已知象多拉抑放素(Dolastatin)-10(US 4,816,444)和多拉抑放 素-15(EP-A-398558)之类的从海洋源分离的肽显示出有效的细胞生长抑制 活性(参见：生物化学药理学40，8，1859-64，1990；J.Natl.Cancer Inst.85，483-88，1993以及其中引用的参考文献)。基于体内实验肿瘤 系统中令人感兴趣的结果，目前正在进行这些天然产物的进一步临床前评 价，以便在癌症患者中开始临床研究。

然而，天然产物具有缺点，例如在含水溶剂中溶解性差以及合成需要 昂贵的原材料。

本文描述的本发明提供了新肽及其衍生物，这些新肽及其衍生物与多 拉抑放素-15相比具有提高的治疗赘生性疾病的潜力。而且，本发明的化合 物可以如下面的详细描述方便地合成。

本发明的化合物包括式I的新肽以及它们与生理上可耐受的酸的盐：

R1R2N-CHX-CO-A-B-D-E-(F)t-K              I

其中

R1是甲基、乙基或异丙基；

R2是氢、甲基或乙基；

R1-N-R2一起可以是吡咯烷环；

A是缬氨酰、异亮氨酰、亮氨酰、2-叔-丁基甘氨酰、2-乙基甘氨酰、正 亮氨酰或正缬氨酰残基；

B是N-甲基-缬氨酰、-亮氨酰、-异亮氨酰、-正缬氨酰、-正亮氨酰、-2- 叔-丁基甘氨酰、-3-叔-丁基丙氨酰或-2-乙基甘氨酰残基；

D是3，4-脱氢脯氨酰、4-氟脯氨酰、4，4-二氟脯氨酰、氮杂环丁烷-2- 碳酰、3-甲基脯氨酰、4-甲基脯氨酰或5-甲基脯氨酰残基；

E是脯氨酰、高脯氨酰、羟脯氨酰或噻唑烷-4-碳酰残基；

F是缬氨酰、2-叔-丁基甘氨酰、异亮氨酰、亮氨酰、2-环己基甘氨酰、 正亮氨酰、正缬氨酰、新戊基甘氨酰、丙氨酰、β-丙氨酰或氨基异丁酰 残基；

X是烷基(优选地是C2-5)、环丙基或环戊基；

t是0或1；并且

K是烷氧基(优选地是C1-4)、苄氧基或取代的或非取代的氨基部分。

本发明也提供了制备式I的化合物的方法、包含这样的化合物以及药 学上可接受的载体的药物组合物、使用该药物组合物治疗哺乳动物中的癌 症的方法。

具体地说，K可以是C1-4-烷氧基、苄氧基、-NH2，-NH-C1-12-烷基、 -NH-C(CH3)2CN、-NH-C(CH3)2CCH、-NH-C(CH3)2C＝CH2、-NH-C(CH3)2CH2CH2OH、 -NH-C(CH3)2CH2OH、-NH-C3-8-环烷基、-NH-[3，3，0]-二环辛基、降麻黄碱 基(norephedryl)、降假麻黄碱基(norpseudoephedryl)、-NH-喹啉基、-NH- 吡嗪基(pyrazyl)、-NH-CH2-苯并咪唑基、-NH-金刚烷基(adamantyl)、- NH-CH2-金刚烷基、-NH-CH(CH3)-苯基、-NH-C(CH3)2-苯基、-N(C1-4-烷氧 基)-C1-4-烷基、-N(C1-4-烷氧基)-CH2-苯基、-N(C1-4-烷氧基)-苯基、 -N(CH3)OBzl、-NH-(CH2)v-苯基(v＝0，1，2或3)、-NH-(CH2)m-萘基(m＝0或1)、 -NH-(CH2)w-二苯甲基(w＝0，1或2)、-NH-联苯基、-NH-吡啶基、-NH-CH2- 吡啶基、-NH-CH2-CH2-吡啶基、-NH-苯并噻唑基、-NH-苯并异噻唑基、-NH- 苯并吡唑基、-NH-苯并噁唑基、-NH-(CH2)m-芴基(m＝0或1)、-NH-嘧啶基、 -NH-(CH2)m-2，3-二氢化茚基(m＝0或1)、-NH-(CH2CH2O)y-CH3(y＝0，1，2，3， 4或5)、-NH-(CH2CH2O)y-CH2CH3(y＝0，1，2，3，4或5)、-(CH2CH2O)y-CH3(y＝0， 1，2，3，4或5)、-(CH2CH2O)y-CH2CH3(y＝0，1，2，3，4或5)、 -NCH3-NH-C6H5、-NCH3-NH-CH2C6H5；或K是

