新的药物和治疗方法的发展取决于生物学靶标的鉴定。一旦得到 鉴定，就能够使用靶受体，酶或蛋白质来鉴定最终导致开发新的药物 的新的配体。一种监测化学体系或生物体系中分子相互作用的方法涉 及闪烁剂的使用。
闪烁剂是磷光质(phosphor)分子或包括磷光质的分子。磷光质 是在受到各种不同的物质(例如光子，电子或化学反应)激发之后能 够发光的化学结构。磷光质与致电离粒子例如β粒子，俄歇电子或光 子的相互作用导致磷光质的激发。短期延迟之后(通常10-10至10-4 秒的范围)磷光质回到其基态(未激发)，伴随电磁能光子释放，通 常是可见光形式或者其它可检测辐射形式。在合适的闪烁计数器中能 够检测和定量测定闪烁剂的松弛作用产生的发光。
为了本发明的目的，术语闪烁体分子(scintillant molecule) 或闪烁剂被用来定义是磷光质或包括磷光质的分子，并且闪烁现象被 用来定义这样的闪烁体分子产生的电磁辐射(通常是光的形式)。
如上面讨论的，作为磷光质和致电离粒子之间的相互作用的结果 发生闪烁现象。电离辐射源例如放射性化合物产生致电离粒子。为了 激发闪烁剂并且使闪烁现象发生，致电离粒子一定要直接或间接地通 过溶剂分子与闪烁剂相互作用。放射性化合物的一个例子是通常用来 放射性标记化合物的氚物质。氚发射具有非常短的光程长度的电离射 线，例如氚在水中的平均光程长度是1.5微米。如果氚化分子和闪烁 剂分子之间的距离小于1.5微米，则发生闪烁现象。该距离显著大于 1.5微米时，在水中闪烁剂分子和放射性标记的化合物之间不发生明 显的闪烁现象。
因为闪烁剂发射的光的量与致电离粒子源接近程度成比例，闪烁 现象测量可以被用来定量测定两种物质的接近程度和可能的结合的程 度。
先前闪烁体分子的应用涉及固体载体的使用，例如掺入闪烁剂的 聚合物树脂或小球。闪烁接近测试(SPA)涉及用荧光分子浸渗过的 小球，例如Sepharose小球。小球通过非特异性非共价相互作用或共 价键包被有生物受体分子。然后使这些小球与放射性标记的配体温 育。选择在水中具有短波长的放射性标记。如果受体结合配体，则明 显比例的放射性非常接近浸渗的荧光分子，它们被激活并且发射光。
与该方法相关的一个问题是只能在含水体系中使用小球，因为有 机溶剂的使用溶解荧光分子，把它们从小球上去除。该问题是 WO00/20475要解决的，在该专利文献中闪烁剂分子通过聚合作用被 直接掺入固体载体。
另一个问题与闪烁接近测试有关。为了将靶分子，例如受体，蛋 白质或酶与固体载体连接，最初必须分离靶物然后将其纯化。作为这 种分离过程的结果，一些靶分子丧失了活性。表现出强疏水性特征的 蛋白质例如内部或外部膜结合的蛋白质(酶，受体或通道)难以纯 化，并且当将它们从疏水性膜脱离时丧失活性。另外，当暴露于SPA 必需的水性条件时，这样的蛋白质会变性。对于多个亚基复合体，蛋 白质的分离可能会导致一个或多个亚基丢失，从而使蛋白质失活。
另外，为了使蛋白质与固体载体连接，必需形成蛋白质与固体载体 的连接(attachment)。这种连接可以是共价键，离子键或氢键形 式。另外这种连接可以通过极性，非极性，疏水性或亲水性相互作用 形成。在某些情况下，这种连接的形成可能改变或封闭特定配体的结 合位点。
闪烁体分子的另一个应用是闪烁平板技术(如WO94/26413中讨论 的)，其中制备由闪烁体分子和塑料的混合物组成的平板并且用包被 密封。在平板上培养细胞并且与放射性配体温育。
闪烁接近测试和闪烁平板技术的一个主要的缺点是需要使用125碘 作为一些应用中的电离辐射源。125碘主要是γ和X-射线发射体，其应 用要求严格的安全性措施。

本发明涉及含有磷光质头部和亲脂性或两亲性尾部的闪烁剂分子 和它们的制备方法。另外，本发明涉及掺入一个或多个闪烁剂分子的 脂质体，其中闪烁剂分子插入到脂质体的脂双层中，或者掺入一个或 多个闪烁剂分子的微胶粒，其中闪烁剂分子插入到微胶粒的单层中。 此外，本发明涉及将闪烁剂分子插入脂质体或微胶粒中的方法。另外， 本发明涉及掺有插入到细胞的细胞膜中的一个或多个闪烁剂分子的细 胞，和将这样的闪烁剂分子插入到细胞中的方法。本发明进一步涉及 所述闪烁剂分子在测试系统中的用途。一个这样的用途是在它们的细 胞环境中鉴定靶分子而不需要纯化或分离靶标，由此开发新的药物和 治疗方法。这些测试使得为靶产生配体，这些配体先前由于它们的不 稳定性或高度疏水性而不能被检测。
本发明的第一方面提供了包括共价连接于一个或多个R1部分的一 个或多个X部分的闪烁剂分子，X是磷光质，R1是亲脂性或两亲性基 团，其中所述闪烁剂分子能够整合到细胞，细胞膜，生物膜，人造膜或 递送载体中，并且当被整合时，能作为磷光质起作用。
在本发明上下文中，术语″膜″包括细胞膜，合成的或人造膜制剂， 包括脂质体，微胶粒等。用于本发明目的的递送载体是允许本发明的 闪烁剂分子插入到膜中的任何试剂或载体(例如脂质体或微胶粒)。
X和R1部分的数目取决于要求的闪烁剂分子的大小，并且可以使 得闪烁剂分子是X和R1基团的寡聚物。也可以使用不同的X和R1部 分的混合物。寡聚物可以由等数目的X和R1基团组成。或者，可以使 用不同数目的X和R1部分。本领域技术人员明白闪烁剂分子的大小 受到下面要求的限制，即闪烁剂分子能够被掺入到细胞膜中并且细胞 容得闪烁剂分子的存在。
在优选的实施方案中，闪烁剂分子具有式(I)：
         (X)m-(R1)n                     (I)
或者它的盐，其中m是1-20并且n是1-20，优选m和n独立 地是1-10，更优选m和n独立地是1-4，最优选m和n两者都是 1。
为了本发明的目的，所述亲脂部分是化学基团，其表现出亲脂(或 疏水)性质。
亲脂性代表一种分子或一个部分对亲脂性环境的亲和性。一般通 过分子在双相体系，或者液-液(在1-辛醇/水中的分配系数)或 固-液(在反相高效液相色谱(RP-HPLC)或薄层色谱(TLC)系统中的滞 留)中的分配行为来测定亲脂性。
对于本发明的目的，两亲性部分是表现出亲脂和憎脂两种性质的 化学结构。因此所述结构通常包含在水或有机溶剂中以不连续方式 (discrete fashion)表现的不同的区。
可以理解，R1基团可以包含用于基团X连接的一个或多个位点。
优选地R1是没有支化的或支化的烷基，烷氧基，链烯基，链烯 基氧基，炔基，炔基氧基，芳基，杂芳基，酰胺，胺，烷基芳基，烷氧 基芳基，还原的芳基烷基(reduced arylalkyl)，还原的烷氧基芳基， 链烯基芳基，链烯基氧基芳基，烷基杂芳基，烷氧基杂芳基，链烯基杂 芳基，链烯基氧基杂芳基，还原的烷基杂芳基，还原的烷氧基杂芳基 或者任何上述基团的被独立地选自下述基团的一个或多个基团取代的 衍生物：卤素，烷基，烷氧基芳基烷基，芳基烷氧基，氰基，硝基， -OC(O)R2，-CO2R2，-NR3R4，-OR2，-SR2，-C(O)NR3R4，-或脂质(天然的 或合成的)，其中R2选自H，烷基，芳基或对于R1所定义的基团的基 团，并且其中R3和R4独立地选自H，烷基，芳基或对于R1所定义的 基团的基团。
在优选的实施方案中，R1是没有支化的或支化的烷基，烷氧基， 链烯基，链烯基氧基或烷基芳基或者上述任何基团的取代的衍生物， 取代有一个或多个独立地选自-CO2R2，-OR2或-OC(O)R2的基团，其中 R2选自H，烷基或芳基。
R1基团应该带来足够的亲脂性使得闪烁剂分子掺入细胞的细胞膜 或者与细胞膜缔合。要明白在闪烁剂分子由一个X基团和一个R1组 成的情况下，如果R1是甲基或乙基，则这些基团不可能给闪烁剂分子 带来足够的亲脂性。但是，如果闪烁剂基团含有一个X基团和多个R1 基团(即多于一个R1基团)，其中R1是甲基或乙基，则多个甲基或乙 基的存在会足以使得闪烁剂分子掺入细胞膜或者与细胞膜缔合。
优选地，烷基具有1-30个碳原子，更优选6-30个碳原子，最 优选8-20个碳原子。烷氧基是具有1-30个碳原子，更优选1-20 个碳原子，最优选1-10个碳原子，任选地插入有一个或多个氧原子 的烃链。在优选的实施方案中，至少一个碳原子(优选饱和的)将烷 氧基部分中的氧原子与磷光质基团X分开。链烯基是含有一个或多个 双键的烃链，其中链烯基具有2-30个碳原子，优选8-30个碳原 子。炔基是含有一个或多个三键的烃链，其中炔基具有2-30个碳原 子，优选8-30个碳原子。芳基是芳香环，例如苯基，或者六元芳香 环或者稠合的环系，例如萘基，蒽基。杂芳基是含有一个或多个选自 O，S或N的杂原子的五元或六元芳香环，或者包含其中一个或多个 稠合环含有杂原子的两个或多个稠合环的稠合环系。这样的基团的例 子包括吡啶基，嘧啶基，哒嗪基，吡嗪基，噻吩基，噁唑基，吡唑基， 喹啉基，喹唑啉基和吲哚基。
