一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置及制备方法与用途
专利汇可以提供一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置及制备方法与用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 专利 公开一种胶体金检测装置及其制备方法，旨在提供一种快速简便，灵敏度高，可检测薄荷及其饮片中掺有易混品留兰香的快筛 试剂 盒 ，适用于中药饮片掺入易混品的现场测定，属于 生物 检测技术领域。装置由 试纸 条及反应杯组成。其中试纸条包括 底板 ，沿同一方向依次铺设的样品垫， 硝酸 纤维 素膜和吸 水 纸，硝酸 纤维素 膜上包括检测线和质控线；反应杯内含有胶体金标记 抗体 。本发明应用层析式免疫胶体金原理，试纸中检测线与质控线比色来半定量检测样品中的香芹 酮 残留量，在短时间内快速准确地检测出样品是否含有香芹酮，能够满足中药饮片监管部 门 对薄荷及其饮片中掺有留兰香快速检测需求，能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。，下面是一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置及制备方法与用途专利的具体信息内容。
1.一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置，其特征在于，所述检测装置包括试纸条及反应杯；试纸条包括底板，底板上沿同一方向依次铺设有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线；检测线为能与香芹酮单克隆抗体结合的香芹酮偶联抗原；所述质控线为能与香芹酮单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体；所述反应杯中包含胶体金标记香芹酮单克隆抗体。
2.一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置的制备方法，用于制备如权利要求
1所述的检测装置；其特征在于，包括以下步骤：
制备硝酸纤维素膜，在所述硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线；
所述检测线为能与香芹酮单克隆抗体结合的香芹酮偶联抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；所述质控线为能与香芹酮单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体进行线性点样制得；
组装试纸条：在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品垫、硝酸纤维素膜及吸水纸；
制备反应杯：所述反应杯中包含胶体金标记香芹酮单克隆抗体；
所述胶体金标记香芹酮单克隆抗体使用制得的胶体金及香芹酮单克隆抗体偶联制得。
3.如权利要求2所述的一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置的制备方法，其特征在于，用于制备检测线的香芹酮偶联抗原是通过以下方法获得：
取香芹酮半抗原0.1mmol溶于2mLN，N-二甲基甲酰胺中，搅拌加入0.2mmol 二环己基碳二亚胺和0.1mmol N-羟基琥珀酰亚胺，4℃下磁力搅拌反应12小时，离心后上清夜作为A液；
称取人血清蛋白 140mg 溶于10mL 浓度0.1mol/L、pH为8.0的磷酸缓冲盐溶液，再加入N，N-二甲基甲酰胺1mL，搅拌溶解制备得到B液；磁力搅拌下，A液逐渐滴B液中，4℃下反应 12h；
离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，得到的全抗原以10mg/mL浓度可控的浓度分装于0.5mL 离心管中，冻存于-20℃冰箱中备用。
4.如权利要求2所述的一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置的制备方法，其特征在于，用于检测质控线的兔抗鼠抗体是通过以下方法获得：
用载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50～100μg/次，背部皮下分多点注射；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取IgG 抗体，-20℃冻存备用。
5.如权利要求2所述的一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置的制备方法，其特征在于，反应杯的胶体金标记香芹酮单克隆是通过以下方法获得：
胶体金的制备，取质量比浓度为1％的氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积，得到胶体金溶液；
胶体金标记单克隆抗体的制备，调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入香芹酮的单克隆抗体，1h后加入抗体量相当的聚乙二醇，充分反应30min后加入抗体量相当的牛血清白蛋白，加完后，继续搅拌30min，在9000rpm下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加PNPB缓冲液或者磷酸缓冲盐溶液重悬备用。
6.如权利要求2或5所述的一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置的制备方法，其特征在于，所述香芹酮单克隆抗体采用以下步骤制备：
香芹酮半抗原的制备
在100mL的三颈瓶中依次加入1.5g香芹酮，1.4g羧甲氧基胺半盐酸盐，甲醇8mL，吡啶
2mL，蒸馏水2mL，65℃反应5h，旋蒸完后，加水，用稀盐酸将溶液调为微酸性后再用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后拌样，过柱提纯得香芹酮半抗原；
香芹酮免疫抗原的制备
取香芹酮半抗原 0.1mmol 溶于2mLN，N-二甲基甲酰胺中，搅拌加入0.2mmol 二环己基碳二亚胺和0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液；
称取血蓝蛋白 140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L、pH8.0的磷酸缓冲盐溶液中，再加入N，N-二甲基甲酰胺1mL，搅拌溶解制备得到B液；磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h；离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液；
得到的全抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中；冻存于-20℃冰箱中；
香芹酮免疫抗原制备单克隆抗体
使用香芹酮免疫抗原并鉴定后免疫4只6周龄BALB/C小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按个数比8:1的比例混合于
50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1100r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中；把 1mL质量百分比浓度为50%的聚乙二醇-4000缓缓加入细胞中，在
1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基 1mL，后30s加入2mL无血清培养基，然后快速加入27mL无血清培养基终止融合过程，