优选的是这样的式I的化合物，其中的取代基R1、R2、A、B、D、E、 X、F和t具有下列含义：

R1是甲基或乙基；

R2是氢、甲基或乙基；

A是缬氨酰、异亮氨酰、2-叔-丁基甘氨酰残基；

B是N-甲基缬氨酰、-异亮氨酰或-2-叔-丁基甘氨酰残基；

D是3，4-脱氢脯氨酰、4-氟脯氨酰、氮杂环丁烷-2-碳酰、3-甲基脯氨酰 或5-甲基脯氨酰残基；

E是脯氨酰、高脯氨酰、羟脯氨酰或噻唑烷-4-碳酰残基；

F是D-缬氨酰、2-叔-丁基甘氨酰、D-异亮氨酰、D-亮氨酰、或氨基异丁 酰残基；

X是-CH(CH3)2、-C(CH3)3或-CH(CH3)CH2CH3；

t是0或1；

K优选地是：

-OC(CH3)3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-NH(CH2)2CH3、-NH(CH2)3CH3、-NH(CH2)4CH3、 -NH(CH2)5CH3、-NH(CH2)6CH3、-NH(CH2)7CH3，

K优选地是：

-OC(CH3)3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-NH(CH2)2CH3、-NH(CH2)3CH3、-NH(CH2)4CH3、

-NH(CH2)5CH3、-NH(CH2)6CH3、-NH(CH2)7CH3、-NHCH(CH3)2、-NHCH(CH3)CH2CH3、

-NHCH(CH3)CH2CH2CH3、-NHCH(CH2CH3)2、-NH(CH2CH2CH3)2、-NHC(CH3)3、 -NHCH(CH2CH3)CH2CH2CH3、-NHCH(CH3)CH(CH3)2、-NHCH(CH2CH3)CH(CH3)2、 -NHCH(CH3)C(CH3)3、-NH-环丙基、-NH-环丁基、-NH-环戊基、-NH-环己基、 -NH-环庚基、-NH-环辛基、-NH-二环[3，3，0]辛基、-N(CH3)OCH3、 -N(CH3)OCH2CH3、-N(CH3)OCH2CH2CH3、-N(CH3)OCH(CH3)2、-N(CH2CH3)OCH3、 -N(CH2CH3)OCH2CH3、-N(CH(CH3)2)OCH3、-N(CH3)OCH2C6H5、-N(OCH3)CH2-C6H5、 -N(CH3)OC6H5、-NH-CH2-C6H5、-NH(CH2)2C6H5、-NH(CH2)3C6H5、-NHCH(CH3)C6H5、 -NHC(CH3)2C6H5、-NHC(CH3)2CH2CH3、-NHC(CH3)(CH2CH3)2、 -NHCH(CH3)CH(OH)C6H5、、-NHCH2-环己基、-NH-CH2CF3、-NHCH(CH2F)2、 -NHC(CH3)2CH2CH2OH、-NH(CH2CH2O)2CH2CH3、-NHC(CH3)2CH(CH3)2、-NHC(CH3)2CN、 -NHC(CH3)2CCH、降麻黄碱基、降假麻黄碱基、-NH-喹啉基、-NH-吡嗪基、 -NH-金刚烷基(2)、-NH-金刚烷基(1)、-NH-CH2-金刚烷基、-NH-CH2-萘基、 -NH-二苯甲基、-NH-联苯基、-NH-吡啶基、-NH-CH2-吡啶基、-NH-CH2-CH2- 吡啶基、-NH-苯并噻唑基、-NH-苯并异噻唑基、-NH-苯并吡唑基、-NH-苯 并噁唑基、-NH-芴基、-NH-嘧啶基、-NH-CH2-(4-甲基)-噻唑基(2)、-NH-CH2- 呋喃基(2)、-NH-CH2-噻吩基(2)、-NH-CH2-(5-甲基)-噻吩基(2)、-NH-噻 唑基(2)、-NH-异噁唑基(3)、-NH-(3-甲基)异噁唑基(5)、-NH-(3-甲基)异 噻唑基(5)、-NH-(2-三氟甲基)-噻二唑基(5)、-NH-(2-环丙基)噻二唑基 (5)、-NHC(CH3)2C＝CH2，或K可以是

这些例子说明但不限制本发明的范围。

式I的肽是由L-氨基酸组成的，但F也可以是D-氨基酸。

所述新化合物可以以与生理上可耐受的酸的盐存在，所述酸如盐酸、 柠檬酸、酒石酸、乳酸、磷酸、甲磺酸、醋酸、甲酸、马来酸、富马酸、 苹果酸、琥珀酸、丙二酸、硫酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、丙酮酸、粘酸、 苯甲酸、葡糖醛酸、草酸、抗坏血酸和N-乙酰甘氨酸。

