用于增强从组织样品回收细胞和富含细胞的基质的方法和装置
阅读：45发布：2022-05-21
专利汇可以提供用于增强从组织样品回收细胞和富含细胞的基质的方法和装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文件描述了用于从组织样品回收富含细胞的基质和细胞（例如再生细胞）的方法和装置。在某些实施方式中，进行至少两轮的 加速 和减速。，下面是用于增强从组织样品回收细胞和富含细胞的基质的方法和装置专利的具体信息内容。
1.提高处理过的脂肪抽吸物中的细胞含量的方法，其旨在回收富含细胞的基质以重新施用于患者，所述方法包括将所述脂肪抽吸物挤出通过1-5mm范围内的限定直径的孔，然后使挤出的脂肪抽吸物经受至少5分钟并且离心力为至少400xg的连续离心步骤。
2.权利要求1的方法，其中离心步骤包含高至2000xg的离心力。
3.权利要求1的方法，其中离心步骤包含约1200xg的离心力。
4.权利要求1的方法，其中组织样品包含脂肪抽吸物、脂肪组织及其组合。
5.权利要求1-4的方法，其中使用固定角度的水平转子进行离心。
6.促进从脂肪组织回收再生细胞的方法，所述方法包括在蛋白水解酶存在下在离心机内对所述组织进行加速和减速，由此将用于所述组织的容器倒置。
7.权利要求6的方法，其中所述离心机的内部是温度受控的。
8.权利要求6的方法，其中向所述组织施加每分钟一个或多个循环的加速和减速。
9.权利要求6的方法，其中所述蛋白水解酶是胶原酶、中性蛋白酶或两者。
10.权利要求6-9的方法，其中胶原酶和中性蛋白酶的组合与提高的温度和由倒置转子中的离心加速和减速引起的搅动一起，被用于促进从脂肪组织回收再生细胞。
11.从脂肪组织具成本效益地回收再生细胞的方法，所述方法包括提供富含细胞的基质；在蛋白水解酶存在下在离心机内对所述富含细胞的基质进行加速和减速，由此将用于所述组织的容器倒置。
12.权利要求11的方法，其中所述离心机的内部是温度受控的。
13.权利要求11的方法，其中向所述富含细胞的基质施加每分钟一个或多个循环的加速和减速。
14.权利要求10-12任一项的方法，其中胶原酶和中性蛋白酶的组合与提高的温度和由倒置转子中的离心加速和减速引起的搅动一起，被用于促进从富含细胞的基质回收再生细胞。
15.组合物，其包含按照权利要求1-5制备的富含细胞的基质与按照权利要求6-14制备的再生细胞制备物合在一起的组合，用于注射到患者中。
16.可取出的旋转装置，其包含至少两个腔，其中每个腔被配置成用于将组织收集容器可拆卸地插入到所述腔中，其中所述可取出的旋转装置被配置成在用于从组织样品分离富含细胞的基质的自动组织处理单元内旋转。
17.权利要求16的装置，其中所述可取出的旋转装置包含与其连接的射频识别（RFID）标签，所述标签允许所述可取出的旋转装置被所述自动组织处理单元识别。
18.权利要求16的装置，其中所述可取出的旋转装置包含可高温高压灭菌的材料。
19.用于从组织样品分离富含细胞的基质的自动组织处理单元，其中所述自动组织处理单元包含可取出的旋转装置，所述可取出的旋转装置包含至少两个腔，其中每个腔被配置成用于将组织收集容器可拆卸地插入到所述腔中。
20.权利要求19的装置，其中所述自动组织处理单元包含温度控制装置。
21.权利要求19的装置，其中所述可取出的旋转装置具有至少一个预定的规格，所述规格允许所述自动组织处理单元识别所述可取出的旋转装置。
22.用于从脂肪组织回收细胞的方法，所述方法包括：
a）将脂肪抽吸物挤出通过孔口；
b）将所述挤出的脂肪抽吸物离心，以产生富含细胞的基质；以及
c）使用离心力使所述富含细胞的基质经受多个加速和减速步骤，以从所述富含细胞的基质回收再生细胞。
23.权利要求22的方法，其还包括在使所述组织样品经受所述多个加速和减速步骤时，在所述容器的内部维持26℃至42℃的温度。
24.权利要求22的方法，其中在一种或多种酶存在下使所述组织样品经受所述多个加速和减速步骤。
25.权利要求22的方法，其中所述酶是胶原酶、其他蛋白酶或其混合物。
26.用于从组织回收细胞的方法，所述方法包括：
a）提供容纳在适合于离心机的容器中的组织样品，所述组织样品包含组织碎片在水性流体中的悬液；
b）使用通过旋转元件施加的离心力使所述样品经受至少一个加速和减速步骤，其中所述旋转元件包含轴和一个或多个从所述轴伸出的臂，其中（i）一个或多个臂由所述轴支撑，支撑的方式使得当所述轴旋转时，一个或多个臂相对于所述轴向上并向外摆动，或者（ii）一个或多个臂以固定的角度支撑，其中连接于所述臂的容器被保持在使材料上的重力与施加的离心力相反的位置中，其中所述施加的离心力在约50g至约4000g的范围内。
27.权利要求25的方法，其中所述样品的温度被维持在32℃和42℃之间。
28.权利要求25的方法，其中所述组织样品还包含一种或多种蛋白酶。
29.用于回收富含细胞的基质的装置，所述富含细胞的基质用于制备再生细胞。
用于增强从组织样品回收细胞和富含细胞的基质的方法和
装置
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2010年12月16日提交的美国临时申请号61/424,012和2011年11月3日提交的美国临时申请号61/555,305的优先权。前述申请的公开内容被认为是本申请的公开内容的一部分（并在此引为参考）。
技术领域
背景技术
[0004] 再生医学中的当前策略旨在替换经历凋亡率增加的组织。这意味着器官内存在功能性细胞的净损失，因为即将死亡的细胞比要被替换的细胞多。因此，再生细胞例如干细胞和祖细胞从一个位置转移至更新位点，是使器官恢复到平衡的治疗方法。我们实验室的研究显示，干细胞和再生细胞存在于每一个器官中，主要位于血管和血管周围的空间中，其中血管壁中的早期祖细胞连接于内弹力层。这些细胞的一个群体能够替换器官的基质，这些细胞的另一部分能够分化成特定器官的相应实质。每个器官可以比作房子，其中由成纤维细胞制成并由细胞外基质构成的基质可以比作房子中由砖和砂浆构成的墙，房子中的管线对应于器官的血管，神经代表墙中的电线排布。在这些房子内，在每个器官中各自具有某种类型的住户，例如肝细胞、心脏细胞、骨细胞、软骨或脂肪细胞，也称为器官的实质。
[0005] 为了恢复功能失调的器官的功能，重要的是提供基质、即形成器官壁的壳体以及住户、即特定实质细胞两者。
[0006] 回收能够恢复器官功能的再生细胞的一种简单手段是将它们从皮下脂肪组织解离，因为所述皮下脂肪组织富含血管，并且可取出的脂肪组织对生命来说不是必需的。大多数人能够、甚至乐于捐献数克这样的组织。
[0007] 通过吸脂术收获的组织的自体移植是美容外科中用于小体积（例如鼻唇沟）和大体积（臀部和乳房）两种填充应用的常见程序。这种被称为“自体脂肪移植”的程序的主要益处是与合成填充物相比较低的成本，并且由于使用患者自己的组织而没有免疫排斥。目前，多种脂肪抽吸物收集和处理方法被用于获得移植用组织。决定自体脂肪移植后的临床结果的因素尚未完全阐明。然而，已广泛认识到改善移植物的持留性是极为需要的领域。
发明内容
[0008] 从身体中的一个位置回收并转移到另一个位置的转移的脂肪组织或脂肪细胞继续具有有氧代谢。没有足够的血液供应时，这些细胞在24至48小时内经历坏死、凋亡和自我吞噬，并死亡。通过吸脂术将脂肪从身体中的一个位置取出并重新注射在另一个位置处的传统脂肪移植，其问题在于大部分的转移细胞不能存活，并且即将死亡的细胞可以引起相当大的局部炎症。脂肪移植物的持留性和再生潜力与移植物中填充有脂类的脂肪细胞的含量不相关，而是与再生细胞例如干细胞的含量和施用的细胞外基质相关。由于收获和重新施用的创伤以及由于移植物环境的缺血本性，成熟脂肪细胞的移植后损失很高。相反，干细胞和再生细胞对这些因素耐受性更高，因此明显有助于移植物长期生存力和再生潜力。
