重组人内抑素的高效表达方法
阅读：65发布：2022-10-05
专利汇可以提供重组人内抑素的高效表达方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了利用乳糖做为诱导剂诱导重组人内抑素在大肠杆菌工程菌株中高效表达生产重组人内抑素的方法，其中该工程菌株含有如SEQ ID No 3以及图3所示的核苷酸序列；此外，本发明还涉及SEQ ID No 3以及图3所示的核苷酸序列在构建高效表达重组人内抑素的大肠杆菌工程菌株中用途；以及乳糖诱导法在诱导重组人内抑素的高效表达中的用途。，下面是重组人内抑素的高效表达方法专利的具体信息内容。
1.一种制备重组人内抑素的方法，其特征在于使用含有N端1 位，3-5位氨基酸的编码无意义突变的人内抑素基因的高表达的大 肠杆菌工程菌株进行。
2.根据权利要求1的方法，其中的N端1位，3-5位氨基酸的 编码无意义突变的人内抑素基因是SEQ ID No.3(附图3)所示的核 甘酸
3.根据权利要求1或者2的方法，其中利用乳糖做为诱导剂， 诱导重组人内抑素在大肠杆菌中的高效表达。
4.根据权利要求3的方法，其中的乳糖诱导是通过在细菌工程 菌株生长至OD60014-18时，加入乳糖而进行的。
5.根据权利要求4的方法，其中加入的乳糖的最终浓度为2％。
6.根据权利要求1或者2的方法，其中利用葡萄糖控制蛋白表 达的泄露。
7.根据权利要求6的方法，其中的蛋白表达的泄露是通过在未 诱导表达前，在培养基中加入葡萄糖而进行的。
8.根据权利要求1或者2的方法，其中的大肠杆菌工程菌株是 保藏号为CCTCC NO：M203063的大肠杆菌BL-21(DE-3) /pENDO。
9.一种大肠细菌工程菌株，该菌株已经被含有SEQ ID No.3(或 者附图3)所示的核甘酸的表达载体转化。
10.根据权利要求9的大肠细菌工程菌株，其是于2003年8月 6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉)并且保 藏号为CCTCC NO：M203063的大肠杆菌BL-21(DE-3) /pENDO。
11.一种重组人内抑素，其是由权利要求1-8中任一项的方法所 生产的。
12.一种核苷酸序列，其如SEQ ID No 3以及图3所示。
13.权利要求12的核苷酸序列在构建高效表达重组人内抑素的 大肠杆菌工程菌株中用途。
14.乳糖诱导法在诱导重组人内抑素的高效表达中的用途。
15.权利要求1-8中任一项的方法所生产的重组人内抑素在制备 用于抗新血管形成的药物中的用途。
16.权利要求15的用途，其中的药物用于抗肿瘤。
技术领域
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及利用乳糖做 为诱导剂诱导重组人内抑素在大肠杆菌工程菌株中高效表达生产重 组人内抑素的方法，其中该工程菌株含有如SEQ ID No 3以及图3 所示的核苷酸序列；以及上述基因工程方法所生产的重组人内抑素 及其在制备用于抗新血管形成，特别是抗肿瘤的药物中的用途；此 外，本发明还涉及SEQ ID No 3以及图3所示的核苷酸序列在构建 高效表达重组人内抑素的大肠杆菌工程菌株中用途；以及乳糖诱导 法在诱导重组人内抑素的高效表达中的用途。
背景技术
内抑素是生物体内胶原18自然降解后C末端183个氨基酸多肽 产物，可在生物体液内如血液、尿液中检出。分子量20-24kDa大小。 1997年O’Reilly[1]等首先报导发现这一分子，并指出这一分子因具 有抑制血管内皮细胞生长的作用，故具有抗新生血管形成功能，也 具有明显抑制小鼠移植肿瘤生长的作用。在Boehm[2]等的研究中发 现，反复应用纯化后的内抑素分子，不但明显抑制小鼠移植肿瘤的 生长，而且无毒副作用，也不产生小鼠的耐药性，这无疑是一治疗 肿瘤最有希望的开发药物之一。仅在2年后，美国FDA以历史上最 快的速度批准重组人内抑素治疗实体肿瘤的临床实验前，重组人内 抑素已在II期临床实验。
目前，临床实验中所使用的重组人内抑素为可溶性，由酵母表 达产生，由于成本和产量不高的原因，人们还在寻找新的高效表达、 低成本、过程简单的途径生产重组人内抑素。1997年，自O’Reilly 发现内抑素后，很快将小鼠内抑素基因克隆入原核系统表达载体中， 并获得重组小鼠内抑素高效表达，其诱导方法是利用IPTG，表达后 的蛋白以包涵体形式存在，但蛋白很难以可溶性形式存在，利用复 性再折叠过程处理，可溶性蛋白不足1％。在难以在大肠杆菌中表达 出可溶性重组人内抑素后，人们探讨多种形式，多种不同类型的重 组人内抑素的表达，有的内抑素获得高表达但不溶或不具备活性， 有的具备活性不溶，有的可溶但产量不高。如Boehem[3][4]等1998年 在酵母系统中成功表达可溶性小鼠内抑素，但所获产物具有不均一 的N端，分析可能是由于蛋白酶降解的原因，在用B16F10黑色素瘤 细胞表达重组的小鼠内抑素，获得均一N端产物，有活性，但产量 非常低。1998年SaSaki[5]利用人胚肾细胞表达重组人内抑素可明显 抑制小鼠移植肿瘤的生长。在此系统中，所表达的蛋白产量也非常 有限。1999年Dhanabal[6]等利用大肠杆菌高效表达出重组小鼠内抑 素，但蛋白不溶，所表达出的蛋白有单体，分子量22-25kDa，也 有双体分子，分子量在44-46kDa。从所使用的表达系统分析，依 然是细菌的表达量为最高，但溶解性是一大难题，许多研究组一直 在寻找一个能使细菌表达的重组内抑素可溶的途径[7]，从所获得资 料指出，细菌表达重组内抑素大部分以IPTG做为诱导，国内也有采 用温控和渗透压改变诱导重组人内抑素表达的报道[8]。
因此，本领迫切需要一种既能高效表达，又能使所表达的重组 内抑素可溶并且具有人内抑素所固有的活性的生产重组人内抑素的 方法。
发明概述