可以用肽化学的已知方法制备新化合物。这样，所述肽可以从氨基酸 依次装配或通过连接适当的小肽片段装配。在依次装配中，肽链从C末端 开始以每次一个氨基酸逐步延长。在片段偶联中，把不同长度的片段连接 在一起是可能的，所述片段同样可以通过从氨基酸依次装配或通过片段自 身偶联获得。

在依次装配和片段偶联中，通过形成酰胺键连接所述单位是必需的。 酶促和化学方法适合于这种连接。

用于形成酰胺键的化学方法在Mueller，Methoden der organischen Chemie第XV卷/2，第1-364页，Thieme Verlag Stuttgart，1974； Stewart，Young，固相肽合成，第31-34页，第71-82页，Pierce化学 公司，Rockford，1984；Bodanszky，Klausner，Ondetti，肽合成， 第85-128页，John Wiley & Sons，纽约，1976以及其它关于肽化学的 权威著作中有详尽描述。尤其优选的是叠氮化物方法、对称的和混合的酸 酐方法、原位产生的或预先形成的活性酯、利用尿烷保护的氨基酸的N-羧 基酸酐以及使用偶联试剂/活化剂形成酰胺键，所述偶联试剂/活化剂尤其 是二环己基碳二酰亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙氧羰基-2- 乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺氢氯化 物(EDCI)、正丙烷膦酸酐(PPA)、N，N-双(2-氧代-3-噁唑烷基 (oxazolldinyl))-酰氨基磷酰氯化物(BOP-C1)、溴代-三-吡咯烷磷鎓六氟 磷酸酯(PyBrop)、二苯磷酰叠氮化物(DPPA)、Castro试剂(BOP，PyBop)、 邻苯并三唑基-N，N，N′，N′-四甲基脲盐(HBTU)、邻氮杂苯并三唑基-N，N， N′，N′-四甲基脲盐(HATU)、二乙基磷酰氰化物(DEPCN)、2，5-二苯基-2，3- 二氢-3-氧代-4-羟基噻吩二氧化物(Steglich试剂；HOTDO)以及1，1′-羰 基二咪唑(CDI)。偶联试剂可以单独使用或与添加剂一起使用，所述添加剂 例如N，N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)、N-羟基-苯并三唑(HOBt)、N-羟基- 苯并三嗪(HOOBt)、氮杂苯并三唑(HOAt)、N-羟基-琥珀酰亚胺(HOSu)或2- 羟基吡啶。

然而，在酶促肽合成中省去保护基通常是可能的，在化学合成中，不 参与酰胺键形成的反应基团的可逆保护对两种反应物来说是必要的。对化 学肽合成而言，优选的是三种常规的保护基技术：苄氧羰基(Z)、叔丁氧羰 基(Boc)以及9-芴基甲氧羰基(Fmoc)技术。在每种情况下识别的是链延长单 位的α-氨基基团上的保护基团。有关氨基酸保护基的详尽综述由Mueller， Methoden der organischen Chemie第XV卷/1，第20-906页，Thieme Verlag，Stuttgart，1974给出。用于装配肽链的单位可以在溶液、悬浮 液中反应或通过类似于由Merrifield在美国化学学会杂志85(1963)2149 中描述的方法反应。尤其优选的方法是其中肽依次装配或通过Z、Boc或 Fmoc保护基技术进行片段偶联的方法。在所说的Merrifield技术中，把一 种反应物结合到不溶性聚合支持物(下文也称为树脂)上。这典型地使所述 肽在聚合支持物上依次装配，在此过程中使用了Boc或Fmoc保护基技术， 加长的肽链以C末端共价结合到不溶性树脂颗粒上(参见图1和2)。该方法 使通过过滤除去试剂和副产物成为可能，这样就不需要进行中间体的再结 晶。

被保护的氨基酸可以与任何适合的聚合物连接，该聚合物仅仅必须是 在所使用的溶剂中不溶性的并具有使过滤容易的稳定的物理形式。聚合物 必须包含使第一个被保护的氨基酸可以通过共价键牢固连接到其上的功能 基团。适合于此目的的聚合物有多种，例如纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙 烯酸酯、磺化聚苯乙烯、氯甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(Merrifield 树脂)、4-甲基二苯甲基胺树脂(MBHA-树脂)、苯乙酰氨基甲基树脂(Pam- 树脂)、对苄氧基-苄基-醇-树脂、二苯甲基-胺-树脂(BHA-树脂)、4-(羟甲 基)-苯甲酸基-甲基-树脂、Breipohl等的树脂(Tetrahedron Letters 28 (1987)565；由BACHEM提供)、4-(2，4-二甲氧苯氨甲基)苯氧基-树脂(由 Novabiochem提供)或邻氯三苯甲基-树脂(由Biohellas供应)。