1100r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，37℃、体积分数5%的CO2条件下培养；7天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备；
采用体内诱生腹水法生产抗香芹酮单克隆抗体：选4只经产昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油 0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×106/只，10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水；用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经紫外测定抗香芹酮单克隆抗体的含量。
7.一种薄荷及其饮片中掺有留兰香的胶体金快速检测装置的应用，其特征是，所述步骤如下：
（1）样品的预处理：取2g已经切碎的某薄荷饮片中药材样品加入到25mL离心管中，分别加入浓度均为10.0mg/L香芹酮各100μL，然后加入8mL含有10%乙醇的pH值为7.2的磷酸缓冲盐溶液的提取液，充分震荡混匀后即为待测液；阴性对照加100μL7.2的磷酸缓冲盐溶液的提取液，其它操作不变；
（2）检测：吸取上述待测液200μL于反应杯中的红色微孔，并上下抽吸10次混匀，20-40°C开始第一步反应，并计时3分钟；将试纸条插入到红色微孔中；20-40°C下开始第二步反应，并计时7分钟；从微孔中取出试纸条，轻轻刮去测试条下端的吸水海绵，并进行结果判读；胶体金标记抗体冻干后即为红色微孔；
（3）结果判读：比较检测线即T线与控制线即C线颜色深浅，如果T线颜色深度大于等于C线，结果为阴性，说明检测样品中不含香芹酮，或其残留量低于本产品的检出限；如果T线颜色深度小于C线或T线不显色，则结果为阳性，说明检测样品中香芹酮残留量等于或高于本产品的检出限。
一种薄荷及其饮片中掺有留兰香胶体金检测装置及制备方法
与用途
技术领域
背景技术
发明内容
所述检测线为能与香芹酮单克隆抗体结合的香芹酮偶联抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；所述质控线为能与香芹酮单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体进行线性点样制得；
组装试纸条，在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品垫，硝酸纤维素膜及吸水纸；
制备反应杯，所述反应杯中包含胶体金标记香芹酮单克隆抗体；
所述胶体金标记香芹酮单克隆抗体使用制得的胶体金及香芹酮单克隆抗体偶联制得；
需要说明的是，用于制备检测线的香芹酮偶联抗原是通过以下方法获得：
取香芹酮半抗原0.1mmol溶于2mLDMF（N，N-二甲基甲酰胺）中，搅拌加入0.2mmol DCC（二环己基碳二亚胺）和0.1mmol NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）。4℃下磁力搅拌反应过夜（一般为12小时），离心后上清夜作为A液，称取人血清蛋白 (HSA)140mg 溶于10mL 浓度0.1mol/L的（磷酸缓冲盐溶液）PBS（pH8.0）中。加入DMF（N，N-二甲基甲酰胺） 1mL，搅拌溶解制备得到B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴B液中，4℃下反应 12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。得到的全抗原以10mg/mL（稀释到该浓度）的浓度分装于0.5mL 离心管中。冻存于-20℃冰箱中备用。
胶体金标记单克隆抗体的制备，调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入香芹酮的单克隆抗体，1h后加入抗体量相当的PEG（聚乙二醇），充分反应
30min后加入抗体量相当的BSA，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加PNPB缓冲液或者PBS缓冲液重悬备用。
在100mL的三颈瓶中依次加入1.5g香芹酮，1.4g羧甲氧基胺半盐酸盐，甲醇8mL，吡啶
2mL，蒸馏水2mL，65℃反应5h。旋蒸完后，加水，用稀盐酸将溶液调为微酸性后再用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后拌样，过柱提纯得香芹酮半抗原。
1100r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。把 1mL50%PEG-4000（聚乙二醇-4000）缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基 1mL，后30s加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程，
1100r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，37℃、体积分数5%的CO2条件下培养。7天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。
（2）检测：吸取上述待测液200μL（9-10滴）于反应杯中的红色微孔，并上下抽吸10次混匀，20-40°C开始第一步反应，并计时3分钟；将试纸条插入到红色微孔中；20-40°C下开始第二步反应，并计时7分钟；从微孔中取出试纸条，轻轻刮去测试条下端的吸水海绵，并进行结果判读；胶体金标记抗体冻干后即为红色微孔；
（3）结果判读：比较检测线即T线与控制线即C线颜色深浅，如果T线颜色深度大于等于C线，结果为阴性，说明检测样品中不含香芹酮，或其残留量低于本产品的检出限；如果T线颜色深度小于C线或T线不显色，则结果为阳性，说明检测样品中香芹酮残留量等于或高于本产品的检出限。
具体实施方式
2mL，蒸馏水2mL，65℃反应5h。旋蒸完后，加水，用稀盐酸将溶液调为微酸性后乙酸乙酯萃取
2-3遍，合并有机相，蒸干后拌样，过柱提纯得香芹酮半抗原。
0.2mmol DCC和0.15mmol NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取血蓝蛋白 (KLH)140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS（pH8.0）中。加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应 12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析
3天，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于 -
20℃冰箱中。
5%的CO2条件下培养。7天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。
取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取
1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。
30min。在9000rpm 下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加PNPB重悬备用。
实施例6 香芹酮胶体金检测装置的灵敏度
通过实验，本发明中香芹酮胶体金检测装置的灵敏度为：香芹酮3μg/g。
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