针对上述现有技术中的需要，本发明人经过长期的探索和大量 的研究，最终成功地发明了一种既能高效表达，又能使所表达的重 组内抑素可溶并且具有人内抑素所固有的活性的生产重组人内抑素 的方法，从而解决了长期困扰本领域技术人员的技术难题：本发明 根据人胶原18C末端编码氨基酸序列的核苷酸[9]合成扩增重组人内 抑素的PCR引物，然后利用人胚胎肝细胞mRNA做为模板，经反转录 再PCR扩增(RT-PCR)后，获得所期望的扩增片段，经核苷酸序列 测定，所获基因与所推断的人内抑素基因序列相符合，为使基因在 大肠杆菌中获得高效表达，在不改变氨基酸序列的前提下，设计出 N端，细菌偏爱的4个氨基酸编码序列，将突变后的重组人内抑素 基因克隆入表达载体pET 24b(Novagen公司.cat No.69418-3)后， 经IPTG可诱导产生重组人内抑素的表达，由于表达过程有泄露现 象，本发明利用葡萄糖控制蛋白表达的泄露，然后利用乳糖诱导蛋 白的表达，结果重组人内抑素在细菌中的表达约占菌体蛋白的40％ 左右，中试放大发酵实验，乳糖可成功诱导重组人内抑素的表达， 表达量40％左右，而且经乳糖诱导表达的重组人内抑素蛋白易于溶 解、纯化和复性(溶解性很好)，所获蛋白具有明显地抑制内皮细胞 生长和动物移植瘤生长的作用。本发明的目的之一在于利用乳糖做 为诱导剂，诱导重组人内抑素在大肠杆菌中的高效表达；利用乳糖 做为诱导剂，在中试和大规模生产中诱导重组人内抑素的高效表达。
因此，本发明的第一个方面，提供了一种制备重组人内抑素的 方法，其特征在于使用含有SEQ ID No.3(附图3)所示的核甘酸的 高表达细菌工程菌株进行。优选地，在该方法中，利用乳糖做为诱 导剂，诱导重组人内抑素在大肠杆菌中的高效表达。更优选地，在 该方法中，利用葡萄糖控制蛋白表达的泄露(leakeage指非诱导性表 达)。
本发明的第二个方面，提供的一种大肠细菌工程菌株，该菌株 已经被含有SEQ ID No.3(或者附图3)所示的核甘酸的表达载体转 化。该大肠杆菌菌株能高效表达重组人内抑素，而该重组蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID No.4(或者附图3)所示。优选地，该大肠细菌 工程菌株是于2003年8月6日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC，武汉)并且保藏号为CCTCC NO：M203063的 大肠杆菌BL-21(DE-3)/pENDO工程菌株。
本发明的第三个方面，提供了一种重组人内抑素，其是由上述 方法所生产的，其序列如SEQ ID No.4(或者附图3)所示，易于纯 化和复性(溶解性很好，易溶)且与人内抑素具有相同的生物学功 能，即具有抑制血管内皮细胞生长的功能，从而对各种因新血管形 成所致的疾病有治疗及预防作用。
本发明的第四个方面，提供了SEQ ID No 3以及图3所示的核 苷酸序列。
本发明的第五个方面，提供了SEQ ID No 3以及图3所示的核 苷酸序列在构建高效表达重组人内抑素的大肠杆菌工程菌株中用 途。
本发明的第六个方面，提供了乳糖诱导法在诱导重组人内抑素 的高效表达中的用途。
本发明的第七个方面，提供了上述基因工程方法所生产的重组 人内抑素在制备用于抗新血管形成，特别是抗肿瘤的药物中的用途。
但是，在以下的“发明详述”，尤其是“实施例”部分的公开内 容的基础上，本发明的其它方面和优点对本领域的普通技术人员来 说是显而易见的。
附图说明：
图1：人胶原18核苷酸及氨基酸序列(人内抑素(Endostatin) 的核酸及氨基酸序列)。
图2：PCR扩增后所测人内抑素基因序列图，其中图2-1：5’方 向，图2-2：3’方向。
图3：突变后人内抑素核苷酸序列及氨基酸序列。
图4：突变后所测人内抑素基因序列图。
图5：PCR扩增人内抑素基因琼脂糖凝胶电泳图：泳道1：标准 核苷酸分子量；2、4：扩增反应中不含镁离子；3、5：扩增反应中 含1mM镁离子；6：50℃扩增含4mM镁离子；7：58℃扩增含4mM镁 离子。
图6：重组人内抑素基因克隆入pET 24b表达载体图(重组人 血管内皮抑制素质粒构建图谱)。
图7：重组人内抑素在大肠杆菌BL-21(DE3)中IPTG诱导表达： 泳道1：未诱导(含葡萄糖抑制)；2：未诱导(不含葡萄糖抑制)； 3：IPTG诱导2小时；4：IPTG诱导3小时；5：IPTG诱导4小时。
图8：重组人内抑素在大肠杆菌BL-21(DE3)中乳糖诱导的表 达：泳道1：未诱导；2-8：分别为诱导2、4、6、8、10、12、14 小时，表达量的扫描结果为8，表达量：42.0171/99.7967×100％＝ 42.1％。
图9：重组人内抑素中试放大发酵中乳糖诱导的表达：泳道1： 空白；2：未诱导；3-9：分别为诱导2、4、6、8、10、12、14小时； 10：标准分子量。表达量扫描结果为9道，表达量：39.5012/99.8929 ×100％＝39.5％。
图10：纯化复性后重组人内抑素SDS-凝胶电泳图：泳道1： 对照品；2：CM纯化样品；3：CM纯化样品。纯度扫描结果为3道， 纯度为99.0124/99.7281×100％＝99.3％。
图11：重组人内抑素复性后对人内皮细胞生长的抑制作用：纵 轴为抑制率(％)，横轴为内抑素浓度。IC50≤5μg。
图12：重组人内抑素对小鼠移植瘤的生长的抑制作用：纵轴为 移植瘤体积(mm3)，横轴时间(天)。
发明详述
在本说明书的上下文中，除非特别指明，否则本说明书所用的 任何技术术语具有本领域普通技术人员在本领域中通常理解的含 义，而未注明具体条件的实验方法是按照常规实验方法，如金冬雁 等译，分子克隆实验指南第二版，科学出版社，北京，1992；吴乃 虎等，基因工程原理，科学出版社，北京，2000；朱厚础等译，蛋 白质纯化与鉴定实验指南，科学出版社，北京，1999；和李育阳主 编，基因表达技术，科学出版社，北京，2000所述的进行的；或按 照供应商所建议的操作说明书进行的。
为获得人内抑素基因，依据人胶原18C末端183个氨基酸序列 (图1)，合成N端和C端引物序列，并在N端引物设计NdeI酶切 位点和起始码ATG，C端引物设计在终止码后加入-BamHI位点，用 人胚胎肝细胞mRNA做为模板，RT-PCR方法扩增人内抑素基因，经 琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段约550bp分子量大小，与预计的相 符合(图5)，将基因片段克隆入Topo PCR2.1克隆质粒(invitrogen 公司)后，扩增并纯化质粒，经核苷酸序列分析，所获基因序列与 人胶原18C端183个氨基酸序列完全一致(图2)，再将基因克隆入 原核系统表达载体质粒pET 24b(购自Novagen公司)中，转化入BL -21(DE3)宿主菌(购自Invitrogen公司)中，培养后，用IPTG 诱导重组人内抑素的表达，表达后收集细菌，SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳后，在分子量20kDa大小左右有一明显诱导表达带，表达量约 20％左右，为提高重组人内抑素在原核细胞中的表达，本发明设计突 变人内抑素基因N端1位，3-5位氨基酸的核苷酸编码，使之成为 细菌核糖体识别偏爱(图3，图4)，将经突变后的重组人内抑素基 因再克隆入pET 24b质粒中，转化入BL-21(DE3)中，经IPTG诱 导，重组人内抑素蛋白表达提高到40％左右(图7)，实验中发现未 经乳糖诱导表达的对照组中，也有10％左右的人内抑素表达，说明 这一质粒的表达有泄露现象。