适合在溶液中的肽合成的是在反应条件下为惰性的所有溶剂，尤其是 水、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、二氯甲烷(DCM)、 1，4-二噁烷、四氢呋喃(THF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)以及所说的溶剂 的混合物。在聚合支持物上的肽合成可以在所有惰性有机溶剂中(其中所使 用的氨基酸衍生物是可溶性的)进行。然而，优选的溶剂还具有树脂-膨胀 性质，如DMF、DCM、NMP、乙腈和DMSO以及这些溶剂的混合物。在合成 完全后，把肽从聚合支持物上裂解下来。在文献中公开了可以从各种树脂 类型上裂解下来的条件。最常用的裂解反应是酸和钯催化的，具体来说是 在液态无水氟化氢、无水三氟甲磺酸、稀释的或浓缩的三氟醋酸中的裂解、 在弱碱(如吗啉)存在下，在THF或THF-DCM混合物中的钯催化的裂解或在 醋酸-二氯甲烷-三氟乙醇混合物中的裂解。依赖于所选择的保护基，在裂 解条件下它们可以保持下来或同样地裂解掉。

当要进行某些衍生反应时，肽的部分去保护也是值得的。可以通过下 列方法制备在N-末端二烷基化的肽：a)通过在溶液中或在聚合支持物上 偶联适当的N，N-二-烷基氨基酸，b)通过在DMF/1％乙酸中用NaCNBH3和适 当的醛或酮还原性烷基化树脂-结合的肽，c)通过在醛或酮和钯/C存在下 在溶液中氢化所述肽。

本文公开的各种非天然存在的氨基酸可以从商业来源获得或使用本领 域已知的方法从市售的物料合成。氮杂环丁烷-2-羧酸、3-甲基-L-脯氨 酸、5-甲基-L-脯氨酸和Boc-或Fmoc-保护的3，4-脱水脯氨酸是市售的起 始原料(ACROS，NOVABIOCHEM，BACHEM)。顺式-和反式-4-氟脯氨酸可以 通过由Panasik等描述的方法(N.Panasik，E.S.Eberhardt，A.S. Edison，D.R.Powell，R.T.Raines，国际肽蛋白质研究杂志44， 1994，262-269)从羟脯氨酸制备。

通过对哺乳动物施用本发明的化合物，可以将本发明的化合物用于抑 制或者治疗固体肿瘤(例如肺脏、胸部、结肠、前列腺、膀胱、直肠或子宫 内膜肿瘤)或血液肿瘤(例如白血病，淋巴瘤)。

新的化合物的特殊的优点是这些化合物与多拉抑放素-15相比对酶促 降解具有更大的抗性。

施用可以通过任何用于药剂(优选地是肿瘤药剂)的常规的方式进行， 这些方式包括口服和肠胃外方式，如皮下、静脉内、肌内和腹膜内。

所述化合物可以单独施用或以药物组合物的形式施用，所述药物组合 物包含式I的化合物与适用于所需的给药途径的药学上可接受的载体。这 样的药物组合物可以是组合产物，即也可以包含其它治疗活性成分。

对哺乳动物施用的剂量包含抑制肿瘤有效量的活性成分，该活性成分 取决于常规因素；这些因素包括所使用的特定化合物的生物活性；施用方 式；接收者的年龄、健康状况和体重；症状的性质与程度；治疗频率；其 它治疗剂的施用；所需的作用。典型的每日剂量是口服施用时每公斤体重 大约0.5至50mg，肠胃外施用时大约0.05至20mg。

新的化合物可以以常规的固体或液体药物施用形式施用，所述形式例 如未包衣的或(薄膜)包衣的片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、栓剂或溶液。它 们以常规方式产生。为了这一目的，所述活性物质可以与常规的药学助剂 加工，所述助剂例如片剂粘合剂、填充剂、防腐剂、片剂分解剂、流动调 节剂、增塑剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、溶剂、缓释组合物、抗氧化剂 和/或推进气体(参见H.Sucker等：Pharmazeutische Technologie， Thieme-Verlag，Stuttgart，1978)。以这种方式获得的施用形式通常包 含1-90％(重量比)的活性物质。