[0009] 本文件是基于用于皮下组织或需要体积增加的其他结缔组织结构的体积填充的改进的方法。所述方法包括富含细胞的基质的转移，所述富含细胞的基质具有降低的脂类含量，但具有提高的再生细胞浓度。已知结缔组织对缺血具有相当长的耐受性，因为它与脂肪细胞相比具有显著更低的代谢。因此，本发明的目的是提供使用细胞-富含细胞的基质进行长期稳定的体积填充的方法和装置。这使组织在被移植到新位点时具有更高的存活率。因此，正如本文中所述，来自于组织驻留的干细胞的新生血管化，为移植的移植物提供了更大的生存力。这种方法的另一种改进是重新施用通过本文描述的方法回收的富含细胞的基质与解离的再生细胞合在一起的混合物，所述方法包括在加热的离心机中，通过在倒置转子中加速和减速对脂肪抽吸物进行酶解离。
[0010] 因此，本文件提供了用于制备和回收富含细胞的基质，利用与用于基质回收的相同的装置改善再生细胞从其皮下位置回收，以及将富含细胞的基质和再生细胞相组合用于增强移植的体积填充移植物组织的新生血管化并提高存活率的新方法。
[0011] 本文件还提供了用于从皮下脂肪组织中的位置回收再生细胞的具成本效益的手段，所述再生细胞被定义为早期间质细胞加上整个范围的祖细胞。对来自于初始脂肪抽吸物的脂类填充细胞进行预处理并降低其含量，是节省高成本的酶例如胶原酶和中性蛋白酶的有效方法。所述方法包括两个步骤的方法，其中降低脂肪抽吸物中脂类填充细胞的量并回收富含细胞的基质，然后通过也使用来自于具有可重新配置的转子的加热离心机的提高的温度和重复循环的加速和减速，使具有降低的脂类含量的富含细胞的基质经受酶和机械处理，以便以最适成本回收再生细胞制备物。
[0012] 目前已知的旨在获得处理过的脂肪抽吸物的处理皮下脂肪的方法仅使用离心。正如本文中所示，单独通过离心进行处理能够提高处理过的组织的细胞得率。然而，在离心步骤之前将脂肪组织挤出，显著提高了被称为富含细胞的基质的处理过的脂肪抽吸物材料的细胞含量。
[0013] 可以如本文中所述进行皮下组织的处理以获得富含细胞的基质，所述富含细胞的基质主要由细胞外基质的胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和其他蛋白聚糖以及仍结合在组织中的组织驻留细胞构成，所述织驻留细胞包括干细胞和祖细胞，干细胞和祖细胞合称为“再生细胞”或“再生平台”。富含细胞的基质通常含有90%以上的结合在其组织位置中的再生细胞。
[0014] 在一种实施方式中，本文件提供了用于制备和回收富含细胞的基质的方法和装置。
[0015] 在一种实施方式中，本文件提供了用于从所述富含细胞的基质制备和回收再生细胞的方法和装置。
[0016] 在一种实施方式中，提供了包含如本文中所述分离的再生细胞的细胞组合物，或含有富含细胞的基质和再生细胞两者的细胞组合物。如本文所述制备的富含细胞的基质具有降低的脂类含量，但具有提高的再生细胞浓度。已知结缔组织对缺血具有相当长的耐受性，因为它与脂肪细胞相比具有显著更低的代谢。本文描述的细胞组合物可以增强移植物的新生血管化并提高移植物的长期存活率。含有富含细胞的基质和再生细胞的组合的细胞组合物，对增强移植物的新生血管化和提高移植物的长期存活率特别有用。
[0017] 在一种实施方式中，本文件的特点在于一种从组织回收富含细胞的基质的方法。所述方法包括将含有脂肪组织碎片在水性流体中的悬液的组织样品通过孔口挤出，以及将挤出的组织样品离心以分离富含细胞的基质。所述孔口的直径可以为1至5mm。将挤出的组织样品以最低400x g、优选地以更高的最高1200x g的离心力（例如400x g至1200x g）离心至少5分钟。可以如本文中所述从富含细胞的基质回收细胞。
[0018] 另一方面，本文件的特点在于一种从组织回收细胞的方法。所述方法包括提供容纳在适合于离心机的容器中的挤出的组织样品，所述组织样品包含组织碎片在水性流体中的悬液；使用通过旋转元件施加的离心力使所述样品经受至少一个加速和减速步骤，其中所述旋转元件包含轴和一个或多个从所述轴伸出的臂，其中（i）一个或多个臂由所述轴支撑，支撑的方式使得当所述轴旋转时，一个或多个臂相对于所述轴向上并向外摆动，或者（ii）一个或多个臂以固定的角度支撑，其中连接于所述臂的容器被保持在使材料上的重力与施加的离心力相反的位置中，其中所述施加的离心力在约50g至约4000g的范围内。所述样品的温度可以被维持在32℃和42℃之间。还可以包含一种或多种酶（例如蛋白酶例如胶原酶或中性蛋白酶，或本文中所描述的其他酶）。
[0019] 在一种实施方式中，本文件的特点在于一种从组织样品（例如脂肪抽吸物、脂肪组织及其组合）回收再生平台的方法。所述方法包括提供容纳在适合于自动组织处理单元的第一组织收集容器中的组织样品，其中所述自动组织处理单元包含可取出的旋转装置，所述可取出的旋转装置包含至少两个腔，其中每个腔被配置成用于将组织收集容器可拆卸地插入到所述腔中，其中所述组织样品包含组织碎片在水性流体中的悬液；以及使用自动组织处理单元使所述组织样品经受至少一轮的在至少400x g下离心至少约5分钟，从而从所述组织样品分离富含细胞的基质，其中所述富含细胞的基质包含再生平台。所述方法还可以包括在将所述组织样品置于所述自动组织处理单元中之前，将所述组织样品通过孔挤出。与除了不将所述组织样品通过孔挤出之外在其他方面相对应的方法相比，所述富含细胞的基质可以具有更高的再生平台浓度。所述方法还可以包括通过闭合系统方法将组织样品浓缩物从第一组织收集容器转移到第二收集容器中。在某些实施方式中，可以向所述第二收集容器添加至少一种蛋白酶。所述富含细胞的基质可以经受至少两轮加速，其中在每轮加速后进行一轮减速，由此使富含细胞的基质分散开。在某些实施方式中，可以将所述富含细胞的基质过滤以获得可注射的再生平台。
[0020] 在本文所描述的任一种方法中，所述方法还可以包括将至少一部分可注射再生平台在注射位点处施用到对象中，由此该注射改变了所述注射位点处或附近的区域。
[0021] 本文件的特点还在于一种将其中具有再生平台的富含细胞的基质分散开的方法，其中所述方法包括提供容纳在适合于自动组织处理单元的第二组织收集容器中的富含细胞的基质，其中所述组织收集容器包含至少一种蛋白酶；以及使所述富含细胞的基质经受至少两轮加速，其中在每轮加速后进行一轮减速，并且其中至少两轮加速和减速以至少10x g的速率进行，由此将所述富含细胞的基质分散开。所述方法还可以包括将分散开的富含细胞的基质过滤或过滤并浓缩，以获得可注射的再生平台。
[0022] 本文件的特点还在于一种可取出的旋转装置，其包含至少两个腔，其中每个腔被配置成用于将组织收集容器可拆卸地插入到所述腔中，其中所述可取出的旋转装置被配置成在用于从组织样品分离富含细胞的基质的自动组织处理单元内旋转。所述可取出的旋转装置可以包括与其连接的射频识别（RFID）标签，所述标签允许所述可取出的旋转装置被所述自动组织处理单元识别。或者，可以根据在加速阶段期间加速所述装置所需的电流量来识别可取出的旋转装置的类型。所述可取出的旋转装置可以包括可高温高压灭菌的材料。
[0023] 另一方面，本文件的特点在于一种用于从组织样品分离富含细胞的基质的自动组织处理单元。所述自动组织处理单元可以包括可取出的旋转装置，所述可取出的旋转装置包含至少两个腔，其中每个腔被配置成用于将组织收集容器可拆卸地插入到所述腔中。所述自动组织处理单元可以包括温度控制装置。所述自动组织处理单元可以被配置成具有至少两个的加速停止-开始间隔期。所述可取出的旋转装置可以具有至少一个预定的规格，所述规格允许所述自动组织处理单元识别所述可取出的旋转装置。
[0024] 另一方面，提供了改良的离心机，其可用于在离心力下进行至少两轮的快速加速和减速步骤。这样的步骤可以在热调控的环境（例如35-42℃）中，在一种或多种酶（例如胶原酶和中性蛋白酶）存在下进行，以增强细胞外基质的降解和细胞的释放。可以使用离心来回收从细胞外基质释放的细胞。本文描述的方法和装置可用于处理含有血管的任何人类或动物组织。所述方法和装置对于从富含血管并易于从对象回收的脂肪组织（例如皮下或腹内脂肪组织）回收细胞来说特别有用。
[0025] 本文件还提供了一种从组织回收细胞的方法。所述方法包括提供容纳在适合于离心机的容器中的组织样品，所述组织样品包括组织碎片在水性流体中的悬液；以及使用离心力使所述组织样品经受多个加速和减速步骤。所述组织样品可以包括人类组织或动物组织，并可以含有血管。所述组织样品可以是脂肪组织例如脂肪抽吸物。所述方法可以包括在使所述组织样品经受所述多个加速和减速步骤时，在所述容器的内部维持26℃至42℃的温度。可以在一种或多种酶（例如胶原酶、其他蛋白酶或其混合物）存在下使所述组织样品经受所述多个加速和减速步骤。
