NF-YC9蛋白在调控植物对ABA耐受性中的应用
阅读：199发布：2020-05-08
专利汇可以提供NF-YC9蛋白在调控植物对ABA耐受性中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了NF‑YC9蛋白在调控 植物 对ABA耐受性中的应用。本发明所提供的应用具体为NF‑YC9蛋白或其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用；所述NF‑YC9蛋白的 氨 基酸序列可如序列3所示。本发明实验证明，NF‑YC9蛋白过表达后植物对ABA的耐受性降低。因而可将其作为一种研究重要基因调控作物生长发育及逆境胁迫的生长研究模型，有助于深入阐明正负调节因子调控植物对ABA 信号 的响应 水 平以及调控植物生长和抗逆性以达到满足农业生产所需要的分子机制，从而为实际农业生产提供理论支持。本发明符合 可持续农业 发展需求，对于研究植物耐受ABA的分子机制、 农作物 改良遗传特性等方面具有重要的实用价值和市场前景。，下面是NF-YC9蛋白在调控植物对ABA耐受性中的应用专利的具体信息内容。
1.NF-YC9蛋白或其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用；
所述NF-YC9蛋白为氨基酸序列为序列表中的序列3的蛋白质；
所述植物为双子叶植物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物对ABA耐受性体现为：所述植物对ABA的耐受性随着所述NF-YC9蛋白的表达量的升高而降低。
3.NF-YC9蛋白或其编码基因在选育对ABA耐受性降低的植物品种中的应用；
所述NF-YC9蛋白为氨基酸序列为序列表中的序列3的蛋白质；
所述植物为双子叶植物。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述NF-YC9蛋白的编码基因是如下任一所述的DNA分子：
(B1)序列表中序列2的第602-1297位所示的DNA分子；
(B2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(B3)序列表中序列1所示的DNA分子。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥。
7.培育对ABA耐受性降低的植物的方法，包括使受体植物中NF-YC9蛋白的表达量提高的步骤；
所述NF-YC9蛋白为氨基酸序列为序列表中的序列3的蛋白质；
所述植物为双子叶植物。
8.培育对ABA耐受性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入NF-YC9蛋白的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性降低；
所述NF-YC9蛋白为氨基酸序列为序列表中的序列3的蛋白质；
所述植物为双子叶植物。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述NF-YC9蛋白的编码基因是如下任一所述的DNA分子：
(B1)序列表中序列2的第602-1297位所示的DNA分子；
(B2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(B3)序列表中序列1所示的DNA分子。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述NF-YC9蛋白的编码基因通过含有所述NF-YC9蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中。
11.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥。
NF-YC9蛋白在调控植物对ABA耐受性中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 脱落酸(Abscisic Acid，ABA)是植物体内重要的激素之一，其在植物生长发育的各阶段都发挥重要作用，包括种子休眠、萌发，幼苗生长，气孔运动，以及营养生长向生殖生长转换等过程。同时，ABA在植物应对外界各种逆境胁迫响应中起着重要作用，例如干旱、冷、高温、盐以及机械伤害等非生物胁迫以及病虫害等生物胁迫。因此植物ABA信号转导通路分子机制的阐明对调控植物生长、提高作物品质、改良遗传特性、促进现代农业生产发展具有重要的意义。
[0003] 植物体内ABA信号转导网络极其复杂，近年来，植物中ABA受体及其信号转导功能组分的筛选与鉴定、ABA生物代谢及转运以及ABA信号转导通路模型的构建及与其它植物激素间的交叉对话等研究均取得了重要进展，有力推动了植物中ABA信号转导调控机理的阐明。到目前为止，研究人员分别鉴定出了三种不同的ABA受体或候选受体：镁螯合酶H亚基CHLH/ABAR、START超家族中的PYR/PYL/RCAR受体以及G蛋白偶联受体GTG1、GTG2以及其他跟ABA信号转导有关的ABA响应基因也被鉴定出来。这些ABA响应基因既包括正调节子也包括负调节子，如各类转录因子、蛋白激酶、磷酸酶以及部分第二信使(钙离子信号、环核苷酸、活性氧、磷脂类)等，这些ABA受体以及响应基因的发现加深了人们对ABA作用机制的认识，对现代农业生产发展具有重要的应用价值。
