提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体及其制法和用途
阅读：81发布：2020-06-08
专利汇可以提供提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体及其制法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种提高稻米 蛋白质 含量和 质量 的表达载体及其制法和用途，具有 摘要 附图 中(a)或(b)所示的结构和特征。包括谷蛋白Gt1基因启动子、大豆Gy7全基因或者Gy7基因编码序列cDNA 片段 、终止子和内切酶敏感序列或者标记基因序列。可应用于转化禾本科 植物 如 水 稻，获得高蛋白质含量和高限制性 氨 基酸含量的新型水稻品种。，下面是提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体及其制法和用途专利的具体信息内容。
1.一种提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体，包括如下序列：
(1)谷蛋白Gt1基因启动子；
(2)大豆球蛋白基因；
(3)终止子；
(4)内切酶敏感序列或者标记基因序列；
其特征在于，序列(2)为大豆球蛋白Gy7基因片段。
2.根据权利要求1所述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体，其特征在于，所说的大豆 球蛋白基因为Gy7全基因或者Gy7基因的cDNA编码序列。
3.根据权利要求2所述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体，其特征在于，所说的大豆 球蛋白Gy7全基因或者Gy7基因的cDNA编码序列为与GenBank号AF319776或 AF319777同源的基因。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体，其特征在于， 所说的终止子为CaMV 35S基因终止子。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体，其特征在于， 在启动子下游还有信号肽编码序列。
6.一种权利要求1所述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法，包括如下步 骤：
(1)采用PCR方法扩增获得水稻谷蛋白基因Gt1启动子和大豆球蛋白Gy7基因片段；
(2)将Gt1启动子和大豆球蛋白Gy7基因的PCR扩增产物与终止子及其他载体序列连 接，得到表达载体。
7.根据权利要求6所述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法，其特征在于， 所说的大豆球蛋白基因为Gy7全基因或者Gy7基因的cDNA编码序列。
8.根据权利要求6所述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法，其特征在于， 所说的步骤(2)是通过以Gt1启动子的PCR产物替代载体中的抗性基因的启动子、以 Gy7基因的PCR扩增产物替代载体中的抗性基因来实现的。
9.根据权利要求6所述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法，其特征在于， 所说的步骤(1)采用PCR方法扩增不但获得Gt1启动子的扩增产物，而且同时还获得信 号肽序列的扩增产物。
10.一种权利要求1所述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的应用，包括以所说的表达 载体转化水稻、大麦、玉米获取新品种。
技术领域
背景技术
水稻稻米的营养成分包括淀粉、蛋白质、脂肪、维生素等，而稻米营养品质则主要指蛋 白质和必需氨基酸含量。目前常规水稻栽培品种稻米总蛋白质含量较低，一般为7％-9％。张瑞 品等人认为在以稻米为主食的地区，精米提供了至少40％的蛋白质，如果把我国稻米蛋白质含 量在现有基础上再提高1％-2％，无疑对改善我国人民的营养水平将是很大的贡献(张瑞品等， 水稻品质育种，农作物品质育种(刘后利主编)，湖北科学技术出版社，2001，pp：37)。水 稻高蛋白育种对于人类健康，尤其对于有些不能食用动物蛋白的特殊疾病患者更为重要。水 稻高蛋白育种对于动物、水稻早期自身的生长以及环境等多方面也都会带来一定的益处。以 高蛋白水稻作为饲养家畜的饲料，减少和避免使用动物饲料，将更有助于家畜的生长，也可 改变我国每年需进口玉米、豆类饲料而消耗大量外汇的状况。稻米的贮藏蛋白在种子萌动发 芽中是一种氮源，具有非常重要的作用。如果以高蛋白水稻稻谷作为种子，内源氮素丰富， 就有可能减少早期氮肥的使用，从而将会降低肥料对环境的污染以及降低种植成本。种植高 蛋白水稻还可提高单位土地面积蛋白质生产量，提高土地的生产率。
蛋白质的营养价值，主要取决于组成它的各种必需氨基酸之间的平衡。人和动物自身不 能合成的八种必需氨基酸分别是：赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 缬氨酸和苯丙氨酸；组氨酸和精氨酸是两种在成人不是必需，而在婴幼儿是必需的半必需氨 基酸；在世界健康组织(WHO)推荐人类食品必需氨基酸含量标准中，甲硫氨酸与半胱基酸 之和为含硫氨基酸，含硫氨基酸含量多少也作为评价食品营养价值的一个重要指标。在水稻 稻米蛋白质中，赖氨酸为第一限制性氨基酸，苏氨酸为第二限制氨基酸，甲硫氨酸、色氨酸 仅次于前两者。因此，这四种必需氨基酸的含量的高低决定了稻米所含蛋白质品质的优劣(张 瑞品等，水稻品质育种，农作物品质育种(刘后利主编)，湖北科学技术出版社，2001，pp： 27)。
