本发明涉及部分脱硫酸化的糖胺聚糖衍生物，特别是肝素，其制 备方法，其作为活性组分在制备用于治疗病症，例如肿瘤，包括转移 形式肿瘤，以及可受益于抑制类肝素酶(heparanase)的任何治疗适应症 的药物中的应用，和含有它们的药物组合物。

现有技术状况

在Hadassah-Hebrew University Hospital-Israel的Tumor Biological Research Unit中进行的研究(Is r.Med.Assoc.J.2000，2， 37-45；J.Med.Chem.2000，43，2591-600；Invasion Metastasis 1994-95， 14，290-302；Exp.Cell Res.1992，201，208-15；)关注于肝素结合生长因 子、硫酸乙酰肝素和硫酸乙酰肝素降解酶(类肝素酶)参与肿瘤血管生 成和转移。已经应用这些研究来筛选和鉴定具有有效类肝素酶抑制活 性的肝素衍生物和肝素/硫酸乙酰肝素模拟物(Nature Med.1999，5， 735-6；Science，1999，285，33-4]。

肿瘤细胞释放类肝素酶，这是一种内型-β-D-葡糖醛酸酶，其降解 在细胞表面上和在细胞外基质中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的多糖链。

已将类肝素酶参与肿瘤血管生成与其从它贮存在ECM(细胞外基 质)内的贮库中释放bFGF(FGF-2)和其它生长因子的能力相关联。这 些生长因子提供了在正常和病理情况下诱导新血管生成的机制。

因此，类肝素酶可能不仅促进肿瘤细胞侵袭和转移，而且还促进 肿瘤血管生成，二者都是肿瘤进展的关键步骤。

类肝素酶的特异性抑制剂阻止由硫酸乙酰肝素贮存的生长因子的 释放和激活以及ECM的破裂，并被视为开发抗癌药物的非常有希望 的途径。

所以，对于抗血管生成药物，一种可能的治疗途径是开发有效的 和选择性的类肝素酶抑制剂。

关于血管生成的讨论可参见在本申请人名下的WO 01/55221。

类肝素酶的另一重要参与是炎症和自身免疫。实际上，类肝素酶 活性还与免疫系统的激活细胞离开循环并引起炎性和自身免疫性反应 的能力有关。血小板、粒细胞、T和B淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细 胞与内皮下ECM的相互作用与类肝素酶活性降解硫酸乙酰肝素有关。 该酶作为对多种不同激活信号的反应而从细胞内区室(即溶酶体，特殊 颗粒)中释放出来，这表明其在炎性位点和自身免疫性损伤中的受调节 的参与和存在。用类肝素酶抑制剂(即非抗凝种类的低分子量肝素 -LMWH)治疗实验动物显著降低了在实验动物中实验性自身免疫性脑 脊髓炎(EAE)、佐剂关节炎和移植物排斥的发生率，这表明可以使用 类肝素酶抑制剂来抑制自身免疫性和炎性疾病。

肝素

肝素是具有不同长度和不同硫酸化度的天然存在的多糖的异质混 合物，其具有抗凝活性，并且是由存在于肝脏(首先从肝脏中分离出 来)、肌肉、肺、胸腺和脾脏中的结缔组织肥大细胞分泌的。

除了规则序列之外，在肝素中已经鉴定出了相应于抗凝血酶活性 的活性位点的序列。

肝素及其衍生物的抗肿瘤和抗转移活性是由于其抑制类肝素酶、 阻断生长因子和调节血管生成的能力所致。

硫酸乙酰肝素(HS)

硫酸乙酰肝素(HS)是普遍存在的蛋白配体。蛋白与HS链结合， 产生了从对抗蛋白酶解作用的简单固定或保护到特异性调节生物活动 例如血管生成的各种作用。

肝素和硫酸乙酰肝素(HS)中的糖骨架是由交替的D-葡糖胺(GlcN) 和己糖醛酸(GlcA或IdoA)构成的。

在肝素中，GlcN残基主要是N-硫酸化的，而在HS中，它们既是 N-硫酸化的，又是N-乙酰化的，具有少量未被取代的NH2基团。

HS平均的O-硫酸化比肝素低。

肝素在治疗血管生成性疾病例如肿瘤，特别是肿瘤转移方面的应 用受到了肝素抗凝活性的严重限制。

已经对肝素进行了化学修饰，以降低其抗凝能力，同时保存其抗 肿瘤性质。

把抗凝血酶位点中的葡糖醛酸单元打开可降低肝素对抗凝血酶的 亲和力：这样，在使用时，肝素可具有降低的抗凝作用，但是仍然保 留抗血管生成性质。

类肝素酶

类肝素酶是属于内切糖苷酶(内型-β-D-葡糖醛酸酶)家族的酶，其 水解硫酸乙酰肝素(HS)和肝素的链的内糖苷键。

这些内切糖苷酶参与肿瘤细胞增殖、肿瘤转移和新血管生成。这 些酶是抗血管生成活性的生物靶标。在科学文献中有大量结构/活性关 系研究(参见例如Lapierre F.等人，Glycobiology，vol.6，(3)，355-366， 1996)。虽然有很多方面仍然有待澄清，但是已报道了有关肝素及其衍 生物对类肝素酶的抑制作用的研究，使用特殊测试已导致出现对结构 类型的考虑，其可用作指导来获得新的、选择性更强的衍生物。

在上述Lapierre等人的文章中，肝素衍生物被描述为是通过2-O 脱硫酸化或“二醇裂解(glycol split)”(用高碘酸盐氧化，然后用硼氢化钠 还原)而获得的。在此分别定义为“2-O-脱硫酸化肝素”和“RO-肝素”的 这些衍生物部分保持了肝素的抗血管生成活性，所述活性是在皮质类 固醇存在下通过CAM实验评价的(出处同上，第360页)。

