橙皮素衍生物及其盐的制备与应用
阅读：183发布：2021-04-14
专利汇可以提供橙皮素衍生物及其盐的制备与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了式(I)表示的橙皮素衍 生物 及其盐，基团定义见 说明书 ，还公开了其制备方法和在制备抗炎免疫药物中的应用，还公开了其组合物，这些化合物 水 溶性更好，具有抗炎活性。，下面是橙皮素衍生物及其盐的制备与应用专利的具体信息内容。
1.橙皮素衍生物及其盐，所述橙皮素衍生物及其盐的化学结构式通式如下：
其中，R1，R2，R3为相同或不相同基团，选自氢，乙酰，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，2-甲基丁酰基，3-甲基丁酰基，2,2-二甲基丙酰基，戊酰基，己酰基，庚酸基，辛酰基，壬酰基，葵酰基或月桂酸基；R4，R5相同或不相同，选自氢，二甲胺基亚甲基，异丙胺基亚甲基，叔丁胺基亚甲基，N-乙基哌嗪基亚甲基，N-羟乙基哌嗪基亚甲基，N-甲基哌嗪基亚甲基，哌嗪基亚甲基，(N-4-(2-吗啉基乙基)哌嗪基)亚甲基，(吗啉基)亚甲基，(α-苯乙胺基)亚甲基，(3-吗啉基丙氨基)亚甲基。
2.根据权利要求1所述的橙皮素衍生物及其盐，其特征在于：所述的R1，R2，R3为相同或不相同基团，选自氢，乙酰，丙酰基或丁酰基。
3.根据权利要求1所述的橙皮素衍生物及其盐，其特征在于：所述的R1，R2，R3均为氢。
4.根据权利要求1所述的橙皮素衍生物及其盐，其特征在于：成盐的酸选自盐酸，氢溴酸，磷酸、亚磷酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸，马来酸，富马酸，酒石酸，各种天然或非天然氨基酸。
5.根据权利要求1～4所述的橙皮素衍生物及其盐，其特征在于：所述橙皮衍生物盐的制备方法是将橙皮素加入水或低级醇溶剂中，再加入相应的醛或其等当物和胺类化合物，进行Mannich反应，制备得到。
6.根据权利要求5所述的橙皮素衍生物及其盐的制备方法，其特征在于：低级醇选自甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，叔丁醇，异丁醇，戊醇，特戊醇，戊醇-2，戊醇-3、己醇和其混合物；醛或其等当物和胺类化合物选自甲醛，乙醛，丙醛，异丙醛，苯甲醛，取代苯甲醛和二甲胺，异丙胺，叔丁胺，N-乙基哌嗪，N-羟乙基哌嗪，N-甲基哌嗪，哌嗪，N-4-(2-吗啉基乙基)哌嗪，吗啉基，α-苯乙胺，3-吗啉基丙氨。
7.根据权利要求1～4所述的橙皮素衍生物及其盐在制备抗炎免疫药物中的应用。
8.一种包括根据权利要求1-4所述的橙皮素衍生物及其盐和载体的药物组合物。
橙皮素衍生物及其盐的制备与应用
技术领域
[0002] 类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，表现为以关节腔滑膜的慢性炎症为特点的对称性、多发性、反复发作型关节炎，它又是一种以关节病变为主并伴有多系统受累的慢性全身性疾病。我国RA患病率约为0.4％，是造成我国人群丧失劳动力与致残的主要原因之一。目前临床用于RA治疗的药物有非甾体抗炎药、甾体激素类、疾病修调药和生物制剂等。非甾体抗炎药抗炎镇痛效果好，但难以控制病情进展，并伴随严重胃肠道副反应；甾体抗炎药由于有严重的激素样副作用，临床应用受到极大限制；一些免疫制剂和细胞毒类药物虽能阻止疾病进展，防止关节破坏，减少致残率，但副作用依然很大。例如，甲氨喋呤常见副作用有恶心、呕吐、粘膜炎和白细胞减少，肝毒性是最严重的副作用。
[0003] 鉴于自身免疫性疾病发病机理的复杂性及其严重落后的治疗现状，国内外正在积极寻找新的方法，开展RA的防治研究。近年来，寻找抗风湿作用显著、副作用小的天然有效成分或其衍生物逐渐成为研究开发RA治疗药物的热点。
[0004] 野菊花(Chrysanthemum indicum L.)系一种常用的清热解毒中药，本课题组在跟踪研究野菊花黄酮类抗炎免疫作用活性成分的过程中，发现橙皮苷(又名橙皮素)是野菊花抗炎免疫作用的活性成分之一。橙皮苷来源广泛，主要分布在柑橘类植物中，常存在于甜橙、酸橙、柠檬、柑橘等芸香科植物的树叶、树皮、花及果实中。橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、免疫调节、防辐射、保护心血管系统等药理活性(Crespo ME,等 .Planta Med.1999,65(7):651-653；Park HJ, 等 .Phytomedicine.2008,15(1-2):147-151；Wilmsen PK,等.J Agric Food Chem.2005,53(12):4757-4761；Yeh CC,等.Life Sci.2007,80(20):1821-1831.)