Losmapimod在非小细胞肺癌中的应用
阅读：212发布：2023-02-24
专利汇可以提供Losmapimod在非小细胞肺癌中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 肿瘤 化学 预防 领域，具体而言，涉及Losmapimod在非小细胞 肺 癌中的应用的 专利 申请 。Losmapimod与非小细胞肺癌酪 氨 酸激酶受体 抑制剂 联合用于非小细胞癌时，能够增强肿瘤细胞对非小细胞肺癌酪氨酸激酶受体抑制剂的敏感性，延缓耐药性形成时间。 发明人 首次证明了吉非替尼耐药细胞株形成过程中及耐药性的形成依赖于四倍 体细胞 的形成。在将Losmapimod与吉非替尼共同应用于非小细胞肺癌肿瘤细胞时，可明显增强肿瘤细胞对吉非替尼的敏感性，抑制了肿瘤细胞的增殖及克隆形成能 力 ，从而可以延长吉非替尼用于非小细胞肺癌 治疗 时耐药性出现时间，增强吉非替尼在非小细胞肺癌治疗中的应用效果。，下面是Losmapimod在非小细胞肺癌中的应用专利的具体信息内容。
1.Losmapimod在非小细胞肺癌中的应用，其特征在于，Losmapimod与非小细胞肺癌酪氨酸激酶受体抑制剂联合用于非小细胞癌时，能够增强肿瘤细胞对非小细胞肺癌酪氨酸激酶受体抑制剂的敏感性，延缓耐药性形成时间。
2.如权利要求1所述Losmapimod在非小细胞肺癌中的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌酪氨酸激酶受体抑制剂，为吉非替尼。
3.如权利要求2所述Losmapimod在非小细胞肺癌中的应用，其特征在于，在非小细胞癌的肿瘤细胞对吉非替尼耐药后，Losmapimod与吉非替尼联合应用时，能够抑制吉非替尼耐药细胞株的增殖及克隆形成能力，增强吉非替尼的敏感性，从而延缓或逆转非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药。
4.如权利要求3所述Losmapimod在非小细胞肺癌中的应用，其特征在于，四倍体细胞形成与p38磷酸化信号通路激活相关，Losmapimod与吉非替尼联合应用时，通过抑制p38磷酸化激活，进而通过抑制吉非替尼耐药细胞株形成四倍体细胞，来发挥其抑制吉非替尼耐药细胞株的增殖及克隆形成能力的功能。
5.Losmapimod在延缓表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂引起的非小细胞肺癌获得性耐药过程中的应用。
6.如权利要求5所述Losmapimod在延缓表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂引起的非小细胞肺癌获得性耐药过程中的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌酪氨酸激酶受体抑制剂，为吉非替尼。
7.如权利要求5所述Losmapimod在延缓表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂引起的非小细胞肺癌获得性耐药过程中的应用，其特征在于，四倍体细胞形成与p38磷酸化信号通路激活相关，Losmapimod与吉非替尼联合应用时，通过抑制p38磷酸化激活，进而通过抑制吉非替尼耐药细胞株形成四倍体细胞，来发挥其抑制吉非替尼耐药细胞株的增殖及克隆形成能力的功能。
Losmapimod在非小细胞肺癌中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 在最近的世界卫生组织（WHO）预测报告中，肺癌是癌症引起死亡的首要原因，在全世界范围内将近有159万人死于肺癌。在中国，最新发布的癌症数据统计结果表明：肺癌是男性癌症发病率最高的，在女性中，其发病率也排第二。最重要的是，从2000年开始，肺癌死亡一直是癌症相关死亡的最主要原因。
[0003] 非小细胞肺癌是目前为止最主要的肺癌类型（约占80%），5年生存率仅有15%。目前，化疗仍是治疗肺癌的主要治疗手段之一，但无论是晚期肺癌还是转移性肺癌，其有效率都很低。
[0004] 非小细胞肺癌的发生发展往往伴随着多种遗传的和表观遗传的改变。目前在非小肺癌患者中，已鉴定出的突变率较高的基因包括EGFR、KRAS、PI3K、MEK1、ALK和PDGFR等。存在这些基因突变的癌细胞的生存往往依赖这些癌基因的信号通路的激活，这种现象被称为“癌基因成瘾”。“癌基因成瘾”现象使癌细胞对这些信号通路的改变异常敏感，因此发展这些突变的癌基因的抑制剂为一线治疗药的发展提供了很大可能性。