水稻高蛋白育种在国内外很早就引起了人们的兴趣，不同学者曾先后采用杂交、辐射育 种等方法开展高蛋白水稻育种及遗传研究(赵则胜等，中国特种稻，上海科学技术出版社，1995， pp：149)，然而结果并不理想，尤其是利用常规方法培育高蛋白水稻，稻谷产量往往与稻米蛋 白质含量呈反相关关系，这一现象在其他禾谷类作物营养品质改良中也同样存在，是制约水 稻等禾谷类作物营养品质改良的重要因素。
在20世纪90年代，国外首先开展了采用基因工程技术将大豆基因导入水稻改良水稻稻米 营养品质的研究。1999年Tomoyuki等人(Plant Physiol，1999，120：1063-1073)将大豆球蛋 白(Glycinin)基因(A1bB1b)cDNA编码序列与水稻谷蛋白基因启动子GluB-1构成融合基因 导入水稻，大豆球蛋白在转基因后代水稻种子中能够表达，并与水稻谷蛋白一同聚集于胚乳 II型蛋白体中。同年Keiko等人报道了他们分析比较了含有大豆球蛋白的转基因水稻与对照水 稻稻米外观形态、与稻米产量密切有关的千粒重、稻米的营养组成等多项指标，结果显示转 基因水稻与对照两者只在蛋白质、氨基酸水平和含水量方面有差异；未转基因水稻稻米蛋白 质含量为6.5％，转基因水稻稻米蛋白质含量为8.0％，比对照提高约20％。而且稻米重要氨基 酸含量也随着稻米蛋白含量的提高而增加。对于第一限制性氨基酸，未转基因水稻稻米赖氨 酸含量为0.25％，转基因水稻稻米赖氨酸含量为0.30％，也比对照提高20％(Keiko等，Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(2)：314-318)。此项研究结果表明了，利用基因工程技术培育高 蛋白水稻有可能克服常规方法无法避免的产量与蛋白质含量呈反相关关系这样一个障碍。
众所周知，启动子是基因表达的重要控制元件。水稻谷蛋白基因启动子是能够在水稻种 子中特异表达的启动子。根据前人的研究认为，水稻谷蛋白可被列为两个亚家族，各自的成 员主要有：GluA-2(Gt1)、GluA-1(Gt2)、GluA-3(Gt3)和GluB-1、GluB-2、GluB-3等(Takaiwa 等，Plant Mol Biol，1999，17(4)：875-885)。Okita等人认为Gt1和Gt2在水稻种子形成期 间的表达时间及表达量两者比较接近，在水稻种子发育过程中Gt3积累的总量明显少于Gt1 (Okita等，Journal of Biol Chemistry，1989，264(21)：12573-12581)。Hwang等人在2002 年，采用谷蛋白等基因的启动子与人的溶菌酶基因融合后转化水稻，研究多种水稻贮藏蛋白 基因启动子的表达活性，结果显示Gt1比Gt3、GluB-1、GluB-2等启动子的表达活性都强(Hwang 等，Cell Rep，2002，20：842-847)。目前关于谷蛋白Gt1基因启动子在大麦(Xue等，Plant Cell Rep，2003，21(11)：1088-1094)、玉米(Racon-Cruz等，2004，Theor Appl Genet，108(2)：335-342)、 烟草(Sardana等，Transgenic Res，，2002，11(5)：521-531)等其他作物中也有成功表达的报 道。
从目前已报道的文献中，在国外利用大豆球蛋白基因改良水稻营养品质的研究都只限于 利用编码A1bB1b球蛋白基因。根据Nielsen(Nielsen等，The Plant Cell，1989，1：313-328) 在1989年报道中的描述，AlbBlb是第三种大豆球蛋白基因(Gy3)。在国内，张宪银等(浙江 大学学报(农业与生命科学版)，2001，27(5)：495-499)曾报道将水稻的谷蛋白基因(Gt1) 启动子与大豆Gy3基因编码序列cDNA构成融合基因，并导入水稻获得转基因植株，但一直未 见有关于提高稻米蛋白质含量及重要氨基酸含量等方面的后续报道。关于11S大豆球蛋白基 因，在Nielsen的报道中共涉及了五种，它们分别是Gy1、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5。在2002 年Beilinson等人(Theor Appl Genet，2002，104：1132-1140)又发现了两种新的11S大豆球蛋 白基因，并命名为Gy6和Gy7，经研究Gy6基因为3′端缺陷型，不能编码有功能的大豆球 蛋白，而Gy7是有功能的。
分析比较Gy1(GenBank X15121)、Gy2(GenBank X15122)、Gy3(GenBank X15123)、 Gy4(GenBank AB004062)、Gy5(GenBank AB003680)和Gy7(GenBank AF319776)六种功 能性大豆球蛋白基因合成的多肽氨基酸组成，不论从八种必需氨基酸、半必需氨基酸和含硫 氨基酸(Met+Cys)的百分含量，还是它们的实际数值(表1)，Gy7基因明显比Gy3基因更 好，只有在苯丙氨酸实际数值没能超过Gy3基因，其他必需氨基酸、半必需氨基酸及含硫氨 基酸(Met+Cys)都超过Gy3基因，在赖氨酸含量上尤其明显。由此可见，将Gy7基因构建 成能够进行禾谷类作物营养品质改良的表达载体的工作是极有意义的，但目前在国内外都还 未见报道。