，国内外研究者对橙皮苷的研究兴趣日益增加。对人和动物实验表明，橙皮苷不会在任何器 官中积累，使用安全、无明显副作用(Erlund I,等.J Nutr.2001,131(2):235-241.)，目前已成为天然保健食品和药物学研究的热点内容。本实验室的前期研究发现橙皮苷灌胃给药能可提高免疫低下小鼠的脏器指数、碳廓清指数和吞噬指数，改善免疫抑制小鼠低下的脾淋巴细胞增殖反应，恢复小鼠迟发型变态反应能+ +力并能提高CD4、CD8 细胞数；表明橙皮苷对小鼠的非特异性免疫和特异性细胞免疫反应有促进作用(李荣等，中国药理学通报.2007,23(2):169-172.)。此外，我们在前期研究中证实橙皮苷灌胃给药能抑制佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠的继发性炎症，与Guardia和Kawaguchi等的报道一致，该作用与其调节AA大鼠异常的免疫功能和恢复细胞因子的网络平衡密切相关(Li R,等，J Pharm Pharmacol.2008,60(2):221-228.Guardia T, 等，Farmaco.2001,56(9):683-687.Kawaguchi K, 等，Planta
Med.2006,72(5):477-479.)
Med.2006,72(5):477-479.)
[0005] 有文献报道，橙皮苷的水溶性较差、生物利用度较低(<25％)，利用橙皮苷直接作为治疗药物比较困难，有必要对橙皮苷结构进行结构修饰，寻找水溶性好、活性更高的橙皮苷衍生物。鉴于橙皮苷主要分布在柑橘类植物中，大量存在于甜橙、酸橙、柠檬、柑橘等芸香科植物的果皮中，来源丰富且价廉。本课题组建立了从地道药材广陈皮中大量提取橙皮苷的方法，并以橙皮苷为前体进行了结构修饰。通过体内、体外研究对系列橙皮苷衍生物进行了抗炎活性筛选，发现7,3'-二甲氧基橙皮素(7,3'-dimethoxy hesperetin,DMHP)具有较高的抗炎活性(彭磊等.安徽医科大学学报.2011,46(1):36-39.)。进一步研究发现，DMHP对AA大鼠的继发性炎症也具有良好的治疗作用，DMHP治疗大鼠AA的作用机制与其调节AA大鼠异常的免疫功能和诱导滑膜细胞凋亡等密切相关(Li R,等Phytother Res.2010,24(12):1850-1856.Li R,等，Phytother Res.2010,24Suppl1:S71-76.)。初步的安全性试验结果表明DMHP无明显的毒副作用，具有显而易见的广阔的开发应用前景。DMHP的发现表明：以橙皮苷为母体进行结构修饰，是寻找毒副作用小、具有较高抗炎活性化合物的有效策略。
[0006] 通常橙皮素的上述生物活性只有在大剂量(≥100mg/kg体重/天)才起显效，橙皮苷的水溶性较差、生物利用度较低(<25％)，利用橙皮苷直接作为治疗药物比较困难，有必要对橙皮苷结构进行结构修饰，寻找水溶性好、活性更高的橙皮苷衍生物。
发明内容
[0007] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一类水溶性好，具有抗炎免疫作用的橙皮素衍生物及其盐。
[0008] 本发明的另一目的在于提供制备上述橙皮素衍生物的方法。
[0009] 本发明的再一目的在于提供一种含有一个或多个这种化合物的药物组合物。
[0010] 本发明的又一目的在于提供一种在制备抗炎免疫药物中的用途。
[0011] 为了完成本发明之目的，本发明采取如下技术方案：
[0012] 式(I)表示的橙皮素衍生物及其盐，
[0013]
[0014] R1，R2，R3相同或不相同，选自氢，乙酰，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，2-甲基丁酰基，3-甲基丁酰基，2,2-二甲基丙酰基，戊酰基，己酰基，庚酸基，辛酰基，壬酰基，葵酰基或月桂酸基。R1，R2，R3优选氢，乙酰，丙酰基或丁酰基。作为一种特例，R1，R2，R3均选自氢。
[0015] R4选自氢，二甲胺基亚甲基，异丙胺基亚甲基,叔丁胺基亚甲基，N-乙基哌嗪基亚甲基，N-羟乙基哌嗪基亚甲基，N-甲基哌嗪基亚甲基，哌嗪基亚甲基，(N-4-(2-吗啉基乙基)哌嗪基)亚甲基，(吗啉基)亚甲基，(α-苯乙胺基)亚甲基，(3-吗啉基丙氨基)亚甲基。
[0016] R5选自氢，二甲胺基亚甲基。
[0019] 低级醇选自甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，叔丁醇，异丁醇，戊醇，特戊醇，戊醇-2，戊醇-3、己醇和其混合物；醛或其等当物和胺类化合物选自甲醛，乙醛，丙醛，异丙醛，苯甲醛，取代苯甲醛和二甲胺，异丙胺,叔丁胺，N-乙基哌嗪，N-羟乙基哌嗪，N-甲基哌嗪，哌嗪，N-4-(2-吗啉基乙基)哌嗪，吗啉基，α-苯乙胺，3-吗啉基丙氨。
