 0.0001
第三组 7.2495 0.0539 0.9725 0.0065
第四组 8.967 0.0871 1.203 < 0.0001
NDUFC2 第一组 6.5858 0.063 0 0
第二组 7.0248 0.1058 1.0667 0.0002
第三组 6.4155 0.0819 0.9741 0.2045
第四组 6.9706 0.1242 1.0584 0.0042
PPP2R2B 第一组 6.5754 0.0303 0 0
第二组 6.4025 0.0579 0.9737 0.0039
第三组 6.4608 0.0612 0.9826 0.095
第四组 6.0673 0.0393 0.9227 < 0.0001
PROS1 第一组 7.8668 0.0744 0 0
第二组 9.1498 0.1852 1.1631 < 0.0001
第三组 7.94 0.1236 1.0093 0.6528
第四组 10.958 0.1274 1.3929 < 0.0001
RXRG 第一组 5.7742 0.0552 0 0
第二组 6.9801 0.1706 1.2088 < 0.0001
第三组 5.5145 0.0352 0.955 0.0227
第四组 7.9765 0.1641 1.3814 < 0.0001
SCEL 第一组 5.047 0.0761 0 0
第二组 6.1447 0.1549 1.2175 < 0.0001
第三组 4.6304 0.0914 0.9174 0.0101
第四组 7.5012 0.1951 1.4863 < 0.0001
SERGEF 第一组 8.8427 0.0562 0 0
第二组 9.3538 0.0836 1.0578 < 0.0001
第三组 8.6541 0.0684 0.9787 0.1135
第四组 9.4299 0.1032 1.0664 < 0.0001
SLC34A2 第一组 7.4009 0.1153 0 0
第二组 9.115 0.2673 1.2316 < 0.0001
第三组 7.4303 0.2147 1.004 0.9088
第四组 11.6827 0.2289 1.5786 < 0.0001
ST3GAL5 第一组 9.311 0.0485 0 0
第二组 9.9544 0.0879 1.0691 < 0.0001
第三组 9.1612 0.0649 0.9839 0.1484
第四组 10.456 0.0805 1.123 < 0.0001
STK32A 第一组 6.5912 0.0677 0 0
第二组 7.338 0.1027 1.1133 < 0.0001
第三组 6.1852 0.0722 0.9384 0.0046
第四组 7.8668 0.1127 1.1935 < 0.0001
TENM1 第一组 5.6507 0.0888 0 0
第二组 6.7176 0.1683 1.1888 < 0.0001
第三组 5.2242 0.0739 0.9245 0.021
第四组 6.9922 0.1526 1.2374 < 0.0001
由表1可知，蓝色模块中基因的表达异常与恶性病理组织特征呈现出显著的相关性。与第一组细胞学不确定性-组织病理学良性组的样本相比，23个特征标志基因在第二组细胞学不确定-组织病理学恶性的样本中显示出显著的高表达（fold change>1.0，p<0.001）；1个特征标志基因PPP2R2B在组织病理学恶性组中显示出显著的低表达（p=0.0039）。
CC2D2B 第一组 4.5471 0.0509 0 0
第二组 4.9695 0.0991 1.0929 <0.0001
第三组 4.5078 0.0696 0.9914 0.718
第四组 4.8765 0.0929 1.0725 0.002
CCND1 第一组 8.784 0.0532 0 0
第二组 9.5306 0.1062 1.085 <0.0001
第三组 8.4014 0.0939 0.9564 0.0013
第四组 10.2243 0.0925 1.164 <0.0001
CFH 第一组 6.4653 0.0806 0 0
第二组 7.1735 0.1893 1.1095 <0.0001
第三组 6.4615 0.1517 0.9994 0.9831
第四组 9.0629 0.1889 1.4018 <0.0001
CITED1 第一组 7.1338 0.0981 0 0
第二组 8.6891 0.2053 1.218 <0.0001
第三组 6.7193 0.0929 0.9419 0.0433