[0005] EGFR和KRAS突变是这些突变中最常见的突变，并且它们往往相互排斥。目前，对于EGFR激活性突变的非小细胞肺癌而言，小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）例如吉非替尼和埃罗替尼，已作为一线治疗药使用。吉非替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂作为一线治疗药时能够明显改善患者生存率，尽管这些小分子酪氨酸激酶抑制剂能够发挥直接和高效的临床疗效，但是几乎所有含有表皮生长因子受体突变且最初对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感的病人最终都会产生耐药性。因此，对耐药性机制的深入研究及延缓耐药性发生时间，是目前研究热点之一。
[0006] 恶性肿瘤往往伴随着基因组的不稳定性。细胞应激反应或DNA损伤后，细胞周期会被延缓并允许DNA进行修复。G1/S和G2/M是两个主要的细胞周期检查点，细胞长期停滞于G2期会使细胞通过核内复制而进入S期，从而导致G1期四倍体细胞的产生。四倍体细胞能够进行不对称性分裂或发生染色体丢失，从而导致肿瘤异质性。
[0007] 在多种早期癌症中都发现存在四倍体细胞，目前的统计结果表明四倍体细胞存在于37%的癌症中。研究表明，四倍体细胞的产生往往伴随着染色体不稳定（CIN），并且最终导致患者耐药、肿瘤异质性及较差的预后。因此，对四倍体细胞形成过程中信号通路的研究是研究肿瘤耐药形成及治疗必不可少的一个环节。
[0008] p38 MAPK属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族，是细胞外刺激的主要信号传感器。p38 MAPK通过Thr180 和 Tyr182位点的磷酸化激活发挥功能。p38 MAPK家族包括p38α、p38α、p38γ和 p38δ。p38MAPK在细胞周期的调控过程中发挥着重要的作用，但是p38 MAPK信号通路在调节四倍体细胞的形成过程中发挥的作用仍然有待研究。
[0009] 目前存在的p38 MAPK抑制剂多为ATP竞争性抑制剂。目前已有的进入临床试验的p38 MAPK抑制剂有AMG-548、VX-745、pamapimo和Losmapimod等。然而，其中多数抑制剂未能在临床Ⅰ期或Ⅱ期实验中发挥长期疗效，进而导致其缺乏进一步应用的可能性。而关于Losmapimod与非小细胞癌之间的关系，目前尚缺乏较为深入和详细的研究报道。
发明内容
[0010] 通过对Losmapimod在非小细胞肺癌(NSCLC)相关实验中应用研究，本申请主要目的是归纳和概括Losmapimod在非小细胞肺癌治疗中的可能应用前景，从而为改善非小细胞肺癌的治疗效果奠定一定应用基础。
[0011] 本申请所采取的技术方案详述如下。
[0012] Losmapimod在非小细胞肺癌中的应用（作为非小细胞肺癌治疗药剂的应用），Losmapimod与非小细胞肺癌酪氨酸激酶受体抑制剂联合用于非小细胞癌治疗时，能够增强肿瘤细胞对非小细胞肺癌酪氨酸激酶受体抑制剂的敏感性，延缓耐药性形成时间，甚至克服非小细胞肺癌肿瘤细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性；所述非小细胞肺癌酪氨酸激酶受体抑制剂，具体例如为吉非替尼。
[0013] 进一步而言，以吉非替尼为例，在非小细胞癌的肿瘤细胞对吉非替尼耐药后，Losmapimod与吉非替尼联合应用时，能够抑制吉非替尼耐药细胞株的增殖及克隆形成能力，增强吉非替尼的敏感性，从而延缓或逆转非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）耐药；更进一步而言，四倍体细胞形成与p38磷酸化信号通路激活相关，Losmapimod与吉非替尼联合应用时，通过抑制p38磷酸化激活，进而通过抑制吉非替尼耐药细胞株形成四倍体细胞，来发挥其抑制吉非替尼耐药细胞株的增殖及克隆形成能力的功能。
[0014] 换个角度而言，本申请涉及Losmapimod在延缓甚至逆转表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂引起的非小细胞肺癌获得性耐药过程中的应用的专利申请。