表1.六种大豆球蛋白重要氨基酸百分含量(％)和实际值(个) 氨基酸种类 G1 G2 G3 G4 G5 G7 重 要 氨 基 酸 百 分 含 量 (％) Lys 5.64 4.33 4.35 5.34 4.08 6.99 Thr 3.83 3.52 3.54 3.18 3.51 3.57 Met 1.44 1.72 1.23 0.42 0.69 1.38 Trp 1.31 1.34 1.01 1.72 1.27 1.83 Ile 5.49 4.96 5.20 3.87 3.66 5.49 Val 4.33 5.01 4.84 5.77 6.35 7.53 Leu 6.96 7.12 6.72 7.01 7.11 7.06 Phe 5.31 5.16 7.10 3.25 4.09 3.70 Arg 7.56 8.30 8.35 8.82 8.36 8.59 His 2.00 1.02 1.54 3.27 3.85 5.10 Met+Cys 3.00 3.31 2.83 1.44 1.82 3.33 重 要 氨 基 酸 实 Lys 24 18 19 26 18 32 Thr 20 18 18 19 19 19 Met 6 7 5 2 3 6 Trp 4 4 3 6 4 6 Ile 26 23 24 21 18 28 Val 23 26 25 35 35 43 Leu 33 33 31 38 35 36 际 值 (个) Phe 20 19 26 14 16 15 Arg 27 29 29 36 31 33 His 8 4 6 15 16 22 Met+Cys 14 15 13 8 9 17
G1-G7分别表示Gy1-Gy7基因相应的多肽产物
关于目的基因在表达载体中的形式，在目前采用大豆球蛋白基因Gy3改良水稻营养品质 研究的报道中，都是选用cDNA序列与启动子结合构成融合基因导入水稻。在克隆基因的操 作中，制备cDNA要比从总基因组获得基因全序列操作困难许多。Zhenwei等人(Plant Physiol， 1995，109：777-786)在1995年曾报道将菜豆(Bean)基因组克隆的β-菜豆蛋白(β-Phaseolin) 全基因序列及cDNA编码序列分别与水稻谷蛋白基因Gt1启动子构成融合基因导入水稻，两 种β-菜豆蛋白DNA序列在转基因后代水稻中都能够正确表达。由Gt1启动子和β-菜豆蛋白全 基因构成的融合基因转化的水稻并没有因为β-菜豆蛋白全基因中内含子的存在影响了成熟β- 菜豆蛋白的形成；利用免疫标记法显示，在转基因水稻中的β-菜豆蛋白都能够在胚乳II型蛋白 体中聚集；他们在研究中还发现采用β-菜豆蛋白总基因构成融合基因在提高稻米蛋白质含量方 面的效果比cDNA编码序列更好。1997年Sindhu等人 (Plant-Science-Shannon，1997，130(2)：189-196)报道将豌豆(Pea)基因组克隆的种子贮藏蛋白 豆球蛋白(Legumin)全基因及cDNA编码序列分别也与水稻谷蛋白启动子Gt1构成融合基因 导入水稻，两种转基因水稻也无表达差异。
蛋白质的营养价值，主要取决于组成它的各种必需氨基酸之间的平衡。人和动物自身不 能合成的八种必需氨基酸分别是：赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 缬氨酸和苯丙氨酸；组氨酸和精氨酸是两种在成人不是必需，而在婴幼儿是必需的半必需氨 基酸；在世界健康组织(WHO)推荐人类食品必需氨基酸含量标准中，甲硫氨酸与半胱基酸 之和为含硫氨基酸，含硫氨基酸含量多少也作为评价食品营养价值的一个重要指标。在水稻 稻米蛋白质中，赖氨酸为第一限制性氨基酸，苏氨酸为第二限制氨基酸，甲硫氨酸、色氨酸 仅次于前两者。因此，这四种必需氨基酸的含量的高低决定了稻米所含蛋白质品质的优劣(张 瑞品等，水稻品质育种，农作物品质育种(刘后利主编)，湖北科学技术出版社，2001，pp： 27)。
水稻高蛋白育种在国内外很早就引起了人们的兴趣，不同学者曾先后采用杂交、辐射育 种等方法开展高蛋白水稻育种及遗传研究(赵则胜等，中国特种稻，上海科学技术出版社，1995， pp：149)，然而结果并不理想，尤其是利用常规方法培育高蛋白水稻，稻谷产量往往与稻米蛋 白质含量呈反相关关系，这一现象在其他禾谷类作物营养品质改良中也同样存在，是制约水 稻等禾谷类作物营养品质改良的重要因素。
在20世纪90年代，国外首先开展了采用基因工程技术将大豆基因导入水稻改良水稻稻米 营养品质的研究。1999年Tomoyuki等人(Plant Physiol，1999，120：1063-1073)将大豆球蛋 白(Glycinin)基因(A1bB1b)cDNA编码序列与水稻谷蛋白基因启动子GluB-1构成融合基因 导入水稻，大豆球蛋白在转基因后代水稻种子中能够表达，并与水稻谷蛋白一同聚集于胚乳 II型蛋白体中。同年Keiko等人报道了他们分析比较了含有大豆球蛋白的转基因水稻与对照水 稻稻米外观形态、与稻米产量密切有关的千粒重、稻米的营养组成等多项指标，结果显示转 基因水稻与对照两者只在蛋白质、氨基酸水平和含水量方面有差异；未转基因水稻稻米蛋白 质含量为6.5％，转基因水稻稻米蛋白质含量为8.0％，比对照提高约20％。而且稻米重要氨基 酸含量也随着稻米蛋白含量的提高而增加。对于第一限制性氨基酸，未转基因水稻稻米赖氨 酸含量为0.25％，转基因水稻稻米赖氨酸含量为0.30％，也比对照提高20％(Keiko等，Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(2)：314-318)。此项研究结果表明了，利用基因工程技术培育高 蛋白水稻有可能克服常规方法无法避免的产量与蛋白质含量呈反相关关系这样一个障碍。
