一株芽孢杆菌及其在防治苹果轮纹病中的应用
阅读：174发布：2020-06-04
专利汇可以提供一株芽孢杆菌及其在防治苹果轮纹病中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株芽孢杆菌及其在防治苹果轮纹病中的应用。解 淀粉 芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PG12的保藏编号为CGMCC NO.7132。本发明还保护解淀粉芽孢杆菌PG12的应用，为如下（a）和/或（b）和/或（c）和/或（d）和/或（e）和/或（f）：（a）抑制 真菌 ；（b）制备真菌 抑制剂 ；（c）防治苹果轮纹病；（d）制备防治苹果轮纹病的产品（e）抑制苹果轮纹病致病菌的孢子萌发；（f）对苹果轮纹病致病菌孢子致畸。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌，对真菌具有广泛的抑菌谱，特别是对于防治苹果轮纹病效果明显。本发明提供的菌株及其应用，在防治 真菌病害 的同时，具有无化学 农药 残料，无环境污染的优点，在 可持续农业 发展中应用前景广阔。，下面是一株芽孢杆菌及其在防治苹果轮纹病中的应用专利的具体信息内容。
1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PG12，它的保藏编号 为CGMCCNO.7132。
2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的应用，为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)和/或(f)：(a)抑制真菌；(b)制备真菌抑制剂；(c)防治苹果轮纹病；(d)制备防治苹果轮纹病的产品；(e)抑制苹果轮纹病致病菌的孢子萌发；(f)对苹果轮纹病致病菌孢子致畸；
所述(a)中，所述真菌为葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌、链格孢属(Alternaria)真菌、镰刀菌属(Fusarium)真菌、疫霉属(Phytophthora)真菌、链核盘菌属(Monilinia)真菌、黑腐皮壳属(Valsa)真菌、聚端孢属(Trichothecium)真菌、葡萄孢属(Botrytis)真菌、青霉属(Penicillium)真菌、中国炭疽菌属(Colletotrichum)真菌或丝核菌属(Rizoctonia)真菌；所述葡萄座腔菌属真菌为葡萄座腔菌、贝伦格葡萄座腔菌或茶藨子葡萄座腔菌；所述链格孢属真菌为苹果斑点落叶病菌或链格孢；所述镰刀菌属真菌为尖孢镰刀菌或尖镰孢菌辣椒专化型；所述疫霉属真菌为致病疫霉或辣椒疫霉；所述链核盘菌属真菌为果生链核盘菌或正美澳型核果褐腐病菌；所述黑腐皮壳属真菌为苹果黑腐皮壳菌；所述聚端孢属真菌为粉红单端孢；所述葡萄孢属真菌为葡萄孢菌；所述青霉属真菌为扩展青霉；所述中国炭疽菌属真菌为胶孢炭疽菌；所述丝核菌属真菌为小麦纹枯病菌；
所述(e)和所述(f)中，所述苹果轮纹病致病菌为葡萄座腔菌。
3.一种产品，其活性成分为权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌或权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的菌悬液；所述产品的用途为如下(g)和/或(h)和/或(i)和/或(j)：(g)抑制真菌；(h)防治苹果轮纹病；(i)抑制苹果轮纹病致病菌的孢子萌发；(j)对苹果轮纹病致病菌孢子致畸；
所述(i)和所述(j)中，所述苹果轮纹病致病菌为葡萄座腔菌。
4.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的发酵物；
所述发酵物的制备方法如下：将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌接种至LB液体培养基，振荡培养至OD600nm＝3.0-3.7，离心收集上清液，即为解淀粉芽孢杆菌PG12的发酵物。
5.权利要求4所述发酵物的甲醇提取物；
所述甲醇提取物的制备方法如下：
(1)将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在5ml LB液体培养基中30℃、160r/min培养至OD600nm＝3.0，取500μl接种至50ml Landy培养基，30℃、160r/min振荡培养48小时，
10000r/min离心20min，收集上清液，采用0.22μm滤膜过滤，得到无菌的发酵上清；
(2)将10ml步骤(1)得到的无菌发酵上清上样于6g吸附树脂XAD16，先用50mL无菌水洗涤柱子，然后用7ml甲醇进行洗脱，收集过柱后的洗脱液，旋转蒸发得到干物质，然后将干物质溶于1ml甲醇，即为甲醇提取物。