[0015] 现有研究认为，肿瘤细胞的进化是目前肿瘤治疗的一个很大障碍，而多倍体性肿瘤细胞，即基因组含量明显增多的细胞，能够明显加速肿瘤细胞的进化及耐药性的获得。多倍体性肿瘤细胞包括：四倍体细胞、非整倍性多倍体细胞及超二倍体细胞等多种类型。部分研究认为，大多数肿瘤细胞均为非整倍性多倍体细胞，其中约90%的固体肿瘤及75%的血液相关癌症细胞均含有非正常的染色体数目。已有研究表明，相对于正常敲除p53的二倍体细胞（不形成肿瘤），四倍体细胞注射入裸鼠后能够明显增加致瘤性。而药物扰乱有丝分裂纺锤体的分离障碍可导致四倍体细胞的形成及更高的肿瘤形成率，则进一步证明了四倍体细胞在肿瘤发生过程中的功能。但总体而言，在面临不同肿瘤类型时，多倍体性肿瘤细胞的作用也并不完全相同。
[0016] 综合而言，在本申请中，发明人首次证明了吉非替尼耐药细胞株形成过程中及耐药性的形成依赖于四倍体细胞的形成，而四倍体形成的形成则依赖于p38磷酸化信号通路的激活，因而Losmapimod通过抑制p38磷酸化激活，进而可抑制吉非替尼耐药细胞株形成四倍体细胞，从而发挥其抑制吉非替尼耐药细胞株的增殖及克隆形成能力的功能。初步试验表明，在将Losmapimod与吉非替尼共同应用于非小细胞肺癌肿瘤细胞时，可明显增强肿瘤细胞对吉非替尼的敏感性，抑制了肿瘤细胞的增殖及克隆形成能力，从而可以延长吉非替尼用于非小细胞肺癌治疗时耐药性出现时间，增强吉非替尼在非小细胞肺癌治疗中的应用效果。附图说明
[0017] 图1为细胞HCC827、HCC827GR、H-1975细胞培养24h，之后分别用吉非替尼（0μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM）处理72h，MTT法检测细胞活性；图2为HCC827、HCC827GR及H-1975细胞用1μM吉非替尼处理24h，之后检测细胞周期统计结果；
图3为 HCC827、HCC827GR及H-1975细胞用1μM 吉非替尼处理8h，之后收集细胞，RIPA缓冲液裂解细胞，免疫印迹检测phospho-p38（p-p38）与p38的表达结果；
图4为 HCC827GR和H-1975细胞经单用吉非替尼（1μM）及吉非替尼（1μM）与Losmapimod（1μM）共同处理24h，之后进行细胞周期检测结果；
图5为HCC827GR和H-1975细胞经吉非替尼（1μM）及Losmapimod（1μM）二者单用及联合共同处理8h，之后收集细胞，RIPA缓冲液裂解细胞，免疫印迹检测phospho-p38、p38、cyclinD1及p21的表达结果；
图6为HCC827、HCC827GR和H-1975细胞经吉非替尼（1μM）及SP680125(10μM)分别或共同处理24h，之后进行细胞周期检测结果；
图7为 HCC827R及H-1975细胞胰酶消化处理后做soft agar实验检测克隆形成能力，soft agar上层及下层胶中均分别或共同加入1μM 的吉非替尼或1μM的losmapimod处理，对克隆数目进行统计计算；
图8为HCC827R及H-1975细胞胰酶消化处理后做soft agar实验检测克隆形成能力，soft agar上层及下层胶中加入单用1μM 的吉非替尼或1μM的losmapimod及二者联合加入共同处理，拍照统计结果；
图9为HCC827R及H-1975细胞胰酶消化处理后在96孔板中培养24 h，之后分别用吉非替尼（1μM）及Losmapimod（1μM）分别或共同处理72h，MTT法检测细胞活性；
图10为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天，小鼠体内肿瘤体积统计结果；
图11为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，小鼠处死后肿瘤块拍照对比结果；
图12为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，小鼠处死后肿瘤块称量统计结果；
图13为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，对小鼠体重称量统计结果；
图14为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，将小鼠处死后，肿瘤块的免疫组织化学染色拍照结果；
图15为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，将小鼠处死后，肿瘤块的免疫组织化学染色后，对p-p38、Cyclin D1和 Ki-67的表达检测统计结果。
图3为 HCC827、HCC827GR及H-1975细胞用1μM 吉非替尼处理8h，之后收集细胞，RIPA缓冲液裂解细胞，免疫印迹检测phospho-p38（p-p38）与p38的表达结果；