下列实施例旨在用于说明本发明。在实施例中使用已知的三字母代码 缩写产生蛋白质的氨基酸。使用的其它缩写为：Me2Val＝N，N-二甲基缬氨 酸，MeVal＝N-甲基缬氨酸，Z＝苄氧羰基。

A.一般步骤

I.使用如上所述的标准Z-和Boc-方法通过经典的溶液合成，或者 使用Boc和Fmoc保护基技术通过固相合成的标准方法来合成权利要求1要 求的肽。

a)Fmoc保护基技术的合成循环

1.DMF洗涤                                       1×1分钟

2.在DMF中的20％哌啶                             1×4分钟

3.在DMF中的20％哌啶                             1×16分钟

4.DMF洗涤                                     5×1分钟

5.添加预活化的被保护的氨基酸(通过在DMF中的1当量 的TBTU和5当量的DIPEA活化)；

肽偶联                                        1×61分钟

6.DMF洗涤                                     3×1分钟

7.如果转化不完全，重复偶联(返回至5.)

8.DMF洗涤                                     3×1分钟

9.返回至2.

使用BOP-C1和PyBrop作为N-甲基氨基酸之后的氨基酸偶联试剂。包 括双偶联的反应时间相应地增加。在溶液合成中，分别使用Boc-保护的氨 基酸NCA′s(N-羧酸酐)、Z-保护的氨基酸NCA′s(N-羧酸酐)或使用氯化新戊 酰氯作为缩合剂对这类偶联是最有利的。

II.N-末端的还原性烷基化

将如在AIa中制备的肽-树脂在N-末端去保护(AIa中的步骤2-4)，然 后在添加3当量NaCNBH3后，与在DMF/1％乙酸中的3倍摩尔过量的醛或酮反 应。在反应完成后(阴性Kaiser试验)，树脂以水、异丙醇、DMF和二氯甲 烷洗涤几次。

在溶液中的还原性烷基化可以通过，例如，使用NaCNBH3或氢-钯/C使 N-末端去保护的肽、肽片段或氨基酸与相应的醛或酮反应来完成。

III.如在Ib和II中的方法获得的肽-树脂的处理

在减压下干燥肽-树脂，然后以TFA/水混合物(95∶5)处理1.5小时 (Wade，Tregear，Howard Florey Fmoc Workshop手册，墨尔本1985)。 然后过滤除去树脂并以TFA和DCM洗涤。浓缩滤液和洗涤液，通过添加乙 醚沉淀肽。在冰浴中冷却后，过滤除去沉淀，浸溶在30％醋酸中并冻干。

IV.当使用邻氯三苯甲基-树脂(由Biohellas提供)时，在室温下搅拌 在醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷混合物(1∶1∶3)中的肽-树脂悬浮液1小时。然 后抽吸过滤除去树脂并以裂解溶液充分洗涤。在真空中浓缩合并的滤液并 用乙醚处理。通过过滤或离心除去沉淀的固体，以乙醚洗涤并在减压下干 燥。

V.肽的纯化和特征确定

通过凝胶色谱(SEPHADEX G-10，3-15/10％HOAc，SEPHADEX LH20/MeOH)和/或中压色谱(固定相：HD-SIL C-8，20-45μm，100埃；流 动相：A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/MeOH的梯度)或制备HPLC(固定相： Waters Delta-Pak C-18，15μm，100埃；流动相：A＝0.1％TFA/水， B＝0.1％TFA/MeOH的梯度)进行纯化。

通过分析型HPLC(固定相：100 2.1mm VYDAC C-18，300埃；流动相： 以0.1％TFA缓冲的乙腈-水梯度，40℃)测定形成的产物的纯度。

通过快速原子轰击质谱和核磁共振谱确定特征。

B.具体步骤

实施例1(SEQ ID NO：1)

Me2Val-Val-MeVal-3，4-脱氢脯氨酰-Pro-酰胺

使相当于0.25mmol批量(batch size)的0.53g Fmoc-RINK-树脂(取代 0.46mmol/g)如AIa所述与0.4mmol以下每种反应：

Fmoc-Pro-OH

Fmoc-3，4-脱氢脯氨酸

Fmoc-MeVal-OH

Fmoc-Val-OH

Fmoc-Val-OH

用PyBrop作为偶联剂进行双偶联以偶联N-甲基氨基酸后的氨基酸。在 完成反复的合成循环后，对肽-树脂进行N-末端去保护(在AIa中的步骤 2-4)，并如AII中所述进一步与甲醛水溶液反应，然后在减压下干燥。使 形成的树脂进行如AIII中所述的TFA裂解。通过制备型中压色谱纯化粗产 物(132mg)以产生32mg所需纯度的肽(在10分钟内10-40％A；在140分 钟内40-90％A)。用快速原子轰击质谱进一步确定化合物的特征 ([M+H]+＝548)。