第四组 9.7515 0.2111 1.3669 <0.0001
CLDN1 第一组 7.6796 0.1184 0 0
第二组 9.443 0.2029 1.2296 <0.0001
第三组 7.3308 0.1857 0.9546 0.1755
第四组 11.1833 0.1335 1.4562 < 0.0001
CLDN16 第一组 6.4054 0.0821 0 0
第二组 8.2403 0.2322 1.2865 <0.0001
第三组 6.3907 0.1392 0.9977 0.9349
第四组 10.1718 0.2151 1.588 <0.0001
FBXO2 第一组 7.0883 0.0325 0 0
第二组 7.5309 0.0638 1.0624 <0.0001
第三组 7.0122 0.0454 0.9893 0.2748
第四组 7.9077 0.0839 1.1156 < 0.0001
FN1 第一组 8.8063 0.129 0 0
第二组 10.1406 0.2211 1.1515 <0.0001
第三组 9.5825 0.2684 1.0881 0.0086
第四组 12.459 0.1306 1.4148 <0.0001
FRMD3 第一组 6.9935 0.0742 0 0
第二组 7.7732 0.151 1.1115 < 0.0001
第三组 6.7098 0.0795 0.9594 0.0691
第四组 8.186 0.1337 1.1705 < 0.0001
G0S2 第一组 7.8689 0.0803 0 0
第二组 8.6001 0.139 1.0929 < 0.0001
第三组 8.2743 0.1643 1.0515 0.0266
第四组 9.2176 0.1089 1.1714 < 0.0001
GABRB2 第一组 4.8529 0.0418 0 0
第二组 6.588 0.2423 1.3575 < 0.0001
第三组 4.7676 0.0477 0.9824 0.3327
第四组 9.1577 0.2228 1.887 < 0.0001
KRT19 第一组 7.9836 0.0464 0 0
第二组 8.8815 0.1368 1.1125 < 0.0001
第三组 7.9101 0.0672 0.9908 0.4615
第四组 10.4713 0.1432 1.3116 < 0.0001
LIPH 第一组 4.6926 0.064 0 0
第二组 6.3388 0.1831 1.3508 < 0.0001
第三组 4.4334 0.0783 0.9448 0.0566
第四组 7.9835 0.1626 1.7013 < 0.0001
MDK 第一组 7.4542 0.0344 0 0
第二组 8.189 0.0768 1.0986 < 0.0001
第三组 7.2495 0.0539 0.9725 0.0065
第四组 8.967 0.0871 1.203 < 0.0001
NDUFC2 第一组 6.5858 0.063 0 0
第二组 7.0248 0.1058 1.0667 0.0002
第三组 6.4155 0.0819 0.9741 0.2045
第四组 6.9706 0.1242 1.0584 0.0042
PPP2R2B 第一组 6.5754 0.0303 0 0
第二组 6.4025 0.0579 0.9737 0.0039
第三组 6.4608 0.0612 0.9826 0.095
第四组 6.0673 0.0393 0.9227 < 0.0001
PROS1 第一组 7.8668 0.0744 0 0
第二组 9.1498 0.1852 1.1631 < 0.0001
第三组 7.94 0.1236 1.0093 0.6528
第四组 10.958 0.1274 1.3929 < 0.0001
RXRG 第一组 5.7742 0.0552 0 0
第二组 6.9801 0.1706 1.2088 < 0.0001
第三组 5.5145 0.0352 0.955 0.0227
第四组 7.9765 0.1641 1.3814 < 0.0001
SCEL 第一组 5.047 0.0761 0 0
第二组 6.1447 0.1549 1.2175 < 0.0001
第三组 4.6304 0.0914 0.9174 0.0101
第四组 7.5012 0.1951 1.4863 < 0.0001
SERGEF 第一组 8.8427 0.0562 0 0