[0020] 本发明所述的橙皮素衍生物制备方法反应机理如下：
[0021] 以橙皮素为原料，通过与甲醛和一级胺或二级胺缩合，生成β-氨基(羰基)化合物，产物β-氨基(羰基)化合物称为“曼尼希碱”(Mannich碱)，简称曼氏碱。
[0022] 上述制备步骤可用反应简式表示如下
[0023]
[0024] 优选的，对上述橙皮素还可以进一步修饰，比如对橙皮素的酚羟基进行酯化。酯化后水溶性会有所增加(LogP下降)。
[0025] 本发明所述橙皮素衍生物有抗炎免疫的作用。
[0026] 运用本领域技术人员熟知的药物载体可以制成含有有效剂量的本发明橙皮素衍生物的药物组合物。组合物可以包括药学上可接受的载体。
[0027] 本发明化合物或其组合物可用口服方法或非肠胃道用药。口服用药可以是片 剂、胶囊剂、包衣剂、非经肠用药剂型有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备的。为了制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的助剂，例如淀粉，明胶，阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂例如水，乙醇，丙二醇，植物油类如玉米油，花生油，橄榄油等。含有本发明化合物的制剂中还可有其它助剂，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂，色素等。另一方面，本发明优选化合物的水溶性优于橙皮素，因此易于制成全身给药制剂。
[0028] 本发明的橙皮素衍生物是对橙皮素结构改造的全新化合物，水溶性更好，在多种疾病中的药理活性更强。
具体实施方式
[0029] 下面通过实施例进一步说明本发明，但它不限制本发明。
[0030] 实施例1
[0031]
[0032] 取0.55g橙皮素(1.82mmol)于反应瓶中，加入甲醇使其溶解，约37ml，再加入37％甲醛-水溶液300ul(3.7mmol，2.0当量)，在30～60℃剧烈搅拌30min后，加入二乙胺(2.2当量)，在此温度下将该反应溶液搅拌8-12h后反应完成。混合物加压浓缩干，残留物加入氯仿/水搅拌，收集氯仿层，加入无水Na2SO4干燥2～3h，抽滤，浓缩至少量，加入
1g硅胶拌样，蒸干，20g硅胶装柱，氯仿-甲醇洗脱，
1g硅胶拌样，蒸干，20g硅胶装柱，氯仿-甲醇洗脱，
[0033] 得到6，8-二(二甲氨基)亚甲基橙皮素(化合物3)0.4g，产率52.8％。
[0034] 1HNMR(CDCl3+DMSO-d6):7.06 ～ 6.91(t,3H,ArH)；5.56(q,1H,O-CH-Ar)；4.31(s,2H,N-CH2-Ar)；4.24(s,2H,N-CH2-Ar)；3.84(s,3H,O-CH3)；3.13,2.85(m,2H,O ＝+
C-CH2)；2.78,2.82(s,12H,3X4N-CH3)；HR-MS calcd for C22H29N2O6[M+H]:417.2025,foun-1
d417.2022；IR(KBr)cm :3444(υOH)；3055(υAr-H),2956,2827(υCH3,υCH2)；1635(υC＝O)；
1552,1514,1462(υc＝c Ar),1373(δCH3)。
C-CH2)；2.78,2.82(s,12H,3X4N-CH3)；HR-MS calcd for C22H29N2O6[M+H]:417.2025,foun-1
d417.2022；IR(KBr)cm :3444(υOH)；3055(υAr-H),2956,2827(υCH3,υCH2)；1635(υC＝O)；
1552,1514,1462(υc＝c Ar),1373(δCH3)。
[0035] 实施例2
[0036]
[0037] 取0.50g橙皮素(1.65mmol)于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(二甲氨基)亚甲基橙皮素(化合物4)0.21g，产率24.5％，mp：186-187℃。
[0038] 1HNMR(CDCl3+DMSO-d6):6.87 ～ 6.97(m,3H,ArH) ；6.20(s,1H,ArH) ；5.35(q,1H,O-CH-Ar)；4.12(s,2H,N-CH2-Ar)；3.85(s,3H,O-CH3)；3.11,2.81(m,2H,O ＝C-CH2)；2.75,2.82(S,6H,2XCH3)；HR-MS calcd for C19H22NO6[M+H]+:360.1359,found3-1