6.权利要求4所述发酵物或权利要求5所述甲醇提取物的应用，为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)和/或(f)：(a)抑制真菌；(b)制备真菌抑制剂；(c)防治苹果轮纹病；(d)制备防治苹果轮纹病的产品；(e)抑制苹果轮纹病致病菌的孢子萌发；
(f)对苹果轮纹病致病菌孢子致畸；
所述(a)中，所述真菌为葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌、链格孢属(Alternaria)真菌、镰刀菌属(Fusarium)真菌、疫霉属(Phytophthora)真菌、链核盘菌属(Monilinia)真菌、黑腐皮壳属(Valsa)真菌、聚端孢属(Trichothecium)真菌、葡萄孢属(Botrytis)真菌、青霉属(Penicillium)真菌、中国炭疽菌属(Colletotrichum)真菌或丝核菌属(Rizoctonia)真菌；所述葡萄座腔菌属真菌为葡萄座腔菌、贝伦格葡萄座腔菌或茶藨子葡萄座腔菌；所述链格孢属真菌为苹果斑点落叶病菌或链格孢；所述镰刀菌属真菌为尖孢镰刀菌或尖镰孢菌辣椒专化型；所述疫霉属真菌为致病疫霉或辣椒疫霉；所述链核盘菌属真菌为果生链核盘菌或正美澳型核果褐腐病菌；所述黑腐皮壳属真菌为苹果黑腐皮壳菌；所述聚端孢属真菌为粉红单端孢；所述葡萄孢属真菌为葡萄孢菌；所述青霉属真菌为扩展青霉；所述中国炭疽菌属真菌为胶孢炭疽菌；所述丝核菌属真菌为小麦纹枯病菌；
所述(e)和所述(f)中，所述苹果轮纹病致病菌为葡萄座腔菌。
7.一种产品，其活性成分为权利要求4所述发酵物或权利要求5所述甲醇提取物；所述产品的用途为如下(g)和/或(h)和/或(i)和/或(j)：(g)抑制真菌；(h)防治苹果轮纹病；(i)抑制苹果轮纹病致病菌的孢子萌发；(j)对苹果轮纹病致病菌孢子致畸；
所述(i)和所述(j)中，所述苹果轮纹病致病菌为葡萄座腔菌。
8.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在生产伊枯草菌素A中的应用。
一株芽孢杆菌及其在防治苹果轮纹病中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株芽孢杆菌及其在防治苹果轮纹病中的应用。
背景技术
[0002] 苹果是蔷薇科苹果属植物的果实，性凉、味甘。苹果原产于两半球温带，当前世界苹果主产区主要集中在亚洲、欧洲、北美洲，占世界苹果总产的90%。中国已经成为世界最大的苹果生产国，国内苹果产值占水果产值的40%以上。我国苹果栽培地区主要分布在环渤海湾、西北黄土高原、黄河故道和云贵川高地。
[0003] 目前，中国苹果的主栽品种为富士，约占我国苹果种植总面积的50%，其次为红帅和金冠，分别占10%和6%，这些主栽品种（富士，红帅和金冠）对苹果轮纹病均高度感病，所以苹果轮纹病的发病面积越来越大，程度越来越重。苹果轮纹病主要危害枝干和果实，国内苹果枝干轮纹病总体发病率达77.6%,不同省份之间苹果枝干轮纹病的发生程度存在一定差异，在山东、河南和北京的危害相对较重，而在山西和陕西的危害相对较轻，几个主栽品种之间无明显差异。苹果果实一般从接近成熟时开始发病，可持续到储藏期，一般年份苹果果实损失20%-30%，严重年份损失70%以上，给苹果产业造成巨大的经济损失。随着人们对食品安全和环境保护意识的增强，对农药残留、病菌抗药性等问题认识逐渐深入，寻找和开发安全高效的杀菌剂要求日益迫切。生物防治因其对环境和动物有较好的安全性而逐渐成为人们所关注的焦点和热点。
[0004] 芽孢杆菌生理特征丰富多样，分布极其广泛，是土壤和植物体、根际的重要微生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。芽孢杆菌突出的特征是能产生耐热、抗逆的芽孢，这有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖，批量生产上工艺简单、成本较低、施用方便、储存期长，是一种较理想的生防微生物。芽孢杆菌在抑制病原菌的过程中有多种机制参与其中，主要包括抗生作用、竞争作用、诱导抗性及微生态调控等机制。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一株芽孢杆菌及其在防治苹果轮纹病中的应用。
[0006] 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PG12已于2013年1月14日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮政编码为：100101），保藏编号为CGMCC NO.7132。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PG12CGMCC NO.7132简称解淀粉芽孢杆菌PG12。
