基于基因沉默技术的灰飞虱致死基因片段Chitinase及其
dsRNA
技术领域
背景技术
[0002] 在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致灰飞虱对多种
农药产生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。另外灰飞虱传播条纹病毒引起的
水稻条纹叶枯病，发病后药剂控制效果较差，只能依靠治虫防病。因此，在农业生产实践中，急需
化学农药之外的替代防治手段。
[0003] RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象，双链RNA最终被加工大小约为22nt的小RNA(siRNA)，通过序列
配对的方式与蛋白编码基因结合，根据序列配对的程度降解靶标基因mRNA或抑制基因的蛋白翻译过程。RNAi广泛地存在于
真菌、
植物和动物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因发现RNAi现象被授予诺贝尔医学与生理奖。
[0004] 在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。因此，从理论上而言，如果利用RNA干扰技术将农业
害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从而达到控制害虫的目的。本
专利发明就是利用实验室改进的dsRNA喂食法从灰飞虱中筛选出经干扰后能够导致灰飞虱死亡的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据
基础。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对
现有技术的上述不足，提供一种灰飞虱致死基因片段Chitinase及其克隆方法。
[0006] 本发明的另一方法是提供该致死基因片段Chitinase的dsRNA及其合成方法。
[0007] 本发明的又一目的是提供一种用于筛选致死基因的dsRNA喂食法。
[0008] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0009] 灰飞虱致死基因片段Chitinase，序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010] 所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的克隆方法，包括如下步骤：
[0011] (1)取灰飞虱，提取总RNA，以提取的灰飞虱总RNA合成cDNA第一条链；
[0012] (2)以步骤(1)合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO.2的上游引物P1、序列为SEQ ID NO.3的下游引物P2进行RT-PCR扩增；
[0013] (3)PCR产物经琼脂糖凝胶
电泳分离，回收目标DNA片段；
[0014] (4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至pEASY-T3载体中，转化到大肠杆菌T1，涂于含有X-gal、IPTG以及
氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养，过夜；
[0015] (5)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；
[0016] (6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；
[0017] (7)全自动序列仪进行测序，得到SEQ ID NO.1所示的Chitinase基因片段。
[0018] 其中，所述的RT-PCR扩增体系为：反应缓冲液5μL，Mg2+4μL，dNTP 4μL，cDNA模板2μL，上游引物P1 1μL，下游引物P2 1μL，R-Tag酶0.5μL，ddH2O 32.5μL，共50μL；所述的反应程序为：94℃变性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环，72℃延伸。
[0019] 灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，序列如SEQ ID NO.4所示。
[0020] 所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法，是以灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO.5的上游引物P3、序列为SEQ ID NO.6的下游引物P4PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA。
[0021] 所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法优选包含如下步骤：
[0022] (1)根据已经验证的Chitinase基因片段序列，设计并合成序列为SEQ ID NO.5的引物3和序列为SEQ ID NO.6的引物4，以灰飞虱cDNA第一条链为模板PCR扩增得到灰飞2+
虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，PCR体系为：反应缓冲液5μL，Mg 4μL，dNTP 4μL，cDNA模板2μL；上游引物P3 2μL，下游引物P4 2μL，Ex Tap酶0.25μL，ddH2O 30.75μL，共50μL；PCR条件为：94℃变性2min，94℃30sec，55-62℃30sec，72℃30sec，38个循环，
72℃延伸。
[0023] (2)PCR产物经浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离；
[0024] (3)回收目标DNA产物。
[0025] 一种灰飞虱的dsRNA喂食方法，包含如下步骤：
[0026] (1)将玻璃管的一端封好，用吸虫器吸取二龄的灰飞虱加入玻璃管内，用纱布将玻璃管另一端封好；
[0027] (2)将虫子拍打至玻璃管封口端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的
封口膜，贴纸的一面朝上，盖到玻璃管管口上，将管竖立放置；
[0028] (3)用移液枪吸取含dsRNA的
饲料滴在膜的中央，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；
[0029] (4)将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间
温度为26℃，利用灰飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料。
[0030] 所述的dsRNA优选所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA。