60.1392；IR(KBr)cm :3410(υOH)；3107(υAr-H)；2962,2724(υCH3,υCH2)；1641(υC＝O)；
1533,1469,1436(υc＝c Ar)；1313(δCH3)。
60.1392；IR(KBr)cm :3410(υOH)；3107(υAr-H)；2962,2724(υCH3,υCH2)；1641(υC＝O)；
1533,1469,1436(υc＝c Ar)；1313(δCH3)。
[0039] 实施例3
[0040]
[0041] 取0.55g橙皮素(1.82mmol)于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(异丙氨基)亚甲基橙皮素(化合物5)0.30g，产率44.2％，mp：259-260℃。
[0042] 1HNMR(CDCl3+DMSO-d6):6.93(s,1H,ArH) ；6.82 ～ 6.88(m,2H,ArH) ；5.52(s,1H,ArH)；5.24(q,1H,O-CH-Ar)；3.94(s,2H,N-CH2-Ar)；3.82(s,3H,O-CH3)；
3.15,2.87(m,2H,O＝C-CH2)；2.6(m,1H,N-CH)；1.24,1.26(d,6H,2XCH3)；HR-MS calcdfor + -1
C20H24NO6[M+H] :374.1598,found374.1599；IR(KBr)cm :3412(υOH)；3221(υNH)；
3124(υAr-H)；2983,2835(υCH3,υCH2)；1645(υC＝O)；1543,1463,1427(υc ＝ c Ar)；
1379(δCH3)。
3.15,2.87(m,2H,O＝C-CH2)；2.6(m,1H,N-CH)；1.24,1.26(d,6H,2XCH3)；HR-MS calcdfor + -1
C20H24NO6[M+H] :374.1598,found374.1599；IR(KBr)cm :3412(υOH)；3221(υNH)；
3124(υAr-H)；2983,2835(υCH3,υCH2)；1645(υC＝O)；1543,1463,1427(υc ＝ c Ar)；
1379(δCH3)。
[0043] 实施例4
[0044]
[0045] 取0.45g橙皮素于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(叔丁氨基)亚甲基橙皮素(化合物6)0.245g，产率42.6％，mp：279-280℃。1
[0046] HNMR(CDCl3+DMSO-d6):6.98(s,1H,ArH)；6.86(d,2H,ArH)；5.69(s,1H,ArH)；5.24(m,1H,O-CH-Ar)；3.98(s,2H,N-CH2-Ar)；3.87(s,3H,O-CH3)；2.95,2.70(m,2H,O
13
＝ C-CH2)；1.34(s,9H,3XCH3)；CNMR(CDCl3+DMSO-d6):191.2,177.05,161.28,160.1
1,146.78,145.72,131.02,116.35,112.74,110.25,98.17,97.34,97.11,77.42,54.85+
,52.89,41.42,36.25,25.26；HR-MS calcd for C21H26NO6[M+H]:388.1755,found388.-1
1756；IR(KBr)cm :3425(υOH)；3093(υAr-H)；2980,2744(υCH3,υCH2)；1643(υC ＝ O)；
1606,1535,1462,1438(υc＝c Ar)；1354(δCH3)。
13
＝ C-CH2)；1.34(s,9H,3XCH3)；CNMR(CDCl3+DMSO-d6):191.2,177.05,161.28,160.1
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,52.89,41.42,36.25,25.26；HR-MS calcd for C21H26NO6[M+H]:388.1755,found388.-1
1756；IR(KBr)cm :3425(υOH)；3093(υAr-H)；2980,2744(υCH3,υCH2)；1643(υC ＝ O)；
1606,1535,1462,1438(υc＝c Ar)；1354(δCH3)。
[0047] 实施例5
[0048]
[0049] 取1g橙皮素于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(N-4-乙基哌嗪基)亚甲基橙皮素(化合物7)0.54g，产率38.5％，mp：102-103℃。