众所周知，启动子是基因表达的重要控制元件。水稻谷蛋白基因启动子是能够在水稻种 子中特异表达的启动子。根据前人的研究认为，水稻谷蛋白可被列为两个亚家族，各自的成 员主要有：GluA-2(Gt1)、GluA-1(Gt2)、GluA-3(Gt3)和GluB-1、GluB-2、GluB-3等(Takaiwa 等，Plant Mol Biol，1999，17(4)：875-885)。Okita等人认为Gt1和Gt2在水稻种子形成期 间的表达时间及表达量两者比较接近，在水稻种子发育过程中Gt3积累的总量明显少于Gt1 (Okita等，Journal of Biol Chemistry，1989，264(21)：12573-12581)。Hwang等人在2002 年，采用谷蛋白等基因的启动子与人的溶菌酶基因融合后转化水稻，研究多种水稻贮藏蛋白 基因启动子的表达活性，结果显示Gt1比Gt3、GluB-1、GluB-2等启动子的表达活性都强(Hwang 等，Cell Rep，2002，20：842-847)。目前关于谷蛋白Gt1基因启动子在大麦(Xue等，Plant Cell Rep，2003，21(11)：1088-1094)、玉米(Racon-Cruz等，2004，Theor Appl Genet，108(2)：335-342)、 烟草(Sardana等，Transgenic Res，，2002，11(5)：521-531)等其他作物中也有成功表达的报 道。
从目前已报道的文献中，在国外利用大豆球蛋白基因改良水稻营养品质的研究都只限于 利用编码A1bB1b球蛋白基因。根据Nielsen(Nielsen等，The Plant Cell，1989，1：313-328) 在1989年报道中的描述，AlbBlb是第三种大豆球蛋白基因(Gy3)。在国内，张宪银等(浙江 大学学报(农业与生命科学版)，2001，27(5)：495-499)曾报道将水稻的谷蛋白基因(Gt1) 启动子与大豆Gy3基因编码序列cDNA构成融合基因，并导入水稻获得转基因植株，但一直未 见有关于提高稻米蛋白质含量及重要氨基酸含量等方面的后续报道。关于11S大豆球蛋白基 因，在Nielsen的报道中共涉及了五种，它们分别是Gy1、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5。在2002 年Beilinson等人(Theor Appl Genet，2002，104：1132-1140)又发现了两种新的11S大豆球蛋 白基因，并命名为Gy6和Gy7，经研究Gy6基因为3′端缺陷型，不能编码有功能的大豆球 蛋白，而Gy7是有功能的。
分析比较Gy1(GenBank X15121)、Gy2(GenBank X15122)、Gy3(GenBank X15123)、 Gy4(GenBank AB004062)、Gy5(GenBank AB003680)和Gy7(GenBank AF319776)六种功 能性大豆球蛋白基因合成的多肽氨基酸组成，不论从八种必需氨基酸、半必需氨基酸和含硫 氨基酸(Met+Cys)的百分含量，还是它们的实际数值(表1)，Gy7基因明显比Gy3基因更 好，只有在苯丙氨酸实际数值没能超过Gy3基因，其他必需氨基酸、半必需氨基酸及含硫氨 基酸(Met+Cys)都超过Gy3基因，在赖氨酸含量上尤其明显。由此可见，将Gy7基因构建 成能够进行禾谷类作物营养品质改良的表达载体的工作是极有意义的，但目前在国内外都还 未见报道。
表1.六种大豆球蛋白重要氨基酸百分含量(％)和实际值(个) 氨基酸种类 G1 G2 G3 G4 G5 G7 重 要 氨 基 酸 百 分 含 量 (％) Lys 5.64 4.33 4.35 5.34 4.08 6.99 Thr 3.83 3.52 3.54 3.18 3.51 3.57 Met 1.44 1.72 1.23 0.42 0.69 1.38 Trp 1.31 1.34 1.01 1.72 1.27 1.83 Ile 5.49 4.96 5.20 3.87 3.66 5.49 Val 4.33 5.01 4.84 5.77 6.35 7.53 Leu 6.96 7.12 6.72 7.01 7.11 7.06 Phe 5.31 5.16 7.10 3.25 4.09 3.70 Arg 7.56 8.30 8.35 8.82 8.36 8.59 His 2.00 1.02 1.54 3.27 3.85 5.10 Met+Cys 3.00 3.31 2.83 1.44 1.82 3.33 重 要 氨 基 酸 实 Lys 24 18 19 26 18 32 Thr 20 18 18 19 19 19 Met 6 7 5 2 3 6 Trp 4 4 3 6 4 6 Ile 26 23 24 21 18 28 Val 23 26 25 35 35 43 Leu 33 33 31 38 35 36 际 值 (个) Phe 20 19 26 14 16 15 Arg 27 29 29 36 31 33 His 8 4 6 15 16 22 Met+Cys 14 15 13 8 9 17
G1-G7分别表示Gy1-Gy7基因相应的多肽产物
关于目的基因在表达载体中的形式，在目前采用大豆球蛋白基因Gy3改良水稻营养品质 研究的报道中，都是选用cDNA序列与启动子结合构成融合基因导入水稻。在克隆基因的操 作中，制备cDNA要比从总基因组获得基因全序列操作困难许多。Zhenwei等人(Plant Physiol， 1995，109：777-786)在1995年曾报道将菜豆(Bean)基因组克隆的β-菜豆蛋白(β-Phaseolin) 全基因序列及cDNA编码序列分别与水稻谷蛋白基因Gt1启动子构成融合基因导入水稻，两 种β-菜豆蛋白DNA序列在转基因后代水稻中都能够正确表达。由Gt1启动子和β-菜豆蛋白全 基因构成的融合基因转化的水稻并没有因为β-菜豆蛋白全基因中内含子的存在影响了成熟β- 菜豆蛋白的形成；利用免疫标记法显示，在转基因水稻中的β-菜豆蛋白都能够在胚乳II型蛋白 体中聚集；他们在研究中还发现采用β-菜豆蛋白总基因构成融合基因在提高稻米蛋白质含量方 面的效果比cDNA编码序列更好。