实施例2(SEQ ID NO：1)

Me2Val-Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰胺

a)Z-(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羧酸

把1.5g(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羧酸(11.6mmol)溶解在4ml水 和2.33ml 5N NaOH中。在4℃下，1小时内添加2.12ml苄基氯甲基酸 盐(Z-C1；12.8mmol)和6.5ml 2N NaOH。反应混合物在室温下搅拌过夜 后，把pH调整到10。以二氯甲烷(4×)提取水层，以5N HCl把pH调整至2， 用二氯甲烷(2×)提取。在硫酸钠上干燥合并的有机提取物并在真空中蒸 发，产生1.75g为油状物的所需产物。

b)Z-(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基-L-脯氨酰-苄酰胺

把1.75g(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羧酸(6.62mmol)和1.59g脯氨 酸苄酰胺氢氯化物(6.62mmol)溶解在66ml二氯甲烷中并冷却至4℃。在 添加0.89ml N-甲基吗啉(7.94mmol)、0.304g HOBt(2.21mmol)以及1.28g EDCI(6.62mmol)后，将反应混合物在室温下搅拌过夜，以150ml二氯甲 烷稀释，并以饱和的碳酸氢钠溶液(3×)、水(1×)、5％柠檬酸(3×)、水(1×) 以及饱和NaCl(1×)洗涤。在硫酸钠上干燥有机层并在减压下浓缩，产生 2.63g的高度胶粘的油状物。

c)(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基-L-脯氨酰-苄酰胺

把2.63g Z-(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基-L-脯氨酰-苄酰胺(5.8 mmol)溶解在43ml甲醇中。在添加105mg 10％钯/炭后，使反应混合物氢 化过夜。过滤并蒸发至干，产生1.88g去保护的二肽。

d)Z-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰胺

把1.54g Z-MeVal-OH(5.8mmol)和1.88g(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷- 2-羰基-L-脯氨酰-苄酰胺(5.8mmol)溶解在58ml二氯甲烷并冷却至4℃。 在添加0.78ml N-甲基吗啉(6.96mmol)、0.266g HOBt(1.93mmol)以及 1.12g EDCI(5.8mmol)后，将反应混合物在室温下搅拌过夜，以120ml二 氯甲烷稀释，并以饱和的碳酸氢钠溶液(3×)、水(1×)、5％柠檬酸(3×)、水 (1×)以及饱和NaCl(1×)洗涤。在硫酸钠上干燥有机层并在减压下浓缩，产 生3.01g白色泡沫状的产物。

e)MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰胺

把3.01g Z-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰胺 (5.33mmol)溶解在39ml甲醇中。在添加96mg 10％钯/炭后，使反应混合 物氢化3小时。过滤并蒸发至干，产生2.18g澄清油状的去保护的三肽。

f)Z-Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰胺

把1.28g Z-Val-OH(5.11mmol)溶解在10ml二氯甲烷中。在添加0.73 ml三乙胺(5.37mmol)并冷却至-10℃后，缓慢添加0.66ml新戊酰氯(5.37 mmol)。混合物在-10℃下搅拌1.5小时，其后添加2.18g MeVal-[(2S， 3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰胺(5.11mmol)和在10ml二氯甲烷 中的0.73ml三乙胺(5.37mmol)。反应混合物在-10℃下搅拌1.5小时并 在室温下过夜，以二氯甲烷稀释，并以饱和的碳酸氢钠溶液(3×)、水(1×)、 5％柠檬酸(3×)、水(1×)以及饱和NaCl(1×)洗涤。在硫酸钠上干燥有机层并 在真空中浓缩，产生2.75g干泡沫状的产物。

g)Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰胺

把2.75g Z-Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰 胺(4.13mmol)溶解在30ml甲醇中。在添加0.34ml浓HCl(4.13mmol) 和78mg 10％钯/炭后，使反应混合物氢化3小时。过滤并蒸发至干，产生 2.23g干的白色泡沫状的去保护的三肽。再把粗制品溶解在50ml水中，用 1N HCl把pH调整到2-3。以二氯甲烷提取水层(3×)，以5N NaOH把pH调 整至10，然后再以二氯甲烷提取(3×)。在硫酸钠上干燥合并的有机提取物 并在减压下浓缩，产生1.71g去保护的四肽苄酰胺。