[0050] 1HNMR(CDCl3+DMSO-d6):6.82 ～ 6.94(m,3H,ArH) ；5.81(s,1H,ArH) ；5.42(dd,1H,O-CH-Ar)；3.81(s,3H,O-CH3)；3.68(s,2H,N-CH2-Ar)；3.17,2.72(m,2H,O＝ C-CH2)；2.57(Brs,4H,2XN-CH2)；2.40(Brs,4H,2XN-CH2)；2.40(Brs,4H, 2XCH2)；
13
2.33(q,2H,CH2)；0.98(t,3H,CH3)；CNMR(DMSO-d6):195.80,168.85,161.73,160.88,
147.87,146.84,131.25,117.64,114.05,111.95,100.88,100.37,95.34,79.19,78.12+
,55.66,51.54,51.75,51.37,42.03,11.93；HR-MS calcd for C23H29N2O6[M+H]:429.2-1
020,found429.2023；IR(KBr)cm :3423(υOH)；2968,2833(υCH3,υCH2)；1641(υC＝O)；
1595,1512,1477,1442(υc＝c Ar)；1346(δCH3)。
13
2.33(q,2H,CH2)；0.98(t,3H,CH3)；CNMR(DMSO-d6):195.80,168.85,161.73,160.88,
147.87,146.84,131.25,117.64,114.05,111.95,100.88,100.37,95.34,79.19,78.12+
,55.66,51.54,51.75,51.37,42.03,11.93；HR-MS calcd for C23H29N2O6[M+H]:429.2-1
020,found429.2023；IR(KBr)cm :3423(υOH)；2968,2833(υCH3,υCH2)；1641(υC＝O)；
1595,1512,1477,1442(υc＝c Ar)；1346(δCH3)。
[0051] 实施例6
[0052]
[0053] 取0.5g橙皮素于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(N-4-羟乙基哌嗪基)亚甲基橙皮素(化合物8)0.272g，产率37.1％，mp：162-163℃。1
[0054] HNMR(DMSO-d6):6.86 ～ 6.94(m,3H,ArH) ；5.81(s,1H,ArH) ；5.42(m,1H,O-CH-Ar)；3.77(s,3H,O-CH3)；3.68(s,2H,N-CH2-Ar)；3.46(t,2H,O-CH2)；
13
3.11,2.72(m,2H,O ＝ C-CH2)；2.56(Brs,8H,4XN-CH2)；2.37(t,4H,N-CH2)； CNMR(DMSO-d6):195.90,168.56,161.73,160.90,147.87,146.47,131.23,117.64,114.05,111.95,100.95,100.47,95.28,79.19,78.13,55.66,54.15,51.61,51.27,45.41,42.02；
+ -1
HR-MS calcd for C23H29N2O7[M+H]:445.1969,found445.1972；IR(KBr)cm :3421(υOH)；
2945,2833(υCH3,υCH2)；1637(υC＝O)；1593,1512,1456,1442(υc＝c Ar)；1346(δCH3)。
13
3.11,2.72(m,2H,O ＝ C-CH2)；2.56(Brs,8H,4XN-CH2)；2.37(t,4H,N-CH2)； CNMR(DMSO-d6):195.90,168.56,161.73,160.90,147.87,146.47,131.23,117.64,114.05,111.95,100.95,100.47,95.28,79.19,78.13,55.66,54.15,51.61,51.27,45.41,42.02；
+ -1
HR-MS calcd for C23H29N2O7[M+H]:445.1969,found445.1972；IR(KBr)cm :3421(υOH)；
2945,2833(υCH3,υCH2)；1637(υC＝O)；1593,1512,1456,1442(υc＝c Ar)；1346(δCH3)。
[0055] 实施例7
[0056]
[0057] 取0.6g橙皮素于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(N-4-甲基哌嗪基)亚甲基橙皮素(化合物9)0.327g，产率39.8％，mp：102-103℃.