据报道，是比肝素更近似的硫酸乙酰肝素模拟物的N-酰基肝素衍 生物抑制类肝素酶的活性仅比N-硫酸衍生物稍弱一些(Irimira T.， Biochemistry 1986，25，5322-5328；Ishai-Michaeli R.，等人， Biochemistry 1992，31，2080-2088)。

肝素和FGF

FGF调节多种生理过程例如细胞生长和分化，但是也参与病理过 程例如肿瘤血管生成。

FGF是生长因子(10个以上多肽的家族)，其中酸性(FGF-1)和碱性 FGF(FGF-2)是研究最充分的，其需要多糖辅因子肝素或HS来与FGF 受体(FGFR)结合并激活它。

虽然肝素和HS激活FGF的确切机制尚不清楚，但是已知肝素 /FGF/FGFR形成“三分子”或“三元”复合物。

一种假定的机制是，肝素与HS引起FGF发生所谓的夹层二聚化， 由此二聚化的后者与FGFR形成稳定的复合物。

肝素衍生物的抗转移活性

原发性肿瘤产生转移性细胞的能力也许是抗癌治疗所面对的主要 问题。

具有阻断类肝素酶的显著能力的肝素衍生物似乎同样能够抑制原 发性肿瘤和转移瘤中的血管生成。

此外，抑制类肝素酶降低了肿瘤细胞从原发性肿瘤迁移到其它器 官的能力。

已经发现，在动物模型中的抗转移活性与肝素和肝素衍生物 (Bitan M.等人，Isr.J.Med.Sci.1995，31，106-108)以及其它硫酸化多 糖(Miao，H.Q.等人，Int.J.Cancer 1999，83，424-431，和其中所引用的 参考文献)的类肝素酶抑制能力有关。对于抗转移活性的分子量依赖性 所进行的研究表明，非常低MW的肝素(Sciumbata，T.，等人，Invasion Metastasis 1996，16，132-143)和多硫酸低聚糖(Parish，C.R.，等人， Cancer Res.1999，59，3433-3441)也保留显著的抗转移活性。虽然除去 N-硫酸基团(N-脱硫酸化)通常会降低肝素的抗转移潜能，但是在将所 形成的游离NH2基团N-酰化(N-乙酰化、N-己酰化(Bitan M.，1995)，和 N-琥珀酰化(Sciumbata，T.，1996)之后，这种活性部分恢复。已发现肝 素的抗转移活性与其O-硫酸化度负相关(Bitan M.，1995)。然而，艾杜 糖醛酸残基的选择性2-O-脱硫酸化不导致肝素抗转移活性的显著下降 (Lapierre，F.，Glycobiology 1996，6，355-366)。

一般情况下，肝素和其它硫酸化多糖的类肝素酶抑制和抗转移活 性随着分子量以及硫酸化度的下降而降低(Bitan M.，1995；Parish，C. R.，1999)。然而，这些活性还取决于多糖的糖主链(残基的类型以及糖 苷键的位置)(Parish，C.R.，1999)。由于类肝素酶活性位点的三维结构 仍然是未知的，所以难以预测哪种多糖主链和硫酸化模式会最有效地 抑制该酶。

基于目前的知识，有利于血管生成抑制作用的肝素样分子的结构 要求可根据欲阻断的靶而分为2类：

a)抑制类肝素酶：虽然该酶识别并裂解含有N-酰基-葡糖胺-葡糖 醛酸(或N-硫酸化葡糖胺残基，参见例如D.Sandback-Pikas等人J. Biol.Chem.，273，18777-18780(1998)以及其中引用的参考文献)的至 少8个单糖单元的肝素和HS序列，但是其抑制可有效地由长于十四 糖的肝素片段来完成(Bitan M.，1995)，或由广泛硫酸化的较短低聚糖 例如硫酸麦芽己糖(MHS)和硫酸磷酸甘露戊糖(PI-88)来完成(Parish， C.R.，1999)。然而，长的肝素片段和重度硫酸化的低聚糖都是抗凝剂， 而对于可能的抗转移药物来说，这是应当避免的性质；

b)抑制血管生成生长因子(成纤维细胞型：FGF-1和FGF-2；血 管内皮型：VEGF；血管通透型：VPF)：对于此，肝素样化合物优选 具有这样的序列，长度为至少5个单糖单元，含有2-硫酸化艾杜糖醛 酸和N，6-硫酸化葡糖胺(参见例如M.Maccarana等人，J.Biol.Chem.， 268，23989-23905(1993))。

文献公开了具有抗血管生成活性的小肽(5-13个氨基酸) (University of Washington的US 5,399,667)，其通过结合血小板反应蛋 白受体来起作用，或更长的肽(约50个氨基酸)。

已知修饰的血小板因子(EP 0589719，Lilly)能以IC50＝7nM抑制 内皮增殖。

具有抗血管生成活性的低聚糖片段也已充分描述过：已经发现， 实际上，通过改变糖序列，可提高相互作用选择性。

此外，肝素还可用作自身具有抗血管生成作用的物质例如某些甾 族化合物的载体，这是采用肝素对血管内皮细胞的亲和力；参见例如 University of Texas和Imperial Cancer Research Technology的WO 93/18793，其中所要求保护的肝素通过酸不稳定连接物例如己二酸肼 结合到氢化可的松上。该缀合分子的抗血管生成作用大于未缀合分子 (即使在同时给药时)。

在Biochim.Biophys.Acta(1996)，1310，86-96中，描述了在C-20 经由腙基团与甾族化合物(例如氢化可的松)结合的肝素，其抗血管生 成活性大于这两种未缀合的分子。