[0026] 在某些实施方式中，每个加速步骤可以进行5至20秒，并且每个减速步骤可以进行3至20秒。可以使组织样品经受多个加速和减速步骤，共5分钟至180分钟（例如20分钟至60分钟）。在一种实施方式中，使组织样品经受每分钟至少三个加速至200x g并减速至1x g的循环，共30分钟。
[0027] 另一方面，本文件的特点在于一种从组织回收细胞的方法。所述方法包括提供容纳在适合于离心机的容器中的组织样品，所述组织样品包括组织碎片在水性流体中的悬液；使用通过旋转元件施加的离心力使所述样品经受多个加速和减速步骤，其中所述旋转元件包含轴和一个或多个从所述轴伸出的臂，其中（i）一个或多个臂由所述轴支撑，支撑的方式使得当所述轴旋转时，一个或多个臂相对于所述轴向上并向外摆动，或者（ii）一个或多个臂以固定的角度支撑，其中连接于所述臂的容器被保持在使材料上的重力与施加的离心力相反的位置中，其中施加的离心力在约50g至约4000g的范围内。每个加速步骤可以进行5至20秒。每个减速步骤可以进行3至20秒。可以使组织样品经受多个加速和减速步骤，共5分钟至180分钟（例如20分钟至60分钟）。在一种实施方式中，使组织样品经受每分钟至少三个加速至200x g并减速至1x g的循环，共30分钟。
[0028] 本文件的特点还在于一种从组织回收再生细胞的方法。所述方法包括提供容纳在适合于离心机的容器中的组织样品，所述组织样品包含组织碎片在水性流体中的悬液；使用离心力使所述样品经受多个加速和减速步骤；以及在400至4000x g下离心所述样品以分离细胞组分。当使所述样品经受400至4000x g下的离心时，所述样品可以被容纳在容器中，所述容器包含细长圆柱形中央部分、与所述中央部分整体成形的第一末端部分以及与所述中央部分整体成形的第二开口末端部分，其中所述第一末端部分缩窄成狭窄开口，并在所述狭窄开口处包含从所述末端部分突出的收集部分，其中所述收集部分能够接收并储存流体，并包含用于将所述第一末端部分密封以与所述收集部分隔开的可取出的塞子。
[0029] 在本文所描述的任一种方法中，所述容器可以包括多孔插件，其中所述多孔插件由生物相容材料构成，并具有0.5mm至5mm范围内的孔径，其中当使所述组织样品经受所述多个加速和减速步骤时，所述多孔插件增强细胞从所述组织样品的细胞外基质解离。所述多孔插件可以是基本上圆柱形的形状、倒置的基本上圆锥形的形状，或者可以将所述容器分成上部和下部部分。
[0030] 在本文所描述的任一种方法中，所述容器可以包含多个粒子，其中所述粒子的直径为至少100微米，并且所述粒子由一种或多种生物相容材料构成，其中当使所述组织样品经受所述多个加速和减速步骤时，所述粒子增强细胞从所述组织样品的细胞外基质解离。所述多个粒子可以包括具有不同比重或形状的粒子。
[0031] 在本文所描述的任一种方法中，所述容器可以包括被竖直布置在所述容器的内腔中的轴，所述轴进一步包括沿着所述轴的长度布置并基本上径向地从所述轴延伸到所述容器的腔内的多个臂，其中当使所述组织样品经受所述多个加速和减速步骤时，所述臂增强细胞从所述组织样品的细胞外基质解离。所述臂可以具有不同的形状或尺寸。所述容器可以包括可取出的盖子，其中所述轴固定于所述可取出的盖子。所述轴可以可旋转地固定于所述容器。所述轴可以在所述容器的腔内移动。
[0032] 另一方面，本文件的特点在于一种容器或容器组件，其包含细长圆柱形中央部分、与所述中央部分整体成形的第一末端部分、与所述中央部分整体成形的第二开口末端部分以及从所述细长圆柱形部分向外径向延伸的端口，其中所述第一末端部分逐渐变细成狭窄开口，并在所述狭窄开口处包含从所述末端部分突出的收集部分，其中所述收集部分能够接收和储存流体，并包含用于将所述第一末端部分与所述收集部分密封的可取出的塞子。在离心力、压力、用酶解离或物理取出后，所述可取出的塞子可以允许流体从所述末端部分流入所述收集部分。可以将所述收集部分与所述第一末端部分拆开。所述收集部分可以包含水性流体。所述第二开口末端包括配合部分。
[0033] 本文件的特点还在于一种容器组件，其包括第一容器、第二容器以及适合于将所述第一容器偶联到所述第二容器的偶联装置。所述第一容器如上所述。所述第二容器包括细长圆柱形中央部分、与所述中央部分整体成形的闭合末端部分以及与所述中央部分整体成形的开口末端部分，其中所述第二容器的开口末端部分包含配合部分；并且所述偶联装置包含具有第一和第二开口末端的管状中央部分和水平延伸跨过所述偶联装置的多孔插件，其中所述偶联装置的每个开口末端包含配合部分，其中所述多孔插件具有40至500μm的孔径。所述偶联装置还包括从所述管状中央部分向外径向延伸的端口，其中所述偶联装置的一个配合部分连接于所述第一容器的配合部分，并且所述偶联装置的另一个配合部分连接于所述第二容器的配合部分。所述端口可以包括多孔插件。
[0034] 可以将所述第一和第二容器进行预先组装，其中由所述第一容器和所述第二容器限定的内部空间为至少部分真空。
[0035] 本文件的特点还在于一种容器，其包括限定了内腔的细长圆柱形中央部分、与所述中央部分整体成形的第一末端部分、与所述中央部分整体成形的第二开口末端部分、被竖直布置在所述内腔中的轴以及沿着所述轴的长度布置并以基本上径向方向从所述轴延伸到所述内腔中的多个臂。所述多个臂可以具有不同的形状或尺寸。所述容器可以进一步包括连接于所述第二开口末端部分的可取出的盖子，其中所述轴固定于所述可取出的盖子。所述轴可以可旋转地固定于所述容器。所述轴可以在所述容器的腔内移动。
[0037] 另一方面，本文件的特点在于一种提高处理过的脂肪抽吸物中的细胞含量的方法，所述方法旨在回收富含细胞的基质以重新施用于患者，所述方法包括将所述脂肪抽吸物通过1-5mm范围内的确定直径的孔挤出，然后使挤出的脂肪抽吸物经受至少5分钟并且离心力为至少400x g的连续离心步骤。所述离心步骤可以包括最高2000x g的离心力。所述离心步骤可以包括约1200x g的离心力。所述组织样品可以包括脂肪抽吸物、脂肪组织及其组合。可以使用固定角度的水平转子进行离心。
[0038] 另一方面，本文件的特点在于一种促进从脂肪组织回收再生细胞的方法，所述方法包括在蛋白水解酶存在下在离心机内对所述组织进行加速和减速，由此将用于所述组织的容器倒置。所述离心机的内部可以是温度受控的。可以向所述组织施加每分钟一个或多个循环的加速和减速。所述蛋白水解酶可以是胶原酶、中性蛋白酶或两者。胶原酶与中性蛋白酶的组合可以与提高的温度和由倒置转子中的离心加速和减速引起的搅动一起，用于促进从脂肪组织回收再生细胞。
[0039] 本文件的特点还在于一种从脂肪组织具成本效益地回收再生细胞的方法，所述方法包括提供富含细胞的基质；在蛋白水解酶存在下在离心机内对所述富含细胞的基质进行加速和减速，由此将用于所述组织的容器倒置。所述离心机的内部可以是温度受控的。可以向所述富含细胞的基质施加每分钟一个或多个循环的加速和减速。胶原酶与中性蛋白酶的组合可以与提高的温度和由倒置转子中的离心加速和减速引起的搅动一起，用于促进从富含细胞的基质回收再生细胞。
[0040] 本文件的特点还在于一种组合物，其包含合在一起的如本文中所述制备的富含细胞的基质与如本文中所述制备的再生细胞制备物，用于注射到患者中。
[0041] 另一方面，本文件的特点在于一种可取出的旋转装置，其包含至少两个腔，其中每个腔被配置成用于将组织收集容器可拆卸地插入到所述腔中，其中所述可取出的旋转装置被配置成在用于从组织样品分离富含细胞的基质的自动组织处理单元内旋转。所述可取出的旋转装置包含与其连接的射频识别（RFID）标签，所述标签允许所述可取出的旋转装置被所述自动组织处理单元识别。所述可取出的旋转装置可以包含可高温高压灭菌的材料。
