核糖核酸酶和青蒿素的联用
阅读：361发布：2021-04-13
专利汇可以提供核糖核酸酶和青蒿素的联用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了有关核糖核酸酶和青蒿素的联用的技术内容。本发明公开了一种药盒，所述药盒包括：一含有青蒿素或青蒿素衍 生物 的制剂；一含有核糖核酸酶的制剂；和一 说明书 。，下面是核糖核酸酶和青蒿素的联用专利的具体信息内容。
1.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括：
一含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂；
一含有核糖核酸酶的制剂；和
一说明书；
并且所述含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂是含有青蒿素或青蒿素衍生物的单元剂型，而所述核糖核酸酶的制剂是含有核糖核酸酶的单元剂型，
其中，所述的核糖核酸酶选自豹蛙卵核糖核酸酶、牛蛙或林蛙的RNase、或牛精管RNase；
所述的青蒿素衍生物选自双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢蒿甲醚、或蒿乙醚。
2.如权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述药盒中装有至少两个含有青蒿素或青蒿素衍生物的单元剂型和至少两个含有核糖核酸酶的单元剂型。
3.如权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液；所述含有核糖核酸酶的制剂是静脉注射液。
4.一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)将肿瘤细胞和核糖核酸酶混合培养20－30小时；
(2)加入青蒿素或青蒿素衍生物继续培养20－50小时；和
(3)用MTT法测定细胞毒性；
以肿瘤细胞和核糖核酸酶的混合物的总体积计，核糖核酸酶浓度为0.12－0.6μmol/L；以肿瘤细胞、核糖核酸酶和青蒿素或青蒿素衍生物的混合物的总体积计，青蒿素或青蒿素衍生物的浓度为2－10μmol/L，
其中，所述的核糖核酸酶选自豹蛙卵核糖核酸酶、牛蛙或林蛙的RNase、或牛精管RNase；
所述的青蒿素衍生物选自双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢蒿甲醚、或蒿乙醚；
所述的肿瘤细胞来自选自以下的肿瘤：恶性间皮瘤，非小细胞肺癌，胰腺癌，结肠癌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肿瘤细胞为每孔 2000－
4000个细胞。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肿瘤细胞为每孔2500－
3500个细胞。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肿瘤细胞为每孔3000个细胞。
8.一种制剂的用途，所述制剂为含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂和含有核糖核酸酶的制剂，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的权利要求1所述的药盒，
其中，所述的核糖核酸酶选自豹蛙卵核糖核酸酶、牛蛙或林蛙的RNase、或牛精管RNase；
所述的青蒿素衍生物选自双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢蒿甲醚、或蒿乙醚；
所述的肿瘤选自恶性间皮瘤，非小细胞肺癌，胰腺癌，结肠癌。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液；所述含有核糖核酸酶的制剂是静脉注射液。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药盒的使用方法包括步骤：
在使用有效剂量核糖核酸酶20－30小时后再使用有效剂量青蒿素或青蒿素衍生物。
核糖核酸酶和青蒿素的联用
技术领域
背景技术