本发明采用未诱导表达前，将培养基 中加入葡萄糖可成功阻止这种泄露，而且利用乳糖又可成功诱导表 达其表达量在40％左右，在发酵罐中试放大实验中，本发明在前期 发酵中加入葡萄糖，既可作为碳源，又可有效控制表达泄露，待细 菌生成密度达到OD60014-18左右时，加入乳糖进行诱导，继续培养 细菌16小时左右，细菌密度可达OD60020以上，重组人内抑素表达 量为40％左右(图9)，经乳糖诱导后，重组人内抑素经包涵体提取， 复性纯化等步骤，可获纯度达95％以上，并且优选地99％以上的可溶 性蛋白(图10)，纯化后的蛋白具有明显的抑制人血管内皮细胞和 小鼠移植瘤生长的作用(图11和12)。
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些 实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明 的范围。在下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规实验方法进行，或按照厂商所建议的操作说明进行。 实施例1：重组人内抑素基因的获得和细菌偏爱型基因的突变
根据人胶原18C末端的183个氨基酸的核苷酸序列，首先合成 RT-PCR的引物，其引物序列如下：
5’-GC CAT ATG CAC AGC CAC CGC GAC-3’
3’端引物5’-CG GGA TCC CTA CTT GGA GGC AGT-3’
人胚胎肝细胞mRNA来源于人胚肝组织，由Trizol试剂(Invitrogen 公司)一步法提取。
RT-PCR反应条件如下(RT-PCR试剂盒购自Roche公司)：
①5×反转录缓冲液 4μl
MgCl2 2μl(50mM)
dNTP 2μl(10mM)
随机引物 1μl(50pmol)
反转录酶 1μl 2.5IU
mRNA 2μl(1μg/μl)
RNase抑制剂 1μl
42℃水浴100分钟后，95℃保温5分钟，-80℃保存。
②模板(cDNA反应液) 5μl
5’引物 2μl 50pmole
3’引物 2μl 50pmole
dNTP 2μl 10mM
5×PCR缓冲液 20μl
MgCl2 2μl 100mM
Taq DNA聚合酶 1μl 5U
H2O 76μl
最终反应体积100μl
聚合酶链式扩增反应(PCR)的条件如下：98℃变性5分钟， 然后94℃40秒、56℃40秒、72℃50秒共30个循环，最后72℃ 延长10分钟。反应结束后，将PCR样品置于冰上或-80℃冻存。
将RT-PCR反应后的样品在1％琼脂糖电泳，可见在550bp分子 量大小处有明显扩增基因片段(图5)。取1μl扩增反应液，混合3μl H2O和1μl Topo PCR 2.1载体(Invitrogen公司)混合液，室温下作 用5分钟后，取1μl放入感受态细菌shot one(Invitrogen公司) 50μl，冰浴30分钟后，42℃水浴30秒，再加入＞50μl SOS(Invitrogen 公司)培养基(购于Invitrogen公司)，37℃水浴30分钟，铺含有 卡那霉素(30μg/ml)的LB琼脂板过夜，37℃，第二天挑选单克隆， LB(含卡那霉素30μg/ml)培养基振摇培养后，提取质粒，酶切鉴 定。同时做核苷酸序列分析，结果证实，所获基因序列与所推测的 序列完全一致(图2)，利用N端NdeI和C端BamHI酶切位点，切 下重组人内抑素基因并克隆入表达载体pET24b中(图6)，经转化 大肠杆菌细胞BL-21(DE3)后，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB 中培养并诱导重组人内抑素的表达，当细菌浓度OD600达到0.6-0.8 时，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导4小时后，离心收集细菌，经 细菌破碎后在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳下，检测重组人内抑素 的表达，结果显示在分子量20kDa左右，有一明显蛋白诱导表达带， 扫描法计算表达量为20％左右，为再进一步提高重组人内抑素在大 肠杆菌中的表达，利用PCR的方法，将人内抑素基因的前4人氨基 酸的编码突变成细菌偏爱型。5’端突变引物如下：5’-GC CAT ATG CAT AGC CAT CGT GAT TTC CAG CCG GTG CTCC-3’与原3’ 端引物组合，利用野生型人内抑素基因质粒(上述550bp PCR片段 装入Topo PCR2.1载体)为模板，以同样的PCR方法(除引物不同 外)后，也获得550bp扩增片段，克隆入 Topo PCR 2.1(Invitrogen) 后，提取质粒并做核苷酸序列分析，其结果与预计突变结果相符合 (图4)，将突变后的重组人内抑素基因再克隆入pET 246中，转化 BL-21(DE3)后，经培养IPTG诱导表达后，收集菌体15％SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳后，在20kDa分子量大小的表达带约为细菌蛋白 的40％(图7)，结果证实，突变质粒为野生型基因克隆质粒在细菌 中的表达的2倍。优选地，该大肠细菌工程菌株是于2003年8月6 日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉)并且保藏 号为CCTCC NO：M203063的大肠杆菌BL-21(DE-3)/pENDO 工程菌株。
实施例2：乳糖诱导重组人内抑素在大肠杆菌中的高效表达
突变型质粒在BL-21(DE3)宿主菌可诱导高效表达重组人内抑 素。而且在实验中发现，即使未经IPTG诱导的对照组也有明显的蛋 白表达。说明由于启动子过强，对人内抑素的表达有启动泄露现象， 本发明曾利用不同的温度、不同时间、不同培养基尝试防止泄露， 最后发现利用葡萄糖可有效防止泄露，而且不仅在IPTG诱导下表达 重组人内抑素，而且利用乳糖同样可以有效表达重组人内抑素，表 达量达40％左右(图8)。