Daiichi Sc.的EP 0246654描述了进行II期研究的具有抗血管生成活 性的硫酸化多糖。Pharmacia & Upiohn-Harvard Coll.的EP 0 394 971描 述了具有低硫酸化的己糖-肝素片段，其能够抑制内皮细胞生长和FGF-1 刺激的血管生成。Alfa Wasserman的EP 0 618 234描述了制备具有携带 亲核基团的肝素或类肝素结构的半合成糖胺聚糖的方法。Glycomed的 WO 95/05182描述了具有抗凝、抗血管生成和抗炎活性的多种硫酸化低聚 糖。Glycomed的US 5,808,021描述了制备基本上非解聚的2-O、3-O脱 硫酸化肝素的方法，所述肝素在艾杜糖醛酸2-位(I，2-O)和葡糖胺单元3- 位(A，3-O)的脱硫酸化百分比是初始百分比的约99-约97％。在该方法中， 脱硫酸化是在二价金属阳离子，例如钙离子或铜离子存在下进行的，然后 将所得产物冷冻干燥。所得脱硫酸化肝素具有抗血管生成活性。Yeda Res & Dev Co Ltd等的EP 0 251 134公开了亚凝血剂量的肝素或其衍生物在 预防同种移植物排斥和治疗自身免疫性疾病中的应用。其中肝素的活性是 通过抑制类肝素酶来实现的。Univ.Australian Nat.的WO 88/05301公开 了包含作为类肝素酶抑制剂的硫酸化多糖的抗转移和/或抗炎组合物。其中 提供了肝素、岩藻多糖、硫酸戊聚糖、硫酸葡聚糖。Univ.Texas System 的WO 92/01003公开了没有抗凝活性的肝素衍生物作为类肝素酶抑制剂 的应用。这些衍生物具有磺氨基或O-硫酸酯基团，M.W.为1000-15000， 并且每个末端单体单元是具有结合到阻断基团上的末端O原子的单体重 复单元。Glycomed的WO 94/14851和WO 96/06867提供了2-O，3-O-脱硫 酸化粘膜肝素或其片段，其在2-O位至少96.7％脱硫酸化，在3-O位至少 75％脱硫酸化，可用作非抗凝性类肝素酶抑制剂。Glycomed的WO 95/09637和WO 96/09828公开了具有肝素样特性的高度硫酸化麦芽低聚 糖化合物。Glycomed的WO 95/30424提供了具有类肝素酶抑制活性的 6-O-脱硫酸化肝素或其片段。Univ.Australian Nat.的WO 96/33726公开了 作为具有类肝素酶抑制活性的类肝素模拟物的硫酸化低聚糖。Knoll AG 的WO 01/35967提供了通过施用类肝素酶抑制剂来治疗心功能不全和相 关病症的方法，在所述类肝素酶抑制剂中提及了具有部分还原的COOH基团，或至少部分N-脱硫酸化和N-乙酰化，或至少部分N，O-脱硫酸化和 N-再硫酸化或O-乙酰化的肝素。

本发明的目的是发现最佳的糖胺聚糖结构，以基于类肝素酶抑制 和/或FGF生长因子抑制机制产生抗血管生成活性。本发明的另一个 目的是提供具有抗血管生成活性的药物，所述药物基本上不具有肝素 衍生物的典型副作用例如抗凝活性。

在本申请人名下的WO 01/55221公开了糖胺聚糖，特别是脱硫酸 化度不超过总糖醛酸单元的60％的脱硫酸化肝素。所提供的这些衍生 物具有抗血管生成活性，并且没有抗凝活性。所述化合物发挥其抗血 管生成活性是基于抑制了FGF。没有预见到抑制类肝素酶的活性。

WO 01/55221还以非常一般性的描述提供了包含葡糖胺残基的改 性肝素，其具有不同N-脱硫酸化度以及任选随后完全或部分乙酰化。 所述参考文献的一般性教导没有清楚地描述N-脱硫酸化和任选随后 完全或部分乙酰化的步骤。

发明概述

现已发现，对于包含具有不同N-脱硫酸化度以及任选随后完全或 部分N-酰化(优选N-乙酰化)的葡糖胺残基的糖胺聚糖，例如肝素样糖 胺聚糖、肝素或改性肝素，将其进行受控制的艾杜糖醛酸单元2-O-脱 硫酸化处理，直至脱硫酸化度最高不超过总糖醛酸单元的60％，可维 持生长因子介导的血管生成性质。

令人惊奇的是，上述WO 01/55221中公开的2-O-脱硫酸化肝素也 是类肝素酶抑制剂。发现通过将未硫酸化的糖醛酸残基进行二醇裂解 可进一步增强该性质。还发现，二醇裂解—导致抗凝活性显著丧失的 化学修饰(Casu B.，等人，Arzneim.Forsch.(Drug Res.)1986，36， 637-642)显著增强了部分N-乙酰化肝素和2-O-脱硫酸化化合物的类肝 素酶抑制性质，其中所述部分N-乙酰化肝素是通过50％N-脱硫酸化， 然后对所得游离氨基进行N-乙酰化而获得的。

在本发明所述条件下进行的脱硫酸化还使得形成了在2，3位具有 oxyranic环的艾杜糖醛酸单元。在本发明所述条件下打开oxyranic环 导致形成L-艾杜糖醛酸或L-半乳糖醛酸单元。

本发明的一个目的是所述糖胺聚糖衍生物在制备具有类肝素酶和 /或FGF生长因子抑制活性的药物中的应用。

依据本发明，所述糖胺聚糖衍生物优选是肝素样糖胺聚糖。依据 本发明，所述糖胺聚糖衍生物是改性的肝素，其中包含具有不同N-脱 硫酸化度以及任选随后完全或部分乙酰化的葡糖胺残基。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及式(I)化合物