1997年Sindhu等人 (Plant-Science-Shannon，1997，130(2)：189-196)报道将豌豆(Pea)基因组克隆的种子贮藏蛋白 豆球蛋白(Legumin)全基因及cDNA编码序列分别也与水稻谷蛋白启动子Gt1构成融合基因 导入水稻，两种转基因水稻也无表达差异。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用大豆球蛋白基因提高稻米蛋白质含量和质量 的表达载体及其制法和用途，以克服现有利用大豆球蛋白基因提高稻米蛋白质含量和质量的 表达载体都由水稻的谷蛋白GluB-1和Gt1基因启动子和大豆Gy3基因编码序列cDNA构成融 合基因，获得的转化子及其后代稻米的蛋白质含量提高不显著、蛋白质的质量即限制性氨基 酸含量的提高幅度较低的缺陷。
技术方案
本发明的第一个方面是提供一种提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体，包括如下序列：
(1)谷蛋白Gt1基因启动子；
(2)大豆球蛋白基因；
(3)终止子；
(4)内切酶敏感序列或者标记基因序列；
其中，序列(2)为大豆球蛋白Gy7基因片段。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的一种优选方案为，所说的大豆球蛋白基因 为Gy7全基因或者Gy7基因的cDNA编码序列，优选为与GenBank号AF319776或AF319777 同源的基因。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的另一种优选方案为，所说的终止子为 CaMV 35S基因终止子。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的另一种优选方案为，在启动子下游还有信 号肽编码序列。
本发明的第二个方面是提供一种上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方 法，包括如下步骤：
(1)采用PCR方法扩增获得水稻谷蛋白基因Gt1启动子和大豆球蛋白Gy7基因片段；
(2)将Gt1启动子和大豆球蛋白Gy7基因的PCR扩增产物与终止子及其他载体序列连 接，得到表达载体。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法一种优选方案为，所说的大豆球 蛋白基因为Gy7全基因或者Gy7基因的cDNA编码序列。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法另一种优选方案为，所说的步骤 (2)是通过以Gt1启动子的PCR产物替代载体中的抗性基因的启动子、以Gy7基因的PCR 扩增产物替代载体中的抗性基因来实现的。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法另一种优选方案为，所说的步骤 (1)采用PCR方法扩增不但获得Gt1启动子的扩增产物，而且同时还获得信号肽序列的扩增 产物。
一种上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的应用，包括以所说的表达载体转化水 稻、大麦、玉米获取新品种。
本发明的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体所转化获得的水稻新品种，其后代稻米 蛋白质含量在未转化的对照稻米蛋白质含量的基础上至少提高2个百分点或比对照增加25％。
本发明提供的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体，只是一种特例，所说的大豆球蛋 白Gy7基因片段还可以是和GenBank号AF319776或AF319777同源的其他基因。
有益效果
1)利用杂交等常规方法培育高蛋白水稻，稻谷产量往往与稻米蛋白质含量呈反相关关系， 本发明提供的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体可利用转基因技术将大豆球蛋白基 因导入水稻，避免了水稻等禾谷类作物营养品质改良的一个重要制约因素；
2)本发明利用表达量比GluB-1更高的Gt1启动子引导目的基因所构建的表达载体转化各个 水稻品种，可使后代稻米蛋白质含量比未转化的对照提高2个百分点以上或比对照增加 25％；
3)利用Gy7基因在各种重要氨基酸组成方面明显好于Gy3基因，本发明构建的表达载体转 化水稻，即便在相同表达水平的前提下，转化稻米中除苯丙氨酸实际值没能超过Gy3基 因构建的表达载体外，其他必需氨基酸、半必需氨基酸及含硫氨基酸(Met+Cys)都超 过Gy3基因构建的表达载体，在赖氨酸含量上可比Gy3基因构建的表达载体提高 (6.99-4.35)/4.35＝60.7％；
4)从目前已有报道显示，所有利用转基因技术改良水稻稻米蛋白质和氨基酸含量的表达载 体都是将抗性基因与目的基因构建在同一个载体上，本发明提供的表达载体不带有耐抗 生素或耐除草剂等抗性选择标记基因，在育种过程中避免了基因工程食品安全性问题的 困扰，对于转基因作物的推广应用极为重要；
5)若在我国自己培育的优质大豆品种(南农87-C38)中成功克隆一个高营养价值的优质基 因对我们这样一个人口大国将具有重要意义。将此优质基因与水稻胚乳特异启动子结合 转化水稻，在水稻中探索该基因如何有效表达的基础上，可为以后开展小麦、玉米、大 麦等重要农作物营养品质改良研究奠定基础。