为了本发明的目的，脂质是有机分子，其可以通过用非极性有机 溶剂萃取而从细胞和组织中分离，或者这样一种分子的合成的等价物 或衍生物。
为本发明目的的基团X包括在多种不同的物质例如光子，电子或 化学反应，优选电离辐射源激发之后能发光的任何化学基团。
为本发明目的的基团X的例子包括苯并三唑和它们的衍生物，香 豆素和它们的衍生物，芳香烃，例如对三联苯，对四联苯和它们的衍 生物，噁唑和1，3，4-噁二唑的衍生物，例如2，4-(联苯基-6-苯基苯 并噁唑，2，5-双-(5’-叔丁基苯并噁唑基-[2’]噻吩，2-(4-叔丁基苯 基)-5-(4-联苯基)-1，3，4-噁二唑，2-(1-萘基)-5-苯基-噁唑，2-苯 基-5-(4-联苯基)-1，3，4-噁二唑，1，4-双[5-苯基-2-噁唑基]-苯， 和2，5-二苯基噁唑。基团X的其他例子包括1，4-双(5-苯基-2-噁唑 基)苯，9，10-二苯基蒽，1，6-二苯基-1，3，4-己三烯，反式-p，p’-二 苯基茋，1，14，4-四苯基-1，3-丁二烯，3-羟基黄酮，和1，4-双(2-甲 基苯乙烯基)苯。
要明白头部基团可以含有用于连接亲脂性R1基团的一个或多个位 点。
在本发明第一方面的另一个优选的实施方案中，闪烁剂分子包含 一个头部基团(即m＝1)。头部基团可以含有用于连接亲脂性R1基团 的一个或多个位点。因此，导致下式的化合物
X-(R1)n                      (II(a))
其中n是等于或大于2的整数。
在另一个优选的实施方案中，闪烁剂分子包含一个亲脂性R1基团 (即n＝1)。该亲脂性R1基团可以含有用于连接头部基团X的两个或 多个位点，产生下式的化合物：
(X)m-R1                      (II(b))
其中m是等于或大于2的整数。
在本发明最优选的实施方案中，提供了下式的闪烁剂分子
X-R1                          (III)
其中一个X基团与一个亲脂性基团R1连接(即m和n＝1)。
本发明第一方面的闪烁剂分子可以包括一个或多个通过连接体部 分与一个或多个R1基团连接的X基团，产生式(V)的闪烁剂分子；
(X)m-(连接体)-(R1)n         (V)
对于本发明目的，所述连接体部分可以是烷氧基，氨基烷基，芳 基氧基，芳基氨基，烷基酸(alkylacid)，羰基酰氨基(carbonyl amidyl)，酯，胺，甲硅烷基，亚氨基(imidyl)，脲，烷硫基，芳基 硫基。
连接体可以为连接一个或多个X基团和一个或多个R1基团提供 多个位点。这样的连接体的例子包括氨基酸，例如赖氨酸，谷氨 酸，天冬氨酸，多元醇，例如丙三醇，多元硫醇，多元酸或多元胺。
适当地，闪烁剂分子由通过连接体与两个或多个R1基团连接的一 个X基团构成。或者，闪烁剂分子由通过连接体与两个或多个头部基 团连接的一个亲脂性R1基团构成。优选地，该分子由通过合适的连 接体基团连接的一个R1基团和一个X基团构成。
在本发明优选的实施方案中，磷光质头部基团是2，5-二苯基噁唑 (PPO)或2，5-二苯基噁唑的衍生物。更优选地，2，5-二苯基噁唑在4- 碳处衍生有连接体基团或者直接是亲脂性尾部基团。
式(I)至(VI)的化合物的盐的例子包括从例如甲磺酸，苯磺酸和 对甲苯磺酸的有机酸或例如盐酸和硫酸等等的无机酸衍生的那些，分 别得到甲磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐，盐酸盐和硫酸盐等，或 者从碱(例如有机碱和无机碱)衍生的那些。用于生成本发明化合物 的盐的合适的无机碱的例子包括铵，锂，钠，钙，钾，铝，铁，镁， 锌等的氢氧化物，碳酸盐和碳酸氢盐。盐也可以用合适的有机碱生 成。适合与本发明的化合物生成碱加成盐的这样的碱包括没有毒性并 且足够强以生成盐的有机碱。这样的有机碱是本领域公知的，并且可 以包括氨基酸，例如精氨酸和赖氨酸，一-，二-，或三羟基烷基胺， 例如一-，二-，和三乙醇胺，胆碱，一-，二-，或三烷基胺，例如 甲胺，二甲胺，和三甲胺，胍；N-甲基葡糖胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙 二胺；N-苄基苯乙基胺；三(羟甲基)氨基甲烷等。
可以利用本领域公知的方法以常规方式制备盐。通过将根据本发 明的第一或第二方面的游离碱化合物溶解于含有需要的酸的合适的溶 剂中可以制备所述碱性化合物的酸加成盐。在式(I)的化合物含有酸 性官能团的情况下，通过使所述化合物与合适的碱反应可以制备所述 化合物的碱加成盐。可以直接分离酸或碱加成盐(acid or base salt)，或者通过例如蒸发溶液可以获得酸或碱加成盐。
本发明的优选的化合物的例子包括：
本发明的第二方面提供根据本发明的第一方面的化合物或衍生物 的制备方法。
一般情况下，通过使一个或多个基团X与一个或多个基团R1偶联 提供本发明的化合物。应用本领域技术人员公知的常规偶联技术能够 进行这样的偶联。使用的具体偶联反应取决于X和R1基团上存在的官 能度和要生成的键。
更优选地，根据下面的方法制备本发明第一方面的优选的化合 物：
在碱的存在下用卤代烷基将2，5-二苯基噁唑的4-醇衍生物烷基 化。要明白卤代烷基可能含有在烷基化步骤之前需要保护的另外的官 能团。如果需要保护，则可以通过任何常规保护试剂来实现。烷基化 步骤之后，利用常规去保护技术可以去除保护基团，或者一个或多个 保护基团可以保留在闪烁剂化合物上。
或者
在碱的存在下用醇将2，5-二苯基噁唑的4-卤素衍生物烷基化。 一样，该醇可能含有在烷基化步骤之前需要保护的另外的官能团。使 用常规保护试剂可以实现这样的保护作用。利用常规去保护技术可以 去除保护基团，然而一个或多个保护基团可以保留在闪烁剂化合物 上。
或者
本发明的一种闪烁剂分子转化为本发明不同的闪烁剂分子。实现 此目的的方法的例子包括：
去除保护基团
加上保护基团
氧化作用(例如醇氧化为醛或酮，或者醛氧化为酸基)
酸或醇的酯化
酸或胺的酰胺化
还原作用(例如烯烃还原为烷烃，或者醛还原为醇)
特定化合物的盐的制备
其它官能团的相互转化(例如醇的溴化)
利用技术人员公知的技术能够在4-位实现2，5-二苯基噁唑基团 的官能化作用。优选地，首先将2，5-二苯基噁唑转化为2，5-二苯基- 4-噁唑羧酸乙酯(Tanaka等Chem Abs.(1963)，58，3407f))，然后 使用硼氢化钠的乙醇溶液还原(Clapham等Tetrahedron Lett.， (1997)，52，9061)。使用本领域公知的试剂能够实现醇向卤化物的相 互转化。
本发明第一方面的所有的优选特征适用于本发明的第二方面。
本发明的第三方面提供掺入了本发明的闪烁剂分子的脂质体。
对于本发明的这个目的，脂质体是由脂质分子双层构成的球形结 构。建议闪烁剂分子通过其脂质尾被插入到脂双层中。构成脂质体的 脂质分子可以是任何天然存在的或合成的脂质。更优选地，这些脂质 分子由带正电荷的头部基团和脂质尾构成。优选地，脂质体包含自磷 脂酰胆碱(PC)，二油酰基三甲基铵丙烷 (dioleoyltrimethylammonium propane，DOTAP)，二油酰基磷脂酰乙 醇胺(DOPE)或二油酰基氧基丙基-三甲基胺氯化铵 (dioleoyloxypropyl-trimethylamine ammonium chloride，DOTMA) 的一种或几种中选择的脂质。
有很多种适合形成脂质体和适合将本发明的闪烁剂分子送递到细 胞膜中的其它脂质，这些包括具有单链烃，双链烃或者胆甾醇作为疏 水性锚定物的阳离子脂质。该主题的综述可以参见Chesnoy S.和 Huang L.用于基因送递的脂质-DNA复合体的结构和功能 (Structure and function of lipid-DNA complexes for gene delivery)，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29.27-47； 2000。