其中U环可具有下列含义：

X和X’可相同或不同，是醛基或-CH2-D基团，其中D是羟基或 氨基酸、肽或者糖或低聚糖的残基；

R和R1可相同或不同，是SO3，C1-8酰基残基，所述残基可任选 携带至少一个另外的羧基；乙酰基、己酰基、琥珀酰基、新戊酰基是 优选的酰基残基；

n和m可相同或不同，可以是1-40；n+m的和为6-40；m∶n 比例为10∶2-1∶1；

符号 是指用m和n表示的单元是沿着多糖链统计学分布，并 且无需按顺序分布。

可任选携带至少一个另外的羧基的C1-8酰基残基的实例是乙酰 基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基以及所有可能的异构 体、草酰基、丙二酰基、琥珀酰基、新戊酰基、戊二酰基；乙酰基、 己酰基、新戊酰基是优选的酰基残基。

当R或R1是N-酰基时，它们优选为R+R1之和的40-60％。m 优选大于或等于n。n优选为m+n之和的40-60％。

其中R和R1是C1或C3-C8酰基残基的上述式(I)化合物是新的。

作为本发明主题的化合物的特征在于，以高效力抑制类肝素酶， 具有引人关注的抗血管生成特性，因此可作为活性组分用于制备用来 治疗可受益于抑制类肝素酶的病症、基于异常血管生成的病症和特别 是用来治疗转移瘤的药物。

本发明化合物还抑制FGF。

有利的是，本发明化合物表现出降低(如果不是不存在的话)的 抗凝性质，因此避免或减少了肝素的典型副作用。另一个优点来自下 述事实，即本发明化合物可用仪器分析技术例如NMR光谱来表征， 由此允许从工业角度看绝对理想的过程控制。

同样对于改性肝素，在制备血管生成抑制剂时，分子量(MW)具有 非常重要的功能。众所周知，实际上，最高达相当于五糖单元的值的 分子量(MW)降低不导致抗血管生成活性丧失。另一方面，已经确立的 是，尽管超过一定长度时肝素链是促成而不是抑制FGF的激活，它们 是比较短链甚至更好的类肝素酶抑制剂。然而，对于抑制类肝素酶来 说，最佳链长度取决于抑制剂的结构(糖主链、键位置、硫酸化模式)， 并且应当确立任何新型潜在抑制剂的最佳链长度。

发明详述

本文具体公开包含具有不同N-脱硫酸化度以及任选随后完全或 部分乙酰化的葡糖胺残基的本发明化合物，并将它们作为新化合物要 求保护。

脱硫酸化度是指未硫酸化的艾杜糖醛酸占起始肝素中原本存在的 总糖醛酸的百分比。脱硫酸化百分比的一个最初优选范围是约40-约 60％。

在式(I)化合物当中，第一个优选的化合物是部分2-O-脱硫酸化的 肝素，其分子量(MW)为11200，多分散指数D为1.3，脱硫酸化度为 1.99(以SO3-∶COO-摩尔比表示)，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是 约50％。所述化合物(下文中还称为ST1514)包含在式(I)中，其中除了 其它相应的定义以外，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的单元是以规则、 交替的方式沿着多糖链分布。

第二个优选的化合物是部分2-O-脱硫酸化的LMW肝素，其分子 量(MW)为3050，多分散指数为2.2，脱硫酸化度为1.99(以SO3-∶COO-摩尔比表示)，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约50％。所述化合 物(下文中还称为ST2010)包含在式(I)中，其中除了其它相应的定义以 外，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的单元是以规则、交替的方式沿着 多糖链分布。该化合物是这样获得的：用亚硝酸将ST1514解聚，然 后将醛基还原，这样大部分其还原端残基是脱水甘露糖残基：

第三个优选的化合物是部分2-O-脱硫酸化的LMW肝素，其分子 量为Mn＝5800，Mw＝7520，多分散指数为1.294，修饰的糖醛酸占总 糖醛酸的百分比是约50％。所述化合物(下文中还称为ST2184)包含在 式(I)中，其中除了其它相应的定义以外，m∶n＝1∶1，并且以m和n 表示的单元是以规则、交替的方式沿着多糖链分布。该化合物是这样 获得的：用亚硝酸将ST1514解聚，然后将醛基还原，这样大部分其 还原端残基是脱水甘露糖残基。

第四个优选的化合物是部分N-脱硫酸化和N-重乙酰化肝素，其分 子量(MW)为11200，多分散指数为1.3，脱硫酸化度为1.6(以 SO3-∶COO-摩尔比表示)，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％。 所述化合物(下文中还称为ST1518)包含在式(I)中，其中除了其它相应 的定义以外，R+R1之和的50％是N-乙酰基。

第五个优选的化合物是部分N-脱硫酸化和N-重乙酰化LMW肝 素，其分子量为Mn＝4780，Mw＝10000，多分散指数为2.092，修饰 的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％。所述化合物(下文中还称为 ST2168)包含在式(I)中，其中除了其它相应的定义以外，R+R1之和的 50％是N-乙酰基。

第六个优选的化合物是部分N-脱硫酸化和N-重乙酰化肝素，其分 子量为Mn＝10890，Mw＝22370，多分散指数为2.054。所述化合物(下 文中还称为ST2037)包含在式(I)中，其中除了其它相应的定义以外，R +R1之和的27％是N-乙酰基。

第七个优选的化合物是部分N-脱硫酸化和N-重乙酰化肝素，其分 子量为Mn＝10210，Mw＝21270，多分散指数为2.083。所述化合物(下 文中还称为ST2038)包含在式(I)中，其中除了其它相应的定义以外，R +R1之和的39％是N-乙酰基。

第八个优选的化合物是部分N-脱硫酸化和N-重乙酰化肝素，其分 子量为Mn＝11070，Mw＝22000，多分散指数为1.987。所述化合物(下 文中还称为ST2041)包含在式(I)中，其中除了其它相应的定义以外，R +R1之和的64％是N-乙酰基。

第九个优选的化合物是部分N-脱硫酸化和N-重乙酰化肝素，其中 修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％。所述化合物包含在式(I) 中，其中除了其它相应的定义以外，R+R1之和的27％是N-乙酰基 (ST2185)。