[0004] 核因子Y(nuclear factor Y,NF-Y)，又称CCAAT盒结合因子(CCAAT-binding factor,CBF)或亚铁血红素激活蛋白(heme activator protein,HAP)，是一类普遍存在于酵母、动物、植物等真核生物中的转录因子，通常由三种不同亚基组成，即NF-YA(CBF-B或HAP2)、NF-YB(CBF-A或HAP3)和NF-YC(CBF-C或HAP5)。NF-YA、NF-YB和NF-YC均包含一个十分保守的区域。这些保守区域是DNA结合或蛋白-蛋白互作的功能域，其中NF-YB和NF-YC具有一段类似于组蛋白折叠元件(HFM)的保守域，形成紧密二聚体。三者通过形成异源三聚体复合物，并与其他调控因子相互作用，激活或抑制下游基因的表达。植物NF-Y家族在进化上不断扩张，通常是由多个基因编码同一类亚基，因而植物NF-Y所形成的异源三聚体数目十分庞大。
[0005] 近年来的研究发现植物NF-Y在胚胎发育、光合作用、开花时间调控、逆境胁迫响应等诸多方面起重要作用。但是目前尚未报到拟南芥NF-YC转录因子参与ABA所介导的种子萌发后幼苗生长过程，其对ABA的耐受性以及各种逆境胁迫响应方面研究得非常不清楚，还有着很大的研究空间。
[0006] 随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的正负调节因子改变植物对ABA信号的响应水平和耐受性，控制植物幼苗生长发育和抗逆性以达到农业生产所需要的状态成为研究前沿，从而有助于。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种NF-YC9蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。
[0008] 本发明所提供的应用，具体为如下A或B：
[0009] A.NF-YC9蛋白或其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。
[0010] 其中，所述调控植物对ABA耐受性具体体现为：植物对ABA的耐受性随着NF-YC9蛋白的表达量的升高而降低。
[0011] B.NF-YC9蛋白或其编码基因在选育对ABA耐受性降低的植物品种中的应用。
[0012] 所述选育对ABA耐受性降低的植物品种的方法，具体可包括将所述NF-YC9蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0013] 所述NF-YC9蛋白为如下任一所示蛋白质：
[0015] (A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0016] (A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
[0017] (A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
[0018] 本发明的另一个目的是提供一种培育对ABA耐受性降低的植物的方法。
[0019] 本发明所提供的培育对ABA耐受性降低的植物的方法，包括使受体植物中NF-YC9蛋白的表达量提高的步骤。
[0020] 更进一步，本发明所提供的培育对ABA耐受性降低的植物的方法具体为培育对ABA耐受性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入NF-YC9蛋白的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性降低。
[0021] 所述NF-YC9蛋白为如下任一所示蛋白质：
[0022] (A1)氨基酸序列为序列表中的序列3的蛋白质；
[0023] (A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0024] (A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
[0025] (A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
[0026] 在上述应用或方法中，所述NF-YC9蛋白的编码基因具体可为如下任一所述的DNA分子：
[0027] (B1)序列表中序列2的第602-1297位所示的DNA分子；
[0028] (B2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0029] (B3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0030] (B4)在严格条件下与(B1)-(B3)中任一限定的DNA分子杂交且编码所述NF-YC9蛋白的DNA分子；
[0031] (B5)与(B1)-(B4)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述NF-YC9蛋白的DNA分子。
[0032] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0033] 其中，序列1由1795个核苷酸组成，为所述NF-YC9基因在拟南芥基因组中序列；序列2由1613个核苷酸组成，为所述NF-YC9基因的cDNA序列，其中第602-1297位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由231个氨基酸残基组成。