图4为 HCC827GR和H-1975细胞经单用吉非替尼（1μM）及吉非替尼（1μM）与Losmapimod（1μM）共同处理24h，之后进行细胞周期检测结果；
图5为HCC827GR和H-1975细胞经吉非替尼（1μM）及Losmapimod（1μM）二者单用及联合共同处理8h，之后收集细胞，RIPA缓冲液裂解细胞，免疫印迹检测phospho-p38、p38、cyclinD1及p21的表达结果；
图6为HCC827、HCC827GR和H-1975细胞经吉非替尼（1μM）及SP680125(10μM)分别或共同处理24h，之后进行细胞周期检测结果；
图7为 HCC827R及H-1975细胞胰酶消化处理后做soft agar实验检测克隆形成能力，soft agar上层及下层胶中均分别或共同加入1μM 的吉非替尼或1μM的losmapimod处理，对克隆数目进行统计计算；
图8为HCC827R及H-1975细胞胰酶消化处理后做soft agar实验检测克隆形成能力，soft agar上层及下层胶中加入单用1μM 的吉非替尼或1μM的losmapimod及二者联合加入共同处理，拍照统计结果；
图9为HCC827R及H-1975细胞胰酶消化处理后在96孔板中培养24 h，之后分别用吉非替尼（1μM）及Losmapimod（1μM）分别或共同处理72h，MTT法检测细胞活性；
图10为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天，小鼠体内肿瘤体积统计结果；
图11为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，小鼠处死后肿瘤块拍照对比结果；
图12为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，小鼠处死后肿瘤块称量统计结果；
图13为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，对小鼠体重称量统计结果；
图14为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，将小鼠处死后，肿瘤块的免疫组织化学染色拍照结果；
图15为吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠加药处理14天后，将小鼠处死后，肿瘤块的免疫组织化学染色后，对p-p38、Cyclin D1和 Ki-67的表达检测统计结果。
具体实施方式
[0018] 下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部部分实验背景情况简要介绍说明如下。
[0019] 生物材料：人非小细胞肺癌细胞系HCC827，购自于美国模式培养物集存库（ATCC）；
人非小细胞肺癌细胞系HCC827GR，由美国丹娜法伯癌症中心Pasi A. Jänne教授馈赠，该细胞为HCC827的吉非替尼耐药株（相关制备方法已有文献发表，参考Engelman等，MET Amplification Leads to Gefitinib Resistance in Lung Cancer by Activating ERBB3 Signaling. Science，2007，18;316(5827):1039-43）；
人非小细胞肺癌细胞系H-1975 ，购自于美国模式培养物集存库（ATCC）；
细胞培养条件为：在含有10%胎牛血清、100单位/毫升青链霉素的RPMI1640培养基中，
37℃、5%CO2条件下培养；
实验试剂：
p-p38 抗体、p38 抗体、CyclinD1抗体，购自cell signaling technology，
p21和 HRP 偶联的抗兔二抗，购自santa cruz biotechnology公司；
Losmapimod，Medchemexperss公司产品；
吉非替尼，LC Laboratory公司产品；
Ki-67抗体，Thermo Scientific公司产品。
人非小细胞肺癌细胞系HCC827GR，由美国丹娜法伯癌症中心Pasi A. Jänne教授馈赠，该细胞为HCC827的吉非替尼耐药株（相关制备方法已有文献发表，参考Engelman等，MET Amplification Leads to Gefitinib Resistance in Lung Cancer by Activating ERBB3 Signaling. Science，2007，18;316(5827):1039-43）；
人非小细胞肺癌细胞系H-1975 ，购自于美国模式培养物集存库（ATCC）；