[0002] Onconase是北方豹蛙(Rana pipiens)卵或早期胚胎中的一种核糖核酸酶。它由104个氨基酸残基构成，分子量约12,000道尔顿。它是RNase A(牛胰核糖核酸酶A)超家族的一员，其一级结构与RNase A有30％相同，它们的三级结构也颇为相似。Onconase可以抑制多种肿瘤的生长。Onconase虽然是蛋白质药物，但免疫原性很低，在临床上可以应用多个疗程。它的副反应不大，且具有抗多重耐药性的能力。
[0003] 青蒿素(Artemisinin)是中国科学家发现和开发的一种新的抗疟疾药。鉴于传统的奎宁类药物普遍遇到抗药性问题，青蒿素和它的衍生物目前已取代它们成为世界上抗疟疾的主流药物。青蒿素是从我国药用植物黄花蒿的叶中提取的一种倍半烯萜内酯化合物。它的大环上有一个内过氧化物桥，在亚铁离子或亚铁血红素的催化下，会放出以碳为中心的自由基。细胞内的蛋白质和核酸被这些自由基烷化后，细胞可能死亡。疟原虫寄生在红血球内，含有大量来自血红蛋白的亚铁血红素，因而青蒿素很易被活化，进而将疟原虫杀死。青蒿素和它的衍生物，如二氢青蒿素，蒿甲醚，蒿乙醚及青蒿琥酯等已广泛应用于疟疾治疗。更多的青蒿素衍生物正在研制中。近年来，国内外科学家相继发现，青蒿素也能抗癌。青蒿素和它的衍生物呈现广谱的抗癌效应。
[0004] 将这两类独特的药物，核糖核酸酶和青蒿素衍生物结合起来治疗肿瘤，会产生怎样的效果呢，却是本领域未知，但却迫切需要了解的。
发明内容
[0005] 本发明旨在提供核糖核酸酶和青蒿素及其衍生物联用抗肿瘤的方法。
[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种药盒，所述药盒包括：
[0007] 一含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂；
[0008] 一含有核糖核酸酶的制剂；和
[0010] 所述药盒中所述的含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液；所述的含有核糖核酸酶的制剂是静脉注射液。
[0011] 在本发明的第二方面，提供了一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞生长的方法，所述的方法包括步骤：
[0012] (1)将肿瘤细胞(每孔2000-4000个细胞，优选每孔2500-3500个细胞，更优选每孔3000个细胞)和核糖核酸酶混合培养20-30小时；
[0013] (2)加入青蒿素或青蒿素衍生物继续培养20-50小时；和
[0014] (3)用MTT法测定细胞毒性；
[0015] 以肿瘤细胞和核糖核酸酶的混合物的总体积计，核糖核酸酶浓度为0.12-0.6μmol/L；以肿瘤细胞、核糖核酸酶和青蒿素或青蒿素衍生物的混合物的总体积计，青蒿素或青蒿素衍生物的浓度为2-10μmol/L。
[0016] 在本发明的第三方面，提供了一种试验性的肿瘤的治疗方法，所述的方法包括步骤：
[0017] (a)先给皮下接种肿瘤的裸鼠静脉注射含有核糖核酸酶的制剂，如用Onconase，剂量为0.5-5mg/kg；
[0018] (b)步骤(a)的20-30小时后，给所述肿瘤患者施用含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂，如用DHA，剂量为5-50mg/kg；
[0019] (c)步骤(b)的40-60小时后，重复步骤(a)；和
[0020] (d)步骤(c)的20-30小时后，重复步骤(b)。
[0021] 所述治疗方法中，所述的含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液；所述的含有核糖核酸酶的制剂是静脉注射液。
[0022] 在本发明的第四方面，提供了一种使核糖核酸酶和青蒿素或青蒿素衍生物合用充分发挥药效的方法，所述的方法包括步骤：
[0023] 在使用有效剂量核糖核酸酶20-30小时后再使用有效剂量青蒿素或青蒿素衍生物。
[0024] 据此，本发明显示核糖核酸酶和青蒿素衍生物联合治疗肿瘤具有显著的协同效应。两药均为低毒，低免疫原性和广谱的抗癌药物。两药合用增强了它们的抗癌能力，并进一步降低了它们的副反应，是一种非常有前途的新的肿瘤治疗方式。附图说明