具体培养基组成份如下：
挑选单克隆，在1.5ml含有50μg氨苄青霉素1ml新鲜LB中，37℃ 培养过夜，第二天，将过夜菌用1∶50新鲜的LB(含氨苄)稀释， 再37℃振摇培养至细菌OD6001.2左右，加入乳糖至终浓度为2％， 继续培养细菌6-8个小时后，离心收集细菌检测重组人内抑素的表 达。
实施例3：乳糖诱导重组人内抑素在中试发酵中的高效表达
重组人内抑素细菌发酵种子液的组成如下：每升培养基中含10g 酪蛋白，5g酵母提取粉，10g氯化钠，2％葡萄糖。实际操作过程如 下：挑取新鲜单一菌落，接种到200ml新鲜种子液中，过夜培养， 第二天10倍体积新鲜种子液继续扩大培养至细菌OD6002.0左右时， 加入发酵罐中，比例为1∶10放大，发酵罐中的培养基依然是种子 液成份。发酵过程中，当溶氧降至0时，加入1/10体积的补料1， 成份为葡萄糖，硫酸胺和硫酸镁，分别为20％、10％和1％，当培养的 细菌OD600达到10时，加入1/20体积的10％酵母提取物，当OD600上 升到14左右时，加入最终浓度为2％的乳糖液进行诱导表达，再继 续培养约14个小时后，OD600约20左右时，放罐，此时每升发酵液 约可得湿菌40g，细菌表达量40％左右，图9为发酵不同时间下重组 人内抑素的表达。
实例4.采用与实例3完全相同的方法，只改变乳糖浓度，分别 为0.01％、0.5％、1％、10％，测定细菌表达量，分别为10％、20％、40 ％、36％。
实施例5：乳糖诱导的重组人内抑素经包涵体纯化、复性、再 纯化
收集菌体后，每罐发酵液可获湿菌1,400g，用冰浴的缓冲液A (50mM Tris-HCl，pH8.3，1mM EDTA，1mM β-巯基乙醇)，约7500ml 混悬菌体后再加入终浓度为0.05％的溶菌酶，4℃下超声破菌，超 声功率为1,000W，时间10min，超声10秒暂停3秒，超声裂解后， 涂片显微镜下检查，细菌破碎率应＞95％。4℃下细菌裂解液离心 7,000rpm/min，离心20分钟，弃上清，沉淀即为粗包涵体。用缓冲 液B(50mM Tris-HCl，pH8.3，4M尿素，1％Trition X-100，1mM EDTA， 5mM β-巯基乙醇)，混悬包涵体后，置室温下10分钟，离心7,000rpm /分，30分钟，洗涤1次，再用缓冲液A洗涤一次，包涵体的纯度 可从50％提高到75％。用缓冲液C(50mM Tris-HCl，pH8.3，8M 尿素，1mM EDTA，15mM β-巯基乙醇)，4℃下搅拌溶解包涵体， 每克湿重包涵体用20ml缓冲液C溶解。搅拌溶解过夜后，10,000rpm /min离心30分钟，收集上清，弃沉淀(上清即为包涵体溶解液)。
将经DEAE-Sepharose Fast Flow纯化后的内抑素装入透析袋中 (分子截留为12,000-14,000kDa)，在PBS缓冲液下加入4M尿素， 透析24小时，再减尿素为2M，调节pH至7.0，同时加入0.1mM氧 化型谷胱甘肽和1mM还原型谷胱甘肽，透析24小时，用平衡液(20mM NaAc/Ac，pH5.8)平衡柱床，然后上样，同时用核酸蛋白检测仪(检 测波长280nm)在线检测，上样后用洗脱液A(0.1M NaCl，20mM NaAc/AcpH5.8)洗脱，收集洗脱峰A，再用平衡液清洗，最后用洗脱液B(0.3M NaCl，20mM NaAc/Ac，pH5.8)洗脱，收集洗脱峰B，经SDS-PAGE 电泳鉴定洗脱峰B含有内抑素蛋白，经纯化复性后得到的纯品纯度 为99.3％。如图10所示。
实施例6：重组人内抑素复性后对人内皮细胞生长的抑制作用
选择生长状态旺盛的ECV细胞(ATCC)，加入少量胰酶，于室 温消化，待消化完全后，小心去除胰酶，加入含3μg.L-1bFGF和2 ％FBS的RPMI medium 1640及青霉素105U.L-1，链霉素100mg.L-1 的培养基终止反应，用滴管将瓶壁上细胞从壁上吹下，并吹打均匀。 再调整细胞浓度为每毫升2×104个，向96孔板中加入0.1ml的细胞 悬液。重组人内抑素再用上述培养基进行不同浓度梯度倍比稀释， 每个浓度梯度设置3个复孔，每孔加液0.1ml，使终浓度(mg.L-1) 分别为：100、50、25、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78，同时设 置空白对照组和阴性对照组。在37℃，饱和湿度及5％CO2条件下静 止培养4h。4h后，小心吸去培养上清，加入0.15ml DMSO，溶解细 胞，用培养板震动器摇匀。再用酶标仪按参比波长为630nm，测试 波长为492nm测定各孔OD吸收值，求出空白及样品每个稀释度3孔 测得的平均值，将样品每个稀释度平均光吸收减去空白平均光吸收， 以阴性对照的光吸收度为50％时的样品浓度。
重组人内抑素的抑制率按下述公式计算：
根据各点的抑制率，绘制量效曲线：以重组人内抑素剂量为横坐 标，以抑制率为纵坐标，Microsoft Excel作图，观察重组人内抑 素的抑制作用并求抑制率为50％时的制剂浓度。
结果表明：产生50％内皮细胞抑制的重组人内抑素的浓度约为 3.50mg.L-1。见图11。
实施例7：重组人内抑素对小鼠移植瘤的生长的抑制作用
试验方法：
1.动物 昆明种小鼠(中国药科大学试验动物中心)，雌雄兼 用，体重18-22g，鼠龄5-6周。
2.肿瘤模型 S180肉瘤。
3.肿瘤移植 选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎 脱臼处死，在无菌条件下(超净台)，用碘酒、酒精消毒动物皮肤， 切开皮肤，剥离肿瘤并称重。在培养皿内将瘤组织剪成小块(室温＞ 15℃时应放冰块上操作)，放入无菌匀浆器内，按1∶3～1∶4(W/V) 加入灭菌生理盐水，匀浆。取受瘤小鼠，于前肢腋窝处碘酒、酒精 消毒，皮下注射肿瘤匀浆液0.2ml/只(肿瘤细胞数约5×106个)。
4.动物分组 于接种后第三天，将荷瘤小鼠随机分为阴性对 照组、阳性对照组和治疗组。治疗组动物数一般10只，阴性对照级 动物数为治疗组动物×√药物配制和试验组数。
5.药物配制和给药途径 溶于水的固体药物，用生理盐水或 注射用水配制。皮下注射给药(须注意注射部位的消毒)，每日给药 一次，阴性对照组注射等体积生理盐水或注射用水。
6.给药时间 接种肿瘤后每日触摸局部，当肿瘤直径达 1～2mm时开始给药，连续用药7天。