细胞培养条件为：在含有10%胎牛血清、100单位/毫升青链霉素的RPMI1640培养基中，
37℃、5%CO2条件下培养；
实验试剂：
p-p38 抗体、p38 抗体、CyclinD1抗体，购自cell signaling technology，
p21和 HRP 偶联的抗兔二抗，购自santa cruz biotechnology公司；
Losmapimod，Medchemexperss公司产品；
吉非替尼，LC Laboratory公司产品；
Ki-67抗体，Thermo Scientific公司产品。
[0020] 实施例1本实施例主要介绍一下p38磷酸化激活通路与四倍体细胞产生间的关系，以及
Losmapimod与四倍体细胞间关系，相关实验简要介绍如下。
Losmapimod与四倍体细胞间关系，相关实验简要介绍如下。
[0021] 在介绍具体实验前，就下述实验中部分检测方法及实验方法简要介绍说明如下。
[0022] （1）细胞活性检测方法细胞在传代培养时，采用胰酶消化贴壁细胞，离心后将细胞用对应培养基重悬，调整细胞浓度，以每孔3000个量接种到96孔板，每孔体积100μL；
24h后，加入相应浓度的药物处理（药物最终溶解在100μL培养基中）；
72h后，每孔加入0.3mg/mL的噻唑蓝（MTT，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液）20μL，继续孵育1小时，终止培养；
小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入100μL的DMSO（二甲基亚砜），轻微振荡；
在酶联免疫检测仪上测定各孔在490nm波长与570nm波长处吸收值，记录结果，绘制细胞生长曲线。
24h后，加入相应浓度的药物处理（药物最终溶解在100μL培养基中）；
72h后，每孔加入0.3mg/mL的噻唑蓝（MTT，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液）20μL，继续孵育1小时，终止培养；
小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入100μL的DMSO（二甲基亚砜），轻微振荡；
在酶联免疫检测仪上测定各孔在490nm波长与570nm波长处吸收值，记录结果，绘制细胞生长曲线。
[0023] （2）免疫印迹方法用RIPA细胞裂解液 (其中加有：蛋白酶抑制剂1mM PMSF、磷酸酶抑制剂1mM矾酸钠Na3VO4）裂解细胞；
细胞裂解液中加入5×SDS上样缓冲液制成蛋白样品；
蛋白质样品通过SDS-PAGE蛋白电泳后，转至PVDF膜，再用含有5%脱脂奶粉的TBST（2.42g Tris base， 8g 氯化钠 PH调至7.6，加入Tween 20 500μL，再用去离子水定容至
1L）中封闭一小时；
加入一抗后4℃冷库孵育过夜；
再加入HRP 偶联的二抗孵育一小时；
用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo fisher）试剂盒曝光显色。
细胞裂解液中加入5×SDS上样缓冲液制成蛋白样品；
蛋白质样品通过SDS-PAGE蛋白电泳后，转至PVDF膜，再用含有5%脱脂奶粉的TBST（2.42g Tris base， 8g 氯化钠 PH调至7.6，加入Tween 20 500μL，再用去离子水定容至
1L）中封闭一小时；
加入一抗后4℃冷库孵育过夜；
再加入HRP 偶联的二抗孵育一小时；
用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo fisher）试剂盒曝光显色。
[0024] （3）细胞周期检测方法细胞培养24h后，加入相应浓度的药物处理相应时间，然后用冷的1×PBS洗两遍，胰酶消化后离心收集细胞；
用冷的1×PBS重悬细胞（例如，0.6mL），然后加入冷的无水乙醇（例如为：1.4ml，使乙醇终浓度为70%），轻弹混匀，-20℃冰箱放置至少2h(固定)；
1000rpm离心7min，去上清，加入0.6% 的TritonX-100的PBS，轻轻振荡混匀；
加入RNAaseA(终浓度为200 μg/mL)，轻轻振荡混匀，室温孵育1小时；
加入PI（碘化丙啶，使其终浓度为20μg/mL），4℃避光孵育15分钟；
将细胞转移至5mL流式管中，加入合适体积的1×PBS使细胞终浓度上机时速度约为200个细胞每秒，用流式细胞仪检测细胞周期。
用冷的1×PBS重悬细胞（例如，0.6mL），然后加入冷的无水乙醇（例如为：1.4ml，使乙醇终浓度为70%），轻弹混匀，-20℃冰箱放置至少2h(固定)；