[0025] 图1显示了Onc与DHA对于恶性间皮细胞瘤MSTO-211H的联合抗肿瘤效应；其中a是“蛋白浓度-细胞存活率”曲线；b是Onc和DHA对每孔3000个MSTO-211H肿瘤细胞联用72小时的等效应分析情况。
[0026] 图2显示了Onc与DHA协同给药可以显著降低MSTO-211H荷瘤裸小鼠肿瘤体积；其中(a)和(b)是给药后肿瘤体积抑制情况以及相应时间的小鼠体重变化。
[0027] 图3显示了荷瘤裸小鼠血液生化指标分析结果；其中a是柱状图，生理盐水组(Saline，n＝6)，Onc给药组(Onc＝1.5mg/kg，n＝5)，联合给药组(Onc1.5mg/kg+DHA20mg/kg，n＝5)，DHA给药组(DHA＝20mg/kg，n＝5)；各指标Y轴的单位分别为：
CRE-μmol/L；BUN-mmol/L；TP-g/L；GLOB-g/L；T-BIL-μmol/L；ALT-U/L；AST-U/L；ALB-g/L；b是各个指标对应中文名称。
CRE-μmol/L；BUN-mmol/L；TP-g/L；GLOB-g/L；T-BIL-μmol/L；ALT-U/L；AST-U/L；ALB-g/L；b是各个指标对应中文名称。
具体实施方式
[0028] 发明人经过广泛而深入的研究，发现核糖核酸酶和青蒿素或其衍生物联合使用抗肿瘤，无论体内还是体外，都可以产生明显的协同效应。具体地是豹蛙卵核糖核酸酶和双氢青蒿素，并且豹蛙卵核糖核酸酶必须先于双氢青蒿素使用。在此基础上，完成了本发明。
[0029] 如本文所用，“核糖核酸酶”是指一种具有细胞毒性的核糖核酸酶，包括豹蛙卵核糖核酸酶(Onconase，Onc或Ranpirnase)、牛蛙或林蛙的RNases，牛精管RNase，人嗜曙红细胞衍生的神经毒素等以及由基因工程改造过的牛胰或人胰RNases等；优选Onc。
[0030] 所述的豹蛙卵核糖核酸酶是一种对于抑制肿瘤细胞有用的酶，其可在胞浆内选择性地降解tRNA，抑制蛋白合成进而抑制细胞增殖和引起细胞凋亡。
[0031] 在本发明中，所用的豹蛙卵核糖核酸酶可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动物。此外，所述的豹蛙卵核糖核酸酶也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组蛙卵核糖核酸酶。优选的，本发明可采用重组的豹蛙卵核糖核酸酶。
[0032] 任何适合的豹蛙卵核糖核酸酶均可用于本发明。所述的豹蛙卵核糖核酸酶包括全长的豹蛙卵核糖核酸酶或其生物活性片段。优选的，所述的蛙卵核糖核酸酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：4所示的序列基本上相同。
[0033] 经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的豹蛙卵核糖核酸酶的氨基酸序列也包括在本发明中。豹蛙卵核糖核酸酶或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。
[0034] 任何一种豹蛙卵核糖核酸酶的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，豹蛙卵核糖核酸酶的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的豹蛙卵核糖核酸酶的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长蛙卵核糖核酸酶的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长豹蛙卵核糖核酸酶的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
[0035] 本发明也可采用经修饰或改良的豹蛙卵核糖核酸酶，比如，可采用为了延长其半衰期、改善其稳定性或增强其杀伤肿瘤细胞能力而加以修饰或改良的豹蛙卵核糖核酸酶。所述经过修饰或改良的豹蛙卵核糖核酸酶或者基因可以是与天然存在的豹蛙卵核糖核酸酶或基因虽然具有一定的不同点，但也能杀伤肿瘤细胞，且不会带来其它不良影响或毒性。
也就是说，任何不影响豹蛙卵核糖核酸酶的生物活性或者说是基因的生物功能的变化形式都可用于本发明中。