[0007] 本发明还保护解淀粉芽孢杆菌PG12的应用，为如下（a）和/或（b）和/或（c）和/或（d）和/或（e）和/或（f）：（a）抑制真菌；（b）制备真菌抑制剂；（c）防治苹果轮纹病；（d）制备防治苹果轮纹病的产品（e）抑制苹果轮纹病致病菌的孢子萌发；（f）对苹果轮纹病致病菌孢子致畸。
[0008] 所述真菌为葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌、链格孢属（Alternaria）真菌、镰刀菌属（Fusarium）真菌、疫霉属（Phytophthora)真菌、链核盘菌属(Monilinia)真菌、黑腐皮壳属（Valsa）真菌、聚端孢属(Trichothecium)真菌、葡萄孢属(Botrytis)真菌、青霉属(Penicillium)真菌、中国炭疽菌属(Colletotrichum)真菌或丝核菌属（Rizoctonia）真菌。所述葡萄座腔菌属真菌具体可为葡萄座腔菌、贝伦格葡萄座腔菌或茶藨子葡萄座腔菌。所述链格孢属真菌具体可为苹果斑点落叶病菌或链格孢。所述镰刀菌属真菌具体可为尖孢镰刀菌或尖镰孢菌辣椒专化型。所述疫霉属真菌具体可为致病疫霉或辣椒疫霉。所述链核盘菌属真菌具体可为果生链核盘菌或正美澳型核果褐腐病菌。所述黑腐皮壳属真菌具体可为苹果黑腐皮壳菌。所述聚端孢属真菌具体可为粉红单端孢。所述葡萄孢属真菌具体可为葡萄孢菌。所述青霉属真菌具体可为扩展青霉。所述中国炭疽菌属真菌具体可为胶孢炭疽菌。所述丝核菌属真菌具体可为小麦纹枯病菌。所述苹果轮纹病具体可为葡萄座腔菌引起的苹果轮纹病。所述苹果轮纹病致病菌具体可为葡萄座腔菌。
[0009] 本发明还保护一种产品，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌PG12或解淀粉芽孢杆菌PG12的菌悬液；所述产品的用途为如下（g）和/或（h）和/或（i）和/或（j）：（g）抑制真菌；（h）防治苹果轮纹病；（i）抑制苹果轮纹病致病菌的孢子萌发；（j）对苹果轮纹病致病菌孢子致畸。
[0010] 所述真菌为葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌、链格孢属（Alternaria）真菌、镰刀菌属（Fusarium）真菌、疫霉属（Phytophthora)真菌、链核盘菌属(Monilinia)真菌、黑腐皮壳属（Valsa）真菌、聚端孢属(Trichothecium)真菌、葡萄孢属(Botrytis)真菌、青霉属(Penicillium)真菌、中国炭疽菌属(Colletotrichum)真菌或丝核菌属（Rizoctonia）真菌。所述葡萄座腔菌属真菌具体可为葡萄座腔菌、贝伦格葡萄座腔菌或茶藨子葡萄座腔菌。所述链格孢属真菌具体可为苹果斑点落叶病菌或链格孢。所述镰刀菌属真菌具体可为尖孢镰刀菌或尖镰孢菌辣椒专化型。所述疫霉属真菌具体可为致病疫霉或辣椒疫霉。所述链核盘菌属真菌具体可为果生链核盘菌或正美澳型核果褐腐病菌。所述黑腐皮壳属真菌具体可为苹果黑腐皮壳菌。所述聚端孢属真菌具体可为粉红单端孢。所述葡萄孢属真菌具体可为葡萄孢菌。所述青霉属真菌具体可为扩展青霉。所述中国炭疽菌属真菌具体可为胶孢炭疽菌。所述丝核菌属真菌具体可为小麦纹枯病菌。所述苹果轮纹病具体可为葡萄座腔菌引起的苹果轮纹病。所述苹果轮纹病致病菌具体可为葡萄座腔菌。
[0011] 本发明还保护解淀粉芽孢杆菌PG12的发酵物。所述发酵物的制备方法具体如下：将解淀粉芽孢杆菌PG12接种至LB液体培养基，振荡培养至OD600nm=3.0-3.7，离心收集上清液，即为解淀粉芽孢杆菌PG12的发酵物。
[0012] 本发明还保护所述解淀粉芽孢杆菌PG12的发酵物的甲醇提取物。
[0013] 本发明还保护所述发酵物或所述甲醇提取物的应用，为如下（a）和/或（b）和/或（c）和/或（d）和/或（e）和/或（f）：（a）抑制真菌；（b）制备真菌抑制剂；（c）防治苹果轮纹病；（d）制备防治苹果轮纹病的产品（e）抑制苹果轮纹病致病菌的孢子萌发；（f）对苹果轮纹病致病菌孢子致畸。
[0014] 所述真菌为葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌、链格孢属（Alternaria）真菌、镰刀菌属（Fusarium）真菌、疫霉属（Phytophthora)真菌、链核盘菌属(Monilinia)真菌、黑腐皮壳属（Valsa）真菌、聚端孢属(Trichothecium)真菌、葡萄孢属(Botrytis)真菌、青霉属(Penicillium)真菌、中国炭疽菌属(Colletotrichum)真菌或丝核菌属（Rizoctonia）真菌。所述葡萄座腔菌属真菌具体可为葡萄座腔菌、贝伦格葡萄座腔菌或茶藨子葡萄座腔菌。所述链格孢属真菌具体可为苹果斑点落叶病菌或链格孢。所述镰刀菌属真菌具体可为尖孢镰刀菌或尖镰孢菌辣椒专化型。所述疫霉属真菌具体可为致病疫霉或辣椒疫霉。所述链核盘菌属真菌具体可为果生链核盘菌或正美澳型核果褐腐病菌。所述黑腐皮壳属真菌具体可为苹果黑腐皮壳菌。所述聚端孢属真菌具体可为粉红单端孢。所述葡萄孢属真菌具体可为葡萄孢菌。所述青霉属真菌具体可为扩展青霉。所述中国炭疽菌属真菌具体可为胶孢炭疽菌。所述丝核菌属真菌具体可为小麦纹枯病菌。所述苹果轮纹病具体可为葡萄座腔菌引起的苹果轮纹病。所述苹果轮纹病致病菌具体可为葡萄座腔菌。
