技术领域
[0001] 本
发明涉及RNA提取领域，具体地是一种茶树RNA提取方法。
背景技术
[0002] 茶树原产于我国西南地区，是一种喜温畏寒的多年生经济作物，从分子
水平上挖掘优良茶树种质资源是一项很有意义的工作。随着现代分子
生物学的发展，构建茶树cDNA文库、茶树基因克隆及表达分析、茶树microRNA分析等已经成为茶树生物技术研究的重点工作，而从茶树中提取出高
质量的RNA是进行这些研究的关键步骤。
[0003] 茶树是一种的多年生木本
植物，富含多糖、多酚类物质，容易在核酸分离纯化时，与RNA相互作用，使得RNA降解，因此，用这些常规方法提取时往往效果较差。
现有技术中常用的RNA提取方法包括CTAB法、Trizol法等，也有很多市售的RNA提取
试剂盒，如史成颖等人利用传统CTAB法，提取获得了茶树嫩叶RNA（史成颖等，提取高质量茶树总RNA的方法研究，安徽农业大学学报，2007年，第34期第3版，360～363页），该茶树RNA的A260/280值为2.08～2.10，RNA浓度为845.5～901.2ng/μL，提取过程消耗了2天的时间。市售的植物RNA提取试剂盒种类较多，提取时间短，一般只需要2～4小时，但针对性不强，提取率和纯度不能很好地满足开展茶树基因工程实验需要。因此，需要寻找一种更加优化的方法，以达到进一步提高总RNA提取率的
基础上缩短提取时间，同时保证RNA的高纯度及完整性的目的。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种茶树RNA提取方法，以提供一种更加优化的方法，进一步提高茶树RNA提取率和纯度，缩短提取时间。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
[0006] 一种茶树RNA提取方法，包括以下步骤：
[0007] （1）取茶树组织，加入茶树组织0.5～1.5倍重量的不溶性聚乙烯吡咯烷
酮PVPP，液氮中
研磨成粉末；
[0008] （2）将步骤（1）的粉末中加入提取液，每1g茶树组织加入4.5mL的提取液，混匀，每1g茶树组织中再加入250μL的β-巯基
乙醇，水浴，得到粗样品；
[0009] （3）将步骤（2）的粗样品在4℃下离心，取上清转移至RNA提取试剂盒的过滤柱中，离心，获得上清液；
[0010] （4）将步骤（3）的上清液中加入0.5倍上清液体积的无水乙醇，混匀，获得粗提液；
[0011] （5）将步骤（4）的粗提液转移至RNA提取试剂盒的
吸附柱中进行吸附，然后用RNA提取试剂盒中的去蛋白液和漂洗液洗涤吸附柱，最后用不含核酸酶的RNA-free水洗脱吸附柱上的RNA，获得茶树RNA。
[0012] 优选地，所述步骤（1）中，茶树组织选自茶树嫩叶、成熟叶、茶树嫩根和茶树花蕾中的一种。
[0013] 优选地，所述步骤（1）中，加入的PVPP重量与茶树组织的重量相等。
[0014] 优选地，所述步骤（2）中，水浴
温度为65℃，水浴时间为30min。
[0015] 优选地，所述步骤（2）中，提取液的配方为：1.4mol/L的NaCl，重量百分比为2%的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，100mmol/L的三羟甲基
氨基甲烷的
盐酸溶液Tris-HCl和20mmol/L的
乙二胺四乙酸EDTA，
溶剂为焦
碳酸二乙酯DEPC水，pH8.0，配制后灭菌。
[0016] 优选地，所述步骤（3）中，离心的转速为12000rpm，离心的时间为5min，将粗样品离心可以去除粗样品中的固体物质，避免后续将样品转入过滤柱时，固体物质堵塞过滤柱。
[0017] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种茶树RNA提取方法，该方法是将现有技术的CTAB法与RNA提取试剂盒结合，在现有茶树RNA提取方法上做了进一步优化，用该方法提取茶树RNA的用时只需2小时，大大缩短了提取时间，同时，用该方法提取茶树RNA与现有技术相比，茶树RNA的提取率和纯度都有大幅度提高。
附图说明
[0018] 图1为茶树嫩叶RNA的甲
醛变性胶
电泳图，其中泳道1～3为3个重复；
[0019] 图2为茶树成熟
叶片RNA的甲醛变性胶电泳图，其中泳道1～2为2个重复；
[0020] 图3为茶树嫩根中RNA的甲醛变性胶电泳图，其中泳道1～3为3个重复；
[0021] 图4为茶树花蕾RNA的甲醛变性胶电泳图，其中泳道1～3为3个重复；
[0022] 图5为用试剂盒提取的茶树嫩叶RNA的甲醛变性胶电泳图，其中1～2为2个重复。
具体实施方式
[0023] 下面对本发明的