7.观察指标 给药后每日测量肿瘤的最长径(r1)、最短径 (r2)，计算肿瘤的体积(V＝1/2×r1×(r2)2)，并记录动物有无不良反 应或死亡，若有死亡应记录死亡时间，分析死亡原因。
8.肿瘤生长抑制率 根据上述的测量结果，计算出肿瘤相对 体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其 中V0为给药时测量所得的肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。 抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
其中：TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
结果显示：按5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg剂量皮下注射重组人 内抑素可明显抑制人胃癌BGC803裸鼠移植肿瘤的生长，如图12所 示。
总上所述，本发明的乳糖诱导的重组人内抑素经包涵体纯化、复性、 再纯化后，蛋白纯度(HPLC)达95％以上(图10)，并具有明显的生 物活性(图11，12)。
参考文献目录：
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序列表 <110>广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 <120>重组人内抑素的高效表达方法 <130>I020301 <160>4 <170>PatentIn version 3.1 <210>1 <211>552 <212>DNA <213>Homo sapiens <220> <221>CDS <222>(1)..(552) <223> <400>1 cac agc cac cgc gac ttc cag ccg gtg ctc cac ctg gtt gcg ctc aac 48 His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn 1 5 10 15 agc ccc ctg tca ggc ggc atg cgg ggc atc cgc ggg gcc gac ttc cag 96 Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln
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180
目前，临床实验中所使用的重组人内抑素为可溶性，由酵母表 达产生，由于成本和产量不高的原因，人们还在寻找新的高效表达、 低成本、过程简单的途径生产重组人内抑素。1997年，自O’Reilly 发现内抑素后，很快将小鼠内抑素基因克隆入原核系统表达载体中， 并获得重组小鼠内抑素高效表达，其诱导方法是利用IPTG，表达后 的蛋白以包涵体形式存在，但蛋白很难以可溶性形式存在，利用复 性再折叠过程处理，可溶性蛋白不足1％。在难以在大肠杆菌中表达 出可溶性重组人内抑素后，人们探讨多种形式，多种不同类型的重 组人内抑素的表达，有的内抑素获得高表达但不溶或不具备活性， 有的具备活性不溶，有的可溶但产量不高。如Boehem[3][4]等1998年 在酵母系统中成功表达可溶性小鼠内抑素，但所获产物具有不均一 的N端，分析可能是由于蛋白酶降解的原因，在用B16F10黑色素瘤 细胞表达重组的小鼠内抑素，获得均一N端产物，有活性，但产量 非常低。1998年SaSaki[5]利用人胚肾细胞表达重组人内抑素可明显 抑制小鼠移植肿瘤的生长。在此系统中，所表达的蛋白产量也非常 有限。1999年Dhanabal[6]等利用大肠杆菌高效表达出重组小鼠内抑 素，但蛋白不溶，所表达出的蛋白有单体，分子量22-25kDa，也 有双体分子，分子量在44-46kDa。从所使用的表达系统分析，依 然是细菌的表达量为最高，但溶解性是一大难题，许多研究组一直 在寻找一个能使细菌表达的重组内抑素可溶的途径[7]，从所获得资 料指出，细菌表达重组内抑素大部分以IPTG做为诱导，国内也有采 用温控和渗透压改变诱导重组人内抑素表达的报道[8]。
因此，本领迫切需要一种既能高效表达，又能使所表达的重组 内抑素可溶并且具有人内抑素所固有的活性的生产重组人内抑素的 方法。
发明概述
针对上述现有技术中的需要，本发明人经过长期的探索和大量 的研究，最终成功地发明了一种既能高效表达，又能使所表达的重 组内抑素可溶并且具有人内抑素所固有的活性的生产重组人内抑素 的方法，从而解决了长期困扰本领域技术人员的技术难题：本发明 根据人胶原18C末端编码氨基酸序列的核苷酸[9]合成扩增重组人内 抑素的PCR引物，然后利用人胚胎肝细胞mRNA做为模板，经反转录 再PCR扩增(RT-PCR)后，获得所期望的扩增片段，经核苷酸序列 测定，所获基因与所推断的人内抑素基因序列相符合，为使基因在 大肠杆菌中获得高效表达，在不改变氨基酸序列的前提下，设计出 N端，细菌偏爱的4个氨基酸编码序列，将突变后的重组人内抑素 基因克隆入表达载体pET 24b(Novagen公司.cat No.69418-3)后， 经IPTG可诱导产生重组人内抑素的表达，由于表达过程有泄露现 象，本发明利用葡萄糖控制蛋白表达的泄露，然后利用乳糖诱导蛋 白的表达，结果重组人内抑素在细菌中的表达约占菌体蛋白的40％ 左右，中试放大发酵实验，乳糖可成功诱导重组人内抑素的表达， 表达量40％左右，而且经乳糖诱导表达的重组人内抑素蛋白易于溶 解、纯化和复性(溶解性很好)，所获蛋白具有明显地抑制内皮细胞 生长和动物移植瘤生长的作用。本发明的目的之一在于利用乳糖做 为诱导剂，诱导重组人内抑素在大肠杆菌中的高效表达；利用乳糖 做为诱导剂，在中试和大规模生产中诱导重组人内抑素的高效表达。
因此，本发明的第一个方面，提供了一种制备重组人内抑素的 方法，其特征在于使用含有SEQ ID No.3(附图3)所示的核甘酸的 高表达细菌工程菌株进行。优选地，在该方法中，利用乳糖做为诱 导剂，诱导重组人内抑素在大肠杆菌中的高效表达。更优选地，在 该方法中，利用葡萄糖控制蛋白表达的泄露(leakeage指非诱导性表 达)。