[0015] 本发明还保护一种产品，其活性成分为所述发酵物或所述甲醇提取物；所述产品的用途为如下（g）和/或（h）和/或（i）和/或（j）：（g）抑制真菌；（h）防治苹果轮纹病；（i）抑制苹果轮纹病致病菌的孢子萌发；（j）对苹果轮纹病致病菌孢子致畸。
[0016] 所述真菌为葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌、链格孢属（Alternaria）真菌、镰刀菌属（Fusarium）真菌、疫霉属（Phytophthora)真菌、链核盘菌属(Monilinia)真菌、黑腐皮壳属（Valsa）真菌、聚端孢属(Trichothecium)真菌、葡萄孢属(Botrytis)真菌、青霉属(Penicillium)真菌、中国炭疽菌属(Colletotrichum)真菌或丝核菌属（Rizoctonia）真菌。所述葡萄座腔菌属真菌具体可为葡萄座腔菌、贝伦格葡萄座腔菌或茶藨子葡萄座腔菌。所述链格孢属真菌具体可为苹果斑点落叶病菌或链格孢。所述镰刀菌属真菌具体可为尖孢镰刀菌或尖镰孢菌辣椒专化型。所述疫霉属真菌具体可为致病疫霉或辣椒疫霉。所述链核盘菌属真菌具体可为果生链核盘菌或正美澳型核果褐腐病菌。所述黑腐皮壳属真菌具体可为苹果黑腐皮壳菌。所述聚端孢属真菌具体可为粉红单端孢。所述葡萄孢属真菌具体可为葡萄孢菌。所述青霉属真菌具体可为扩展青霉。所述中国炭疽菌属真菌具体可为胶孢炭疽菌。所述丝核菌属真菌具体可为小麦纹枯病菌。所述苹果轮纹病具体可为葡萄座腔菌引起的苹果轮纹病。所述苹果轮纹病致病菌具体可为葡萄座腔菌。
[0017] 本发明还保护解淀粉芽孢杆菌PG12在生产伊枯草菌素A中的应用。
[0018] 应用解淀粉芽孢杆菌PG12生产伊枯草菌素A的方法具体如下：（1）将解淀粉芽孢杆菌PG12在LB液体培养基中振荡培养至OD600nm=3.0-3.7；（2）将步骤（1）得到的菌液接种至Landy培养基，振荡培养（振荡条件具体可为30℃、160r/min）48小时，得到伊枯草菌素A。
[0019] 本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌菌株，对真菌具有广泛的抑菌谱，特别是对于防治苹果轮纹病效果明显。本发明提供的菌株及其应用，在防治真菌病害的同时，具有无化学农药残料，无环境污染的优点，在可持续农业发展中应用前景广阔。附图说明
[0020] 图1为实施例1中的菌株形态照片。
[0021] 图2为实施例1中的16S rDNA系统发育树。
[0022] 图3为实施例1中的gyrA基因的系统发育树。
[0023] 图4为实施例2中对峙培养5天后的照片。
[0024] 图5为实施例3的步骤一中在密闭容器中放置48小时后的苹果照片。
[0025] 图6为实施例3的步骤一中发病率随时间的变化。
[0026] 图7为实施例3的步骤二中在密闭容器中放置48小时后的苹果照片。
[0027] 图8为实施例3的步骤二中每个苹果上的病斑个数。
[0028] 图9为实施例3的步骤三中的防治效果随时间的变化。
[0029] 图10为实施例4中发病率随时间的变化。
[0030] 图11为实施例5中发病率随时间的变化。
[0031] 图12为实施例6的结果。
[0032] 图13为实施例7中甲醇提取物对致病菌生长的抑制作用。
[0033] 图14为实施例7中的质谱图。
具体实施方式
[0034] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0036] 牛肉膏培养基（NA培养基）：牛肉膏3g、大豆蛋白胨7g、NaCl5g、琼脂20g，用蒸馏水定容至1000ml；pH7.2。
[0037] LB液体培养基：每升培养基中含10g NaCl、10g Trypton（Oxoid公司产品）和5g Yeast Extract（Oxoid公司产品）；pH7.2-7.4；高压蒸气灭菌20min。
[0038] LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入15g琼脂粉；高压蒸气灭菌20min。