第十个优选的化合物是部分N-脱硫酸化和N-重乙酰化肝素，其中 修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％。所述化合物(下文中还称 为ST2186)包含在式(I)中，其中除了其它相应的定义以外，R+R1之 和的39％是N-乙酰基。

第十一个优选的化合物是部分N-脱硫酸化和N-重乙酰化肝素，其 中修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％。所述化合物(下文中还 称为ST2187)包含在式(I)中，其中除了其它相应的定义以外，R+R1 之和的64％是N-乙酰基。

第十二个优选的化合物是部分2-O-脱硫酸化肝素，其分子量(MW) 为12900D，多分散指数D为1.5，脱硫酸化度为1.9(以SO3-∶COO-摩尔比表示)，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比为：5％环氧基，29 ％氧化和还原的糖醛酸残基。所述化合物(下文中还称为ST1513)包含 在式(I)中，其中除了其它相应的定义以外，m∶n＝1∶1，并且以m和n 表示的单元是以规则、交替的方式沿着多糖链分布。

第十三个优选的化合物是部分2-O-脱硫酸化肝素，其分子量(MW) 为9200D，多分散指数D为1.5，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比 为：11％环氧基，27.5％氧化和还原的糖醛酸残基。所述化合物(下文 中还称为ST1515)包含在式(I)中，其中除了其它相应的定义以外，m∶n ＝1∶1，并且以m和n表示的单元是以规则、交替的方式沿着多糖链分 布。

第十四个优选的化合物是部分2-O-脱硫酸化肝素，其分子量(MW) 为11000D，多分散指数D为1.5，脱硫酸化度为1.93(以SO3-∶COO-摩尔比表示)，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比为：5％环氧基，29 ％氧化和还原的糖醛酸残基。

化合物ST1514、ST1513、ST1516和ST1515的制备具体公开在 WO 01/55221中。

本发明的部分2-O-脱硫酸化衍生物是按照上述WO01/55221中公 开的方法制备的。

至于本发明N-脱硫酸化和任选N-乙酰化糖胺聚糖，它们可通过还 能够制备2-O-部分脱硫酸化肝素的方法制得，所述方法包括：

a)通过下述操作进行N-脱硫酸化：将磺氨基残基在DMSO∶H2O95∶5 v∶v中于室温下溶剂分解水解0.5-8小时，甚至更优选约2小时， 以完全或部分除去在葡糖胺残基2-位的硫酸根基团；

b)通过下述操作将所述在葡糖胺残基2-位完全或部分脱硫酸化 的基团N-酰化：在碱性水溶液(pH8-9)中用酰化剂例如酰基酐处理， 以生成在葡糖胺残基2-位完全或部分酰化的基团；然后将所得化合物 进行下述步骤c)、d)或e)与f-g)，或直接进行下述步骤f)；

c)在室温-约100℃，优选50-70℃，甚至更优选约65℃温度下 进行碱处理，导致在艾杜糖醛酸2-位的受控制百分比的硫酸根基团被 除去，和形成环氧基团；和如果需要的话

d)在约pH 7，于约50℃-约100℃，优选约70℃温度下打开所 述环氧环，以产生半乳糖醛酸残基；或者

e)在约0℃-30℃，优选约25℃温度下打开所述环氧环，以产生 艾杜糖醛酸残基；和如果需要的话

f)用高碘酸钠将二醇氧化，以打开糖苷环和形成2个醛基/个修饰 的残基；和如果需要的话

g)将所述醛基还原成伯醇，和如果需要的话，将D基团转化成如 在式(I)中给出的不同含义所表示的非羟基基团；

h)任选对在步骤g)中获得的化合物进行酸水解，以获得与规则序 列相对应的低聚糖，优选通过用亚硝酸脱氨基来实现。经常用于通过 裂解N-硫酸葡糖胺残基与下一个糖醛酸之间的键来获得LMW肝素的 该反应导致获得在非还原端具有由糖醛酸组成的残基和在还原端具有 脱水甘露糖残基的LMW化合物，可通过用硼氢化钠还原来将脱水甘 露糖残基进一步修饰成脱水甘露醇。所获得的LMW化合物含有至少 一个二醇裂解的艾杜糖醛酸残基；或者

i)用选自裂解酶、肝素酶、类肝素酶或同等物的酶将在步骤g)中 获得的产物进行部分酶促水解，以获得低聚糖，优选四糖或八糖，其 非还原末端残基由不饱和艾杜糖醛酸组成，还原残基由N-硫酸葡糖胺 组成，并含有至少一个开环艾杜糖醛酸残基。

i)任选地通过部分酶促水解来处理在步骤c)中获得的化合物或在 步骤d)中获得的产物；和如果需要的话

j)将在步骤b)、c)和f)之一中获得的产物部分6-O-脱硫酸化；或 者

k)将部分或完全6-脱硫酸化的起始肝素进行步骤b)、c)和f)。

本发明2-O-脱硫酸化衍生物是用省去步骤a)和b)的上述方法获得 的。

本发明方法还可以通过下面的反应方案来说明：

依据本发明，优选的化合物是：

-部分2-O-脱硫酸化的肝素，其可通过省去步骤a)和b)的上述方 法获得，其中步骤c)是在60℃进行45分钟，步骤d)是在70℃于pH7 进行的，其分子量(MW)为11200，多分散指数D为1.3，脱硫酸化度 为1.99 (以SO3-∶COO-摩尔比表示)，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分 比是约50％(下文中还称为ST1514)；

-部分2-O-脱硫酸化的LMW肝素，其可通过省去步骤a)和b) 的上述方法获得，其中步骤c)是在60℃进行45分钟，步骤d)是在70 ℃于pH7进行的，然后进行步骤f)、g)和通过脱氨基来进行h)，其分 子量(MW)为3050，多分散指数D为2.2，脱硫酸化度为1.99(以 SO3-∶COO-摩尔比表示)，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约50％ (下文中还称为ST2010)；