[0042] 本文件的特点还在于一种从组织样品分离富含细胞的基质的自动组织处理单元，其中所述自动组织处理单元包含可取出的旋转装置，所述可取出的旋转装置包含至少两个腔，其中每个腔被配置成用于将组织收集容器可拆卸地插入到所述腔中。所述自动组织处理单元包含温度控制装置。所述可取出的旋转装置具有至少一个预定的规格，所述规格允许所述自动组织处理单元识别所述可取出的旋转装置。
[0043] 另一方面，本文件的特点在于一种从脂肪组织回收细胞的方法，所述方法包括将脂肪抽吸物通过孔口挤出；将挤出的脂肪抽吸物离心，以产生富含细胞的基质；以及使用离心力使所述富含细胞的基质经受多个加速和减速步骤，以从所述富含细胞的基质回收再生细胞。所述方法还可以包括在使所述组织样品经受所述多个加速和减速步骤时，在所述容器的内部维持26℃至42℃的温度。可以在一种或多种酶（例如胶原酶、其他蛋白酶或其混合物）存在下使所述组织样品经受所述多个加速和减速步骤。
[0044] 另一方面，本文件的特点在于一种从组织回收细胞的方法。所述方法包括提供容纳在适合于离心机的容器中的组织样品，所述组织样品包含组织碎片在水性流体中的悬液；使用通过旋转元件施加的离心力使所述样品经受至少一个加速和减速步骤，其中所述旋转元件包含轴和一个或多个从所述轴伸出的臂，其中（i）一个或多个臂由所述轴支撑，支撑的方式使得当所述轴旋转时，一个或多个臂相对于所述轴向上并向外摆动，或者（ii）一个或多个臂以固定的角度支撑，其中连接于所述臂的所述容器被保持在使材料上的重力与施加的离心力相反的位置中，其中所述施加的离心力在约50g至约4000g的范围内。所述样品的温度被维持在32℃和42℃之间。所述组织样品还可以包含一种或多种蛋白酶。
[0045] 除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域内的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所描述的相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验，但下面描述了示例性的方法和材料。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利、 登记号和其他参考文献，在此以其全文引为参考。在有冲突的情况下，以本申请、包括本申请的定义为准。材料、方法和实例仅仅是说明性的，而不打算是限制性的。
[0047] 图1是本文描述的实施方式的用于从组织样品解离、分离和回收细胞的装置的透视图。
[0048] 图2是解离阶段期间不同时间和能量循环及其组合的图。
[0049] 图3A-3E是适合于离心机的不同容器的透视图。
[0050] 图4是本文描述的一种实施方式的容器组件的透视图。
[0051] 图5是图1的装置的一种实施方式的横截面侧视图。
[0052] 图6是使用图1的装置的实施方式处理后或用摇床处理后获得的粘附细胞的数量的条形图。
[0053] 图7是使用图1的装置和图3A、3D或3E的容器的实施方式处理后或用摇床处理后获得的粘附细胞的数量的条形图。
[0054] 图8是可以被插入到自动组织处理单元中的可取出的旋转装置的顶视图。
[0055] 图9是可以被插入到自动组织处理单元中的可取出的旋转装置的侧视图。
[0056] 图10是从如下处理的脂肪组织获得的粘附细胞数量/g组织的图：未离心，离心，或挤出然后离心。
[0057] 图11是从未挤出、通过乳液针挤出（SS挤出）或Luer挤出，然后不离心或以1200x g离心的脂肪组织获得的细胞数量/g组织的图。对于挤出来说，使用注射器使组织穿过挤出装置5次。
[0058] 图12是从离心5、10或20分钟后的脂肪组织获得的粘附细胞数量/g组织的图。
[0059] 图13是从未离心、以400x g离心30分钟或以1200x g离心30分钟后的脂肪组织获得的粘附细胞数量/g组织的图。
[0060] 图14是用于提高移植用组织制备物中脂肪来源的再生细胞（ADRC）的浓度的方法的示意图。首先对组织进行处理以将ADRC浓缩在富含细胞的基质（CEM）中。对一半的CEM进行处理以得到分离的ADRC，然后将其与剩余的CEM合并以进一步提高移植物中的ADRC浓度。
[0061] 图15是在处理脂肪组织或脂肪抽吸物以获得ADRC中提高酶和一次性用品的效率的方法的示意图。首先对组织进行处理以将ADRC浓缩在CEM中，然后将其合并并进行处理以得到ADRC。
[0062] 各个图中相似的参考符号指示相似的元件。
具体实施方式
[0063] 总的来说，本文件是基于用于从组织回收细胞的方法和装置，所述组织包括人类和动物组织，例如犬、猫、马、牛、羊或猪的组织。本文描述的方法和装置特别可用于从通过例如吸脂术获得的脂肪组织（即脂肪抽吸物）回收细胞，所述吸脂术包括抽吸辅助的、蒸汽辅助的或超声辅助的吸脂术及其组合。例如，本文描述的方法和装置可用于从脂肪组织分离干细胞、祖细胞、造血细胞或完全分化的细胞。
[0064] 本文描述的方法和装置可用于在位制备用于施用于患者（例如自体施用）的细胞组合物。例如，本文描述的方法和装置可用于从患者回收可以被制备用于施用的再生细胞，其在本文中被称为再生平台，然后将其施用（例如注射或手术植入）回到从其回收细胞的患者中。在某些实施方式中，可以将细胞荷载到递送装置例如注射器中，用于通过例如皮下、静脉内、肌内或腹膜内技术注射到受体中。例如，可以将再生细胞注射到血管中，以全身或局部递送至组织（例如心肌或骨骼肌）中、真皮中（皮下）、组织空间（例如心包或腹膜）中或其他位置。再生平台的注射可以导致注射位点附近的区域增大、修复、具有降低的炎症、减少的疼痛及其组合。在某些实施方式中，在施用之前向细胞添加一种或多种添加剂。例如，可以将细胞与其他细胞、生物活性化合物、生物惰性化合物、脱矿物化的骨、基质或其他可吸收支架、一种或多种生长因子或能够增强细胞群体的递送、功效、耐受性或功能的其他添加剂混合。
[0065] 所述方法和装置还可以用于制备用于生长研究、基因表达研究、分化研究或其他研究目的的细胞组合物。此外，本文描述的方法和装置可用于回收再生细胞群体（例如干细胞），使得可以通过例如用适合的培养基低温保存所述细胞来保藏细胞。对于进一步参考，参见美国专利申请公布号20100285588-A1。
[0066] 在一种实施方式中，本文描述的方法在离心力下使用多个即两个以上的加速和减速步骤来增强细胞（例如再生细胞如干细胞或祖细胞）从组织的细胞外基质解离。在离心力下的一个加速和减速步骤可以被称为一轮离心。在某些实施方式中，下列一种或多种操作也可用于增强细胞的回收：机械破坏，机械搅动，将温度维持在高于室温（≥26℃）和等于或低于42℃（例如约37℃至40℃），使用酶来降解组织，以及根据物理特性例如密度、比重和溶解性来分离组织的不同组分。在某些实施方式中，在使组织在离心力下经受两个加速和减速步骤之前将组织机械破坏（例如通过挤出）。在某些实施方式中，在组织的机械破坏后，在离心力下进行第一加速和减速步骤，以将组织分离成三个通称的层（即水性层、含有再生平台的富含细胞的基质和脂质层）。可以将富含细胞的基质取出并在离心力下经受第二加速和减速步骤。在某些实施方式中，在使富含细胞的基质经受第二加速和减速步骤之前向富含细胞的基质添加一种或多种酶（例如蛋白酶）。这样的方法减少样品体积，使得处理组织所需的酶量更少。在某些实施方式中，使一部分富含细胞的基质在离心力下经受第二加速和减速步骤，并从细胞沉淀物分离再生细胞。然后可以将从这部分富含细胞的基质分离的细胞与尚未经受进一步离心的富含细胞的基质合并。
[0067] 在本文描述的方法中，使用可以如下所述配置在倒置位置中或吊桶式配置中的可重新配置的离心机转子是特别有用的。当为倒置配置时，离心力驱动内含物朝向样品容器的外部更高部分，在静息时这些内含物返回到样品容器的内部较低部分。因此，通过加速和减速的重复循环，倒置转子提供了一种搅动样品的手段，其方式使得在静息时，在重力和无加速力下，容器的内含物驻留并朝向离心机的中心和轴移动，而在加速时，内含物跟随离心力并向外移动。当将组织与本文中描述的蛋白水解酶溶液合并，并以倒置位置放置在可重新配置的转子中的容器中时，加速和减速的重复循环促进了组织的酶解离。然而，当可重新配置的转子被配置在典型的吊桶式转子配置中时，样品容器的内含物浓缩在底部，因此搅动减少。