在本发明的优选特征中，提供作为送递系统的脂质体-闪烁剂偶 联物(conjugate)，该送递系统允许闪烁剂分子插入到细胞的细胞 膜中。
或者，本发明的第三方面提供掺入了本发明的闪烁剂分子的微胶 粒。
本发明第一和第二方面所有的优选特征也适用于这第三方面。
本发明的第四方面提供将闪烁剂分子插入到脂质体中的方法。在 该方法的一个实例中，脂质和闪烁剂分子一起在有机溶剂中温育，然 后去除有机溶剂，得到的混合物重新悬浮于水中形成脂质体。然后将 重新悬浮的脂质体-闪烁剂分子复合体冻干并且提供为冻干的粉末。 或者，提供水性介质(例如，水或含水缓冲液或去污剂溶液)中悬浮液 形式的脂质体-闪烁剂分子复合体。
在另一种替代方法中，为了形成脂质体，需要将脂质体悬浮液温 热。优选地，将脂质体悬浮液温热至80℃和30℃之间的温度，更优选 70℃和50℃之间，最优选60℃或高于60℃。
以闪烁剂分子与脂质的比例在1∶1和10∶1之间，更优选闪烁 剂分子与脂质的比例是2∶1至8∶1，更优选闪烁剂分子与脂质的 比例是4∶1的比例温育脂质和闪烁剂分子。
在另一种替代方法中，闪烁剂分子与预先形成的脂质体温育。
要明白脂质体的生成是本领域公知的。
因此，技术人员能够制备掺入闪烁剂分子的不同大小和组成等的 脂质体。
作为脂质体的替代，研究了在将闪烁剂分子送递给细胞膜中的微 胶粒的用途。微胶粒(micelles)是亲脂性分子例如表面活性剂的聚 集体，并且在药物送递中被广泛使用。在本发明的一个实施方案中， 使用以0.1％，0.5％或1.0％，优选0.1％溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中 的表面活性剂溴化十二烷基三甲基铵(DTAB)形成微胶粒。在另一个实 施方案中，将0.1mg至25mg的闪烁剂分子，优选0.5mg至15mg 的闪烁剂分子，更优选10mg或多于10mg的闪烁剂分子分散到10毫 升的1％DTAB溶液中。
因此，本发明的第四方面还提供了将闪烁剂分子插入微胶粒中的 方法。
本发明第一，第二和第三方面所有的优选特征也适用于这第四方 面。
本发明的第五方面提供其中闪烁剂分子被插入到细胞的细胞膜中 而不影响正常的细胞功能的掺入了闪烁剂分子的细胞。优选地，细胞 含有插入到膜中的闪烁剂分子和感兴趣的膜结合的蛋白质或受体。
细胞可以是一种或多种原核细胞(例如细菌)或者真核(例如真菌， 哺乳动物，爬行动物，昆虫，鱼)细胞。优选的细胞是哺乳动物细胞。
本发明第五方面的细胞可以来自表达感兴趣的蛋白质的任何细胞 系。蛋白质可以是天然的或导入细胞中的并且可以是组成型的(即所 有时间都表达)或者诱导型的(响应某些刺激而产生)。蛋白质可以是 膜结合的(整合膜蛋白或膜外蛋白)或者可以定位在细胞溶胶中。或者， 可以对细胞溶胶蛋白质进行工程处理使得其在细胞内或外表面上表 达。可以修饰细胞使得细胞表达的蛋白质的水平高于其正常水平。
细胞可以是生殖系细胞或干细胞。另外，可以作为细胞混合群提 供细胞(即多于一种类型以上的细胞或者来自一个来源以上的细胞)。
可以在很多种以细胞为基础的测试中使用载有闪烁剂分子的细 胞，其中利用放射性标记的分子监测生物学活性或药物活性。可以使 用掺入这些闪烁剂分子的测试系统研究实时细胞过程。可以使用这些 闪烁剂分子的测试系统包括(i)掺入测试(ii)转运测试，(iii)结合 测试和(iv)信号转导研究。
(i)应用掺入测试来监测细胞内生物化学过程，例如蛋白质合成 (14C/3H/35S-甲硫氨酸掺入)，细胞增殖和DNA修复/损伤(14C/3H-胸苷吸 收/掺入)和脂质新陈代谢(掺入14C/3H标记的前体)。
(ii)可以应用膜转运测试，测定多种放射性标记 (3H/14C/35S/45Ca/125I)底物转运进(流入)或出(流出)细胞的转运 来监测通道和载体的活性。除了膜转运蛋白的动力学研究之外，也可 以进行抑制剂/激活剂研究来鉴定可能是有潜力的治疗药物的转运抑 制剂。
(iii)包括受体结合测试的结合测试需要放射性标记 (3H/14C/35S/45Ca/125I)配体的结合，从中可以计算受体数目和亲合力。 也可利用竞争研究来评价靶受体的潜在的抑制剂/激活剂。覆盖包括 嘌呤能的(purinergic)，肾上腺素能的和烟碱性受体等在内的所有 类型的受体的宽范围配体在商业上是可获得的。
(iv)使用放射性标记的第二信使和底物也可以研究信号转导活 性。使用35S-GTPγ-S能监测G-蛋白活性。[33P]-ATP结合可以被用来 监测蛋白质-磷酸化作用。在信号转导中钙起着主要的作用，并且 45Ca可以被用来测定钙吸收。放射性标记的IP3，IP4和cAMP也是 商业上可获得的并且可以用来研究信号转导。
一般情况下，对放射性同位素的测定需要细胞破碎或细胞膜的分 离；实时测定也是不可能的。使用掺入到细胞膜中的本发明第一方面 的闪烁剂分子，能够克服这些问题。
本发明第五方面另一个实施方案提供了掺入了一种或多种本发明 第一方面的闪烁剂分子和一种或多种感兴趣的蛋白质或受体的脂质体 或微胶粒。对于本发明的目的，蛋白质或受体是纯化的，部分纯化的 或重组的。如上文讨论的，蛋白质可以是细胞溶胶的(例如蛋白质激酶) 或膜结合的(例如七跨膜受体或离子通道)。如上文讨论的，可以在结 合测试中使用这样的脂质体或微胶粒。
本发明第一，第二，第三和第四方面所有的优选特征也适用于这 第五方面。
本发明的第六方面提供将本发明第一方面的闪烁剂分子插入到细 胞中的方法。在一个方法中，首先将闪烁剂分子插入到脂质体或微胶 粒中。闪烁剂分子-微胶粒或者闪烁剂分子-脂质体与细胞优选在20- 40℃下，优选37℃下温育30-120分钟。在另一种方法中，闪烁剂 分子直接与细胞温育。
本发明第一，第二，第三，第四和第五方面所有的优选特征也适 用于这第六方面。
本发明第七方面提供包括脂质体或微胶粒和本发明的闪烁剂分子 的试剂盒。在另一个实施方案中，所述试剂盒包括用于形成脂质体或 微胶粒的一种或多种试剂，例如去污剂分子或脂质和本发明的闪烁剂 分子。
本发明第一，第二，第三，第四，第五和第六方面所有的优选特 征也适用于这第七方面。
本发明第八方面提供包括细胞，一种或多种本发明的闪烁剂分子 和感兴趣的蛋白质或受体的测试系统。
在本发明的一个实施方案中，闪烁剂分子被插入到含有特定受体 的细胞膜中。放射性标记的药物分子与受体结合，并且作为它们与膜 上锚定的闪烁剂分子相互作用的结果触发闪烁现象。然后利用该项技 术通过它们置换放射性标记配体的能力来鉴定结合受体的新的药物 (竞争分子)。当放射性标记配体被置换并且没有观察到闪烁现象时就 鉴定了新药物。
在另一个实施方案中，与反义分子结合使用闪烁剂分子来确定一 种特定分子是否结合给定的细胞蛋白质。反义分子阻止给定蛋白质的 表达。因此，当应用放射性标记分子之后没有发生闪烁现象时，就鉴 定了针对该药物的真实靶标。
本发明第八方面的一个实施方案是应用闪烁剂分子来测定细胞是 否吸收一种特定的物质。这些应用中，包括测定掺入到细胞中的放射 性标记的甲硫氨酸来监测蛋白质合成，和测定放射性标记的胸苷的吸 收和掺入来监测细胞增殖。另外，可以利用放射性标记底物的流入和 流出来评价膜转运系统例如通道的活性和潜在的治疗药物对这些途经 的抑制作用。
进一步的吸收实验表明当电离放射源是标记有14碳，45钙，35硫和 33磷的化合物时，可以成功使用闪烁剂分子。因此，这项闪烁测试有优 于先前讨论的闪烁接近测试的优点，因为其允许使用除125碘之外的 放射性同位素。
本发明第一，第二，第三，第四，第五，第六和第七方面所有的 优选特征也适用于这第八方面。
本发明第九方面提供含有一种或多种本发明的闪烁剂分子的组合 物。该组合物可以含有一种或多种本发明第一方面的闪烁剂分子和另 外的成分，包括稳定剂，去污剂和/或染料。可以提供液体，溶液， 固体，粉末，冻干粉末，一种或多种颗粒或小丸形式的组合物。
在本发明第九方面的其它特征中，组合物可以含有具有互补或协 同性质的两种或多种闪烁剂分子。
例如，各个闪烁剂分子可以用不同的放射性同位素发出闪烁，使 得实现更大的灵敏度。
本发明第一，第二，第三，第四，第五，第六，第七和第八方面 所有的优选特征也适用于这第九方面。
本发明第十方面提供含有用于插入到特定细胞系中的闪烁剂分子 和放射性标记配体的试剂盒。在另一个实施方案中，提供插入到脂质 体或微胶粒运送载体中的闪烁剂分子。
本发明第一，第二，第三，第四，第五，第六，第七，第八和第 九方面所有的优选方面也适用于这第十方面。