-部分2-O-脱硫酸化的LMW肝素，其可通过省去步骤a)和b) 的上述方法获得，其中步骤c)是在60℃进行45分钟，步骤d)是在70 ℃于pH7进行的，然后进行步骤f)、g)和通过脱氨基来进行h)，其分 子量为Mn＝5800，Mw＝7520，多分散指数D为1.294，修饰的糖醛酸 占总糖醛酸的百分比是约50％(下文中还称为ST2184)；

-肝素N-乙酰基(50％)，其可通过上述方法获得，其中步骤a)在 室温进行2小时，步骤b)在4℃进行2小时，步骤c)、d)、e)省去，步 骤f)在4℃进行一夜，步骤g)在室温进行3小时，其分子量(MW)为 11200，多分散指数D为1.3，脱硫酸化度为1.6(以SO3-∶COO-摩尔比 表示)，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％(下文中还称为 ST1518)。

-LMW肝素N-乙酰基(50％)，其可通过上述方法获得，其中步 骤a)在室温进行2小时，步骤b)在4℃进行2小时，步骤c)、d)、e) 省去，步骤f)在4℃进行一夜，步骤g)在室温进行3小时，步骤h)通 过用亚硝酸脱氨基于4℃进行17分钟，然后于室温用硼氢化物还原醛 基3小时，其分子量为Mw＝4780，Mn＝10000，多分散指数D为2.092， 修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％(下文中还称为ST2168)。

-肝素N-乙酰基(27％)，其可通过上述方法获得，其中步骤a)在 室温进行2小时，步骤b)在4℃进行2小时，步骤c)、d)、e)、f)、g)、 h)省去，其分子量为Mn＝10890，Mw＝22370，多分散指数D为2.054 (下文中还称为ST2037)。

-肝素N-乙酰基(39％)，其可通过上述方法获得，其中步骤a)在 室温进行2小时，步骤b)在4℃进行2小时，步骤c)、d)、e)、f)、g)、 h)省去，其分子量为Mn＝10210，Mw＝21270，多分散指数D为2.083 (下文中还称为ST2038)。

-肝素N-乙酰基(64％)，其可通过上述方法获得，其中步骤a)在 室温进行2小时，步骤b)在4℃进行2小时，步骤c)、d)、e)、f)、g)、 h)省去，其分子量为Mn＝11070，Mw＝22000，多分散指数D为1.987 (下文中还称为ST2041)。

-肝素N-乙酰基(27％)，其可通过上述方法获得，其中步骤a)在 室温进行2小时，步骤b)在4℃进行2小时，步骤c)、d)、e)、f)、g)、 h)省去，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％(在下文中还称为 ST2185)。

-肝素N-乙酰基(39％)，其可通过上述方法获得，其中步骤a)在 室温进行2小时，步骤b)在4℃进行2小时，步骤c)、d)、e)、f)、g)、 h)省去，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％(在下文中还称为 ST2186)。

-肝素N-乙酰基(64％)，其可通过上述方法获得，其中步骤a)在 室温进行2小时，步骤b)在4℃进行2小时，步骤c)、d)、e)、f)、g)、 h)省去，修饰的糖醛酸占总糖醛酸的百分比是约30％(在下文中还称为 ST2187)。

化合物ST1514、ST1513、ST1516和ST1515的制备具体公开在 WO 01/55221中。

分子量可通过HPLC-GPC(高效液相色谱-凝胶渗透层析)测定。 脱硫酸化度是通过电导分析法测定的，并且修饰的糖醛酸的百分比是 通过13C-NMR测定的。

MW是分子量，D是以MW/Mn表示的多分散指数。

依据本发明，原料是不同来源的糖胺聚糖，优选天然肝素。还可 能使用N，6二硫酸酯的百分比含量为0-100％的化学改性的肝素。使 用具有不同6-O-硫酸化葡糖胺含量的产物作为原料，可调节一个打开 的艾杜糖醛酸与另一个之间的规则序列的长度。糖苷环被打开的本发 明糖胺聚糖按惯例被本领域技术人员称为RO衍生物，这是指该糖苷 环已经通过氧化作用，然后还原而被打开(还原-氧化-RO)。这种糖苷 环的打开通常还称为“二醇裂解”，之所以这样称谓是因为形成了存在 于开环上的两个伯羟基。这样的化合物还称为“RO”或“二醇裂解”衍生 物。

在另一个本发明实施方案中，通过上述开环反应(“二醇裂解”) 而形成的醛和伯羟基还可使自身发生随后的官能化。因此，式(I)化合 物还可以在衍生自二醇裂解的伯羟基上携带如上文关于X和X’所定义 的相同或不同的基团，例如从单糖或一个氨基酸到一个以上单元长度 优选2或3个单元的低聚糖或肽基团。

其中X和X’是-CH2OH的式(I)化合物还可用作其它类型药物的载 体，通过与肝素部分的适当结合，所述肝素部分能在正常的配制药物 生产和贮存条件下提供稳定的键，而在体内，优选在靶器官附近释放 出所运送的药物。可运送的药物的实例是甾类和非甾类抗炎药物、皮 质类固醇以及具有抗转移作用的其它药物，在这种情况下，作为本发 明化合物与其所结合的抗转移剂的单独内在活性的总和，抗转移作用 将被有利地增强，并且具有较高的靶目标选择性以及较低的系统毒性 这样的相关优点。这些药物的实例是金属蛋白酶抑制剂。其它可有用 运送的药物是在内皮水平上起作用的药物。其中X和X’不是羟基或醛 的式(I)化合物也可用作药物的载体，在这种情况下，X和X’基团将起 被运送的分子，即本发明糖胺聚糖与起载体作用的分子之间的“间隔 物”的作用，这些情况可能由于药动学或药效学的原因而是期望的。