[0069] 相对于不使用离心力下的多个加速和减速步骤的其他方法，本文描述的方法和装置提高了从组织样品回收的细胞的得率。鉴于Kurita等，Plast.Reconst.Surg.,121:1033-1041（2008）的发现，使用本文描述的方法和装置回收的细胞的提高的得率是令人吃惊的，在所述发现中，单独地以恒定速度离心不足以从细胞外基质释放出数量增加的活的干细胞。
[0070] 图1是离心机1的一种实施方式的透视图，所述离心机具有被壁2（例如金属壁）隔开的内部腔室，由此产生内部容器4。取决于用于细胞制备物的容器的尺寸，内部容器4的直径通常为20-40cm。在内部容器4中具有轴6，其由马达8驱动以使轴6旋转。马达8通常位于内部容器4下方。控制器10可以打开或关闭马达8，并且也可如下所述用于调节内部容器4内的温度。马达8通过轴6来转动转子12，所述转子具有两个（如图所示）以上的臂，每个臂能够接受并抓住容器16，使其与转子臂14牢固连接。在一种实施方式中，转子臂14能够基于通过马达8经由轴6施加的离心力而上下摆动，并根据它们的速度而改变其位置，当轴6的每分钟转数超过某个离心力（例如20-30g）时，从竖直位置改变到完全90°的位置。在例如图5中示出的另一种实施方式中，转子臂14被设定在固定的角度θ（例如在1°至小于90°范围内的角度）。例如，角度θ可以被固定在12°。在这样的实施方式中，容器16可以以倒置取向连接于转子臂14，其中含有可取出的盖子的容器16的顶部被定向为靠近轴6的中心。
[0071] 在某些实施方式中，可以调节内部容器4的温度，以使内部容器的温度在例如26至42℃、30至42℃、35至42℃、35至40℃、37至40℃的范围内或约37℃。可以通过任何已知方法例如闭环温度反馈调节方法来调节温度。在一种实施方式中，可以将电阻丝（在图1中未示出）缠绕在内部容器4周围或包埋在其中，以便通过与电力的连接例如通过电缆对内部容器4加温。这样的电阻丝可以是加热垫的一部分，或被包埋在柔性聚合物中。为了保持温度恒定，可以使用可操作连接到控制器10的温度探头18来探测内部容器4中的温度，并通过控制器10调节内部容器4内的温度。当使用一种或多种酶时，将温度维持在35至42℃是特别有用的，因为低于该范围的温度能够减缓解离过程，而高于42℃的温度能够损坏细胞。
[0072] 控制器10可以被编程，以例如控制加速和减速步骤、启动和停止马达8以及调节温度。控制器10与电源相连（例如通过插头或电缆）。
[0073] 控制器10可以被编程以将容器16加速来获得在50x g和4,000xg之间并包括50x g和4,000x g的离心力，将所述离心力维持一段短的时间，以及在一段短的时间内将容器16减速至1x g。可以在5至180分钟（例如5至120分钟、10至100分钟、20至60分钟、
25至50分钟、30至45分钟、约30分钟或约45分钟）的时间框内施加加速/减速步骤的重复循环。例如，每个加速步骤可以进行5至20秒，每个减速步骤可以进行3至20秒。在一种实施方式中，可以进行每分钟至少三个加速至200x g并减速至1x g的循环，共30分钟。
25至50分钟、30至45分钟、约30分钟或约45分钟）的时间框内施加加速/减速步骤的重复循环。例如，每个加速步骤可以进行5至20秒，每个减速步骤可以进行3至20秒。在一种实施方式中，可以进行每分钟至少三个加速至200x g并减速至1x g的循环，共30分钟。
[0074] 图2示出了可用于增强细胞组织样品中的细胞外基质解离的各种时间循环的实例，所述组织样品被包含在如图1中示出的容器8中。可以合并图2中示出的不同模式，例如间歇打开和关闭以及在较长时间段内维持某种离心力的某些加速。
[0075] 图3A-3E示出了容器，每个容器是图1和6中所示容器16的示例性实施方式。图3A-3E中的容器适合用在离心机（例如图1或图6中示出的离心机）中。容器具有插件，当使所述容器在离心力、例如由图1的离心机1提供的离心力下经受多个加速和减速步骤时，所述插件能够帮助细胞从组织的细胞外基质解离。在图3A-3E的每个图中，容器300包含细长圆柱形中央部分302、与中央部分整体成形的闭合末端部分304和与中央部分整体成形的开口末端部分306，它们限定了内腔308。闭合末端部分304可以是基本上平坦、圆形、半球形、圆锥形或任何其他适合的形状。在某些实施方式中，容器300可以具有约10-12cm的长度。在某些实施方式中，容器300可以具有约50-60ml的体积。
[0076] 开口末端部分306包括被形成用于接受可取出的盖子312的配合部分310（例如带螺纹部分）。当可取出的盖子312连接到配合部分310上时，可取出的盖子312基本上包围并密封容器300的内腔308。在某些实施方式中，可以通过螺纹、摩擦（例如咬合式盖子（snap-on cap））、通过夹紧、通过磁力吸引、通过真空密封或通过可以将容器可逆密封的任何其他适合的机构，将盖子312连接到开口末端。
[0077] 在图3A中，容器300包含倒置的基本上圆锥形插件320。圆锥形插件320被形成为在内腔308中的倒置中空圆锥。倒置的基本上圆锥形插件320基本上与细长圆柱形中央部分302共轴，具有从闭合末端部分304近端的顶点324向开口末端部分308近端的底面326延伸的圆锥形侧壁322。
[0078] 倒置的基本上圆锥形插件320由生物相容材料构成，并且是多孔的。生物相容材料的非限制性实例包括聚酰胺（例如尼龙）；聚酯例如聚己内酯；聚苯乙烯；聚丙烯；聚丙烯酸酯；聚乙烯基化合物；聚碳酸酯；聚酮例如聚醚醚酮（PEEK）；聚四氟乙烯（PTFE，特氟龙）；thermanox；硝酸纤维素；聚原酸酯；聚氨酯；不锈钢；钛；或氧化钛（二氧化钛）。插件的孔径可以在0.5mm至5mm范围内（例如0.7至1.5mm，0.7至1.2mm，0.9至1.1mm，0.9至1.5mm，
0.9mm至2.0mm，1至3mm，2至4mm，3至5mm）。在某些实施方式中，倒置的基本上圆锥形的侧壁322可以是筛、格子框架、网状物、网、穿孔片或其他适合的生物相容的多孔基材。在某些实施方式中，倒置的基本上圆锥形插件可以是具有1mm的孔眼的网状物。
0.9mm至2.0mm，1至3mm，2至4mm，3至5mm）。在某些实施方式中，倒置的基本上圆锥形的侧壁322可以是筛、格子框架、网状物、网、穿孔片或其他适合的生物相容的多孔基材。在某些实施方式中，倒置的基本上圆锥形插件可以是具有1mm的孔眼的网状物。
[0079] 圆锥形插件230的底面322具有与细长圆柱形部分302在开口末端308处的直径基本上相同的直径。因此，将圆锥形插件320通过开口末端308插入到内部体积302中，直至底面接触开口末端306的边缘。然后将盖子312可取出地固定到开口末端306上，由此将圆锥形插件320基本上居中并固定到内腔308中。在某些实施方式中，底面326含有法兰，其可用于连接到开口末端308。底面326也可以直接固定于盖子312的底表面。底面326也可以直接固定于末端304。
[0080] 在使用中，可以将倒置的基本上圆锥形插件320插入到容器300内。可以用包含组织碎片在水性流体中的悬液的组织样品填充倒置的基本上圆锥形插件320，使得流体和比孔眼小的组织组分能够穿过圆锥形插件320，被圆柱形侧壁304和闭合末端306捕获。
[0081] 在某些实施方式中，可以向容器300添加一种或多种蛋白酶（例如一种或多种胶原酶例如I型和/或II型胶原酶，中性蛋白酶例如嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶，或其混合物），以增强细胞从组织样品的细胞外基质解离。例如，可以使用I型胶原酶、II型胶原酶和分散酶来增强细胞从细胞外基质解离。
[0082] 盖子312在施加后密封内腔308，并基本上将圆锥形插件320固定在位。通过多个加速和减速步骤促使流体和组织通过基本上圆锥形插件320的孔眼。例如，在基本上圆锥形插件320内荷载有组织样品的容器300，可以连接到图1的离心机1的转子臂14上。然后可以如图1和2的描述中所讨论的，对容器300进行加速和减速。在加速和减速的重复循环下，促使组织样品在各个方向通过插件的孔眼。这一过程将组织机械破坏，以增强细胞从细胞外基质释放。