本发明的第二个方面，提供的一种大肠细菌工程菌株，该菌株 已经被含有SEQ ID No.3(或者附图3)所示的核甘酸的表达载体转 化。该大肠杆菌菌株能高效表达重组人内抑素，而该重组蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID No.4(或者附图3)所示。优选地，该大肠细菌 工程菌株是于2003年8月6日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC，武汉)并且保藏号为CCTCC NO：M203063的 大肠杆菌BL-21(DE-3)/pENDO工程菌株。
本发明的第三个方面，提供了一种重组人内抑素，其是由上述 方法所生产的，其序列如SEQ ID No.4(或者附图3)所示，易于纯 化和复性(溶解性很好，易溶)且与人内抑素具有相同的生物学功 能，即具有抑制血管内皮细胞生长的功能，从而对各种因新血管形 成所致的疾病有治疗及预防作用。
本发明的第四个方面，提供了SEQ ID No 3以及图3所示的核 苷酸序列。
本发明的第五个方面，提供了SEQ ID No 3以及图3所示的核 苷酸序列在构建高效表达重组人内抑素的大肠杆菌工程菌株中用 途。
本发明的第六个方面，提供了乳糖诱导法在诱导重组人内抑素 的高效表达中的用途。
本发明的第七个方面，提供了上述基因工程方法所生产的重组 人内抑素在制备用于抗新血管形成，特别是抗肿瘤的药物中的用途。
但是，在以下的“发明详述”，尤其是“实施例”部分的公开内 容的基础上，本发明的其它方面和优点对本领域的普通技术人员来 说是显而易见的。
附图说明：
图1：人胶原18核苷酸及氨基酸序列(人内抑素(Endostatin) 的核酸及氨基酸序列)。
图2：PCR扩增后所测人内抑素基因序列图，其中图2-1：5’方 向，图2-2：3’方向。
图3：突变后人内抑素核苷酸序列及氨基酸序列。
图4：突变后所测人内抑素基因序列图。
图5：PCR扩增人内抑素基因琼脂糖凝胶电泳图：泳道1：标准 核苷酸分子量；2、4：扩增反应中不含镁离子；3、5：扩增反应中 含1mM镁离子；6：50℃扩增含4mM镁离子；7：58℃扩增含4mM镁 离子。
图6：重组人内抑素基因克隆入pET 24b表达载体图(重组人 血管内皮抑制素质粒构建图谱)。
图7：重组人内抑素在大肠杆菌BL-21(DE3)中IPTG诱导表达： 泳道1：未诱导(含葡萄糖抑制)；2：未诱导(不含葡萄糖抑制)； 3：IPTG诱导2小时；4：IPTG诱导3小时；5：IPTG诱导4小时。
图8：重组人内抑素在大肠杆菌BL-21(DE3)中乳糖诱导的表 达：泳道1：未诱导；2-8：分别为诱导2、4、6、8、10、12、14 小时，表达量的扫描结果为8，表达量：42.0171/99.7967×100％＝ 42.1％。
图9：重组人内抑素中试放大发酵中乳糖诱导的表达：泳道1： 空白；2：未诱导；3-9：分别为诱导2、4、6、8、10、12、14小时； 10：标准分子量。表达量扫描结果为9道，表达量：39.5012/99.8929 ×100％＝39.5％。
图10：纯化复性后重组人内抑素SDS-凝胶电泳图：泳道1： 对照品；2：CM纯化样品；3：CM纯化样品。纯度扫描结果为3道， 纯度为99.0124/99.7281×100％＝99.3％。
图11：重组人内抑素复性后对人内皮细胞生长的抑制作用：纵 轴为抑制率(％)，横轴为内抑素浓度。IC50≤5μg。
图12：重组人内抑素对小鼠移植瘤的生长的抑制作用：纵轴为 移植瘤体积(mm3)，横轴时间(天)。
发明详述
在本说明书的上下文中，除非特别指明，否则本说明书所用的 任何技术术语具有本领域普通技术人员在本领域中通常理解的含 义，而未注明具体条件的实验方法是按照常规实验方法，如金冬雁 等译，分子克隆实验指南第二版，科学出版社，北京，1992；吴乃 虎等，基因工程原理，科学出版社，北京，2000；朱厚础等译，蛋 白质纯化与鉴定实验指南，科学出版社，北京，1999；和李育阳主 编，基因表达技术，科学出版社，北京，2000所述的进行的；或按 照供应商所建议的操作说明书进行的。
为获得人内抑素基因，依据人胶原18C末端183个氨基酸序列 (图1)，合成N端和C端引物序列，并在N端引物设计NdeI酶切 位点和起始码ATG，C端引物设计在终止码后加入-BamHI位点，用 人胚胎肝细胞mRNA做为模板，RT-PCR方法扩增人内抑素基因，经 琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段约550bp分子量大小，与预计的相 符合(图5)，将基因片段克隆入Topo PCR2.1克隆质粒(invitrogen 公司)后，扩增并纯化质粒，经核苷酸序列分析，所获基因序列与 人胶原18C端183个氨基酸序列完全一致(图2)，再将基因克隆入 原核系统表达载体质粒pET 24b(购自Novagen公司)中，转化入BL -21(DE3)宿主菌(购自Invitrogen公司)中，培养后，用IPTG 诱导重组人内抑素的表达，表达后收集细菌，SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳后，在分子量20kDa大小左右有一明显诱导表达带，表达量约 20％左右，为提高重组人内抑素在原核细胞中的表达，本发明设计突 变人内抑素基因N端1位，3-5位氨基酸的核苷酸编码，使之成为 细菌核糖体识别偏爱(图3，图4)，将经突变后的重组人内抑素基 因再克隆入pET 24b质粒中，转化入BL-21(DE3)中，经IPTG诱 导，重组人内抑素蛋白表达提高到40％左右(图7)，实验中发现未 经乳糖诱导表达的对照组中，也有10％左右的人内抑素表达，说明 这一质粒的表达有泄露现象。本发明采用未诱导表达前，将培养基 中加入葡萄糖可成功阻止这种泄露，而且利用乳糖又可成功诱导表 达其表达量在40％左右，在发酵罐中试放大实验中，本发明在前期 发酵中加入葡萄糖，既可作为碳源，又可有效控制表达泄露，待细 菌生成密度达到OD60014-18左右时，加入乳糖进行诱导，继续培养 细菌16小时左右，细菌密度可达OD60020以上，重组人内抑素表达 量为40％左右(图9)，经乳糖诱导后，重组人内抑素经包涵体提取， 复性纯化等步骤，可获纯度达95％以上，并且优选地99％以上的可溶 性蛋白(图10)，纯化后的蛋白具有明显的抑制人血管内皮细胞和 小鼠移植瘤生长的作用(图11和12)。