[0034] 在所述方法中，所述NF-YC9蛋白的编码基因可通过含有所述NF-YC9蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中。
[0035] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0036] 在上述方法中，将携带有所述NF-YC9基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0037] 在上述应用或方法中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物进一步可为十字花科植物，具体如拟南芥。
[0038] 本发明研究发现NF-YC9蛋白是ABA信号传导的重要正调节子。NF-YC9蛋白过表达后其对ABA的耐受性降低。通过基因工程手段改变农作物中NF-YC9蛋白的表达量，将其作为一种研究其它具有调控重要农业性状的功能基因调控作物生长、发育以及逆境胁迫的生长模型，从而有助于深入阐明正负调节因子调控植物对ABA信号的响应水平很耐受性以及控制植物生长和抗逆性以达到满足农业生产所需要的分子机制，从而为实际农业生产提供理论支持。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物耐受ABA的分子机制、农作物改良遗传特性等方面具有重要的实用价值和市场前景。附图说明
[0039] 图1为NF-YC9基因相关T-DNA插入突变体nf-yc9-1的鉴定。测序比对结果，突变体nf-yc9-1插入在NF-YC9基因的5’端非翻译区位置。
[0040] 图2为用实时荧光定量PCR检测各遗传材料NF-YC9基因表达量的分析结果。从图中可以看出nf-yc9-1为基因敲除突变体，OE1中NF-YC9 mRNA表达量是野生型(Col-0)的近12倍，OE6中NF-YC9 mRNA表达量是野生型(Col-0)的近7倍。
[0041] 图3为ABA对NF-YC9各遗传材料幼苗生长的影响分析结果。
[0042] 图4为图3中ABA对NF-YC9各遗传材料幼苗根长观察分析。
[0043] 图5为图4中根长统计。
具体实施方式
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
[0047] NF-YC9两个过表达lines OE1和OE6为新加坡国立大学淡马锡生命科学院生物科学系于浩博士馈赠，为向拟南芥野生型(Col-0生态型)中导入NF-YC9基因后得到的(无其他外源基因导入)，具体构建过程参照该实验室已发表文献“Hou X,Zhou J,Liu C,Liu L,Shen L,Yu H(2014)Nuclear factor Y-mediated H3K27me3 demethylation of the SOC1 locus orchestrates flowering responses of Arabidopsis.Nature Communications5:4601doi:10.1038/ncomms5601”正文部分第12页右栏第三段。
[0048] 拟南芥野生型(Col-0生态型)：拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia-0)，为拟南芥生物研究中心(ABRC)的产品。
[0049] NF-YC9基因敲除突变体nf-yc9-1，为拟南芥生物研究中心(ABRC)的产品，背景为拟南芥野生型(Col-0生态型)，编号为SALK_058903。
[0050] 实施例1、NF-YC9转基因植物的获得及鉴定
[0051] 本实施例中所涉及的NF-YC9基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由1795个核苷酸组成；所述NF-YC9基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由1613个核苷酸组成，其中第602-1297位为编码序列(CDS)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由231个氨基酸残基组成。
[0052] 一、NF-YC9基因敲除突变体鉴定
[0053] NF-YC9基因敲除突变体T-DNA插入突变体，名称为nf-yc9-1，购买自拟南芥生物研究中心(Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC))，http://www.arabidopsis.org/)，背景为拟南芥野生型(Col-0生态型)。通过PCR技术鉴定出纯合体。
[0054] PCR鉴定后的结果与TAIR网站(http://www.arabidopsis.org/)预测的插入位置一致，nf-yc9-1突变体中的T-DNA插入在NF-YC9基因起始密码子(ATG)前5’端非翻译区(图1)。
[0055] 所用引物序列如下：
[0056] nf-yc9-1LP：5’-CTATTGGAGCAGTTCCTGCAG-3’(Left primer,LP)
[0057] nf-yc9-1RP：5’-AACCAGTCTCTTCCCCTTCAG-3’(Right primer,RP)
[0058] LBb1.3：5’-TTGCCGATTTCGGAAC-3’(Left border primer,LB)