[0058] 1HNMR(DMSO-d6):6.85 ～ 6.94(m,3H,ArH) ；5.82(s,1H,ArH) ；5.41,5.31(m,1H,O-CH-Ar)；3.79(s,3H,O-CH3) ；3.67(s,2H,N-CH2-Ar)；
3.11,2.72(m,2H,O ＝ C-CH2)；2.56(Brs,4H,2XN-CH2)；2.36(Brs,4H,2XN-CH2)；
13
2.11(s,3H,N-CH3)；CNMR(DMSO-d6):195.81,168.87,161.74,160.89,147.88,146.47,131.26,117.66,114.06,111.97,100.88,100.31,95.36,78.12,59.92,58.48,55.67,52.63,51+
.75,51.45,42.02；HR-MS calcd for C22H27N2O6[M+H]:415.1864,found415.1863；IR(KBr)-1
cm :3408(υOH)；2943,2839,2804(υCH3,υCH2)；1639(υC＝O)；1593,1512,1475,1458(υc＝c Ar)；1348(δCH3)。
3.11,2.72(m,2H,O ＝ C-CH2)；2.56(Brs,4H,2XN-CH2)；2.36(Brs,4H,2XN-CH2)；
13
2.11(s,3H,N-CH3)；CNMR(DMSO-d6):195.81,168.87,161.74,160.89,147.88,146.47,131.26,117.66,114.06,111.97,100.88,100.31,95.36,78.12,59.92,58.48,55.67,52.63,51+
.75,51.45,42.02；HR-MS calcd for C22H27N2O6[M+H]:415.1864,found415.1863；IR(KBr)-1
cm :3408(υOH)；2943,2839,2804(υCH3,υCH2)；1639(υC＝O)；1593,1512,1475,1458(υc＝c Ar)；1348(δCH3)。
[0059] 实施例8
[0060]
[0061] 取0.5g橙皮素于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(哌嗪基)亚甲基橙皮素(化合物10)0.299g，产率45.2％。
[0062] 1HNMR(DMSO-d6):6.84 ～ 6.95(m,3H,ArH) ；5.75(s,1H,ArH) ；5.35(q,1H,O-CH-Ar)；3.76(s,3H,O-CH3)；3.63(s,2H,N-CH2-Ar)；3.14,2.63(m,2H,O ＝C-CH2)；2.77,2.55(Brs,8H,4XN-CH2)。
[0063] 实施例9
[0064]
[0065] 取0.5g橙皮素于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(N-4-(2-吗啉基乙基)哌嗪基)亚甲基橙皮素(化合物11)0.411g，产率48.4％，mp：90-91℃。1
[0066] HNMR(CDCl3):12.4(S,1H,OH),6.87～6.95(m,3H,ArH)；5.96(s,1H,ArH)；5.27～5.32(dd,1H,O-CH-Ar)；3.91(s,3H,O-CH3)；3.78(s,2H,N-CH2-Ar)；3.71(t,4H,2XO-CH2)；
13
2.78～3.04(m,2H,O＝C-CH2)；2.5～2.6(m,16H,8XN-CH2)； CNMR(CDCl3):195.79,168.
90,162.40,161.35,147.29,146.17,131.88,118.21,113.07,110.94,102.03,110.31,96.2
1,78.90,67.01,56.43,56.17,55.36,54.25,53.37,53.19,52.42；HR-MS calcd for C27H36N+
3O7[M+H]:514.2548,found514.2542。
13
2.78～3.04(m,2H,O＝C-CH2)；2.5～2.6(m,16H,8XN-CH2)； CNMR(CDCl3):195.79,168.
90,162.40,161.35,147.29,146.17,131.88,118.21,113.07,110.94,102.03,110.31,96.2
1,78.90,67.01,56.43,56.17,55.36,54.25,53.37,53.19,52.42；HR-MS calcd for C27H36N+
3O7[M+H]:514.2548,found514.2542。
[0067] 实施例10
[0068]
[0069] 取0.8g橙皮素于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(吗啉基)亚甲基橙皮素(化合物12)0.546g，产率51.4％，mp：158-160℃。
[0070] 1HNMR(DMSO-d6):12.6(s,1H,OH),6.84 ～ 6.94(m,3H,ArH)；5.87(s,1H,ArH)；5.38 ～ 5.43(dd,1H,O-CH-Ar)；3.76(s,3H,O-CH3) ；3.60(s,2H,N-CH2-Ar) ；