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些 实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明 的范围。在下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规实验方法进行，或按照厂商所建议的操作说明进行。 实施例1：重组人内抑素基因的获得和细菌偏爱型基因的突变
根据人胶原18C末端的183个氨基酸的核苷酸序列，首先合成 RT-PCR的引物，其引物序列如下：
5’-GC CAT ATG CAC AGC CAC CGC GAC-3’
3’端引物5’-CG GGA TCC CTA CTT GGA GGC AGT-3’
人胚胎肝细胞mRNA来源于人胚肝组织，由Trizol试剂(Invitrogen 公司)一步法提取。
RT-PCR反应条件如下(RT-PCR试剂盒购自Roche公司)：
①5×反转录缓冲液 4μl
MgCl2 2μl(50mM)
dNTP 2μl(10mM)
随机引物 1μl(50pmol)
反转录酶 1μl 2.5IU
mRNA 2μl(1μg/μl)
RNase抑制剂 1μl
42℃水浴100分钟后，95℃保温5分钟，-80℃保存。
②模板(cDNA反应液) 5μl
5’引物 2μl 50pmole
3’引物 2μl 50pmole
dNTP 2μl 10mM
5×PCR缓冲液 20μl
MgCl2 2μl 100mM
Taq DNA聚合酶 1μl 5U
H2O 76μl
最终反应体积100μl
聚合酶链式扩增反应(PCR)的条件如下：98℃变性5分钟， 然后94℃40秒、56℃40秒、72℃50秒共30个循环，最后72℃ 延长10分钟。反应结束后，将PCR样品置于冰上或-80℃冻存。
将RT-PCR反应后的样品在1％琼脂糖电泳，可见在550bp分子 量大小处有明显扩增基因片段(图5)。取1μl扩增反应液，混合3μl H2O和1μl Topo PCR 2.1载体(Invitrogen公司)混合液，室温下作 用5分钟后，取1μl放入感受态细菌shot one(Invitrogen公司) 50μl，冰浴30分钟后，42℃水浴30秒，再加入＞50μl SOS(Invitrogen 公司)培养基(购于Invitrogen公司)，37℃水浴30分钟，铺含有 卡那霉素(30μg/ml)的LB琼脂板过夜，37℃，第二天挑选单克隆， LB(含卡那霉素30μg/ml)培养基振摇培养后，提取质粒，酶切鉴 定。同时做核苷酸序列分析，结果证实，所获基因序列与所推测的 序列完全一致(图2)，利用N端NdeI和C端BamHI酶切位点，切 下重组人内抑素基因并克隆入表达载体pET24b中(图6)，经转化 大肠杆菌细胞BL-21(DE3)后，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB 中培养并诱导重组人内抑素的表达，当细菌浓度OD600达到0.6-0.8 时，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导4小时后，离心收集细菌，经 细菌破碎后在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳下，检测重组人内抑素 的表达，结果显示在分子量20kDa左右，有一明显蛋白诱导表达带， 扫描法计算表达量为20％左右，为再进一步提高重组人内抑素在大 肠杆菌中的表达，利用PCR的方法，将人内抑素基因的前4人氨基 酸的编码突变成细菌偏爱型。5’端突变引物如下：5’-GC CAT ATG CAT AGC CAT CGT GAT TTC CAG CCG GTG CTCC-3’与原3’ 端引物组合，利用野生型人内抑素基因质粒(上述550bp PCR片段 装入Topo PCR2.1载体)为模板，以同样的PCR方法(除引物不同 外)后，也获得550bp扩增片段，克隆入 Topo PCR 2.1(Invitrogen) 后，提取质粒并做核苷酸序列分析，其结果与预计突变结果相符合 (图4)，将突变后的重组人内抑素基因再克隆入pET 246中，转化 BL-21(DE3)后，经培养IPTG诱导表达后，收集菌体15％SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳后，在20kDa分子量大小的表达带约为细菌蛋白 的40％(图7)，结果证实，突变质粒为野生型基因克隆质粒在细菌 中的表达的2倍。优选地，该大肠细菌工程菌株是于2003年8月6 日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉)并且保藏 号为CCTCC NO：M203063的大肠杆菌BL-21(DE-3)/pENDO 工程菌株。
实施例2：乳糖诱导重组人内抑素在大肠杆菌中的高效表达
突变型质粒在BL-21(DE3)宿主菌可诱导高效表达重组人内抑 素。而且在实验中发现，即使未经IPTG诱导的对照组也有明显的蛋 白表达。说明由于启动子过强，对人内抑素的表达有启动泄露现象， 本发明曾利用不同的温度、不同时间、不同培养基尝试防止泄露， 最后发现利用葡萄糖可有效防止泄露，而且不仅在IPTG诱导下表达 重组人内抑素，而且利用乳糖同样可以有效表达重组人内抑素，表 达量达40％左右(图8)。
具体培养基组成份如下：
挑选单克隆，在1.5ml含有50μg氨苄青霉素1ml新鲜LB中，37℃ 培养过夜，第二天，将过夜菌用1∶50新鲜的LB(含氨苄)稀释， 再37℃振摇培养至细菌OD6001.2左右，加入乳糖至终浓度为2％， 继续培养细菌6-8个小时后，离心收集细菌检测重组人内抑素的表 达。
实施例3：乳糖诱导重组人内抑素在中试发酵中的高效表达
重组人内抑素细菌发酵种子液的组成如下：每升培养基中含10g 酪蛋白，5g酵母提取粉，10g氯化钠，2％葡萄糖。实际操作过程如 下：挑取新鲜单一菌落，接种到200ml新鲜种子液中，过夜培养， 第二天10倍体积新鲜种子液继续扩大培养至细菌OD6002.0左右时， 加入发酵罐中，比例为1∶10放大，发酵罐中的培养基依然是种子 液成份。发酵过程中，当溶氧降至0时，加入1/10体积的补料1， 成份为葡萄糖，硫酸胺和硫酸镁，分别为20％、10％和1％，当培养的 细菌OD600达到10时，加入1/20体积的10％酵母提取物，当OD600上 升到14左右时，加入最终浓度为2％的乳糖液进行诱导表达，再继 续培养约14个小时后，OD600约20左右时，放罐，此时每升发酵液 约可得湿菌40g，细菌表达量40％左右，图9为发酵不同时间下重组 人内抑素的表达。