对于衍生自肝素的本发明化合物，它们是用本领域技术人员众所 周知的技术，通过N-脱硫酸化，然后N-酰化而由肝素原料制得的。例 如，N-脱硫酸化是这样进行的：在DMSO∶H2O溶液95∶5 v∶v中于室温 溶剂分解0.5-8小时，然后在碱性条件下，用例如酰基酐(即乙酰基、 己酰基、琥珀酰基、新戊酰基)N-酰化。

接下来的2-O-脱硫酸化是在碱性试剂例如氢氧化钠存在下于室温 -100℃，优选50-70℃，例如在60℃温度下进行足够长的时间以获 得所需2-O-脱硫酸化。2-O-脱硫酸化是通过作用于过程参数例如反应 物浓度、温度和反应时间来控制。一个优选的实例是保持恒定的浓度： 底物(糖胺聚糖)浓度为80mg/ml，NaOH浓度为1M，60℃的恒定温 度，并将脱硫酸化的反应时间控制在15-60分钟。本领域技术人员可 根据标准试验和实验操作误差以及个体的一般知识来改变条件，例如 提高反应温度和缩短反应时间。

用碱性试剂处理可生成特征为在脱硫酸化单元上存在环氧环的中 间产物。令人十分惊讶的是，经证实，这些中间体具有类似于式(I)化 合物的类肝素酶抑制性质。因此，本发明的另一个目的是部分2-O-脱 硫酸化肝素，因此是具有减少的电荷的肝素，特别是2-O-脱硫酸化不 超过60％的肝素的衍生物，其特征在于在脱硫酸化位点存在环氧环。 特征是存在环氧环的所述化合物也属于本发明范围内。

在形成环氧环之后，将所述环氧环打开，这同样采用已知技术。 所形成的环氧化物的百分比是通过在约55ppm的13C-NMR信号面积 (是含有环氧化物的糖醛酸环的碳2和3的特征)与全体数目异头碳信 号面积(葡糖胺与糖醛酸残基的C1)之间的比例计算的。如果在加热条 件下进行开环，则获得半乳糖醛酸残基，而如果环氧环的开环是在冷 条件下进行，则获得艾杜糖醛酸残基。含有环氧环的化合物的优选实 例是可通过上述方法获得的，并且环氧化糖醛酸含量分别为14％(下文 中称为ST1509)、24％(下文中称为ST1525)和30％(下文中称为ST1526) 的那些。

然后依据上述方法将部分脱硫酸化肝素进行“二醇裂解”(缩写为 RO)和Smith降解(缩写为SD)。

或者，式(I)化合物也可不经由环氧化物中间体来获得，也就是说， 通过直接二醇裂解和随后的Smith降解获得。

上述方法还导致形成其中X和X’基团都是-CH2OH的式(I)化合 物。

对于不是-CH2OH的X和X’，本领域技术人员可采用用于将羟基 转化成其它如上所定义的基团的方法(参见例如第14-15页的反应方 案，化合物ST1828、ST1829、ST1917和ST1919)。例如，与氨基酸 或肽的缀合可通过用还原胺化反应处理得自二醇裂解反应的中间体醛 来进行(Hoffmann J.等人，Carbohydrate Research，117，328-331 (1983))，该反应可在含水溶剂中进行，并且不会妨碍肝素结构的保持。

如果需要的话，并且也构成本发明另一个目的的是，可用酸试剂 在合适的pH条件下，例如在pH4将式(I)化合物进一步降解，以生成 保持抗血管生成性质的低聚糖混合物。

同样，本发明的目的是通过上述方法的步骤g)、h)、i)和j)当中的 一个步骤获得的化合物。

本发明的目的是药物组合物，其中含有至少一种式(I)化合物作为 活性组分，所述式(I)化合物单独或者与一种或多种式(I)化合物联合， 或者所述式(I)化合物与上述N-酰基-脱硫酸化肝素例如环氧化中间体 联合；后者还可单独用作为药物组合物中的活性组分。本发明活性组 分可以与制药技术中常用的合适的载体和/或赋形剂，例如在 “Remington′s Pharmaceutical Sciences Handbook”，最新版中描述的 那些形成混合物。本发明组合物将含有治疗有效量的活性组分。剂量 由本领域技术人员例如临床医师或主治医师根据欲治疗的疾病类型和 患者身体状况决定，或者与其它活性组分的给药相伴。例如，剂量范 围可以是0.1-100mg/kg。

药物组合物的实例是可口服给药或非胃肠道、静脉内、肌内、皮 下、透皮给药或者呈鼻用或口腔用喷雾剂形式的那些。适用于这些目 的的药物组合物是片剂、硬或软胶囊、粉剂、溶液、悬浮液、糖浆剂 和用于临时制备液体制剂的固体剂型。用于非胃肠道给药的组合物是 例如所有肌内、静脉内和皮下注射剂型以及溶液、悬浮液和乳液。还 可以提及的是脂质体制剂。片剂还包括用于控制释放活性组分的形式， 它们可以是口服给药形式，用适当层包衣的片剂、微包囊粉剂、与环 糊精的复合物，也可以是贮库形式，例如皮下施用的贮库形式，例如 贮库注射剂或植入剂。

本发明化合物具有抗类肝素酶和抗血管生成活性。这使得它们适 于制备用于治疗患有改变的血管生成或需要抑制类肝素酶活性的治疗 的个体，一般是哺乳动物，特别是人个体的药物。

可用本发明药物治疗的疾病的实例是原发性肿瘤、转移瘤、糖尿 病性视网膜病、牛皮癣、晶状体后纤维组织形成、血管成形术后的再 狭窄、冠状动脉旁路、炎症、关节炎、自身免疫性疾病、同种移植物 排斥、心血管疾病、纤维增殖性疾病、异常血小板聚集引起的疾病、 平滑肌增殖引起的疾病、Goodpasture综合征、急性肾小球肾炎、新 生儿肺动脉高血压、哮喘、充血性心力衰竭、成人肺动脉高血压、肾 血管性高血压、增殖性视网膜病、实验性自身免疫性脑脊髓炎、多发 性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、局限性回 肠炎。