3.58(t,4H,2XO-CH2)；2.73～3.13(m,2H,O＝C-CH2)；2.49(brs,4H,2XN-CH2)；HR-MS calcd +
for C21H24NO7[M+H]:402.1547,found402.1547。
3.58(t,4H,2XO-CH2)；2.73～3.13(m,2H,O＝C-CH2)；2.49(brs,4H,2XN-CH2)；HR-MS calcd +
for C21H24NO7[M+H]:402.1547,found402.1547。
[0071] 实施例11
[0072]
[0073] 取0.5g橙皮素于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(α-苯乙胺基)亚甲基橙 皮素(化合物14)0.246g，产率34.2％，mp：91-92℃。
[0074] 1HNMR(DMSO-d6):1HNMR(CDCl3):12.48(Brs,1H,OH),7.29 ～7.40(m,5H,ArH),6.78～7.03(m,3H,ArH)；5.96(s,1H,ArH)；5.20～5.38(m,1H,O-CH-Ar)；
3.77～3.98(m,6H,O-CH3,N-CH2,N-CH)；2.72～3.02(m,2H,O＝C-CH2)；1.50(d,3H,CH3)；
13CNMR(CDCl3):195.62,170.17,162.36,160.97,147.17,146.07,142.11,131.97,129.08,128.13,126.84,118.26,112.83,110.76,101.66,101.63,96.71,78.84,60.59,
56.16,43.17,42.06,22.49；HR-MS calcd for C25H26NO6[M+H]+:436.1753,found436.1752。
3.77～3.98(m,6H,O-CH3,N-CH2,N-CH)；2.72～3.02(m,2H,O＝C-CH2)；1.50(d,3H,CH3)；
13CNMR(CDCl3):195.62,170.17,162.36,160.97,147.17,146.07,142.11,131.97,129.08,128.13,126.84,118.26,112.83,110.76,101.66,101.63,96.71,78.84,60.59,
56.16,43.17,42.06,22.49；HR-MS calcd for C25H26NO6[M+H]+:436.1753,found436.1752。
[0075] 实施例12
[0076]
[0077] 取0.6g橙皮素于反应瓶中，操作见实施例1，得到8-(3-吗啉基丙氨基)亚甲基橙皮素黄色橙皮素曼氏碱(化合物15)0.395g，产率43.4％。
[0078] 1HNMR(DMSO-d6):δ6.86(m,3H,ArH),5.34(s,1H,ArH),5.21(dd,J ＝11.7,3.1Hz,1H,O-CH-Ar),3.85(s,2H,N-CH2),3.76(s,3H,O-CH3),3.56(t,J ＝
4.5Hz,4H,2XCH2),2.98–2.83(m,2H,O ＝ C-CH2),2.50+2.8(m,2H,N-CH2),2.38–
2.23(m,6H,3X N-CH2),1.71(m,2H,CH2)。
4.5Hz,4H,2XCH2),2.98–2.83(m,2H,O ＝ C-CH2),2.50+2.8(m,2H,N-CH2),2.38–
2.23(m,6H,3X N-CH2),1.71(m,2H,CH2)。
[0079] 实施例13
[0080]
[0081] 取0.25g化合物9(1.82mmol)于反应瓶中，加入二氯甲烷和三乙胺溶解，冷却条件下，滴加入醋酸酐，室温搅拌反应12h，TLC监控反应完成，加入少量甲醇，搅拌30min，加入二氯甲烷和水，萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，浓缩后，柱层析(石油醚：乙酸乙酯)，收集主斑点，用乙醇重结晶，得8-(N-4-甲基哌嗪基)亚甲基三乙酰橙皮素(化合物17)类白色固体0.148g，产率45.6％。1
[0082] H NMR(DMSO-d6)δ6.95 ～ 7.22(m,3H,ArH) ；6.08(s,1H,ArH)；5.49,5.40(m,1H,O-CH-Ar)；3.81(s,3H,O-CH3),3.61(s,2H,N-CH2-Ar),3.08,2.97(m,2H,O＝ C-CH2),3.20–2.62(Brs,4H,2XN-CH2)；3.15–2.57(Brs,4H,2XN-CH2)；2.25(d,6H,2XO+
＝C-CH3),2.10(s,3H,O＝C-CH3),1.92(s,3H,N-CH3)；HR-MS calcd for C28H33N2O9[M+H]:5
41.2180,found541.2185.
＝C-CH3),2.10(s,3H,O＝C-CH3),1.92(s,3H,N-CH3)；HR-MS calcd for C28H33N2O9[M+H]:5
41.2180,found541.2185.