实例4.采用与实例3完全相同的方法，只改变乳糖浓度，分别 为0.01％、0.5％、1％、10％，测定细菌表达量，分别为10％、20％、40 ％、36％。
实施例5：乳糖诱导的重组人内抑素经包涵体纯化、复性、再 纯化
收集菌体后，每罐发酵液可获湿菌1,400g，用冰浴的缓冲液A (50mM Tris-HCl，pH8.3，1mM EDTA，1mM β-巯基乙醇)，约7500ml 混悬菌体后再加入终浓度为0.05％的溶菌酶，4℃下超声破菌，超 声功率为1,000W，时间10min，超声10秒暂停3秒，超声裂解后， 涂片显微镜下检查，细菌破碎率应＞95％。4℃下细菌裂解液离心 7,000rpm/min，离心20分钟，弃上清，沉淀即为粗包涵体。用缓冲 液B(50mM Tris-HCl，pH8.3，4M尿素，1％Trition X-100，1mM EDTA， 5mM β-巯基乙醇)，混悬包涵体后，置室温下10分钟，离心7,000rpm /分，30分钟，洗涤1次，再用缓冲液A洗涤一次，包涵体的纯度 可从50％提高到75％。用缓冲液C(50mM Tris-HCl，pH8.3，8M 尿素，1mM EDTA，15mM β-巯基乙醇)，4℃下搅拌溶解包涵体， 每克湿重包涵体用20ml缓冲液C溶解。搅拌溶解过夜后，10,000rpm /min离心30分钟，收集上清，弃沉淀(上清即为包涵体溶解液)。
将经DEAE-Sepharose Fast Flow纯化后的内抑素装入透析袋中 (分子截留为12,000-14,000kDa)，在PBS缓冲液下加入4M尿素， 透析24小时，再减尿素为2M，调节pH至7.0，同时加入0.1mM氧 化型谷胱甘肽和1mM还原型谷胱甘肽，透析24小时，用平衡液(20mM NaAc/Ac，pH5.8)平衡柱床，然后上样，同时用核酸蛋白检测仪(检 测波长280nm)在线检测，上样后用洗脱液A(0.1M NaCl，20mM NaAc/AcpH5.8)洗脱，收集洗脱峰A，再用平衡液清洗，最后用洗脱液B(0.3M NaCl，20mM NaAc/Ac，pH5.8)洗脱，收集洗脱峰B，经SDS-PAGE 电泳鉴定洗脱峰B含有内抑素蛋白，经纯化复性后得到的纯品纯度 为99.3％。如图10所示。
实施例6：重组人内抑素复性后对人内皮细胞生长的抑制作用
选择生长状态旺盛的ECV细胞(ATCC)，加入少量胰酶，于室 温消化，待消化完全后，小心去除胰酶，加入含3μg.L-1bFGF和2 ％FBS的RPMI medium 1640及青霉素105U.L-1，链霉素100mg.L-1 的培养基终止反应，用滴管将瓶壁上细胞从壁上吹下，并吹打均匀。 再调整细胞浓度为每毫升2×104个，向96孔板中加入0.1ml的细胞 悬液。重组人内抑素再用上述培养基进行不同浓度梯度倍比稀释， 每个浓度梯度设置3个复孔，每孔加液0.1ml，使终浓度(mg.L-1) 分别为：100、50、25、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78，同时设 置空白对照组和阴性对照组。在37℃，饱和湿度及5％CO2条件下静 止培养4h。4h后，小心吸去培养上清，加入0.15ml DMSO，溶解细 胞，用培养板震动器摇匀。再用酶标仪按参比波长为630nm，测试 波长为492nm测定各孔OD吸收值，求出空白及样品每个稀释度3孔 测得的平均值，将样品每个稀释度平均光吸收减去空白平均光吸收， 以阴性对照的光吸收度为50％时的样品浓度。
重组人内抑素的抑制率按下述公式计算：
根据各点的抑制率，绘制量效曲线：以重组人内抑素剂量为横坐 标，以抑制率为纵坐标，Microsoft Excel作图，观察重组人内抑 素的抑制作用并求抑制率为50％时的制剂浓度。
结果表明：产生50％内皮细胞抑制的重组人内抑素的浓度约为 3.50mg.L-1。见图11。
实施例7：重组人内抑素对小鼠移植瘤的生长的抑制作用
试验方法：
1.动物 昆明种小鼠(中国药科大学试验动物中心)，雌雄兼 用，体重18-22g，鼠龄5-6周。
2.肿瘤模型 S180肉瘤。
3.肿瘤移植 选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎 脱臼处死，在无菌条件下(超净台)，用碘酒、酒精消毒动物皮肤， 切开皮肤，剥离肿瘤并称重。在培养皿内将瘤组织剪成小块(室温＞ 15℃时应放冰块上操作)，放入无菌匀浆器内，按1∶3～1∶4(W/V) 加入灭菌生理盐水，匀浆。取受瘤小鼠，于前肢腋窝处碘酒、酒精 消毒，皮下注射肿瘤匀浆液0.2ml/只(肿瘤细胞数约5×106个)。
4.动物分组 于接种后第三天，将荷瘤小鼠随机分为阴性对 照组、阳性对照组和治疗组。治疗组动物数一般10只，阴性对照级 动物数为治疗组动物×√药物配制和试验组数。
5.药物配制和给药途径 溶于水的固体药物，用生理盐水或 注射用水配制。皮下注射给药(须注意注射部位的消毒)，每日给药 一次，阴性对照组注射等体积生理盐水或注射用水。
6.给药时间 接种肿瘤后每日触摸局部，当肿瘤直径达 1～2mm时开始给药，连续用药7天。
7.观察指标 给药后每日测量肿瘤的最长径(r1)、最短径 (r2)，计算肿瘤的体积(V＝1/2×r1×(r2)2)，并记录动物有无不良反 应或死亡，若有死亡应记录死亡时间，分析死亡原因。
8.肿瘤生长抑制率 根据上述的测量结果，计算出肿瘤相对 体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其 中V0为给药时测量所得的肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。 抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
其中：TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
结果显示：按5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg剂量皮下注射重组人 内抑素可明显抑制人胃癌BGC803裸鼠移植肿瘤的生长，如图12所 示。
总上所述，本发明的乳糖诱导的重组人内抑素经包涵体纯化、复性、 再纯化后，蛋白纯度(HPLC)达95％以上(图10)，并具有明显的生 物活性(图11，12)。
参考文献目录：
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