1000rpm离心7min，去上清，加入0.6% 的TritonX-100的PBS，轻轻振荡混匀；
加入RNAaseA(终浓度为200 μg/mL)，轻轻振荡混匀，室温孵育1小时；
加入PI（碘化丙啶，使其终浓度为20μg/mL），4℃避光孵育15分钟；
将细胞转移至5mL流式管中，加入合适体积的1×PBS使细胞终浓度上机时速度约为200个细胞每秒，用流式细胞仪检测细胞周期。
[0025] （一）吉非替尼诱导吉非替尼耐药细胞株产生四倍体细胞实验将人非小细胞肺癌细胞系HCC827、HCC827GR、H-1975细胞进行传代培养，传代培养时，将细胞接种到96孔板（3000个细胞每孔），培养24h后，分别用不同浓度吉非替尼（0 μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2.5μM）处理72h；检测细胞活性，结果如图1所示。
[0026] 分析可以看出，HCC827是吉非替尼敏感细胞，HCC827GR和H-1975均为吉非替尼耐药细胞。
[0027] 上述实验基础上，在将HCC827、HCC827GR、H-1975传代培养时，将细胞接种到6cm皿中，24h后加入1μM 吉非替尼刺激24h后，进行细胞周期检测，结果如图2所示。
[0028] 分析可以看出，对吉非替尼敏感的HCC827细胞不产生四倍体细胞，但是对吉非替尼耐药的HCC827R和H-1975细胞均能够产生四倍体细胞。
[0029] 进一步的，在将HCC827、HCC827GR、H-1975传代培养时，将细胞接种到六孔板中，细胞贴壁后，1μM吉非替尼处理8h，收集细胞并经细胞裂解液裂解后用phospho-p38和p38抗体作免疫印迹检测其表达，结果如图3所示。
[0030] 分析可以看出，只有在对吉非替尼耐药的HCC827R和H-1975细胞中，可检测到p38的磷酸化激活。
[0031] 综合上述结果可以看出，吉非替尼能够诱导已对吉非替尼耐药的细胞株产生四倍体细胞，而四倍体细胞形成过程中伴随着p38的磷酸化激活。
[0032] （二）Losmapimod能够抑制吉非替尼诱导的G1期四倍体细胞产生将HCC827GR和H-1975细胞进行传代培养，将细胞接种到6cm皿中，细胞贴壁后分别用吉非替尼（1μM）、Losmapimod（1μM）处理24h后，检测细胞周期（结果如图4所示）。
[0033] 分析可以看出，正常情况及Losmapimod（1μM）单独处理时均无法诱导产生四倍体细胞，吉非替尼（1μM）单独处理能够诱导四倍体细胞产生，该四倍体的产生能够被Losmapimod抑制。
[0034] 将HCC827GR和H-1975细胞进行传代培养，将细胞接种到六孔板中，细胞贴壁后分别用吉非替尼（1μM）、Losmapimod（1μM）处理8h，收集细胞并经细胞裂解液裂解后用phospho-p38（p-p38）、p38、CyclinD1、p21、GAPDH抗体作免疫印迹检测其表达（结果如图5所示）。
[0035] 分析可以看出，吉非替尼耐药的HCC827R和H-1975细胞经吉非替尼处理后，可检测到p38的磷酸化激活，CyclinD1及p21表达的增高，而Losmapimod能够抑制该过程。
[0036] 将HCC827、HCC827GR和H-1975细胞进行传代培养，将细胞接种到6cm皿中，细胞贴壁后分别用吉非替尼（1μM）、SP680125（10μM）（SP680125，JNK抑制剂）处理24h后，检测细胞周期（结果如图6所示）。
[0037] 分析可以看出，p38抑制剂Losmapimod与吉非替尼联合使用时抑制四倍体细胞的产生是特异性的，JNK抑制剂SP680125单独或联合吉非替尼使用均不能抑制四倍体细胞的产生。
[0038] 综合上述结果可以看出，吉非替尼处理吉非替尼耐药细胞株时能够诱导产生四倍体细胞，此过程的发生需要p38磷酸化激活，而p38MAPK抑制剂losmapimod与吉非替尼联合使用时能够明显抑制四倍体细胞的产生。
[0039] 实施例2通过MTT细胞活性检测实验（实验方法参考实施例1）及soft agar实验，本实施例主要对Losmapimod与吉非替尼联合使用后，肿瘤细胞的增殖能力及克隆形成能力变化情况情况进行实验检测，在介绍具体实验前，就soft agar实验方法简要介绍如下。
[0040] 实验配制1.2%的琼脂糖，高压灭菌后置于44℃水浴锅保温，使琼脂糖处于融化状态；
配制2×1640，配制好以后用0.22μm的滤膜过滤至灭过菌的容器中，4℃冰箱保存；
配制下层胶，以50ml为例：20ml 的2×1640、7.5ml的胎牛血清、2.5ml的1×PBS、20ml的