本文所用的术语“大豆Gy7基因”是指编码大豆种子贮藏蛋白中沉降值为11S的球蛋白 (Glycinin)家族之中的一类球蛋白的基因，比如GenBank号为AF319776的全基因或者 GenBank号为AF319777的mRNA序列。
本文所用的术语“PCR方法”是指聚合酶链式反应的基因扩增方法。
本文所用的术语“CaMV 35S基因终止子”是指来自于花椰菜花叶病毒的35S终止子。
本文所用的术语“中间载体”是指在目标载体制备过程中获得的载体。
本文所用的术语“T-DNA”是指根癌农杆菌Ti质粒基因组中可转移并整合到寄主植物细胞 染色体上去的特定DNA片段，亦即一种转位单元。
附图说明
图1是p1300-Gt1-Gy7(a)和p1300-Gt1-Gy7cDNA(b)载体T-DNA结构图。图 中，LB、RB：T-DNA的左右边界；Gy7指大豆球蛋白Gy7基因去除信号肽后序列；Gy7cDNA 指大豆球蛋白Gy7基因去除信号肽后编码序列；Gt1-pro-S指水稻谷蛋白Gt1基因启动子和信 号肽；Terminator指基因终止子。
图2是pCAMBIA1300质粒T-DNA区的结构图。图中，LB、RB：T-DNA的左右边界； 35S-pro、35S-ter：CaMV 35S基因启动子和终止子；hpt：潮霉素抗性基因；Xh：XhoI；Bs：Bst XI；E：EcoRI；Sa：SacI；K：KpnI；S：SmaI；B：BamHI；X：XbaI；Sal：SalI；P：PstI；H：Hind III。
技术方案
本发明的第一个方面是提供一种提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体，包括如下序列：
(1)谷蛋白Gt1基因启动子；
(2)大豆球蛋白基因；
(3)终止子；
(4)内切酶敏感序列或者标记基因序列；
其中，序列(2)为大豆球蛋白Gy7基因片段。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的一种优选方案为，所说的大豆球蛋白基因 为Gy7全基因或者Gy7基因的cDNA编码序列，优选为与GenBank号AF319776或AF319777 同源的基因。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的另一种优选方案为，所说的终止子为 CaMV 35S基因终止子。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的另一种优选方案为，在启动子下游还有信 号肽编码序列。
本发明的第二个方面是提供一种上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方 法，包括如下步骤：
(1)采用PCR方法扩增获得水稻谷蛋白基因Gt1启动子和大豆球蛋白Gy7基因片段；
(2)将Gt1启动子和大豆球蛋白Gy7基因的PCR扩增产物与终止子及其他载体序列连 接，得到表达载体。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法一种优选方案为，所说的大豆球 蛋白基因为Gy7全基因或者Gy7基因的cDNA编码序列。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法另一种优选方案为，所说的步骤 (2)是通过以Gt1启动子的PCR产物替代载体中的抗性基因的启动子、以Gy7基因的PCR 扩增产物替代载体中的抗性基因来实现的。
上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的制备方法另一种优选方案为，所说的步骤 (1)采用PCR方法扩增不但获得Gt1启动子的扩增产物，而且同时还获得信号肽序列的扩增 产物。
一种上述的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体的应用，包括以所说的表达载体转化水 稻、大麦、玉米获取新品种。
本发明的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体所转化获得的水稻新品种，其后代稻米 蛋白质含量在未转化的对照稻米蛋白质含量的基础上至少提高2个百分点或比对照增加25％。
本发明提供的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体，只是一种特例，所说的大豆球蛋 白Gy7基因片段还可以是和GenBank号AF319776或AF319777同源的其他基因。
有益效果
1)利用杂交等常规方法培育高蛋白水稻，稻谷产量往往与稻米蛋白质含量呈反相关关系， 本发明提供的提高稻米蛋白质含量和质量的表达载体可利用转基因技术将大豆球蛋白基 因导入水稻，避免了水稻等禾谷类作物营养品质改良的一个重要制约因素；
2)本发明利用表达量比GluB-1更高的Gt1启动子引导目的基因所构建的表达载体转化各个 水稻品种，可使后代稻米蛋白质含量比未转化的对照提高2个百分点以上或比对照增加 25％；
3)利用Gy7基因在各种重要氨基酸组成方面明显好于Gy3基因，本发明构建的表达载体转 化水稻，即便在相同表达水平的前提下，转化稻米中除苯丙氨酸实际值没能超过Gy3基 因构建的表达载体外，其他必需氨基酸、半必需氨基酸及含硫氨基酸(Met+Cys)都超 过Gy3基因构建的表达载体，在赖氨酸含量上可比Gy3基因构建的表达载体提高 (6.99-4.35)/4.35＝60.7％；
4)从目前已有报道显示，所有利用转基因技术改良水稻稻米蛋白质和氨基酸含量的表达载 体都是将抗性基因与目的基因构建在同一个载体上，本发明提供的表达载体不带有耐抗 生素或耐除草剂等抗性选择标记基因，在育种过程中避免了基因工程食品安全性问题的 困扰，对于转基因作物的推广应用极为重要；