[0083] 在图3B中，容器300包含基本上圆柱形插件340。基本上圆柱形插件340被形成为在内腔308中的圆柱体。圆柱形插件340基本上与细长圆柱形中央部分302共轴，具有从闭合末端部分304向开口末端部分306延伸的侧壁344。基本上圆柱形插件340由生物相容材料构成，并且是多孔的。适合的生物相容材料和孔径的实例如上所讨论。
[0084] 在使用中，可以将基本上圆柱形插件340插入到容器300内。可以用包含组织碎片在水性流体中的悬液的组织样品填充基本上圆柱形插件340，使得流体和比孔眼小的组织组分能够穿过圆柱形插件340，被细长圆柱形中央部分302和闭合末端304捕获。如上所讨论的，也可以向容器添加一种或多种酶。盖子312在施加后密封内部体积308，并基本上将圆柱形插件340固定在位。然后可以如图1和2的描述中所讨论的，对容器300进行加速和减速。在加速和减速的重复循环下，促使组织样品在各个方向通过插件的孔眼。这一过程将组织机械破坏，以增强细胞从细胞外基质释放。
[0085] 在图3E中，容器300含有将容器分成上部和下部部分的插件345。插件由生物相容材料构成，并且是多孔的。适合的生物相容材料和孔径的实例如上所讨论。可以使用例如由橡胶制成的环将插件保持在位。在使用中，将含有组织碎片在水性流体中的悬液的组织样品荷载到容器的上部或下部部分中，并经受多个加速和减速步骤，以增强细胞从细胞外基质解离。也可以与组织样品一起加入一种或多种酶。
[0086] 现在参考图3C，容器300在内腔308中包含多个粒子350。球粒的直径为至少100微米，并由一种或多种生物相容材料构成或涂覆有一种或多种生物相容材料。生物相容材料的非限制性实例包括聚酰胺（例如尼龙）；聚酯例如聚己内酯；聚苯乙烯；聚丙烯；聚丙烯酸酯；聚乙烯基化合物；聚碳酸酯；聚酮例如PEEK；PTFE；thermanox；硝酸纤维素；聚原酸酯；聚氨酯；不锈钢；钛；氧化钛（二氧化钛）；和玻璃。在某些实施方式中，所述多个粒子350可以包括具有不同比重、形状或表面特性的粒子。在一种实施方式中，所述多个粒子350可以包括光滑的聚苯乙烯珠子和具有铁涂层的粒子。
[0087] 在使用中，将含有组织碎片在水性流体中的悬液的组织样品和粒子350荷载到容器300中并用盖子312密封。在某些实施方式中，在用盖子密封之前还向容器添加一种或多种酶。然后将容器荷载到图1的离心机1中并经受多个加速和减速步骤，所述加速和减速步骤引起粒子350被搅动，并增强细胞从细胞外基质释放。
[0088] 图3D示出了含有插件的容器300的另一个实例，其中将轴370竖直布置在容器的内腔308中。轴370包括沿着轴370的长度布置并从轴370基本上径向延伸到腔308中的多个臂372。如图3D中所示，臂372可以具有不同的形状和/或尺寸。
[0089] 在某些实施方式中，轴370可以固定于可取出的盖子312。轴370可以可旋转地固定于容器或可取出的容器盖子312。例如，轴370可以可旋转地固定于并延伸通过盖子312，使得可以从容器外部抓住轴370并使轴370旋转以搅动组织样品。在某些实施方式中，轴370可以可旋转地固定于盖子312，并且可以偏心配重以使轴370可以在重力或离心力下旋转。在某些实施方式中，轴370可以可旋转地固定于盖子312，并且一个或多个臂372可以包括磁体，以便轴370可以磁性偶联到容器外部的磁场。通过相对于容器旋转磁场，可以促使轴370在内腔308中旋转，以搅动组织样品。在某些实施方式中，轴370可以在腔308内竖直移动，使得臂372可以上下穿过组织样品。在某些实施方式中，臂是锋利的刀片。
[0090] 在一种实施方式中，可以将含有组织碎片在水性流体中的悬液的组织样品荷载到容器300中，并将连接有轴370的盖子312固定以密封开口末端，以便将沿着轴370的长度布置的臂372插入到内腔308和组织样品中。也可以与组织样品一起添加一种或多种酶。然后可以如本文中讨论的使容器300经受多个加速和减速步骤。当使组织样品经受多个加速和减速步骤时，轴370和相连的臂372可以增强细胞从组织样品的细胞外基质解离。
[0091] 图4示出了第一容器300、第二容器404和偶联装置406的容器组件400的实例。在图4示出的实施方式中，组件400包括图3A的容器300以及容器404。在某些实施方式中，容器300可以是图3B-3E中示出的任何容器。容器404包括细长圆柱形中央部分408、与中央部分408整体成形的第一末端部分410和与中央部分408整体成形的第二开口末端部分412，它们限定了内腔414。
[0092] 在某些实施方式中，端口432可以从细长圆柱形部分408向外径向延伸，并提供从内腔414延伸到外部的流体通道。这样的端口也可以包括多孔插件434。在某些实施方式中，多孔插件可以具有约0.2微米的孔眼，所述孔眼可以允许空气穿过但是防止污染物进入内腔414。
[0093] 第一末端部分410缩窄成狭窄开口416，并在狭窄开口416处含有从末端部分410突出的收集部分418。收集部分418能够接收并储存流体，并包含用于将第一末端部分410密封以与收集部分418隔开的可取出的塞子420。可取出的塞子420允许流体在离心力、压力、使用酶进行解离或物理取出后从末端部分410流入收集部分418。在某些实施方式中，可取出的塞子是可以被启动以提供通往收集部分的入口的阀。在某些实施方式中，可以将收集部分与第一末端部分拆开。
[0094] 在某些实施方式中，收集部分418包含通过可取出的塞子420与内腔414隔开的水性流体。例如，收集部分418可以包含无菌盐水、缓冲液、细胞培养基、一种或多种生物活性化合物、一种或多种生物惰性化合物、脱矿物化的骨、基质或其他可吸收支架、一种或多种生长因子或能够增强细胞群体的递送、功效、耐受性或功能的其他添加剂。
[0095] 第二末端部分可以含有配合部分（例如带螺纹部分），以便可以连接盖子以基本上密封容器。
[0096] 可以使用偶联装置406将容器404可取出地连接到容器300，所述偶联装置406包含具有第一和第二开口末端424的管状中央部分422，以及水平延伸跨过偶联装置406的多孔插件426。每个开口末端424包括配合部分（例如带螺纹部分）。多孔插件具有40至500微米的孔径，并水平延伸跨过偶联装置406，使得多孔插件426将内部体积308与内部体积414基本上隔开。在某些实施方式中，可以将两个以上的多孔插件相互叠加布置。例如，具有相对较大孔径的多孔插件可以被布置成更接近于容器300，而具有相对较小孔径的多孔插件可以被布置成更接近于容器404。因此，当从容器300流向容器404的流体和粒子穿过多孔插件426时，它们可以穿过逐渐变小的孔眼。
[0097] 偶联装置406还可以包含从管状中央部分422向外径向延伸的端口428，以提供始于偶联装置内部的流体通道。端口可以包括孔径为0.2至500微米的多孔插件430。在某些实施方式中，多孔插件430可以具有约0.2微米的孔眼，所述孔眼可以允许空气进入偶联装置406的内部，但是过滤掉否则可以污染容器300、404或组织样品的细菌和颗粒物质。
[0098] 偶联装置的一个配合部分可以连接于容器300的配合部分，偶联装置的另一个配合部分可以连接于容器404的配合部分。在容器300和404的开口末端部分带有螺纹的实施方式中，偶联装置406在每个末端带有螺纹，以允许将容器300和404通过它们的带螺纹部分螺纹连接到偶联装置406中。在某些实施方式中，将容器300和404预先组装，以使由第一容器和第二容器限定的内部空间为至少部分真空。
[0099] 在使用中，可以将容器300与偶联装置406拆开并荷载入组织样品、缓冲液（例如乳酸盐林格（Ringer）溶液）和任选的酶。施加盖子（例如盖子312）以可取出地密封容器300。容器300和其中的组织样品可以如上所讨论的在离心机1中进行处理。在如上所讨论的使包含在容器300中的样品经受多个加速和减速步骤之后，可以取出盖子312并可以将偶联装置406连接于容器300和容器404。通过将容器组件倒置并向端口432施加负压，可以迫使容器300内的液体组分进入容器404。例如，可以将一小段管线连接到端口432，并使用注射器（例如使用Luer连接）施加抽吸以在容器404中产生负压，以便迫使容器300中的流体和流体内的细胞通过多孔插件426并进入容器404的内腔414。