第二组 9.3538 0.0836 1.0578 < 0.0001
第三组 8.6541 0.0684 0.9787 0.1135
第四组 9.4299 0.1032 1.0664 < 0.0001
SLC34A2 第一组 7.4009 0.1153 0 0
第二组 9.115 0.2673 1.2316 < 0.0001
第三组 7.4303 0.2147 1.004 0.9088
第四组 11.6827 0.2289 1.5786 < 0.0001
ST3GAL5 第一组 9.311 0.0485 0 0
第二组 9.9544 0.0879 1.0691 < 0.0001
第三组 9.1612 0.0649 0.9839 0.1484
第四组 10.456 0.0805 1.123 < 0.0001
STK32A 第一组 6.5912 0.0677 0 0
第二组 7.338 0.1027 1.1133 < 0.0001
第三组 6.1852 0.0722 0.9384 0.0046
第四组 7.8668 0.1127 1.1935 < 0.0001
TENM1 第一组 5.6507 0.0888 0 0
第二组 6.7176 0.1683 1.1888 < 0.0001
第三组 5.2242 0.0739 0.9245 0.021
第四组 6.9922 0.1526 1.2374 < 0.0001
由表1可知，蓝色模块中基因的表达异常与恶性病理组织特征呈现出显著的相关性。与第一组细胞学不确定性-组织病理学良性组的样本相比，23个特征标志基因在第二组细胞学不确定-组织病理学恶性的样本中显示出显著的高表达（fold change>1.0，p<0.001）；1个特征标志基因PPP2R2B在组织病理学恶性组中显示出显著的低表达（p=0.0039）。
[0020] 实施例2：独立样本中特征基因验证发明人对24个基因的表达进行独立病理样本数据验证。通过cBioPortal癌症病例基因组学数据库（http://www.cbioportal.org/），对来源于甲状腺乳头状癌(TCGA，Cell 2014)（肿瘤患者512名，对照组337名）的病例数据集进行查询。结果发现，与对照组相比，实施例1中所述24个基因中的17个基因在肿瘤患者中表现出显著高表达。这17个基因分别是：
CCND1、CITED1、CLDN1、CLDN16、 FBXO2、FN1、FRMD3、GABRB2、KRT19、LIPH、MDK、PROS1、RXRG、SCEL、SLC34A2、STK32A和TENM1。图14是恶性甲状腺肿瘤中异常表达的标志性基因图，由图
14可见，所述的17个基因在肿瘤组织中表现出显著高表达。
CCND1、CITED1、CLDN1、CLDN16、 FBXO2、FN1、FRMD3、GABRB2、KRT19、LIPH、MDK、PROS1、RXRG、SCEL、SLC34A2、STK32A和TENM1。图14是恶性甲状腺肿瘤中异常表达的标志性基因图，由图
14可见，所述的17个基因在肿瘤组织中表现出显著高表达。
[0021] 扩大数据验证的样本量，对来源于3个独立研究的甲状腺乳头状癌(TCGA，Cell 2014)、甲状腺癌(TCGA临时)以及低分化及未分化甲状腺癌（MSKCC，JCI 2016）共915名甲状腺癌病例患者的病例数据集进行验证，进一步验证筛选出实施例1中所述24个基因中的15个基因发生改变。这15个基因是：CC2D2B、CFH、CITED1、FN1、G0S2、GABRB2、KRT19、TENM1、PPP2R2B、PROS1、RXRG、SCEL、SERGEF、SLC34A2和STK32A；其涉及到的变化包括：错义突变、扩增、大片段缺失；图15是15个发生改变的基因的oncoprint图表；如图15所示，其中每行代表一个基因，每列代表数据集中不同的肿瘤样品。进一步地，在上述15个发生改变的基因中发现5个标志基因（FN1，PROS1，TENM1，SCEL，SLC34A2）的位点突变可作为潜在生物标志物，包括［FN1(R534P；R2381I；D2376N)，PROS1(K200I；Q571K)，TENM1 (V1278L；S1131F)，SCEL(T320S)和SLC34A2(T688M；C622R；A200G)］。经过测定，所述的5个标志基因在组织病理学恶性组中的表达显著高于组织病理学恶性组，图16是5个基因在组织病理学恶性组中显著高表达图；其中，***表示p值<0.0001；*表示p值<0.01。