h)Me2Val-Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰胺

把0.47g Me2Val-OH(3.24mmol)和1.71g Val-MeVal-[(2S，3S)-3-甲 基-吡咯烷-2-羰基]-Pro-苄酰胺(3.24mmol)溶解在32ml干DMF中。在冷 却至4℃后，添加1.07ml DEPCN(6.48mmol)和1.88ml三乙胺(12.96 mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜，在减压下蒸发DMF。把残余物溶解 在100ml二氯甲烷中并以饱和的碳酸氢钠溶液(3×)、水(1×)、5％柠檬酸 (3×)、水(1×)以及饱和NaCl(1×)洗涤。在硫酸钠上干燥有机层并在减压下 浓缩，产生0.88g无色油状产物。把粗制品溶解在煮沸的二异丙基醚中并 通过冷却沉淀。收集沉淀并干燥，产生0.56g纯化产物。通过快速原子轰 击质谱进一步确定所述化合物的特征([M+H]+＝655.6)。

制备了下列化合物，并且这些化合物可以按照实施例1和2的方法制 备：

3.Xaa Val Xab Xac Xad

4.Xaa Val Xab Xac Xae

5.Xaa Val Xab Xac Xaf

6.Xaa Val Xab Xac Xag

7.Xaa Val Xab Xac Xah

8.Xaa Val Xab Xac Xai

9.Xaa Val Xab Xac Xak

10.Xaa Val Xab Xac Xal

11.Xaa Val Xab Xac Xam

12.Xaa Val Xab Xac Xan

13.Xaa Val Xab Xac Xao

14.Xaa Val Xab Xac Xap

15.Xaa Val Xab Xac Xaq

16.Xaa Val Xab Xac Xar

17.Xaa Val Xab Xac Xas

18.Xaa Val Xab Xac Xat

19.Xaa Val Xab Xac Xat

20.Xaa Val Xab Xac Xav

21.Xaa Val Xab Xac Xaw

22.Xaa Val Xab Xac Xax

23.Xaa Val Xab Xac Xay

24.Xaa Val Xab Xac Xaz

25.Xaa Val Xab Xac Xba

26.Xaa Val Xab Xac Xbb

27.Xaa Val Xab Xac Xbc

28.Xaa Val Xab Xac Xbd

29.Xaa Val Xab Xac Xbe

30.Xaa Val Xab Xac Xbf

31.Xbg Val Xab Xac Xar

32.Xbg Val Xab Xac Xas

33.Xbh Val Xab Xac Xar

34.Xbh Val Xab Xac Xas

35.Xaa Ile Xab Xac Xar

36.Xaa Ile Xab Xac Xas

37.Xaa Xbk Xab Xac Xar

38.Xaa Xbk Xab Xac Xas

39.Xaa Val Xbi Xac Xar

40.Xaa Val Xbi Xac Xas

41.Xaa Val Xab Xac Xbl

42.Xaa Val Xab Xac Xbm

43.Xaa Val Xab Xac Xbn

44.Xaa Val Xab Xbo Xae

45.Xaa Val Xab Xbo Xbp

46.Xaa Val Xab Xbo Xar

47.Xaa Val Xab Xbo Xas

48.Xaa Val Xab Xbo Xbm

49.Xaa Val Xab Xbq Xae

50.Xaa Val Xab Xbq Xar

51.Xaa Val Xab Xbq Xas

52.Xaa Val Xab Xbq Xbm

53.Xaa Val Xab Xbr Xbp

54.Xaa Val Xab Xbr Xae 

55.Xaa Val Xab Xbr Xas

56.Xaa Val Xab Xbr Xar

57.Xaa Val Xab Xbs Xae

58.Xaa Val Xab Xbs Xas

59.Xaa Val Xab Xbs Xar

60.Xaa Val Xab Xac Xbu

61.Xaa Val Xab Xac Xbt

62.Xaa Val Xab Xbq Xbu

63.Xaa Val Xab Xbq Xbt

64.Xaa Val Xab Xac Pro Xbv

65.Xaa Val Xab Xac Pro Xbw

66.Xaa Val Xab Xac Pro Xbx

67.Xaa Val Xab Xac Pro Xby

68.Xaa Val Xab Xac Pro Xbz

64.Xaa Val Xab Xbq Pro Xbv

65.Xaa Val Xab Xbq Pro Xbw

66.Xaa Val Xab Xbq Pro Xbx

67.Xaa Val Xab Xbq Pro Xby

68.Xaa Val Xab Xbq Pro Xbz

69.Xaa Val Xab Xbo Xaz

70.Xaa Val Xab Xbq Xaz

71.Xaa Val Xab Xbq Xbn

72.Xaa Val Xab Xbo Xbn

下表中给出了合成的新化合物的MS-定性的实例。

实施例[编号]       快速原子轰击MS分析[分子量(测量值)]