[0100] 在转移到容器404之后，可以将容器300与偶联装置拆开，并且可以将偶联装置与容器404拆开。可以将盖子可取出地连接于配合部分420，以基本上密封容器404。然后可以通过将容器在400至4000xg下离心，将从细胞外基质解离的细胞从其他细胞组分中回收。在某些实施方式中，将细胞收集在容器404的收集部分418中。
[0101] 在某些实施方式中，在400至4,000x g下的离心可以作为使用离心机1执行的第二程序来进行。例如，第二程序可以被编程到控制器10中。在其中盖子被定向为朝向转子的中心并且收集部分418被定向为远离该中心的固定角度实施方式中，可以将容器404插入到转子臂14中。可以使用约400x g至4,000x g（例如400至1,000x g）的离心力将容器404离心约5至10分钟。以这样的离心力离心允许将细胞分离并收集在收集部分418处。
[0102] 在某些实施方式中，一种或多种细胞分离试剂、包括磁性珠子或抗体或其抗原结合片段，可以与本文描述的方法和装置联合使用。例如，可以使用对特定细胞类型具有结合亲和性的抗体，从被收集在收集部分内的细胞回收所述类型的细胞。在某些实施方式中，这样的细胞分离试剂被包含在容器300内。在某些实施方式中，这样的细胞分离试剂被包含在容器404内。
[0103] 在某些实施方式中，使组织样品在离心力下经受一个加速和减速步骤以制备富含细胞的基质，然后使所述富含细胞的基质经受一个或多个加速和减速步骤。例如，可以将容纳在组织收集容器中的组织样品离心，以产生其中包含再生平台的富含细胞的基质。再生平台是指浓缩物中的再生细胞例如干细胞、祖细胞和/或造血细胞。US2010/0124563Al中给出了这样的细胞制备物的实例。组织样品可能具有遍及整个组织样品的再生平台；然而，离心导致组织样品形成其中具有浓缩量的再生平台的富含细胞的基质。例如，在将组织收集容器中的组织样品离心后，形成3个通称的层（例如水性层、具有再生平台的富含细胞的基质和脂质层）。富含细胞的基质一般位于脂质层与水性层之间。在提取水性层后，可以从组织收集容器容易地提取富含细胞的基质（例如使用闭合系统），用于富含细胞的基质的进一步使用。
[0104] 可以使用自动组织处理单元来离心组织样品。例如，可以使用其中具有可取出的旋转装置的自动组织处理单元来产生离心力，其中所述可取出的旋转装置被配置成在自动组织处理单元内旋转。自动组织处理单元可以包含用于控制所述单元内的温度的温度控制装置。
[0105] 图8是可以被插入到自动组织处理单元（未示出）中的可取出的旋转装置500的顶视图。可以将组织收集容器502可拆卸地插入到可取出的旋转装置500中，并通过锁定机构504（例如可咬合的锁定机构）保持在位。在这里，组织收集容器502咬合在腔506中。在一种非限制性实施方式中，可以将组织收集容器502定制成可咬合地配备在腔506中，并通过可咬合的锁定机构504保持在位。组织收集容器502被定向成使得组织收集容器502的开口512离中心最远。富含细胞的基质的形成可以形成在开口512附近，并且可以通过开口从组织收集容器502容易地提取富含细胞的基质，而不会对富含细胞的基质造成额外的污染。
[0106] 可取出的旋转装置500可以具有至少两个腔（在这里示出为506、508），或者在另一种非限制性实施方式中可以具有最多约8个腔。每个腔506、508可以为水平取向，并且可以具有可拆卸的机构用于将组织收集容器502插入到腔506、508中。可拆卸机构可以是但不限于咬合机构、尼龙搭扣（Velcro）等及其组合。在另一种非限制性实施方式中，可取出的旋转装置500可以具有或包含可高温高压灭菌的材料，以便将可取出的旋转装置500配置成可高温高压灭菌的。
[0107] 图9是可以被插入到自动组织处理单元（未示出）中的可取出的旋转装置500的侧视图。组织收集容器502被示出在腔506内，并通过锁定机构504保持在位。应该认识到，图8-9中示出的可取出的旋转装置不是按标度或比例的，并且出于说明的目的可能将其某些特征夸大或歪曲了。
[0108] 自动组织处理单元也可以具有用于通过可取出的旋转装置的至少一种预定的规格识别特定可取出的旋转装置的机构。在一种实施方式中，可取出的旋转装置可以具有连接的RFID标签。在将可取出的旋转装置放置到自动组织处理单元中之后，可以对RFID标签进行扫描，以被自动组织处理单元识别。在另一种实施方式中，可以测量并记录自动组织处理单元中可取出的旋转装置的规格，例如但不限于与加速相关的功率要求、重量、风阻力及其组合。测量到的规格可以被储存作为自动组织处理单元的软件程序和/或软件包的一部分，其能够使自动组织处理单元通过这样的规格数据识别可取出的旋转装置。
[0109] 组织样品可以被容纳在适合于自动组织处理单元的第一组织收集容器中。组织样品可以具有或包含组织碎片在水性流体中的悬液。在一种非限制性实施方式中，可以在将组织样品置于第一组织收集容器中之前将组织样品挤出。可以将组织样品通过直径独立地在约1mm至约4mm范围内、或者可选地独立地在约1.5mm至约3mm范围内的孔挤出1至20次，或者可选地约2次至约10次。与除了不将组织样品挤出之外其他方面都一致的方法相比，在使组织样品经受加速轮次之前将组织样品挤出，产生具有更高的再生平台浓度的富含细胞的基质。当在本文中针对范围使用时，“独立地”是指可以将任何下限阈值与任何上限阈值一起使用，以给出适合的可替范围。
[0110] 可以使用自动组织处理单元使组织样品经受离心，以获得独立地在约200x g至约2000x g范围内、或可选地至少400x g的离心力。离心可以进行独立地在约3分钟至约60分钟范围内、或至少约5分钟的一段时间。在离心后，可以形成富含细胞的基质。
[0111] 可以通过闭合系统方法将富含细胞的基质从第一组织收集容器转移到第二收集容器中。这样的闭合系统方法可以包括但不限于在第一收集容器与第二收集容器之间的机构例如leur连接器、针状端口、针或其组合。闭合系统转移方法防止包含再生平台的富含细胞的基质被组织样品和/或组织收集容器外部的任何其他病原体污染，例如但不限于防止细菌、病毒等进入组织收集容器或富含细胞的基质。闭合系统降低了在如上所述将组织样品施用回到对象中之前对富含细胞的基质进行附加步骤的必要性。当在本文中使用时，“第一组织样品容器”和“第二组织样品容器”的数字符号表示容器的使用次序。容器可以是相同类型的容器或不同类型的容器，例如小瓶或离心管。
[0112] 然后可以如上所述使第二组织收集容器另外经受至少一个加速和减速步骤。每一轮加速和减速可以进行到获得至少约10x g的速率。或者，加速和减速的速率可以发生在独立地约10x g至约400x g，或者在另一种非限制性实施方式中独立地约20x g至约40x g范围内的速率。在一种非限制性实施方式中，加速和减速的每分钟轮数可以在约每分钟1轮至约每5分钟1轮的范围内，或者可选地至少约每分钟3轮。在另一种非限制性实施方式中，在许多轮加速和减速、或可选地至少两轮加速和减速后，富含细胞的基质可以被分散开。
[0113] 在某些实施方式中，可以向第二组织容器添加一种或多种蛋白酶（例如一种或多种胶原酶例如I型和/或II型胶原酶，中性蛋白酶例如嗜热菌蛋白酶，胰蛋白酶或其混合物）。一种或多种蛋白酶可以通过重组产生。例如，可以以独立地在每ml约0.5Wunsch单位胶原酶至每ml约4.0Wunsch单位胶原酶范围内，或可选地独立地在每ml约1.0Wunsch单位胶原酶至每ml约3.0Wunsch单位胶原酶范围内的量，向第二组织收集容器添加一种或多种胶原酶。在蛋白酶存在下加速并随后减速的间歇轮次，可以将富含细胞的基质的再生平台分散开。
[0114] 在加速和减速步骤后，可以将富含细胞的基质过滤并洗涤，以获得可以如上所述通过植入或注射施用回到对象中的再生平台。例如，可以将富含细胞的基质过滤以获得可注射的再生平台，其中为了将再生平台注射到对象中，必须执行数个或者不执行附加步骤。