也就是说，任何不影响豹蛙卵核糖核酸酶的生物活性或者说是基因的生物功能的变化形式都可用于本发明中。
[0036] 作为本发明的一个实例，所述的豹蛙卵核糖核酸酶是重组表达的，所述的豹蛙卵核糖核酸酶的编码基因全长315bp，编码104个AA的一个多肽，该基因如SEQ ID NO：3所示，其编码的蛋白如SEQ ID NO：4所示。
[0037] 所述的蛙卵核糖核酸酶可通过常规的基因工程方法生产，一般来说有以下步骤：
[0038] (1)用含有豹蛙卵核糖核酸酶编码基因的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0039] (2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0040] (3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0041] 如本文所用，“青蒿素或其衍生物”包括双氢青蒿素(DHA)、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢蒿甲醚、蒿乙醚等；优选DHA。
[0042] 以下是本领域几种已知的青蒿素和青蒿素衍生物的化学式：
[0043]
[0044] 本文所述的“青蒿素衍生物”除了文中提到的那些以外，还包括本领域技术人员能够通过简单的化学方法，例如取代、还原等方法对于骨架上的侧链基团进行修饰，而仍然保留青蒿素活性的那些衍生物。这些衍生物的合成方法可以参考现有技术中的教科书。同时，青蒿素衍生物还包括其各种酸碱形式的盐、水合物、光学异构体等。
[0045] 本发明提供一种药盒，所述药盒包括：
[0046] 一含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂；
[0047] 一含有核糖核酸酶的制剂；和
[0048] 一说明书。
[0049] 所述含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液；所述含有核糖核酸酶的制剂是静脉注射液。
[0050] 所述含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂可以是含有青蒿素或青蒿素衍生物的单元剂型，所述核糖核酸酶的制剂可以是含有核糖核酸酶的单元剂型。
[0051] 药盒中装有至少两个含有青蒿素或青蒿素衍生物的单元剂型和至少两个含有核糖核酸酶的单元剂型；较佳地各为4-10个。
[0052] 如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。
[0053] 所述的含有青蒿素或其衍生物的单元剂型可以是片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。所述的含有核糖核酸酶的单元剂型是静脉注射液。
[0054] 本发明提供的说明书中有如下描述：所述药盒的使用方法是使用含有核糖核酸酶的单元剂型20-30小时后使用含有青蒿素或青蒿素衍生物的单元剂型，隔一天，重复这样的使用方式一次。
[0055] 本发明提供的药盒通过下述步骤制备得到：将含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂和含有核糖核酸酶的制剂，以及说明书一起放置，形成药盒。所述的含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂优选含有青蒿素或青蒿素衍生物的单元剂型，所述核糖核酸酶的制剂优选含有核糖核酸酶的单元剂型。所述步骤优选将至少两个含有青蒿素或青蒿素衍生物的单元剂型和至少两个含有核糖核酸酶的单元剂型，以及说明书一起放置，形成药盒。
[0056] 本发明提供的药盒用于治疗肿瘤，所述的肿瘤包括恶性间皮瘤，非小细胞肺癌，胰腺癌，鼻咽癌，胸腺瘤，结肠癌，乳癌，黑色素瘤，肾癌以及白血病和淋巴瘤等；优选恶性间皮瘤。
[0057] 本发明提供一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞生长的方法，所述的方法包括步骤：
[0058] (1)将肿瘤细胞和核糖核酸酶混合培养20-30小时；和
[0059] (2)加入青蒿素或青蒿素衍生物继续培养45-50小时。