5)若在我国自己培育的优质大豆品种(南农87-C38)中成功克隆一个高营养价值的优质基 因对我们这样一个人口大国将具有重要意义。将此优质基因与水稻胚乳特异启动子结合 转化水稻，在水稻中探索该基因如何有效表达的基础上，可为以后开展小麦、玉米、大 麦等重要农作物营养品质改良研究奠定基础。
本文所用的术语“大豆Gy7基因”是指编码大豆种子贮藏蛋白中沉降值为11S的球蛋白 (Glycinin)家族之中的一类球蛋白的基因，比如GenBank号为AF319776的全基因或者 GenBank号为AF319777的mRNA序列。
本文所用的术语“PCR方法”是指聚合酶链式反应的基因扩增方法。
本文所用的术语“CaMV 35S基因终止子”是指来自于花椰菜花叶病毒的35S终止子。
本文所用的术语“中间载体”是指在目标载体制备过程中获得的载体。
本文所用的术语“T-DNA”是指根癌农杆菌Ti质粒基因组中可转移并整合到寄主植物细胞 染色体上去的特定DNA片段，亦即一种转位单元。
附图说明
图1是p1300-Gt1-Gy7(a)和p1300-Gt1-Gy7cDNA(b)载体T-DNA结构图。图 中，LB、RB：T-DNA的左右边界；Gy7指大豆球蛋白Gy7基因去除信号肽后序列；Gy7cDNA 指大豆球蛋白Gy7基因去除信号肽后编码序列；Gt1-pro-S指水稻谷蛋白Gt1基因启动子和信 号肽；Terminator指基因终止子。
图2是pCAMBIA1300质粒T-DNA区的结构图。图中，LB、RB：T-DNA的左右边界； 35S-pro、35S-ter：CaMV 35S基因启动子和终止子；hpt：潮霉素抗性基因；Xh：XhoI；Bs：Bst XI；E：EcoRI；Sa：SacI；K：KpnI；S：SmaI；B：BamHI；X：XbaI；Sal：SalI；P：PstI；H：Hind III。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议 的条件。
实施例1
本实施例是为了说明构建由Gt1基因启动子引导的Gy7大豆球蛋白基因表达载体的方法 及所获载体的结构组成。
构建该表达载体操作中涉及的常规PCR扩增、限制性内切酶酶切和连接等方法主要参考 《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J等，分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社，1992)。 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
由Gt1基因启动子引导的优质大豆球蛋白基因两种表达载体的构建过程如下：
将Genbank AY649098公布的水稻谷蛋白基因Gt1启动子序列通过NCBI比对得到与该序 列同源性为99％的GenbankAC021891基因序列。参照该序列在Gt1启动子距离翻译起始点 ATG上游约5.3kb处和翻译起始点ATG后72个核苷酸对的谷蛋白信号肽序列处分别设计引 物，在设计的上游引物一端引入HindIII酶切位点，下游引物一端引入XbaI酶切位点，并同时 添加保护碱基。利用常规PCR从越光水稻总DNA中扩增获得约5.3kb谷蛋白基因Gt1启动子 及其信号肽序列。利用HindIII和XbaI直接对5.3kb Gt1启动子及其信号肽序列的PCR产物进 行双酶切后，与pCAMBIA1300(简称p1300，中科院上海植物生理与生态研究所王宗阳研究 员提供)质粒HindIII和XbaI双酶切后回收的大片段进行连接形成中间载体p1300-5.3k Gt1， 转化感受态大肠杆菌。利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测p1300-5.3k Gt1载体。
根据Genbank AF319776公布的大豆球蛋白Gy7基因序列设计特异PCR引物。上游引物 一端引入XbaI位点，在下游引物一端引入XhoI位点。利用常规PCR从南农87-C38(Glycine max)总DNA中扩增约2.2kb大豆球蛋白Gy7基因序列信号肽以后的部分，将PCR产物与T 载体连接获得T-1载体，并转化感受态大肠杆菌。同样利用分子生物学酶切、PCR等常规方 法检测T-1载体。
再根据Genbank AF319777公布的大豆球蛋白Gy7 mRNA序列设计特异PCR引物。同样 由于后续构建植物表达载体的需要，在上游引物一端引入XbaI位点，在下游引物一端引入 XhoI位点。利用RT-PCR技术从南农87-C38(Glycine max)种子总RNA中反转录获得约1.6kb 大豆球蛋白Gy7基因序列信号肽以后的cDNA序列，将PCR产物与T载体连接获得T-2载体， 也转化感受态大肠杆菌。同样利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测T-2载体。
从大肠杆菌中提取T-1和T-2载体，利用XbaI和XhoI两种限制性内切酶消化T-1、T-2 载体和p1300-5.3k Gt1载体，电泳回收T-1、T-2载体的小片段以及p1300-5.3k Gt1载体的 最大片段，利用T4连接酶分别将两个小片段与大片段连接，构建成p1300-Gt1-Gy7(a)和 p1300-Gt1-Gy7cDNA(b)载体(图1)。
实施例2
本实施例是为了说明如何利用实施例1构建的表达载体转化水稻。