[0115] 将参考下面的实施例对本发明进行进一步描述，所述实施例不旨在限制本发明，而是进一步说明各种实施方式。
[0116] 实施例
[0117] 实施例1
[0118] 从绝育手术后丢弃的组织获得新鲜的狗网膜脂肪组织。将组织用无菌剪刀剪碎，然后等分（约2g/管）到50mL无菌离心管中。加入含有细菌胶原酶I和II与分散酶合在一起的掺混物的无菌乳酸盐林格溶液，然后将管随机分配到在摇床（60rpm）中温育或分配到在固定转子中的加热组织处理装置（TPA，每分钟3个1x g到200x g再到1x g的循环）。将温度维持在37-40℃之间，并将温育/处理进行30min。
[0119] 在处理后，使解离的组织浆液穿过100μm滤器，并通过在TPA中以400x g离心2
10min，从滤液回收细胞级分。将细胞级分铺在25cm 组织培养瓶中，在含有抗生素和抗真菌剂的DMEM/20%（v/v）胎牛血清（FBS）中在37℃下生长2天。在培养2天后，使用血细胞计数器对粘附细胞进行计数。图6是使用TPA和使用摇床处理后获得的粘附细胞的数量的条形图。与在摇床上进行解离时相比，用TPA处理组织导致2.6倍的提高。
10min，从滤液回收细胞级分。将细胞级分铺在25cm 组织培养瓶中，在含有抗生素和抗真菌剂的DMEM/20%（v/v）胎牛血清（FBS）中在37℃下生长2天。在培养2天后，使用血细胞计数器对粘附细胞进行计数。图6是使用TPA和使用摇床处理后获得的粘附细胞的数量的条形图。与在摇床上进行解离时相比，用TPA处理组织导致2.6倍的提高。
[0120] 实施例2
[0121] 在患者知情同意下，从经历选择性抽脂术的患者获得新鲜的人类脂肪抽吸物。使用无菌不锈钢滤器引流组织，然后将其等分（约10g/管）到带有（参见图3A、3D和3E）或不带有由孔径为1mm的尼龙网制成的插件的50ml无菌离心管中。加入含有细菌胶原酶I和II与分散酶合在一起的掺混物的无菌乳酸盐林格溶液，然后将管随机分配到在摇床（60rpm）中温育或分配到在吊桶式转子中的加热TPA（每分钟3个1x g到200x g再到1x g的循环）。将温度维持在37-40℃之间，并将温育/处理进行30min。
[0122] 在处理后，使解离的组织浆液穿过100μm滤器，并通过在TPA中以400x g离心2
10min，从滤液回收细胞级分。将细胞级分铺在25cm 组织培养瓶中，在含有抗生素和抗真菌剂的DMEM/20%（v/v）FBS中生长2天。在培养2天后，使用血细胞计数器对粘附细胞进行计数。图7是使用TPA和三种不同插件处理后或使用摇床处理后获得的粘附细胞的数量的条形图。结果表明，用TPA处理组织与在摇床上进行解离相比，导致2.6倍的提高。通过在TPA中处理并使用圆锥形插件（例如图3A）获得的细胞得率，与通过在摇床中处理获得的细胞得率相似。
10min，从滤液回收细胞级分。将细胞级分铺在25cm 组织培养瓶中，在含有抗生素和抗真菌剂的DMEM/20%（v/v）FBS中生长2天。在培养2天后，使用血细胞计数器对粘附细胞进行计数。图7是使用TPA和三种不同插件处理后或使用摇床处理后获得的粘附细胞的数量的条形图。结果表明，用TPA处理组织与在摇床上进行解离相比，导致2.6倍的提高。通过在TPA中处理并使用圆锥形插件（例如图3A）获得的细胞得率，与通过在摇床中处理获得的细胞得率相似。
[0123] 实施例3
[0124] 从经历选择性抽脂术的人类患者获得脂肪抽吸物样品。将脂肪抽吸物转移至多个具有20cc容积的组织收集容器中。将每个组织收集容器的脂肪抽吸物内含物通过微乳化针挤出5次。然后将来自于每个组织收集容器的挤出的脂肪抽吸物转移到独立的组织收集容器中。然后将组织收集容器置于在自动组织处理单元内的可取出的旋转装置的腔中。可取出的旋转装置允许组织收集容器维持水平位置，同时自动组织处理单元向组织收集容器的内含物施加加速和离心力。离心力以约400x g、约700x g、约1200x g的速率施加30分钟，或以约2000x g的速率施加30分钟。对于每种离心力速率，使用两个组织收集容器的内含物。
[0125] 在离心后，将每个组织样品收集容器内具有再生平台的富含细胞的基质与剩余的组织样品分离开。对于每个样品，取出并测量油层、脂肪抽吸物级分和水性级分的体积。将脂肪抽吸物层置于独立的50cc圆锥形离心管中。
[0126] 作为对照样品，将约5g未处理的、即既未挤出也未离心的脂肪抽吸物转移到2个组织收集容器的每一个中。将容器称重，并记录转移的脂肪抽吸物的重量。以每个组织收集容器5mL的量向未处理过的脂肪抽吸物添加包含胶原酶和分散酶的林格乳酸盐溶液。然后将组织收集容器在约37℃和约60rpm的摇床中放置约30min，以将未处理过的脂肪抽吸物分散开。然后使分散后的组织样品穿过100μm steriflip滤器。然后将过滤后的组织以约600x g的速率离心约10分钟以回收再生细胞。将回收的细胞置于含有20%（v/v）胎牛血清的最低必需培养基（MEM）中培养24小时。通过血细胞计数器对粘附细胞进行计数。
[0127] 如图10中所述，在离心前将组织样品挤出产生更高的每克组织的细胞数量。图11说明，不论在离心之前是否将组织挤出，以1200x g离心在提高富含细胞的基质内的细胞浓度方面具有累加效果。
[0128] 图12说明，更长的组织样品离心时间量产生更高的每克富含细胞的基质的细胞数量。图13说明，与400x g加速度或完全不离心时相比，1200x g加速度产生更高的每单位富含细胞的基质的细胞浓度。
[0129] 实施例4
[0130] 将新鲜的人类脂肪抽吸物分成两份等分试样。使用与在美容手术中制备脂肪抽吸物来源的脂肪移植物时通常采用的条件相似的条件来处理等分试样1（“对照方法”）。将脂肪抽吸物以200x g离心2分钟。等分试样2（“富含细胞的基质”（CEM）方法）通过首先将脂肪抽吸物跨过连接在两个注射器之间的luer挤出5次，然后将挤出的脂肪抽吸物以1200x g离心30分钟来进行处理。在离心后，两种方法都导致分级成上部油层、中间组织层和下部水性层。收集每个等分试样的中间组织层级分。将来自于每种方法的一部分收集的组织层级分荷载到单个1cc注射器中，并皮下施用到雌性免疫缺陷NU/NU小鼠的颈背区域中（n=3只小鼠/制备物）。
[0131] 将来自于每种方法的另一部分组织层级分在37℃下用胶原酶I和II与分散酶的掺混物进行处理，通过100μm滤器过滤，然后以600x g离心，以获得再生细胞。测定新鲜细胞制备物中活的再生细胞的数量以及培养24h时塑料粘附细胞的数量。在植入后1个月时，将小鼠处死并对移植物进行评估。
[0132] 与对照方法相比，通过CEM方法处理导致新鲜制备物中活细胞的浓度高达2.2倍，塑料粘附细胞的浓度高达5.5倍。参见表1。这种细胞富集转变成1个月时移植物的生存力更高，正如在注射有使用CEM方法获得的细胞制备物的小鼠中的血管化和不存在油袋所证实的。
[0133] 表1
[0134]方法 活细胞/g组织 粘附细胞/g组织
对照 2.82x105 5.35x104
CEM 6.16x105 2.94x105
对照 2.82x105 5.35x104
CEM 6.16x105 2.94x105
[0135] 其他实施方式
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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| 一种面向虚拟化实例的启动配置实施方法 | 2020-05-11 | 429 |
| 的用途，包括但不限于癌症、狼疮、过敏性疾病、生产具有BTK抑制活性的嘧啶和吡啶化合物 Sjogren氏病和类风湿关节炎。在优选实施例中，的组合物和方法 本发明描述了不可逆激酶抑制剂，包括但不限于 | 2020-05-12 | 667 |
| 基于姿势的搜索方法及系统 | 2020-05-13 | 299 |
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