[0060] 所述的肿瘤细胞包括恶性间皮瘤，非小细胞肺癌，胰腺癌，鼻咽癌，胸腺瘤，结肠癌，乳癌，黑色素瘤，肾癌以及白血病和淋巴瘤等；优选恶性间皮瘤。
[0061] 所述步骤(1)中，将每孔3000个肿瘤细胞和1.2-6×10-1μmol/L核糖核酸酶混合培养20-30小时。
[0062] 所述步骤(2)中，加入的青蒿素或其衍生物是2-10μmol/L。
[0063] 步骤(1)中的混合培养时间优选22-26小时；步骤(2)中的继续培养时间优选46-48小时。
[0064] 所述的含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液；所述的含有核糖核酸酶的制剂是静脉注射液。
[0065] 所述的含有青蒿素或青蒿素衍生物的制剂优选含有青蒿素或青蒿素衍生物的单元剂型，所述的核糖核酸酶的制剂优选含有核糖核酸酶的单元剂型。
[0066] 所述的含有青蒿素或其衍生物的单元剂型可以是片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。
[0067] 所述的含有核糖核酸酶的单元剂型是静脉注射液。
[0068] 步骤(b)和(d)中的时间优选22-26小时；步骤(c)中的时间优选45-50小时。
[0069] 所述肿瘤细胞包括恶性间皮瘤，非小细胞肺癌，胰腺癌，鼻咽癌，胸腺瘤，结肠癌，乳癌，黑色素瘤，肾癌以及白血病和淋巴瘤等；优选恶性间皮细胞瘤。
[0070] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0071] 本发明的主要优点在于：
[0072] 1、Onc与DHA联用可增强抑制肿瘤生长效果。
[0073] 2、两药的副反应不尽相同，合用时，每个药的剂量较各自单独使用的量低，因此有可能减轻副反应。
[0074] 3、Onc与DHA都是低毒性，低免疫原性的药物，它们的组合应保持上述特性，而且有可能长期使用。
[0075] 4、DHA具很强的抑制肿瘤新生血管的能力，Onc也具类似活性。两者组合有可能用于防止经化疗或放疗的肿瘤再次复发。
[0076] 5、两药联合组成药盒，可以规定每个疗程的药量，使用时间和两药配比等。这样治疗可以方便而安全地进行。
[0077] 下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
[0078] 本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
[0079] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0080] 实施例1
[0081] 联合使用Onc与DHA对恶性间皮细胞瘤MSTO-211H的细胞毒性作用
[0082] 恶性间皮细胞瘤MSTO-211H培养于含10％胎牛血清，青霉素(100units/ml)，链霉素(100μg/ml)RPMI1640(GIBICO)培养基中。96孔板培养，每孔加90μl培养液4
(2×10cells/ml)，CO2(5％)培养箱中培养12h后，联合给药孔中先加入设定浓度梯度的Onc蛋白样品10μl，对照组孔中一次性分别加入单独给药的Onc，DHA和PBS，24h后联合给药孔中再加入设定浓度梯度的DHA(10μl)，培养48h后，MTT法检测细胞存活率，利用药物等效线法则判定其联合给药效应。结果见图1。
(2×10cells/ml)，CO2(5％)培养箱中培养12h后，联合给药孔中先加入设定浓度梯度的Onc蛋白样品10μl，对照组孔中一次性分别加入单独给药的Onc，DHA和PBS，24h后联合给药孔中再加入设定浓度梯度的DHA(10μl)，培养48h后，MTT法检测细胞存活率，利用药物等效线法则判定其联合给药效应。结果见图1。
[0083] Onc给药最高浓度为[10A]＝0.6μmol/L，DHA给药最高浓度[10B]＝10μmol/L。按照A/B＝5/0，4/1，3/2，2/3，1/4，0/5的比例按照一定梯度稀释后先加入Onc，24h后加入配制好的DHA，得到每种组合比例的“蛋白浓度-细胞存活率”曲线(图1(a))，并且计算得出每种组合比例中Onc和DHA分别的IC50值。以所有比例中Onc的值为X轴，DHA的值为Y轴得到二维坐标图。将比例分别为[5/0]和[0/5]的坐标点连线，由于剩余四点位于连线的左侧，结果表明，Onc与DHA对于恶性间皮细胞瘤MSTO-211H的联合给药具有协同作用(图1(b))。