45.                627

53.                655

表I-按照实施例1和2的方法制备的化合物的序列识别号(SEQ ID NO：)

化合物编号                 序列识别号

1-34，39-63，69-72         1

35，36                     2

37，38                     3

64-68                      4

在概述中符号Xaa具有下述含义：

Xaa：  N，N-二甲基缬氨酸

Xab：  N-甲基缬氨酸

Xac：  3，4-脱氢脯氨酸

Xbg：N，N-二甲基异亮氨酸

Xbh：N，N-二甲基-2-叔丁基-甘氨酸

Xbi：N-甲基异亮氨酸

Xbk：2-叔丁基甘氨酸

Xbo：L-氮杂环丁烷-2-碳酰

Xbq：(4-氟代)-L-脯氨酸 

Xbr：(5-甲基)-L-脯氨酸

Xbs：(3-甲基)-L-脯氨酸

可以通过常规方法(包括，例如，如下所述的方法)测定本发明的化合 物的抗癌活性。

A.体外方法

使用用于贴壁细胞系的标准方法(如微量培养四唑测定(MTT))测定细 胞毒性。这种测定的细节已经发表(Alley，MC等，癌症研究，48：589- 601，1988)。使用肿瘤细胞(如，HT-29结肠癌或LX-1肺脏肿瘤)的指数 生长培养物制作微滴定板培养物。细胞以96-孔平板上每孔5000-20,000 个细胞接种(在150μl培养基中)，在37℃下培养过夜。以从10-4M到10-10M 变化的10倍的稀释倍数添加试验化合物，然后培养细胞48小时。为了测 定每个孔中存活的细胞的数量，添加MTT染料(50μl在盐水中的3mg/ml 的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)。将该混合物在37 ℃下培养5小时，然后向每个孔添加50μL的25％SDS(pH2)。培养过夜后， 使用ELISA读数仪读出在550nm下各孔的吸光度。利用公式％T/C从重复孔 计算数据的平均值+/-SD(％处理的存活细胞/对照)。

产生50％生长抑制的T/C的试验化合物的浓度指定为IC50值。

实施例的化合物               IC50[M]

1.                           1×10-9

2.                           1×10-9

45.                          1×10-7

53.                          1×10-8

B.体内方法

在临床前测定中也试验了本发明的化合物的体内活性，这种体内活性 表示临床效用。用移植(异种移植)进肿瘤组织(优选地是人起源的)的裸鼠 实施这样的测定，这在本领域是熟知的。在把试验化合物施用到进行异种 移植的小鼠中后评价其抗肿瘤功效。

更具体地说，利用大约50mg大小的肿瘤片段把在无胸腺的裸鼠中生 长的人胸部肿瘤(MX-1)移植进新的受体小鼠。把移植的日期指定为第 0天。六至十天后，以静脉内注射的试验化合物处理小鼠(各剂量下，以5-10 只小鼠为一组)。每隔一天施用化合物，共施用3周，剂量为1-100mg/kg 体重。每周测定两次肿瘤直径和体重。利用游标卡尺测定的直径和下式计 算肿瘤体积：

              (长度×宽度2)/2＝mm3肿瘤体积

计算每个处理组的平均肿瘤体积，测定每组相对于未处理的对照肿瘤的T/C 值。

新的化合物具有良好的抑制肿瘤性质。

                             序列表

(1)一般信息

  (i)申请人：

    (A)BASF Aktiengesellschaft

    (B)街道：Carl-Bosch-Strasse 38

    (C)城市：Ludwigshafen

    (E)国家：Bundesrepublik Deutschland

    (F)邮区代码：D-67056

    (G)电话：0621/6048526

    (H)传真：0621/6043123

    (I)电传：1762175170

  (ii)发明名称：新的肽及其制备方法和用途

  (iii)序列数：4

  (iv)计算机可读形式：

    (A)介质类型：软盘，3.5英寸，2DD

    (B)计算机：IBM AT-兼容机，80286处理器

    (C)操作系统：MS-DOS 5.0版

    (D)软件：WordPerfect

(2)SEQ ID NO：1的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：5个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Xaa Val Xaa Xaa Xaa

(2)SEQ ID NO：2的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：5个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Xaa Ile Xaa Xaa Xaa

(2)SEQ ID NO：3的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：5个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

(2)SEQ ID NO：4的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：6个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Xaa Val Xaa Xaa Pro Xaa