利用如上两种表达载体分别与含有抗性选择标记基因和报告基因的pCAMBIA1301载体 对目前常规水稻稻米蛋白质含量介于7％-9％的水稻品种进行共转化，在培育转基因水稻中涉 及的根癌农杆菌培养及抗性愈伤组织筛选及植株再生主要参照刘巧泉的方法进行(刘巧泉等， 植物生理学报，1998，24(3)：259-271)，水稻的遗传转化主要参照李建粤等人的方法进行(李建 粤等，科学通报，2004，49(24)：2556-2561)，即能够获得无抗性选择标记基因和报告基因， 而稻米蛋白质含量和质量能够提高的转基因后代。
本实施例利用表达量比GluB-1更高的Gt1启动子引导目的基因转化水稻，后代稻米蛋白 质含量将比未转化的对照提高2个百分点以上或比对照增加25％；利用Gy7基因在各种重要 氨基酸组成方面明显好于Gy3基因，本发明构建的表达载体转化水稻，即便在相同表达水平 的前提下，除苯丙氨酸没能超过Gy3基因外，其他必需氨基酸、半必需氨基酸及含硫氨基酸 (Met+Cys)都超过Gy3基因，在赖氨酸含量上可比前人利用Gy3基因的基础上提高 (6.99-4.35)/4.35＝60.7％；而且转基因植株不含抗性基因。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议 的条件。
实施例1
本实施例是为了说明构建由Gt1基因启动子引导的Gy7大豆球蛋白基因表达载体的方法 及所获载体的结构组成。
构建该表达载体操作中涉及的常规PCR扩增、限制性内切酶酶切和连接等方法主要参考 《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J等，分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社，1992)。 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
由Gt1基因启动子引导的优质大豆球蛋白基因两种表达载体的构建过程如下：
将Genbank AY649098公布的水稻谷蛋白基因Gt1启动子序列通过NCBI比对得到与该序 列同源性为99％的GenbankAC021891基因序列。参照该序列在Gt1启动子距离翻译起始点 ATG上游约5.3kb处和翻译起始点ATG后72个核苷酸对的谷蛋白信号肽序列处分别设计引 物，在设计的上游引物一端引入HindIII酶切位点，下游引物一端引入XbaI酶切位点，并同时 添加保护碱基。利用常规PCR从越光水稻总DNA中扩增获得约5.3kb谷蛋白基因Gt1启动子 及其信号肽序列。利用HindIII和XbaI直接对5.3kb Gt1启动子及其信号肽序列的PCR产物进 行双酶切后，与pCAMBIA1300(简称p1300，中科院上海植物生理与生态研究所王宗阳研究 员提供)质粒HindIII和XbaI双酶切后回收的大片段进行连接形成中间载体p1300-5.3k Gt1， 转化感受态大肠杆菌。利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测p1300-5.3k Gt1载体。
根据Genbank AF319776公布的大豆球蛋白Gy7基因序列设计特异PCR引物。上游引物 一端引入XbaI位点，在下游引物一端引入XhoI位点。利用常规PCR从南农87-C38(Glycine max)总DNA中扩增约2.2kb大豆球蛋白Gy7基因序列信号肽以后的部分，将PCR产物与T 载体连接获得T-1载体，并转化感受态大肠杆菌。同样利用分子生物学酶切、PCR等常规方 法检测T-1载体。
再根据Genbank AF319777公布的大豆球蛋白Gy7 mRNA序列设计特异PCR引物。同样 由于后续构建植物表达载体的需要，在上游引物一端引入XbaI位点，在下游引物一端引入 XhoI位点。利用RT-PCR技术从南农87-C38(Glycine max)种子总RNA中反转录获得约1.6kb 大豆球蛋白Gy7基因序列信号肽以后的cDNA序列，将PCR产物与T载体连接获得T-2载体， 也转化感受态大肠杆菌。同样利用分子生物学酶切、PCR等常规方法检测T-2载体。
从大肠杆菌中提取T-1和T-2载体，利用XbaI和XhoI两种限制性内切酶消化T-1、T-2 载体和p1300-5.3k Gt1载体，电泳回收T-1、T-2载体的小片段以及p1300-5.3k Gt1载体的 最大片段，利用T4连接酶分别将两个小片段与大片段连接，构建成p1300-Gt1-Gy7(a)和 p1300-Gt1-Gy7cDNA(b)载体(图1)。
实施例2
本实施例是为了说明如何利用实施例1构建的表达载体转化水稻。
利用如上两种表达载体分别与含有抗性选择标记基因和报告基因的pCAMBIA1301载体 对目前常规水稻稻米蛋白质含量介于7％-9％的水稻品种进行共转化，在培育转基因水稻中涉 及的根癌农杆菌培养及抗性愈伤组织筛选及植株再生主要参照刘巧泉的方法进行(刘巧泉等， 植物生理学报，1998，24(3)：259-271)，水稻的遗传转化主要参照李建粤等人的方法进行(李建 粤等，科学通报，2004，49(24)：2556-2561)，即能够获得无抗性选择标记基因和报告基因， 而稻米蛋白质含量和质量能够提高的转基因后代。
本实施例利用表达量比GluB-1更高的Gt1启动子引导目的基因转化水稻，后代稻米蛋白 质含量将比未转化的对照提高2个百分点以上或比对照增加25％；利用Gy7基因在各种重要 氨基酸组成方面明显好于Gy3基因，本发明构建的表达载体转化水稻，即便在相同表达水平 的前提下，除苯丙氨酸没能超过Gy3基因外，其他必需氨基酸、半必需氨基酸及含硫氨基酸 (Met+Cys)都超过Gy3基因，在赖氨酸含量上可比前人利用Gy3基因的基础上提高 (6.99-4.35)/4.35＝60.7％；而且转基因植株不含抗性基因。
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