[0084] 图1显示Onc与DHA对于恶性间皮细胞瘤MSTO-211H的协同抗肿瘤效应。Onc给药最高浓度为[10A]＝0.6μmol/L，DHA给药最高浓度[10B]＝10μmol/L，按照A/B＝5/0，4/1，3/2，2/3，1/4，0/5的比例进行一系列梯度稀释后，先加入Onc，24h后再加入配制好的DHA，继续保温48小时。由此得到每种组合比例的“蛋白浓度-细胞存活率”曲线(图
1(a))，并且计算得出每种组合比例中Onc和DHA分别的IC50值，以所有比例中Onc的值为X轴，DHA的值为Y轴得到二维坐标图，将比例分别为[5/0]和[0/5]的坐标点连线。由于剩余四点在连线的左侧，因此得出结论：Onc与DHA对于恶性间皮细胞瘤MSTO-211H的联合给药具有协同作用(图1(b))
1(a))，并且计算得出每种组合比例中Onc和DHA分别的IC50值，以所有比例中Onc的值为X轴，DHA的值为Y轴得到二维坐标图，将比例分别为[5/0]和[0/5]的坐标点连线。由于剩余四点在连线的左侧，因此得出结论：Onc与DHA对于恶性间皮细胞瘤MSTO-211H的联合给药具有协同作用(图1(b))
[0085] 实施例2
[0086] Onc与DHA联合给药治疗接种恶性间皮细胞瘤MSTO-211H的裸小鼠
[0087] 收集足够量的恶性间皮细胞瘤MSTO-211H，加入100％Matrigel混匀后，每只裸小6
鼠于右后肢表皮下接种2×10 个细胞。接种后第十日开始给药。协同给药组每周两次尾静脉注射Onc 1.5mg/kg，每次注射后的次日于腹腔给药注射DHA20mg/kg，共给药三周(6次)。
对照组分别为尾静脉注射的Onc1.5mg/kg，腹腔给药注射的DHA20mg/kg，以及生理盐水，每周均给药两次，共给药三周(6次)。每周两次测量其肿瘤直径，按照肿瘤体积＝0.4×长×
2
宽 计算其肿瘤体积大小，并记录小鼠体重。结果见图2。
鼠于右后肢表皮下接种2×10 个细胞。接种后第十日开始给药。协同给药组每周两次尾静脉注射Onc 1.5mg/kg，每次注射后的次日于腹腔给药注射DHA20mg/kg，共给药三周(6次)。
对照组分别为尾静脉注射的Onc1.5mg/kg，腹腔给药注射的DHA20mg/kg，以及生理盐水，每周均给药两次，共给药三周(6次)。每周两次测量其肿瘤直径，按照肿瘤体积＝0.4×长×
2
宽 计算其肿瘤体积大小，并记录小鼠体重。结果见图2。
[0088] 图2显示Onc与DHA协同给药可以显著降低MSTO-211H荷瘤裸小鼠肿瘤体积。(a)和(b)：给药后肿瘤体积抑制情况以及相应时间的小鼠体重变化(生理盐水组：生理盐水，n＝6；Onc给药组：Oncl.5mg/kg，n＝5；DHA给药组：DHA20mg/kg，n＝5；协同给药组：
Onc1.5mg/kg+DHA20mg/kg，n＝5)
Onc1.5mg/kg+DHA20mg/kg，n＝5)
[0089] 结果表明，两药合用的抗癌效果比单药分别使用明显增强，可以几乎完全抑制肿瘤的生长。两药合用并不引起裸鼠体重明显的变化，说明药物的毒性很低。图2b所示为用药后裸鼠体重的变化，如用药后体重明显减轻，说明药物有毒性。反之，体重没明显变化，说明药物毒性不大。
[0090] 实施例3
[0091] 血液生化指标检验给药后荷瘤裸小鼠肝肾损伤情况
[0092] 停药后第十天小鼠眼球取血500μl，离心取血清200μl，测定血清中各个生化指标的情况。结果见图3。
[0093] 图3显示荷瘤裸小鼠血液生化指标分析：生理盐水组(生理盐水，n＝6)，Onc给药组(Onc＝1.5mg/kg，n＝5)，协同给药组(Onc 1.5mg/kg+DHA 20mg/kg，n＝5)，DHA给药组(DHA＝20mg/kg，n＝5)；各指标Y轴的单位分别为：CRE-μmol/L；BUN-mmol/L；TP-g/L；GLOB-g/L；T-BIL-μmol/L；ALT-U/L；AST-U/L；ALB-g/L(图(a))；(b)为各个指标对应中文名称。
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