[0083] 实施例14橙皮素衍生物的抗炎活性测定
[0084] 一、目的：确认不同结构橙皮素类衍生物抗炎免疫活性
[0085] 二、细胞的选择：
[0086] 巨噬细胞是机体免疫系统的一种重要免疫细胞，是促炎细胞因子产生释放的主要来源，脂多糖(LPS)可诱导巨噬细胞活化，产生大量的炎症因子，TNF-α、IL-6是活化巨噬细胞炎症反应的重要效应分子，炎症反应中，TNF-α不仅直接参与炎症反应，还能诱导其他细胞因子释放，共同对组织造成伤害；IL-6可活化丝裂原活化蛋白激酶信号转导途径加重炎症反应过程。拮抗TNF-α、IL-6的过量释放成为预防和治疗炎症的关键措施之一。橙皮素类具有一定的抗炎活性，能抑制炎症因子的释放量，我们选取RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞的永生细胞系)，观察比较橙皮素类衍生物对LPS诱导的RANW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6的影响。
[0087] MTT法初筛，分组如下：
[0088] 正常组(C)；lps刺激模型组(LPS)；橙皮素衍生物的5个浓度组(12.5、25、50、100、200μM)；母体药物橙皮素组(M)。
[0089] 接种96孔板，以每孔3000个细胞接种，待细胞生长24小时后，加LPS刺激。LPS浓度为1μg/ml，刺激的同时分别加入5个不同浓度橙皮素衍生物，母体药物橙皮素。作用24h后，提取上清液，做elisa检测细胞因子TNF-a、IL-6， 根据标准曲线求炎症因子的浓度(ng/L)。统计学处理采用SPSS13.0软件进行分析，数据以 表示，组间比较采用One-Way ANOVA检验。
[0090] 实验结果如下：
[0091] 在不影响细胞存活率的情况下，LPS(浓度为1μg/ml)可以明显增加正常小鼠巨噬细胞系RAW264.7分泌炎症因子TNF-α、IL-6的释放量；LPS刺激的同时分别加入5个不同浓度橙皮素衍生物，结果如下：
[0092] 橙皮素衍生物体外抑制由LPS刺激RAW264.7细胞产生的炎症因子TNF-α(ng/L)的结果
[0093]
[0094] *P＜0.05对比模型组
[0095] 从表中数据通过Spass分析可以知道，本发明提供的橙皮素衍生物5、6、11、12与LPS刺激的模型组相比的差异有统计学意义。橙皮素衍生物5、6药物在200、100和-450×10 mol/l浓度时对由LPS刺激产生的炎症因子TNF-α有明显的抑制作用。橙皮素衍-4
生物11在200、100、50和25×10 mol/l浓度时对由LPS刺激产生的炎症因子TNF-α有明-4
显的抑制作用。橙皮素衍生物12在浓度为200和 100×10 mol/l时对由LPS刺激产生的炎症因子TNF-α有明显的抑制作用，由IC50值可以看出，橙皮素衍生物5、11、12的IC50-5 -5 -5
值为9.3706×10 、5.6234×10 、7.4829×10 。其中5、11、12号药物与母药橙皮素的IC50-4
值1.7431×10 相比较低，其抑制炎症因子产生的活性高于橙皮素本身。
生物11在200、100、50和25×10 mol/l浓度时对由LPS刺激产生的炎症因子TNF-α有明-4
显的抑制作用。橙皮素衍生物12在浓度为200和 100×10 mol/l时对由LPS刺激产生的炎症因子TNF-α有明显的抑制作用，由IC50值可以看出，橙皮素衍生物5、11、12的IC50-5 -5 -5
值为9.3706×10 、5.6234×10 、7.4829×10 。其中5、11、12号药物与母药橙皮素的IC50-4
值1.7431×10 相比较低，其抑制炎症因子产生的活性高于橙皮素本身。
[0096] 橙皮素衍生物体外抑制由LPS刺激RAW264.7细胞产生的炎症因子IL-6的结果[0097]
[0098] *P＜0.05对比模型组
[0099] 从表中数据通过Spass分析可以知道，本发明提供的橙皮素衍生物5、6、11、12、14与LPS刺激的模型组相比的差异有统计学意义。橙皮素衍生物5、11、14在浓度在200和-4100×10 mol/l时对由LPS刺激产生的炎症因子IL-6有明显的抑制作用，衍生物6、14在浓-4
度为200、100和50×10 mol/l时对由LPS刺激产生的炎症因子IL-6有明显的抑制作用。衍-4 -5 -5 -5
生物5、6、11、12、14的IC50值分别为1.137×10 、9.877×10 、5.3021×10 、8.215×10 、-5 -4
4.764×10 低于橙皮素的IC50值1.3566×10 。表明其抑制炎症因子产生的活性高于橙皮素本身。
度为200、100和50×10 mol/l时对由LPS刺激产生的炎症因子IL-6有明显的抑制作用。衍-4 -5 -5 -5
生物5、6、11、12、14的IC50值分别为1.137×10 、9.877×10 、5.3021×10 、8.215×10 、-5 -4
4.764×10 低于橙皮素的IC50值1.3566×10 。表明其抑制炎症因子产生的活性高于橙皮素本身。
[0100] 实施例15部分橙皮素衍生物油水分配系数(Log P)的测定
[0101] 按照参考文献方法(宋桂军等，药物分析杂志，2007(11)，1704-1706，吴明明等，安徽农业科学，2010(22)，11987-11986)，采用摇瓶-紫外分光光度法，测定部分橙皮素衍生物的油水分配系数(Log P)见下表。下表同时对比了相对于橙皮素的活性(根据实施例13)
[0102] 橙皮素衍生物与橙皮素的Log P及活性比较
[0103]
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