1.25% agar、5μL的庆大霉素（50mg/ml），配制好以后，放置于44℃水浴锅保温；
配制15%FBS的1640培养基，以50 ml为例：22.5ml 的2×1640、7.5ml的胎牛血清、20 ml的无菌去离子水、5μL的庆大霉素（50mg/ml）；配制好以后，放置于37℃水浴锅保温；
灌制下层胶，准备好所需六孔板，每孔加入3ml，室温放置待凝，约1 2h；
~
等待下层胶凝固过程中，胰酶消化所需细胞，用15%胎牛血清的1640培养基重悬细胞，计数，将细胞浓度调整至2.4×104个细胞每毫升培养基；
下层胶凝固以后，将3ml的下层胶与1.5ml稀释好的细胞悬液混合作为上层胶，混匀后加入六孔板中，每孔1ml，每个细胞系设置3个平行孔；
上层胶凝固以后，37℃、5%CO2培养箱中培养，三周后收细胞，计数并统计克隆形成情况，也可加入0.1%结晶紫染色后拍照。
配制2×1640，配制好以后用0.22μm的滤膜过滤至灭过菌的容器中，4℃冰箱保存；
配制下层胶，以50ml为例：20ml 的2×1640、7.5ml的胎牛血清、2.5ml的1×PBS、20ml的
1.25% agar、5μL的庆大霉素（50mg/ml），配制好以后，放置于44℃水浴锅保温；
配制15%FBS的1640培养基，以50 ml为例：22.5ml 的2×1640、7.5ml的胎牛血清、20 ml的无菌去离子水、5μL的庆大霉素（50mg/ml）；配制好以后，放置于37℃水浴锅保温；
灌制下层胶，准备好所需六孔板，每孔加入3ml，室温放置待凝，约1 2h；
~
等待下层胶凝固过程中，胰酶消化所需细胞，用15%胎牛血清的1640培养基重悬细胞，计数，将细胞浓度调整至2.4×104个细胞每毫升培养基；
下层胶凝固以后，将3ml的下层胶与1.5ml稀释好的细胞悬液混合作为上层胶，混匀后加入六孔板中，每孔1ml，每个细胞系设置3个平行孔；
上层胶凝固以后，37℃、5%CO2培养箱中培养，三周后收细胞，计数并统计克隆形成情况，也可加入0.1%结晶紫染色后拍照。
[0041] 按照上述soft agar实验步骤，将HCC827GR和H-1975细胞利用胰酶消化处理后进行soft agar实验，soft agar上层及下层胶中均分别采用1 μM吉非替尼、1 μM的Losmapimod，三周后，荧光显微镜观察克隆数，并对克隆形成数量进行统计学分析（结果如图7所示）。
[0042] 分析结果可以看出，losmapimod与吉非替尼联合使用时，能够明显抑制吉非替尼耐药细胞株HCC827GR和H-1975的克隆形成能力。
[0043] 按照上述soft agar实验步骤，将HCC827GR和H-1975细胞利用胰酶消化处理后进行soft agar实验，soft agar上层及下层胶中均分别采用1 μM吉非替尼、1 μM的Losmapimod、1 μM吉非替尼+1 μM的Losmapimod处理，三周后，荧光显微镜观察克隆数并进行拍照（结果如图8所示）。
[0044] 分析结果可以看出，Losmapimod与吉非替尼联合使用时，能够明显抑制吉非替尼耐药细胞株HCC827GR和H-1975的克隆形成能力。
[0045] 按照细胞活性检测步骤，将HCC827GR和H-1975细胞进行传代培养，胰酶消化贴壁细胞并离心后，将细胞用对应培养基重悬，调整细胞浓度以每孔3×103个细胞接种到96孔板中；24 h后，1 μM吉非替尼、1 μM的Losmapimod处理72h之后，MTT法检测细胞活性（结果如图9所示）。
[0046] 分析可以看出，Losmapimod与吉非替尼联合使用时能够明显降低HCC827GR和H-1975细胞的增殖。
[0047] 综合上述MTT细胞活性检测实验及soft agar实验结果，可以初步证明：Losmapimod与吉非替尼联合使用时可明显抑制肿瘤细胞的增殖能力及克隆形成能力；同时，Losmapimod与吉非替尼联合使用时可增强表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药后的非小细胞肺癌对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。
[0048] 实施例3在上述实施例1、2基础上，发明人进一步进行了吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织（该例肿瘤由河南省肿瘤医院提供）的异种移植肺癌小鼠体内实验，详细实验过程简介如下。