[0031] 有益效果：
[0032] 利用RNAi技术沉默Chitinase基因，对灰飞虱具有明显的致死效果，说明该基因可作为利用RNA干扰技术控制害虫的有效靶点。
[0033] 本发明合成的Chitinase基因dsRNA能有效沉默Chitinase基因，更好地抵抗RNA酶的降解，同时合成成本较低，便于大量实验使用。
[0034] 本发明采用改进的喂食法进行RNAi干扰实验，相对注射法，减少了虫体的机械损伤，更加便于实验操作。最终通过喂食实验验证了Chitinase基因的RNAi对灰飞虱具有致死效果，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供新的实验手段。
附图说明
[0035] 图1dsRNA合成电泳图，泳道1为Marker，泳道2：Chitinase的dsRNA。
[0036] 图2两次独立重复试验校正死亡率比较。
具体实施方式
[0038] 1.Chitinase基因片段的克隆方法：
[0039] (1)取灰飞虱10-20头，用TRIzol法提取总RNA；
[0040] (2)合成cDNA第一条链；
[0041] (3)从灰飞虱转录组中获取基因片段序列，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/进行同源性比对之后，预测为灰飞虱Chitinase基因，利用Primer premier 5.0
软件设计P1和P2，以RT-PCR方法进行扩增；
[0042] 上游引物(P1)：5′TCACCAACTCGCCCATTA 3′(SEQ ID NO.2)，
[0043] 下游引物(P2)：5′AGCCTCGTCACTCACCTTT 3′(SEQ ID NO.3)；
[0044] PCR条件为：94℃变性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环，72℃延伸
[0045] PCR反应体系(50μL)：
[0046]
[0047]
[0048] (4)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；
[0049] (5)将回收的目标片段在T3连接酶作用下插入至pEASY-T3载体中，转化到大肠杆菌T1，涂于含X-gal 0.02g/ml、IPTG0.2g/ml以及氨苄青霉素50ng/ml的LB培养基，37℃培养，过夜；
[0050] (6)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；
[0051] (7)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；
[0052] (8)全自动序列仪进行测序(由上海生工
生物工程技术服务有限公司完成)，即可得到SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的Chitinase基因片段。
[0053] 实施例2.dsRNA合成及回收
[0054] (1)根据已经验证的Chitinase基因片段序列，采用Primer Premier 5.0软件设计P3和P4，在上下游引物5’端加入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG；
[0055] 上游引物(P4)：5′TAATACGACTCACTATAGGGTCACCAACTCGCCCATTA 3′(SEQ ID NO.5)
[0056] 上游 引物 (P5)：5 ′TAATACGACTCACTATAGGGAGCCTCGTCACTCACCTTT 3′ (SEQ IDNO.6)
[0057]
[0058] PCR条件：94℃变性2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，38个循环，72℃延伸。
[0059] (2)PCR产物经浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离并在紫外灯下进行观察，结果见图1，其序列见SEQ ID NO.4。
[0060] (3)采用Promega公司的 SV Gel and PCR Clean-Up System
试剂盒进行回收：
[0061] ①对分离得到的目标片段切胶，并放入称量过重量(a)的1.5ml微量离心管中，再次称量(b)，b-a算得所切胶重；
[0062] ②根据胶重，每10mg凝胶加入10μL Membrane Binding Solution。凝胶重量不超过350mg；
[0063] ③将凝胶放入50-65℃水浴锅中水浴10min或者直到凝胶完全融化；
[0064] ④将试剂盒中的滤管放置在配套的收集管中，转移融化的凝胶液体至滤管中，室温放置1min；
[0065] ⑤16,000×g(14,000rpm)离心1min，弃去收集管中的液体；
[0066] ⑥ 加 入 700μl Membrane Wash Solution( 已 加 入 95 ％ 酒 精 )，16,000×g(14,000rpm)离心1min，弃去收集管中的液体；
[0067] ⑦ 加 入 500μl Membrane Wash Solution( 已 加 入 95 ％ 酒 精 )，16,000×g(14,000rpm)离心5min，弃去收集管中的液体；
[0068] ⑧不加液体空转1min；
[0069] ⑨转移滤管到1.5ml微量离心管中，加入50μl Nuclease-Free Water，室温放置1min，16,000×g(14,000rpm)离心1min；
[0070] ⑩收集到的DNA产物保存在4℃或-20℃。
[0071] 实施例3.dsRNA喂食实验
[0072] (1)将玻璃管的一端用封口膜封好，用吸虫器吸取二龄的灰飞虱加入玻璃管内，用纱布将另一端封好；
[0073] (2)将虫子轻轻用手拍打至一端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜贴纸的一面朝上，均匀用
力向两侧拉，拉成正方形，然后盖到玻璃管管口上，将管竖立放置在超净
台面上；
[0074] (3)用移液枪吸取饲料100μl滴在封口膜的中央，对照只加饲料(配方见表2)，处理组在饲料中加入Chitinase基因的dsRNA(浓度见表1)，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；
[0075] (4)将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间温度为26℃，利用灰飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次饲料和dsRNA；
[0076] (5)连续喂食五天，每24h统计一次死亡率，重复两次，结果见表1和图2，由表1和图2可见喂食致死基因Chitinase的dsRNA能够达到很好的致死效果。
[0077]
[0078] 数值后的字母为显著性差异标注符号。
[0079]
[0080] 表2
[0081]