有利的是，本发明化合物基本上没有肝素的典型副作用。特别是， 本发明化合物基本上没有抗凝活性。对于本领域技术人员来说，基本 上没有这样的活性，从临床应用的角度上来看，是指没有或仅有可忽 略的活性。

类肝素酶抑制活性是依据Vlodavsky′s小组建立的方法测定的 (Bitan M.等人，1995)。该方法是基于评价由类肝素酶引起的硫酸乙酰 肝素蛋白聚糖(HSPG)的硫酸乙酰肝素链断裂的程度。硫酸盐标记的细 胞外基质(ECM)是最常用的HSPG来源。在缺乏和存在递增浓度的测 试化合物的情况下，将硫酸盐标记的ECM与重组类肝素酶在pH6.2 培养。为了评价蛋白聚糖降解的发生，收集培养基，施加到Sepharose 6B柱(0.9×30cm)上来进行凝胶过滤。用PBS以5ml/小时的流速洗脱 级份(0.2ml)，并计数放射性。用蓝色葡聚糖标记排除体积(Vo)，用酚 红标记总包括体积(Vt)。以0.5＜Kav＜0.8(峰II)将HS侧链的降解片 段从Sepharose 6B上洗脱下来。在所报道的实验条件下，良好的类肝 素酶抑制剂以10μg/ml或更小的浓度抑制HS断裂。

结果如下表1所示。

表1

在25μ/ml-5μ/ml剂量下的类肝素酶抑制                  抑制       剂量   25μg/ml    10μg/ml    5μg/ml       肝素     100％        n.d.     ＞100％ ST1516    肝素40％RO     100％        n.d.     ＞85％ ST1514    肝素～50％RO     100％        100％    ＞85％ ST1515    肝素27.5％RO     100％        100％    100％ ST1518    50％NAc肝素      30％RO     100％        100％    ＞85％

值得注意的是，即使在1μg/ml的浓度下，ST1518也具有高抑制 活性。

使用在WO 01/55221中描述的相同实验模型，测定本发明化合物， 特别是新化合物对于FGF生长因子的活性，结果表明它们表现出与在 引用文献中公开的化合物相当的活性。

下列实施例进一步举例说明了本发明。

实施例1

ST1518

将过量吡啶加到1g肝素的水溶液中，其中所述肝素是预先从 Amberlite IR 120柱上洗脱下来的。将该溶液减压蒸发；把所得的肝 素吡啶盐溶解在50ml DMSO/H2O 95∶5混合物中，在20℃搅拌2小时 以获得约50％的脱硫酸化度。

然后用等体积的饱和碳酸氢钠溶液稀释该溶液。用在膜(截止分子 量为1000-2000D)中的蒸馏水将该溶液透析。通过减压蒸发分离出终 产物。

通过将50％N-脱硫酸化肝素N-乙酰化来制备N-乙酰化肝素。将1 g肝素溶解在10ml蒸馏水中；将该溶液冷却至4℃，用碳酸氢钠饱和； 向该溶液中加入625μl乙酸酐，将该混合物在4℃搅拌2小时。在反 应期间，通过加入碳酸氢钠来控制pH并保持在约8。然后用在膜(截 止分子量为2000-1000D)中的蒸馏水将所得溶液透析。

将1g该50％N-乙酰化肝素溶解在25ml蒸馏水中，并冷却至4℃。 加入25ml NaIO4 0.2M溶液后，将该溶液在黑暗条件下搅拌20小时， 通过加入乙二醇来停止该反应，并通过切向超滤除去盐。向该脱盐的 溶液中分批加入400mg NaBH4。将该溶液在室温搅拌3小时，然后用 稀盐酸中和，通过切向超滤脱盐。

该化合物的13C NMR光谱如附图1所示。

实施例2

ST2010和ST2184

将5g肝素溶解在63ml NaOH 1N溶液中。将该溶液在60℃搅拌 45分钟，冷却，并用稀盐酸中和。然后将该溶液在70℃搅拌48小时， 冷却，用在膜(截止分子量为2000-1000D)中的水透析。

将2g2-O-脱硫酸化肝素溶解在50ml蒸馏水中，冷却至4℃。加 入50ml NaIO4 0.2M溶液后，将该溶液在黑暗条件下搅拌20小时， 通过加入乙二醇来停止该反应，通过切向超滤除去盐。向该脱盐的溶 液中分批加入800mg NaBH4。将该溶液在室温搅拌3小时，然后用稀 盐酸中和，通过切向超滤脱盐。

将400mg氧化-还原的肝素溶解在25ml蒸馏水中。加入7mg NaNO2后，用稀盐酸将pH调节至2，将该溶液在4℃搅拌17分钟。 通过中和停止该反应。向该脱盐的溶液中分批加入60mg NaBH4。将 该溶液在室温搅拌3小时，然后用稀盐酸中和，通过凝胶过滤来分级 分离。分离出具有不同分子量的两个级份：ST2010，具有Mw＝3050； 和ST2184，具有Mn＝5800，Mw＝7520。

化合物ST2010的13C NMR光谱如附图2所示。

实施例3

ST2041

将过量吡啶加到2g肝素的水溶液中，其中所述肝素是预先从 Amberlite IR 120柱上洗脱下来的。将该溶液减压蒸发；把所得的肝 素吡啶盐溶解在100ml DMSO/H2O 95∶5混合物中，在20℃搅拌4小 时，以获得约64％的脱硫酸化度。

然后用等体积的饱和碳酸氢钠溶液稀释该溶液。用在膜(截止分子 量为1000-2000D)中的蒸馏水将该溶液透析。通过减压蒸发分离出终 产物。

化合物ST2041的13C NMR光谱如附图3所示。