本发明第十一方面提供本发明第一方面的闪烁剂分子在测试系统 中的应用。优选地，该测试系统涉及使用一种或多种原核细胞或真核 细胞。更优选地，细胞是哺乳动物细胞。
在本发明优选的实施方案中，闪烁剂分子被插入到细胞的细胞膜 中。直接或者通过运送载体例如脂质体或微胶粒实现闪烁剂分子的插 入。
优选地，与放射性标记部分结合使用闪烁剂分子，其中放射性标 记部分用14C，3H，35S，33P，45Ca，125I放射性标记。
可以应用本发明第十一方面描述的测试系统来鉴定细胞中的细胞 靶标。
本发明第一，第二，第三，第四，第五，第六，第七，第八，第 九和第十方面所有的优选方面也适用于这第十一方面。
现在通过参考下面的非限制性实施例举例说明本发明。
通过下面概述的附图进一步举例说明包括的这些实施例。
附图的简要说明
图1是包含插入的闪烁剂分子和感兴趣的运输通道的图示说明。 放射性标记底物通过该通道，将底物带至闪烁剂分子近处并且产生闪 烁现象。与运输抑制剂温育会防止放射性底物通过该通道运输，从而 防止闪烁现象。
图2是与商售的闪烁体″Microscint″相比较的闪烁剂分子ST1- ST11闪烁现象程度的比较。
图3说明向0.5ml脂质体溶液加入0.1微Ci 14C-牛磺酸时闪烁 剂分子-脂质体制剂的闪烁体活性。
图4说明闪烁剂分子与脂质体(DOTAP)比例增加对脂质体形成的 影响。
图5说明当牛磺酸的活性从0.1微Ci增加至1.0微Ci时观察 到的含有闪烁剂分子的脂质体的线性响应。
图6说明与阳离子脂质体(a)和0.1％微胶粒制剂(b)温育之后荧 光探针N-678进入HeLa细胞的吸收。
图7说明HeLa细胞吸收30和120分钟之后闪烁剂分子ST4， ST5和ST6的吸收。
图8说明含有插入的闪烁剂分子的HeLa细胞对14C-甲硫氨酸的 吸收。插图说明使用商业上购得的闪烁混合物(scintillation cocktail)测定的HeLa细胞中甲硫氨酸吸收。
图9说明含有插入的ST4闪烁剂分子的大鼠C6神经胶质瘤对 14C-甲硫氨酸的吸收。插图说明使用商业上购得的闪烁混合物测定的 C6神经胶质瘤细胞中甲硫氨酸吸收。
图10说明HeLa细胞对35S-甲硫氨酸的吸收。插图说明使用商业 上购得的闪烁混合物测定的HeLa细胞中甲硫氨酸吸收。
图11说明ST4的结果，最初没有吸收14C-甲硫氨酸，但是大约72 小时之后开始发生14C-甲硫氨酸蓄积。预先与ST4/DOTAP或 ST4/DOTAP/DOPE温育的细胞之间没有显著差异。
图12说明化合物ST4的结果，插图说明使用商业上购得的闪烁 混合物测定的HeLa细胞中胸苷吸收。
图13说明对HTC细胞进行的糖皮质激素受体结合测试的结果。
图14说明对HTC细胞进行的证明3H-地塞米松置换的实验结果。
图15说明对与闪烁体脂质(scintilipid)温育过的C6神经胶 质瘤细胞进行的β-肾上腺素能受体结合测试的结果。
图16说明使用3H-乌本苷作为放射性配体对培养的HeLa细胞进 行的Na+/K+ ATP酶结合测试的结果。
实施例
实施例1：闪烁剂分子与商售闪烁体的比较
应用以Clapham，等(1997)Tetrahedron Lett.38，52描述的 方法为基础的方法，将合成的闪烁剂分子的闪烁体活性与商售闪烁体 Microscint 20(Packard)相比较。在甲苯中制备闪烁体脂质 (scintilipid)的系列稀释液，得到10mM，1mM，0.1mM和 0.01mM的最终浓度。也制备每100微升甲苯中含有0.1微Ci的 14C-十六烷原液，并且以96孔平板形式对每个孔100微升闪烁体脂质 (scintilipid)加入100微升放射性标记(radiolabel)，混合并 且计数。为了比较，向100微升Microscint 20加入100微升放射性 标记。图2说明了结果。
对于10mM的每一种闪烁体脂质，计算出相对于Microscint 20 的闪烁现象百分比效率并且制表(表1)。
表1. 闪烁体  脂质  ST1  ST2  ST3  ST4  ST5  ST6  ST7  ST8  ST9  ST10  ST11 百分比  效率   34   33   30   15   13   10   8   12   9   0.6   65
发明人进行的另外的实验发现商售闪烁体3-羟基黄酮，POPOP (1，4-双[5-苯基-2-噁唑基]-苯)或丁基-PBD(2-(4-叔丁基苯基)- 5-(4-联苯基)-1，3，4-噁二唑)中没有一个能插入到脂质体中。
实施例2：闪烁剂分子掺入到脂质体中
将脂质(a)磷脂酰胆碱，b)二油酰基三甲基铵丙烷和c)二油酰基 三甲基铵丙烷/二油酰基磷脂酰乙醇胺)和所研究的闪烁体脂质一起 (1∶1；脂质∶闪烁体脂质)溶解于氯仿/甲醇中，并且在氮气流下蒸 发至干。为了保证完全脱水，最后将脂质真空干燥至少2小时。然后 悬浮于水中形成脂质体，得到10mg/ml的最终脂质含量。在某些 情况下需要将脂质体悬浮液加热至60℃。通过显微镜检查检查稳定 的脂质体结构，并且向脂质体制剂等份中加入14C-牛磺酸来检查闪烁 现象(图3)。
闪烁剂分子ST3至ST7和ST10表现出显著的闪烁体活性。在显 微镜下检查脂质体制剂得出掺入到脂质体膜中的闪烁体脂质的掺入作 用的量度。结果表明ST4，ST5和ST10形成更稳定的脂质体，并且 带有ST3，ST6和ST7的制剂得到闪烁体脂质的结晶沉积。因此，用 ST4，ST5和ST10进行检查闪烁体脂质吸收到细胞中的其它实验，并 且接着在以细胞为基础的测试中使用。
具有渐增闪烁体脂质含量的脂质体配方表明最佳脂质体制剂是每 毫升脂质体悬浮液有8mg闪烁体脂质比2mg DOTAP(图4)，并且对于 下面的实验使用该脂质体组成。
当14C-牛磺酸活性从0.1微Ci增加至1.0微Ci时观察到线性响 应(图5)。
实施例3：闪烁剂分子掺入到细胞膜中
使用两种方法将闪烁体脂质化合物掺入到细胞膜中。(A)含有 DOTAP的阳离子脂质体(如上所述)和(B)微胶粒。
微胶粒是亲脂性分子例如表面活性剂的聚集体，并且在药物送递 中被广泛使用。在该项研究中，我们使用了以0.1％，0.5％或1.0％溶 解于PBS中的表面活性剂DTAB(十二烷基三甲基铵溴化物)。初步的 工作表明多达10mg的闪烁体脂质可以分散到10ml的1％ DTAB溶 液中。
制备含有闪烁体脂质分子的放射性标记脂质体，并且研究可普遍 获得的上皮细胞系(HeLa)的吸收。放射性标记脂质体由重新悬浮于1 毫升水中的8mg闪烁体脂质，2mg DOTAP和0.5微Ci 14C-DOPE组 成。在与HeLa细胞温育之前在磷酸盐缓冲液(PBS)中将脂质体稀释 50％。在75cm2烧瓶中在DMEM中HeLa细胞生长至汇合，使细胞受 胰蛋白酶解并且接种到96孔板上，并且在37℃下在O2/CO2保温箱中 温育大约48小时。然后用PBS冲洗细胞，去除生长培养基(存在血清 会破坏脂质体吸收)并且在37℃下与放射性标记脂质体制剂(100微升 /孔)温育30或120分钟。温育之后，用PBS充分冲洗96孔板，去 除所有没有结合的脂质体，并且对平板计数β-闪烁(图7)。
闪烁计数表明HeLa细胞吸收了闪烁体脂质，并且也被吸收的14C- DOPE的接近产生闪烁现象。
实施例4：14C-甲硫氨酸吸收测试
在75cm2瓶中在DMEM中HeLa细胞生长至汇合，然后接种到96 孔板上，并且在37℃下温育过夜。在不同的时间点，用加有PBS中 的14C-甲硫氨酸的DMEM取代DMEM并且加入脂质体。脂质体成分是 在1毫升水中重新悬浮有8mg闪烁体脂质，2mg DOTAP，并且最后在 1ml PBS中稀释。在脂质体的存在下将细胞温育120，60和30分 钟。
图8说明对于ST4，ST5和ST10的结果。小插图表明使用商售 闪烁体混合物(Microscint 20)测得的HeLa细胞中甲硫氨酸吸收， 这可反映出携带ST4和ST5的细胞的结果。携带ST4细胞的闪烁体活 性大于携带ST5和ST10的细胞，这可从图4和图7中的结果预测 到。
对大鼠神经原细胞系(C6神经胶质瘤)重复甲硫氨酸吸收测试。C6 神经胶质瘤细胞在Hams F12培养基中生长，除此之外，实验方案是 相同的。图9给出了对于ST4的结果。
实施例5：35S-甲硫氨酸吸收
使用35S-甲硫氨酸重复HeLa对甲硫氨酸的吸收。获得的结果与 14C-甲硫氨酸吸收相吻合，并且如图10所示。