实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0024] 实施例1
[0025] 本实施例为茶树嫩叶RNA提取方法，包括以下步骤：
[0026] （1）取茶树嫩叶0.2g，加入0.2g的不溶性聚乙烯吡咯烷酮，液氮中迅速研磨成粉末；
[0027] （2）配制提取液并灭菌，将步骤（1）的粉末中加入900μL的提取液，混匀，再加入50μL的β-巯基乙醇，65℃下水浴30min，得到粗样品，所述提取液的配方为：1.4mol/L的NaCl，重量百分比为2%的十六烷基三甲基溴化铵，100mmol/L的Tris-HCl，20mmol/L的EDTA，溶剂为水；
[0028] （3）将步骤（2）的粗样品在4℃下离心5min，离心转速为12000rpm，取上清转移至天根RNA提取试剂盒（购于天根生化科技有限公司）的过滤柱CS中，12000rpm离心2min，获得上清液；
[0029] （4）将步骤（3）的上清液中加入0.5倍上清液体积的无水乙醇，混匀，获得粗提液；
[0030] （5）将步骤（4）的粗提液用天根RNA提取试剂盒提取，所述提取步骤包括：
[0031] 1）将粗提液转移至试剂盒的带有收集管的吸附柱CR3中进行吸附，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱CR3重新放回收集管中；
[0032] 2）向上述步骤1）的吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1溶液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱CR3重新放回收集管中；
[0033] 3）配制DNaseⅠ溶液：取10μL的DNaseⅠ的存储液，加入70μL的RDD溶液混匀；
[0034] 4）向上述步骤2）的吸附柱CR3中加入80μL的DNaseⅠ溶液，室温放置15min，然后加入350μL的去蛋白液RW1溶液，12000rpm下离心1min，弃废液，将CR3重新放回收集管中；
[0035] 5）向上述步骤4）的吸附柱CR3中加入500μL的漂洗液RW（使用前已按试剂盒
说明书中的提示加入无水乙醇），室温静置2min，12000rpm下离心1min，弃废液，将CR3重新放回收集管中；
[0036] 6）重复上述步骤5），在12000rpm下离心2min，弃废液，将吸附柱CR3于室温下静置10分钟以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液
[0037] 7）将上述步骤6）的吸附柱CR3放入一个新的离心管中，向吸附膜中悬空滴加50μL不含核酸酶的RNA-free水，室温放置2min，12000rpm下离心2min，得到得溶液即为RNA。得到的所述总RNA。
[0038] 以上提取方法中所用到的试剂和实验器材均不含核酸酶，重复3次，提取获得的RNA甲醛变性胶电泳结果如图1所示。
[0039] 实施例2
[0040] 本实施例为茶树成熟叶的RNA提取方法，取茶树成熟叶0.2g，剪碎，加入0.2g的PVPP，其它步骤同实施例1，重复2次，提取获得的RNA甲醛变性胶电泳结果如图2所示。
[0041] 实施例3
[0042] 本实施例为茶树嫩根的RNA提取方法，取茶树嫩根0.2g，剪碎，加入0.2g的PVPP，其它步骤同实施例1，重复3次，提取获得的RNA甲醛变性胶电泳结果如图3所示。
[0043] 实施例4
[0044] 本实施例为茶树花蕾的RNA提取方法，取茶树花蕾0.2g，加入0.2g的PVPP，其它步骤同实施例1，重复3次，提取获得的RNA甲醛变性胶电泳结果如图4所示。
[0045] 取实施例1～4提取的茶树RNA，用甲醛变性胶进行电泳检测，获得如图1～4所示的电泳图，另取茶树嫩叶，用天根RNA提取试剂盒提取RNA作为对照组，重复2次，得到如图5所示的甲醛变性胶电泳图。
[0046] 通过核酸定量仪检测实施例1～4提取的茶树RNA和对照组的RNA的A260/280值和RNA浓度，计算RNA平均浓度，结果如下表1所示：
[0047] 表1：茶树RNA的A260/280值和提取率的测定结果
[0048]
[0049] 本发明的茶树RNA提取方法提取所用的时间只需2小时，从表1中可以看出，用本发明改良的茶树RNA提取方法提取获得的茶树嫩叶RNA的浓度提高50%以上，说明该方法提取的RNA的提取率高；A260/280值更接近2，说明RNA降解的程度更小，纯度更高，将图1～4和图5做比较，可以看出，与RNA提取试剂盒提取获得的RNA相比，本发明改良方法提取获得的RNA电泳条带更清晰，无拖带杂带，RNA质量好。