[0022] 表2.特征基因有关突变类型的关键信息表基因 样本来源 样本序列号 癌症类型 氨基酸改变 等位基因频率（T） 突变样本数FN1 甲状腺乳头状癌 TCGA-J8-A3O0-01 甲状腺乳头状癌 R534P 0.33 9
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-J8-A3O0-01 甲状腺癌 R534P 0.33 9
PROS1 甲状腺乳头状癌 TCGA-EM-A22L-01 甲状腺乳头状癌 K200I 0.36 10
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-EM-A22L-01 甲状腺滤泡状癌 K200I 0.36 10
甲状腺乳头状癌 TCGA-EM-A4FV-01 甲状腺乳头状癌 Q571K 0.21 20
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-EM-A4FV-01 甲状腺癌 Q571K 0.21 21
SCEL 甲状腺乳头状癌 TCGA-EM-A22L-01 甲状腺乳头状癌 T320S 0.19 10
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-EM-A22L-01 甲状腺癌 T320S 0.19 10
SLC34A2 甲状腺乳头状癌 TCGA-BJ-A2NA-01 甲状腺乳头状癌 T688M 0.38 25
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-BJ-A2NA-01 甲状腺癌 T688M 0.38 27
TENM1 甲状腺乳头状癌 TCGA-ET-A3DO-01 甲状腺乳头状癌 S1131F 0.05 17
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-ET-A3DO-01 甲状腺癌 S1131F 0.05 17
表2是5个标志基因FN1、PROS1、TENM1、SCEL和SLC34A2有关突变类型的关键信息表，表中突变类型为错义突变，拷贝数为二倍体，COSMIC数据库为1，由表2可知，5个标志基因的特异性突变位点（FN1（R534P），PROS1（K200I；Q571K），TENM1（S1131F），SCEL（T320S），SLC34A2（T688M））在数据集中得到验证。
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-J8-A3O0-01 甲状腺癌 R534P 0.33 9
PROS1 甲状腺乳头状癌 TCGA-EM-A22L-01 甲状腺乳头状癌 K200I 0.36 10
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-EM-A22L-01 甲状腺滤泡状癌 K200I 0.36 10
甲状腺乳头状癌 TCGA-EM-A4FV-01 甲状腺乳头状癌 Q571K 0.21 20
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-EM-A4FV-01 甲状腺癌 Q571K 0.21 21
SCEL 甲状腺乳头状癌 TCGA-EM-A22L-01 甲状腺乳头状癌 T320S 0.19 10
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-EM-A22L-01 甲状腺癌 T320S 0.19 10
SLC34A2 甲状腺乳头状癌 TCGA-BJ-A2NA-01 甲状腺乳头状癌 T688M 0.38 25
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-BJ-A2NA-01 甲状腺癌 T688M 0.38 27
TENM1 甲状腺乳头状癌 TCGA-ET-A3DO-01 甲状腺乳头状癌 S1131F 0.05 17
甲状腺癌 (TCGA,临时) TCGA-ET-A3DO-01 甲状腺癌 S1131F 0.05 17
表2是5个标志基因FN1、PROS1、TENM1、SCEL和SLC34A2有关突变类型的关键信息表，表中突变类型为错义突变，拷贝数为二倍体，COSMIC数据库为1，由表2可知，5个标志基因的特异性突变位点（FN1（R534P），PROS1（K200I；Q571K），TENM1（S1131F），SCEL（T320S），SLC34A2（T688M））在数据集中得到验证。
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