实施例6：“实时”14C-甲硫氨酸吸收测试
也以“实时”展示了14C-甲硫氨酸吸收。在75cm2瓶中在DMEM 中HeLa细胞生长至汇合，然后接种到96孔板上，并且在37℃下温 育过夜。HeLa细胞然后和含有闪烁体脂质的脂质体温育。脂质体组 成是在1毫升水中重新悬浮有8mg闪烁体脂质，2mg DOTAP，或者 8mg闪烁体脂质，1mg DOTAP，1mg DOPE，并且最后在1ml PBS中稀 释。37℃下在脂质体的存在下将细胞温育120分钟。然后加入含有 14C-甲硫氨酸的DMEM，并且测定随时间推移的吸收量。图11说明对 于ST4的结果，最初没有14C-甲硫氨酸吸收，但是大约72小时之后开 始发生14C-甲硫氨酸蓄积。用ST4/DOTAP或ST4/DOTAP/DOPE预先温 育的细胞之间没有显著差异。
实施例7：14C-胸苷吸收测试
在75cm2瓶中在补充DMEM中HeLa细胞生长至汇合，然后接种 到24孔板上，并且在37℃下温育过夜。然后用无血清DMEM置换培 养基，并且在37℃下温育24小时。然后用含有14C-胸苷(0.2微Ci/ 孔)的DMEM置换无血清DMEM，并且在37℃下温育达24小时。为了终 止吸收测试，用PBS冲洗细胞并且加入脂质体。脂质体组成是在1毫 升水中重新悬浮有8mg闪烁体脂质，2mg DOTAP，并且最后在1ml PBS中稀释。37℃下在脂质体的存在下将细胞温育120，60和30分 钟。图12说明对于ST4的结果，小插图表明使用商售闪烁体混合物 测得的HeLa细胞中胸苷吸收。
实施例8：放射性配体结合测试
应用闪烁体脂质技术进行三个放射性配体结合测试，3H-地塞米松 结合HTC细胞中的糖皮质激素受体，3H-二氢阿普洛尔结合C6神经胶 质瘤细胞中的β-肾上腺素能受体，和3H-乌本苷结合HeLa细胞中的 Na/K泵。
实验详细内容的大部分对于进行的所有三个测试来说是共同的。 每一种细胞系在75cm2瓶中生长至汇合，然后接种到96孔板或24 孔板上。HTC细胞在补充有基本氨基酸的极限基本培养基中培养，C6 神经胶质瘤细胞在Ham’s F12培养基中生长，HeLa细胞在DMEM中 生长。一旦细胞生长至汇合，就用PBS洗涤，并且在37℃下将细胞携 带闪烁体脂质2小时。闪烁体脂质组成是在1毫升水中重新悬浮有 8mg闪烁体脂质，2mg DOTAP，并且最后在1ml PBS中稀释。然后再 次用PBS洗涤细胞并且加入培养基，37℃下将细胞温育24-48小 时。
实施例9：糖皮质激素受体测试
对在96孔中生长的并且与闪烁体脂质温育的HTC细胞进行糖皮 质激素受体测试。细胞在HEPES缓冲盐水(HBS)(155mM NaCl，5 mM HEPES，pH7.4)中冲洗三次后与各种浓度的3H-地塞米松(5× 10-10M至1×10-8M)在37℃下温育30分钟。然后用冰冷却的HBS将 细胞冲洗三次后对平板计数，确定总结合。为了确定非特异性结合， 使用相同浓度的3H-地塞米松，但是加入20×10-6M’冷’地塞米松， 将特异性结合计算为总结合和非特异性结合之间的差异。图13给出 了结果。
也进行了证明3H-地塞米松置换的实验。在递增浓度的’冷’地塞 米松(5×10-10M-1×10-8M)的存在下，1×10-9M3H-地塞米松被 加给细胞，细胞在37℃下温育30分钟，然后洗涤并且计数，图14给 出了该项测试的结果。
实施例10：β-肾上腺素能受体测试
对在96孔板上生长并且与闪烁体脂质温育的C6神经胶质瘤细胞 进行β-肾上腺素能受体结合测试。细胞在MOPS缓冲盐水(MBS)(125 mM NaCl，25mM MOPS，pH8.2)中冲洗三次后与各种浓度的3H-二氢 阿普洛尔(1×10-8M至1×10-4M)在37℃下温育30分钟。然后 用冰冷却的MBS将细胞冲洗三次后对平板计数，确定总结合。为了 确定非特异性结合，使用相同浓度的3H-二氢阿普洛尔，但是加入10 ×10-3M“冷”阿普洛尔，将特异性结合计算为总结合和非特异性结 合之间的差异。图15给出了结果。
实施例11：Na+/K+ ATP酶结合测试
对在24孔板上生长的HeLa细胞进行Na+/K+ ATP酶结合测试，使 用3H-乌本苷作为放射性配体。细胞在HEPES缓冲盐水(HBS)(140 mM NaCl，5mM葡萄糖，0.5mM MgCl2，1.5mM CaCl2，10mM HEPES，pH7.4)中冲洗三次后与各种浓度的3H-乌本苷(5×10-8M 至1×10-5M)在37℃下温育40分钟。然后用冰冷却的MBS将细胞 冲洗三次后对平板计数，确定总结合量。为了确定非特异性结合，使 用相同浓度的3H-乌本苷，但是向温育培养基加入15mM KCl，将特 异性结合计算为总结合和非特异性结合之间的差异。图16给出了结 果。
实施例12：闪烁剂分子的制备
ST1 醇＝0.50g＝2mmol. 氢化钠(60％油溶液)＝0.160g(60％)＝0.096g＝4mmol＝2当量 DMF＝10cm3 溴代辛烷＝0.346cm3＝0.386g＝2mmol＝1当量
在50cm3圆底烧瓶中装入氢化钠和醇。加入DMF并且在室温下将 得到的灰/黑浆状物搅拌15分钟。然后缓慢加入溴代辛烷，并且将反 应混合物搅拌过夜。将混合物倒入水(40cm3)中并且用乙酸乙酯萃取 (2×50cm3)。合并的有机相用盐水洗涤(5×50cm3)，用无水硫酸镁干 燥，过滤并在减压下浓缩，得到粗产物醚，为黄色油状物(1.058g)。 通过急骤柱层析纯化(梯度洗脱：100cm3己烷之后200cm35％乙酸乙 酯的己烷溶液)得到纯醚，为无色油状物(0.5474g，83％)。将该油状 物的大部分装在样品试管中，几个小时之后，油状物固化，得到蜡状 白色固体(0.5528g，76％)。                   □max/cm-1(薄膜， NaCl平板)3060(m，C-H)，2925(s，C-H)，2854(s，C-H)； (CDCl3，300MHz) 0.85(3Ht J 6.9)，1.20-1.40(10H bs)，1.65(2H pentet J 7.5)，3.61(2Ht J 6.7)，4.65 (2Hs)，7.34-7.50(6Hm)，7.79(2H d J 7.3)，8.10(2H dd J 5.3，1.8)；□C(CDCl3，75 MHz，Pendant)14(CH3)，22.7(CH2)，26.3(CH2)，29.4(CH2)，29.5(CH2)，29.8(CH2)， 31.9(CH2)，65.5(CH2)，71.1(CH2)，126.9(CH)，127.1(CH)，129.2(CH)，129.4 (CH)，129.5(CH)，131.0(CH)，剩余的季碳信号太小不能解析； M/Z(APCI)364 M+H+(C24H29NO2 requires M+363)，234(100％). ST2 醇＝0.50g＝2mmol. 氢化钠(60％油溶液)＝0.160g(60％)＝0.096g＝4mmol＝2当量 DMF＝5cm3 溴代癸烷＝0.415cm3＝0.442g＝2mmol＝1当量
在50cm3圆底烧瓶中装入氢化钠和醇。加入DMF并且在室温下将 得到的灰/黑浆状物搅拌15分钟。然后缓慢加入溴代癸烷，并且将反 应混合物搅拌过夜。将混合物倒入水(40cm3)中并且用乙酸乙酯萃取 (2×50cm3)。合并的有机相用盐水洗涤(5×50cm3)，用无水硫酸镁干 燥，过滤并在减压下浓缩，得到粗产物醚，为黄色油状物(1.173g)。 通过急骤柱层析纯化(梯度洗脱：300cm3己烷之后200cm3 7％乙酸乙 酯的己烷溶液)得到纯醚，为白色固体(0.5619g，72％)。 □max/cm-1(薄膜，NaCl平板)3059(w，C-H)，2924(s，C-H)，2852(s，C-H)； (CDCl3，300MHz)0.88(3Ht J 6.9)，1.20-1.40(14H bs)，1.66(2H pentet J 7.1)， 3.62(2Ht J 6.5)，4.65(2Hs)，7.33-7.50(6Hm)，7.80(2H d J 7.7)，8.11(2H dd J 5.0，1.6)；□C(CDCl3，75MHz，Pendant)14.1(CH3)，22.7(CH2)，26.3(CH2)，29.4 (CH2)，29.6(CH2)，29.70(CH2)，29.72(CH2)，29.9(CH2)，32.0(CH2)，65.6(CH2)， 71.1(CH2)，126.9(CH)，127.1(CH)，128.1(季C)129.02(季C)， 129.04(CH)，129.46(CH)，129.54(CH)，131.0(CH)，135.1(季C)，149.7 (季C)，160.5(季C)；M/Z(APCI)392M+H+(C26H33NO2需要M+ 391)，234(100％). ST3 醇＝0.40g＝1.6mmol 氢化钠(60％油溶液)＝0.128g(60％)＝0.077g＝3.2mmol＝2当量 DMF＝5cm3 溴代十八烷＝0.531g＝1.6mmol＝1当量