[0059] 二、NF-YC9过表达lines OE1和OE6及突变体nf-yc9中NF-YC9基因表达量分析[0060] NF-YC9两个过表达lines OE1和OE6为新加坡国立大学淡马锡生命科学院生物科学系于浩博士馈赠，为向拟南芥野生型(Col-0生态型)中导入NF-YC9基因后得到的(无其他外源基因导入)，具体构建过程参照该实验室已发表文献“Hou X,Zhou J,Liu C,Liu L,Shen L,Yu H(2014)Nuclear factor Y-mediated H3K27me3 demethylation of the SOC1 locus orchestrates flowering responses of Arabidopsis.Nature Communications5:4601 doi:10.1038/ncomms5601”正文部分第12页右栏第三段。
[0061] 提取拟南芥野生型(Col-0生态型)与T-DNA插入突变体nf-yc9-1，过表达植株OE1和OE6的总RNA，利用实时荧光定量PCR检测材料中NF-YC9基因在转录水平上表达情况。具体如下：
[0062] 以NF-YC9两个过表达lines OE1和OE6，T-DNA插入突变体nf-yc9-1，以及拟南芥野生型(Col-0生态型)平皿中生长10天的幼苗做为实验材料。提取各实验材料的基因组RNA，分别通过实时荧光定量PCR方法分析NF-YC9基因在各实验材料中的表达情况。其中，扩增NF-YC9基因的引物序列为：
[0063] NF-YC9-RT-F1：5’-TTCCACCAGATCCATCAGCA-3’；
[0064] NF-YC9-RT-R1：5’-TCCGCCTCTTATTCTCCTCA-3’。
[0065] 以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Act in的引物序列为：
[0066] Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
[0067] Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
[0068] 上述引物的反应条件如下:
[0069] (1)反应体系的建立
[0070] 实时荧光定量PCR反应体系
[0071]
[0072] (2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。
[0073] (3)反应程序的设定：
[0074] 实时荧光定量PCR反应程序
[0075]
[0076]
[0077] (4)数值分析，以2-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各个基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。
[0078] NF-YC9相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图2所示，NF-YC9基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型(Col-0)的NF-YC9基因的表达为1。从图中可以看出，T-DNA插入突变体nf-yc9-1中NF-YC9基因在转录水平上调低，为基因敲低突变体；相比拟南芥野生型(Col-0)，NF-YC9过表达lines OE1中NF-YC9 mRNA表达量是野生型(Col-0)的近12倍，NF-YC9过表达lines OE6中NF-YC9 mRNA表达量是野生型(Col-0)的近7倍。
[0079] 实施例2、NF-YC9转基因植物对ABA耐受性分析试验
[0080] ABA能够抑制植物幼苗的生长。随着外源ABA浓度的升高，拟南芥野生型(Col-0生态型)受到的抑制得到增强，其主根和叶片的生长都会受到不同程度的影响，实验重复3次。
[0081] 以拟南芥野生型(Col-0生态型)、NF-YC9基因敲除突变体nf-yc9-1及NF-YC9过表达lines OE1和OE6为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上(0μΜ、0.4μM和0.6μΜ)(每种实验材料播种80-100粒)。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中，10天后观察拟南芥幼苗生长的情况并测定根长
[0082] 结果如图3和图4以及图5所示，在含0μM ABA的培养基上，各种遗传材料的幼苗都能够正常生长。在含0.4μM和0.6μΜABA的MS培养基上，nf-yc9-1相对于拟南芥野生型(Col-0生态型)表型不明显(对ABA的耐受性与Col-0类似)；而NF-YC9过表达lines OE1和OE6相对于野生型Col-0，对ABA均表现出明显超敏的表型(对ABA的耐受性降低)。综合以上实验结果可见，NF-YC9基因过表达植株对ABA表现出不耐受性。
[0083] 本发明实验结果表明：可以通过基因工程手段改变农作物中NF-YC9蛋白的表达量，将其作为一种研究其它具有调控重要农业性状的功能基因调控作物生长、发育以及逆境胁迫的生长模型，从而有助于深入阐明正负调节因子调控植物对ABA信号的响应水平很耐受性以及控制植物生长和抗逆性以达到满足农业生产所需要的分子机制，从而为实际农业生产提供理论支持。
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