[0049] 将吉非替尼耐药的非小细胞肺癌组织切块后接种至40只小鼠皮下，小鼠分为4组（每组10只小鼠）；当小鼠体内肿瘤体积约25mm3时，四组小鼠分别做如下处理：1、对照组（5%DMSO，50%生理盐水，50%PEG400）；
2、50mg/kg 吉非替尼处理组；
3、12mg/kg的Losmapimod处理组；
4、50mg/kg的吉非替尼和12mg/kg的Losmapimod共同处理组(灌胃方式)；
每周两次测量小鼠体重及肿瘤体积（长×宽2 ×0.5）；
实验结束后，将小鼠处死并保存肿瘤块以进行进一步的分析。
2、50mg/kg 吉非替尼处理组；
3、12mg/kg的Losmapimod处理组；
4、50mg/kg的吉非替尼和12mg/kg的Losmapimod共同处理组(灌胃方式)；
每周两次测量小鼠体重及肿瘤体积（长×宽2 ×0.5）；
实验结束后，将小鼠处死并保存肿瘤块以进行进一步的分析。
[0050] 分析过程中，免疫组织化学染色过程具体参考如下处理步骤：免疫组织化学用标本经10%(v/v)甲醛溶液固定后，石蜡包埋，并将5 μm厚切片常规脱蜡至无水保存备用；
检测时，将用于免疫组织化学检测的切片置于枸橼酸钠缓冲液中，高压锅煮沸90秒，以进行修复抗原，然后用冷水冲淋高压锅至室温，之后将切片置于水中；
用3% H2O2避光处理3 5min进行阻断，之后置于清水中5min，最后置于PBS中5min；
~
封闭液室温封闭1h，滴加工作浓度的一抗，放于湿盒中，4℃孵育过夜；
使用过氧化物酶标记的链霉卵白素检测试剂盒进行显色（中杉金桥，SP9001），之后使用使用显微镜进行拍照（400×）保存；
使用Image-Pro Premier software (v.9.0)软件对结果进行统计分析。
检测时，将用于免疫组织化学检测的切片置于枸橼酸钠缓冲液中，高压锅煮沸90秒，以进行修复抗原，然后用冷水冲淋高压锅至室温，之后将切片置于水中；
用3% H2O2避光处理3 5min进行阻断，之后置于清水中5min，最后置于PBS中5min；
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封闭液室温封闭1h，滴加工作浓度的一抗，放于湿盒中，4℃孵育过夜；
使用过氧化物酶标记的链霉卵白素检测试剂盒进行显色（中杉金桥，SP9001），之后使用使用显微镜进行拍照（400×）保存；
使用Image-Pro Premier software (v.9.0)软件对结果进行统计分析。
[0051] 加药处理14天后，对小鼠体内肿瘤体积测量及统计结果如图10所示。
[0052] 分析可以看出：吉非替尼单独处理时没有明显效果，但Losmapimod单独使用或与吉非替尼联合使用时能够明显减小吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌小鼠体内肿瘤体积。
[0053] 加药处理14天后，对小鼠体内肿瘤进行拍照称重并统计，结果如图11、12所示。
[0054] 分析可以看出：吉非替尼单独处理时没有明显效果，Losmapimod单独使用或与吉非替尼联合使用时能够明显降低吉非替尼耐药的来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌模型小鼠体内肿瘤重量。
[0055] 加药处理14天后，对小鼠体重进行统计，结果如图13所示。
[0056] 分析可以看出：不同药物处理之后，小鼠体重基本没有变化，说明药物处理对小鼠体重没有影响。
[0057] 加药处理14天后，对小鼠进行处死并保存肿瘤块进行免疫组织化学染色分析，分别检测p-p38, Cyclin D1和 Ki-67的表达，拍照保存并进行统计分析，结果如图14、15所示。
[0058] 分析可以看出：相对于对照组及吉非替尼处理组，Losmapimod单独处理或与吉非替尼共同处理时能够明显降低 Ki67、Cyclin D1 和p-p38 MAPK的表达。
[0059] 综合上述实验结果可以看出：Losmapimod与吉非替尼联合使用时可明显抑制来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌小鼠体内肿瘤细胞的增殖；而通过来源于患者肿瘤组织的异种移植肺癌小鼠模型实验及免疫组织化学（IHC）实验证明， Losmapimod与吉非替尼联合使用后，可通过抑制G1期四倍体细胞的形成，来增强吉非替尼耐药后的非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感性。
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