在50cm3圆底烧瓶中装入氢化钠和醇。加入DMF并且在室温下将 得到的灰/黑浆状物搅拌15分钟。然后缓慢加入溴代十八烷，并且将 反应混合物搅拌过夜。将混合物倒入水(40cm3)中并且用乙酸乙酯萃 取(2×50cm3)。合并的有机相用盐水洗涤(5×50cm3)，用无水硫酸 镁干燥，过滤并在减压下浓缩，得到粗产物醚，为黄色固体 (1.0772g)。通过急骤柱层析纯化(梯度洗脱：400cm3己烷之后 200cm37％乙酸乙酯的己烷溶液)得到纯醚，为白色固体(0.6146g， 76％)。
□max/cm-1(薄膜，NaCl平板)3059(w，C-H)，2915(s，C-H)，2848(s，C-H)； (CDCl3，300MHz)0.87(3Ht J 6.9)，1.15-1.40(30H bs)，1.65(2H pentet J 7.3)，3.61(2Ht J 6.5)，4.63(2Hs)，7.32-7.50(6H m)，7.79(2Hd J 7.3)，8.10(2H dd J 7.7，1.8)；□C(CDCl3，75MHz，Pendant)14.1(CH3)，22.7(CH2)，26.3(CH2)， 29.4(CH2)，29.6(CH2)，29.68(CH2)，29.72(CH2)，29.9(CH2)，32.0(CH2)， 前面8CH2信号下的剩余8CH2基团，65.6(CH2)，71.1(CH2)，126.9 (CH)，127.1(CH)，128.1(季C)，129.04(季C)，129.19(CH)，129.46 (CH)，129.54(CH)，131.0(CH)，1`35.1(季C)，149.7(季C)，160.5 (季C)；M/Z(APCI)504 M+H+(C34H49NO2需要M+503)，234(100％). ST4-方法‘A’ 8-溴代-1-辛醇1＝1.0g＝4.8mmol. TBDMS-C1＝0.993g＝6.6mmol＝1.4当量 咪唑＝0.458g＝6.7mmol＝1.4当量 DCM＝30cm3
将上述试剂合并并且在氮气氛下在室温下搅拌20小时。将混合 物倒入水(100cm3)中并且用DCM萃取(2×50cm3)。合并的有机萃取 物用盐水洗涤(2×50cm3)，用无水硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓 缩，得到粗产物，为黄色油状物(1.955g)。通过急骤柱层析纯化(10％ 乙酸乙酯的己烷溶液加2％三乙胺)得到纯甲硅烷基醚2，为白色油状 物(1.512g，98％)。
                                 □max/ cm-1(薄膜，NaCl平板)2928(s，C-H)，2855(s，C-H)； (CDCl3，300MHz)0.02 (6Hs)，0.87(9Hs)，1.29(6Hs)，1.40(2Ht J 6.4)，1.48(2Ht J 6.4)，1.85(2H pentet J 7.1)，3.37(2Ht J 6.93)3.55(2Ht J 7)；□C(CDCl3，75MHz，Pendant)-5.5 (2×CH3)，18(C)，25.5(CH2)，26(3×CH3)，28(CH2)，29(CH2)，29.5(CH2)，32.8 (CH2)，34(CH2)，63.2(CH2)，71.5(CH2). 甲硅烷基醚2＝1.211g＝3.75mmol 噁唑3＝0.988g＝3.94mmol＝1.05当量 氢化钠＝0.900g＝37.49mmol＝10当量 DMF＝30cm3
将上述试剂合并并且在氮气氛下在室温下搅拌2小时。用水 (50cm3)小心终止反应并且用乙酸乙酯萃取(3×30cm3)含水相。合并 的有机萃取物用盐水洗涤(2×50cm3)，用无水硫酸镁干燥，过滤并在 减压下浓缩，得到粗产物4，为黄色油状物(2.997g，162％)。该产物 (含有一些乙酸乙酯)不用进一步纯化就继续反应。
             (CDCl3，300MHz)0.00(6H s)，0.85(9Hs)，1.21(8Hm)，1.45(2Ht J 6.6)，1.62(2Ht J 6.8)，3.51-4.60(4Hm)， 4.59(2Hs)，7.3-8.2(10Hm). 噁唑甲硅烷基醚4＝2.838g＝3.75mmol(最大理论量) TBAF＝1.656g＝6.33mmol＝1.7当量 THF＝30cm3
将上述试剂合并并且在氮气氛下在室温下搅拌16小时。将反应 混合物倒入水中(50cm3)并且用乙酸乙酯萃取(2×40cm3)。合并的有 机相用饱和的氯化铵水溶液(2×40cm3)，盐水(2×40cm3)洗涤，用无 水硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓缩，得到粗产物，为黄色油状物 (1.83g)。通过急骤柱层析纯化(梯度洗脱：20％乙酸乙酯的己烷溶液 (150cm3)之后是40％乙酸乙酯的己烷溶液(150cm3)，分离的产 物Rf＝0.21，在20％乙酸乙酯的己烷溶液中)，得到纯醇，为黄色油 状物(0.737g，52％，对于从甲硅烷基醚2起的两个步骤)。黄色油状 物溶解于40％乙酸乙酯的己烷溶液(20cm3)并且与活性炭(1g为脱 色剂)小心加热10分钟。混合物通过C盐垫过滤，并且在减压下浓 缩，得到纯产物5，为淡黄色油状物(0.397g，28％，对于甲硅烷基 醚2起的两个步骤)。              □max/cm-1(KBr片)3425(m，O-H)，3057(w，C-H)，2928(s，C-H)，2850(s，C-H)，1549(m，C＝C)； (CDCl3，300 MHz)1.30(8H br s)，1.53-1.67(4Hm)，3.60(4Ht J 6.5)，4.63(2Hs)，7.30-7.60(6 Hm)，7.78(2H d J 8)，8.09(2H dd J 4，7.9)；m/z(APCI)380(M+H+)(C24H29NO3 需要M+379)，234(100％). ST4-方法‘B’ 示意概要
a.i.s-BuLi，THF，-78℃。ii.CO2(s)，73％产率。
b.MeOH，H2SO4，回流，42％产率。
c.TBDMS-Cl，咪唑，DCM，98％产率。
d.NaBH4，EtOH，93％产率。
e.NaH，DMF。
f.THF，TBAF，从6起28％。
实验
2，5-二苯基噁唑-4-羧酸，2 2，5-二苯基噁唑1        ＝94.0g     ＝0.425mol s-丁基锂                ＝360mL，1.3M(己烷中) ＝1.1当量 二氧化碳(固体)          ≈50g 无水四氢呋喃            ＝130mL
将二苯基噁唑溶解于四氢呋喃并且冷却到-75℃。向该混合物滴 加s-丁基锂，并且在氮气下机械搅拌该混合物，使得无色溶液转为 深红色。30分钟之后，分批小心加入破碎的二氧化碳固体，产生剧 烈放热反应。控制加入，使得反应温度不超过-60℃。完全加入之 后，将混合物搅拌过夜，并且使其温热至室温。一旦用3M盐酸水溶 液酸化至pH1，就沉淀出白色固体。过滤，用水洗涤(3×30mL)， 并且真空下干燥，得到2，5-二苯基噁唑-4-羧酸，2，为灰白色固体 (82.7g，73％)。H(CDCl3，300MHz)7.47-7.56(6H，m)，8.12-8.17 (2H，m)，8.28-8.33(2H，m)；C(CDCl3，75MHz)125.80，126.81，128.30，128.67， 129.03，130.84，131.52，171.58；MS(EI)m/z＝265(M+)(C16H11NO3需要M+ 265)，105(100％).
2，5-二苯基噁唑-4-羧酸甲酯，3
2，5-二苯基噁唑-4-羧酸，2＝50.0g＝0.189mol
甲醇＝300mL
浓硫酸                        ＝2mL
将上述试剂合并，并且在排除大气水分的情况下在回流下加热过 夜。然后减压下蒸发溶剂，并且将油状物再溶解于乙酸乙酯中(200 mL)。然后用10％碳酸钠水溶液，盐水和水洗涤(各3×100mL)。 有机溶剂用无水硫酸镁干燥，过滤并且真空蒸发，得到2，5-二苯基噁 唑-4-羧酸甲酯，3，为黄色油状物(22.0g，42％)。
H(CDCl3，300MHz)3.98(3H，s)，7.47-7.54(6H，m)，8.12-8.18(4H，m)；C(CDCl3，75
MHz)52.43，126.28，126.85，126.95，128.46，128.48，128.85，130.13，130.40，131.15，
155.32，159.81，162.70；MS(EI)m/z＝279(M+)(C17H13NO3需要M+279)，105
(100％).
3-羟甲基-2，5-二苯基噁唑，6
2，5-二苯基噁唑-4-羧酸甲酯，3＝15.1g＝0.054mol
粉末硼氢化钠＝10.3g＝0.27mol＝5当量
无水乙醇＝200mL
将2，5-二苯基噁唑-4-羧酸甲酯，3，溶解于乙醇并且冷却到0 ℃。向其中分批加入硼氢化钠，并且将混合物搅拌1.5小时，使其温 热至室温。用3M盐酸水溶液酸化至pH1，并且用二氯甲烷萃取(3 ×100mL)。然后有机层用无水硫酸镁干燥，过滤并且真空蒸发，得 到从氯仿中结晶出来的黄色固体。将得到的沉淀物过滤，用乙醚洗涤 并且真空干燥，得到3-羟甲基-2，5-二苯基噁唑，6，为浅黄色结晶 (12.6g，93％)。
                                                      H
(CDCl3，300MHz)4.40(1H，bs)，4.86(2H，s)，7.34-7.49(6H，m)，7.70-7.75(2H，m)，
8.01-8.07(2H，m)；C(CDCl3，75MHz)56.85，126.10，126.35，126.85，128.00，128.56，
128.78，128.89，130.48，136.17，147.39，159.88；MS(EI)m/z＝251(M+)(100％)
(C16H13NO2需要M+251).
ST5
反式-4-癸烯醛   ＝1.0cm3       ＝5.5mmol.
硼氢化钠        ＝1.033g     ＝27.3mmol    ＝5当量
甲醇            ＝10cm3
氮气氛下向硼氢化钠加入甲醇。向该搅拌着的混合物加入反式- 4-癸烯醛，并且在室温下继续搅拌16小时。将混合物倒入水中(30cm3) 并且用乙酸乙酯萃取(2×25cm3)。合并的有机萃取液用盐水(2× 50cm3)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓缩，得到粗反 式-4-癸烯-1-醇，为黄色油状物(0.947g，110％)。 □max/cm-1(薄膜，NaCl平板)3332(m，O-H)，2925(s，C-H)，2855(s，C-H)； (CDCl3，300MHz)0.9(3Ht J 7)，1.20-1.40(6Hm)，1.61(2H pentet J 9.1)，1.90- 2.10(4H m0，3.65(2Ht J 7)，5.44(2Hm). 反式-4-癸烯-1-醇＝0.947g＝6.07mmol 4-溴甲基-2，5-二苯基噁唑＝1.906g＝6.07mmol＝1当量 氢化钠＝1.457g＝60.7mmol＝10当量 DMF＝20cm3
氮气氛下将氢化钠和反式-4-癸烯-1-醇在DMF中在室温下搅拌 10分钟。向得到的灰色浆状物加入4-溴甲基-2，5-二苯基噁唑的DMF 溶液。得到的混合物在室温下搅拌16小时。用水(50cm3)小心终止反 应并且用二乙醚萃取(3×30cm3)。合并的有机萃取液用盐水(20cm3) 洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓缩，得到黄色固体。与 二乙醚研制使得没有反应的噁唑沉淀，并且通过C盐垫过滤将沉淀去 除。减压下浓缩滤液，得到粗产物，为黄色油状物。通过急骤柱层析 纯化(梯度洗脱：100cm3己烷，20％乙酸乙酯的己烷溶液(200cm3)) 得到纯产物，为无色固体(0.284g，12％)。
        □max/cm-1(KBr片)2916(s，C-H)，2852(s，C-H)，1545(m，C＝C)；
(CDCl3，300MHz)0.86(3Ht J 7.1)，1.20-1.40(6Hm)，1.71(2H pentet J 6.9)，
1.93(2H q J 5.1)，2.08(2H q J 5.6)，3.63(2Ht J 6.5)，4.64(2Hs)，5.39(2Hm)，
7.30-7.50(6Hm)，7.79(2H d J8)，8.10(2H dd J 4，7.7)；
m/z(APCI)390(M+H+)(C26H31NO2需要M+389)，234(100％).
ST6
4-溴甲基噁唑＝0.492g＝1.57mmol.
3-(4-羟基苯基)-丙-1-醇＝0.248g＝1.63mmol＝1.04当量
碳酸钾＝1.273g＝16.3mmol＝10.4当量
18-冠醚-6＝催化剂量
乙腈＝25cm3
将上述试剂合并，并且在氮气下回流16小时。将混合物倒入水 中(30cm3)并且用二乙醚萃取(3×30cm3)。合并的有机萃取液用盐酸 水溶液(20％，2×30cm3)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并在减压下 浓缩，得到粗产物，为灰白色固体(0.651g)。用二乙醚研制，得到白 色固体产物(0.330g，55％)。
               □max/cm-1(KBr片)3444(m，O-H)，3055(w，C-H)，
2927(s，C-H)；.H(CDCl3，300MHz)1.87(2H pentet J 6.5)，2.66(2Ht J 7.5)，3.67
(2Ht J 6.2)，5.15(2Hs)，7.00(2H d J 8.5)，7.13(2H d J 8.7)，7.30-7.60(6Hm)，
7.77(2H d J 7)，8.10(2H dd J 4，7.7)；m/z(APCI)386(M+H+)(C25H23NO3需要
M+385)，234(100％).
ST7
ST6           ＝0.40g        ＝1.04mmol.
苯甲酰氯      ＝0.13cm3     ＝0.153g      ＝1.09mmol     ＝1.05当量
三乙胺        ＝0.29cm3     ＝0.210g      ＝2.08mmol     ＝2.0当量
DCM           ＝10cm3
ST6溶解于DCM并且置于氮气下。加入苯甲酰氯并且在室温下搅拌 十分钟。然后加入三乙胺，并且得到的混合物在室温下搅拌3小时。将 混合物倒入水(20cm3)中并且用乙酸乙酯萃取(3×20cm3)。合并的有机 萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓缩，得到粗产物，为黄色 油状物(0.511g)。该油状物静置16小时，之后形成黄色固体 (0.511g)。该固体用二乙醚研制，得到黄色溶液和白色固体，过滤收 集固体并干燥，得到纯产物ST7，为白色固体(0.330g，65％)。
                                     □max/cm-1
(薄膜，NaCl平板)3051(w，C-H)，2927(s，C-H)，1716(s，C＝O)； (CDCl3，300
MHz)2.07(2H pentet J 6.9)，2.73(2Ht J 7.9)，4.33(2Ht J 6.2)，5.14(2Hs)，7.00
(2H d J 8.5)，7.14(2H d J 8.5)，7.30-7.60(9Hm)，7.76(2H d J 7)，8.03(2H d J 7)，
8.10(2Hm)；m/z(APCI)490(M+H+)(100％)(C32H27NO4需要M+489)，234.
ST8
6-溴-1-己醇1             ＝1.486g        ＝8.21mmol.
TBDMS-C1           ＝1.361g      ＝9.03mmol      ＝1.1当量
咪唑               ＝0.615g      ＝9.03mmol      ＝1.1当量
DCM                ＝20cm3
将上述试剂合并并且在氮气下室温下搅拌48小时。过滤去除咪 唑盐酸盐白色沉淀，并且用乙酸乙酯萃取滤液(2×50cm3)。合并的有 机萃取物用无水硫酸镁干燥，过滤并且减压浓缩，得到粗产物2，为 桔黄色油状物(2.361g，98％)。该产物不用进一步纯化就直接使用。
甲硅烷基醚2          ＝2.361g          ＝8.03mmol
噁唑3        ＝1.818g        ＝7.24mmol         ＝0.905当量
氢化钠       ＝1.921g        ＝80.3mmol         ＝10当量
DMF          ＝30cm3
将上述试剂合并并且在氮气下室温下搅拌3小时。用水(50cm3)小 心终止反应，并且用乙酸乙酯萃取含水相(3×30cm3)。需要加入盐水 破坏在该萃取过程中发生的乳化作用。合并的有机萃取物用盐水洗涤 (2×20cm3)，无水硫酸镁干燥，过滤并且减压浓缩，得到粗产物4，为 黄色油状物(3.88g，104％)。该产物(含有一些乙酸乙酯)不用进一 步纯化就直接反应。
噁唑甲硅烷基醚4        ＝3.88g      ＝8.03mmol(最大理论量)
TBAF           ＝4.63g        ＝17.7mmol      ＝2.2当量
THF            ＝30cm3
将上述试剂合并并且在氮气下室温下搅拌16小时。将反应混合 物倒入水(50cm3)中，并且用乙酸乙酯萃取含水相(2×30cm3)。合并的 有机萃取物用饱和的氯化铵溶液(2×20cm3)，盐水(2×20cm3)洗 涤，无水硫酸镁干燥，过滤并且减压浓缩，得到粗产物，为黄色油状 物(3.209g)。通过急骤柱层析纯化(梯度洗脱，20％乙酸乙酯的己烷 溶液(400cm3)，接着40％乙酸乙酯己烷溶液(500cm3))，得到纯的 醇ST10，为浅黄色蜡状固体(1.127g，40％，对于甲硅烷基醚2起的 两个步骤)。
νmax/cm-1(薄膜，NaCl平板)3386(s，O-H)，3059(w，C-H芳族)，2930(s，C-H
)，2857(s，C-H)，1594(w，C＝C芳族)，1551(m，C＝C芳族)，1485，1447，
1377，1346，1279，1090，1070，1026，920，775，764，706，690；δH(CDCl3，300MHz)
1.35-1.45(4H m)，1.54(2H pentet J 6.7)，1.66(2H pentet J 6.7)，3.61(4H hexet J
3.2)，4.63(2H s)，7.36-7.48(6H m)，7.79(2H d J 7.3)，8.10(2H dd J 5.3 7.9)；δC
(CDCl3，75MHz，Pendant)25.3(CH2)，25.8(CH2)，29.4(CH2)，32.4(CH2)，62.4
(CH2)，64.9(CH2)，70.3(CH2)，126.0(CH)，126.2(CH)，128.6(CH)，128.7(CH)，
129.3(CH)，130.2(CH)；M/Z(APCI)352 M+H+(C22H25O3N需要M+351)，234
(100％).
醇ST10        ＝0.580g          1.65mmol
丁酰氯        ＝0.176g          1.65mmol        ＝1当量
三乙胺        ＝0.334g          3.30mmol        ＝2当量
DCM           ＝20cm3
醇ST10溶解于DCM并且将得到的黄色溶液置于氮气氛下。向该 搅拌着的溶液加入丁酰氯之后加入三乙胺，并且在室温下继续搅拌 16小时。将反应混合物倒入水(20cm3)中，并且用乙酸乙酯萃取(3× 20cm3)。合并的有机萃取物用盐水(20cm3)洗涤，无水硫酸镁干燥并 且减压浓缩，得到粗产物酯ST8，为黄色油状物(0.747g，107％)。向 该产物加入活性炭和二乙醚(30cm3)并且温和加热得到的混合物。溶 液通过C盐垫过滤并且减压浓缩，得到纯酯ST8，为浅黄色油状物 (0.312g，45％)。                             □max/cm-1(薄膜，
NaCl平板)3059(w，C-H)，2934(s，C-H)，2859(s，C-H)，1732(s，C＝O)，1549(m，
C＝C)； (CDCl3，300MHz)0.92(3Ht J 7.3)，1.35(4H br s)，1.61(6H m)，2.25(2
Ht J 7.5)，3.60(2Ht J 6.5)，4.03(2Ht J 6.7)，4.63(2Hs)，7.30-7.60(6Hm)7.78(2
H d J 7.2)，8.10(2H dd J 3，8)；m/z(APCI)422 M+H+(C26H31NO4需要M+421)，
234(100％).
ST9
醇1              ＝0.501g              ＝1.43mmol 苯甲酰氯     ＝0.17cm3      ＝0.201g        ＝1.43mmol      ＝1当量 三乙胺       ＝0.3cm3       ＝0.217g        ＝2.15mmol      ＝1.5当量 DCM          ＝10cm3
醇1溶解于DCM并且置于氮气氛下。加入苯甲酰氯，并且在室温 下将混合物搅拌10分钟。加入三乙胺，并且将得到的混合物在室温 下搅拌16小时。将混合物倒入水(20cm3)中，并且用二乙醚萃取 (2×20cm3)。合并的有机萃取物用无水硫酸镁干燥，过滤并且减压浓 缩，得到粗产物，为黄色油状物。让该油状物静置16小时，此后生 成黄色固体。通过急骤柱层析纯化(20％乙酸乙酯己烷溶液(200 cm3))，得到纯的酯ST9，为无色油状物(0.340g，52％)。
           □max/cm-1(薄膜，NaCl平板)3059(w，C-H)，
2934(m，C-H)，2858(m，C-H)，1716(s，C＝O)； (CDCl3，300MHz)1.46(4H
pentet J 3.5)，1.71(4H m)，3.62(2Ht J 6.5)，4.28(2Ht J 6.7)，4.64(2Hs)，7.30-
7.60(9Hm)，7.80(2Hm)，8.02(2Hd J 7.3)，8.09(2H dd J 4.2，7.7)；m/z(APCI)456
M+H+(100％)(C29H29NO4需要M+455)，234.
ST11
ST10         ＝2.5g    ＝7.12mmol       ＝1当量
氯铬酸吡啶鎓/硅胶(1∶1)＝4.6g＝10.67mmol＝1.5当量
二氯甲烷         ＝30cm-3
 PCC/二氧化硅加至ST10的二氯甲烷溶液(30cm3)中并且搅拌过 夜。用乙醚稀释反应混合物并且通过C盐和二氧化硅过滤，然后减压 浓缩，得到噁唑醛，为粗产物黄色油状物(2.087g 84％)。该产物不用 进一步纯化就可直接使用。
通过二氧化硅柱(20％乙酸乙酯的己烷溶液)洗脱并且合并级分 (Rf＝0.47)(40％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化的样品被分离为浅黄色油 状物。对该油状物的光谱学分析给出下面的数据：
                                                  νmax/ cm-1(薄板，NaCl平板)3059(m，C-H芳族)，2933(s，C-H)，2860(s，C-H)， 1722(s，C＝O)，1594(w，C＝C芳族)，1551(m，C＝C芳族)，1486，1447，1377， 1346，1319，1279，1214，1177，1133，1091，1069，1025，1011，950，921，776，765，707， 691，675，660；δH(CDCl3，300MHz)1.40-1.66(6Hm)，2.31-2.41(2Hm)，3.61(2Ht J 6.15)，4.63(2Hs)，7.35-7.49(6Hm)，7.77(2H d J 7.44)，8.10(2H d J 3.75)，9.72 (1Hs)；
醛1＝1.580g＝4.527mmol＝1当量
氧化银(I)＝1.574g＝6.791mmol＝1.5当量
NaOH(水溶液)(2M)＝30cm-3
甲醇＝30cm-3
向醛1的甲醇溶液加入氧化银(I)，然后滴加NaOH(水溶液) (2M)。反应混合物被置于氮气下，防止溶剂蒸发，并且在室温下搅拌 6小时。反应混合物通过C盐过滤，并且酸化(20％HCl(水溶液))， 产生黄色混浊溶液。该溶液用二乙醚萃取(3×50cm3)，无水硫酸镁 干燥，过滤并且减压浓缩，得到黄色油状物，其暴露在空气中固化。 该黄色固体用热二乙醚(50cm3)研制，得到黄色溶液和白色固体。白 色固体经过滤分离，并且用冷二乙醚(30cm3)洗涤。将滤液碱化(2M NaOH(水溶液))，然后将分离的含水相酸化(20％HCl(水溶液))并 且用二乙醚萃取(2×30cm3)。向二乙醚萃取液中加入炭，将得到的 混合物温和加热后通过C盐过滤，并且减压浓缩，得到不透明油状 物，其在空气中静置过夜固化为白色固体。这两种固体是相同的，因 此合并，得到单一纯产物(1.27g，77％)。νmax/cm-1(KBr disc)3060 (w，C-H芳族)，2930(s，C-H)，2856(s，C-H)，2581(br，O-H)，1716(s，C＝O)，1596 (w，C＝C芳族)，1546(m，C＝C芳族)，1488，1450，1420，1350，1326，1307， 1217，1183，1090，1014，911，780，761，707，688；δH(CDCl3，300MHz)1.41-1.49(2H m)，1.65(4H pp J 6.7，7.5)，2.33(2Ht J 7.3)，3.61(2Ht J 6.5)，4.64(2Hs)，7.34-7.51 (6Hm)，7.77(2H d J 7.5)，8.1(2H dd)；δC(CDCl3，75MHz，Pendant)24.5(CH2)，25.7 (CH2)，29.3(CH2)，33.9(CH2)，65.1(CH2)，70.2(CH2)，126.2(CH)，126.5(CH)， 128.4(CH)，128.6(CH)，128.8(CH)，128.8(CH)，剩余的季碳信号太小不能解析；
                               M/Z(APCI)366M+H+(C22H23O4N  需要 M+365)，234(100％).