[0039] Landy培养基：每升培养基含有100ml20g/100mL的葡萄糖水溶液、100ml50mg/ml的L-谷氨酸水溶液、2ml1mol/l的MgSO4水溶液、25ml20mg/ml的KCl水溶液、25ml40mg/ml的KH2PO4水溶液、12.5μl12mg/ml的Fe2(SO4)3·6H2O水溶液、25μl200mg/ml的MnSO4·H2O水溶液、25μl6.4mg/ml的CuSO4·5H2O水溶液，pH7-8。
[0040] 福星（40%氟硅唑乳油）：杜邦公司，有效成分为flusilazole,浓度为400g/l,通用名：福硅唑，农药登记证号：PD376-2002，农药分装登记证号：PD376-2002-F01-786，产品标准号：Q/DDDA53-2007，农药生产批准证书号：HNP31024-D3888。
[0041] 苹果轮纹病发病表征：初期以皮孔为中心形成水渍状近圆形的褐色斑点，周围有红褐色晕圈，随后很快向四周扩展，典型的病斑表面有明显的深浅相间的同心轮纹，病部果肉腐烂，初期病斑果面不凹陷，严重时5-6天可全果腐烂，常溢出褐色粘液，有酸臭气味。
[0042] 葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）：参考文献：Tang W,Ding Z,Zhou Z,Wang Y,Guo L(2012)Phylogenetic and pathogenic analyses show that the causal agent of apple ring rot in China is Botryosphaeria dothidea.Plant Disease96:486-496.。
[0043] 贝伦格葡萄座腔菌（Botryosphaeria berengeriana de Not.f.sp.piricola）：参考文献：Shutong W,Wang Y,Hu T,Cao K,Year(2010):Crucial Weather Conditions for Conidia Release of Botryosphaeria berengeriana de Not.f.sp.piricola on Apple Stems.In.。
[0044] 茶 藨 子 葡 萄 座 腔 菌（Botryosphaeria ribis Grossenbacher et TMDuggar,teleomorph）： 200571 。
[0045] 苹果斑点落叶病菌（Alternaria alternate f.sp.mali）：参考文献：Wu YuXing Li MeiNa;Zhou ZongShan;Chou GuiSheng;et al.(2007)Experiment of control of apple ring spot disease by using8fungicides.China Fruits2:28-30。TM
[0046] 链格孢（Alternaria alternata(Fries)Keissler,anamorph）： 96178 。
[0047] 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schlechtendahl,anamorph）： 44187TM。
[0048] 尖镰孢菌辣椒专化型（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum(Atkinson)TMSnyder et Hansen,anamorph）： 16613 。
TM
TM
[0049] 致病疫霉（Phytophthora infestans(Montagne)de Bary）： 64099 。
[0050] 辣椒疫霉（Phytophthora capsici Leonian）： 46102TM。
[0051] 果 生 链 核 盘 菌（Monilinia fructigena(Aderhold et Ruhland)Honey,teleomorph）： 11790TM。
[0052] 正美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola(Winter)Honey,teleomorph）：TM
9962 。
9962 。
[0053] 苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali Miyabe et Yamad）:参考文献：Gao Ting;Liu XinYing;Zhang XinZhong et al.(2012)Inheritance of susceptibility to Valsa canker in Malus interspecific hybrids.Journal of Fruit Science29(5):717-721。
[0054] 粉红单端孢（Trichothecium roseum(Persoon)Link ex Gray,anamorph）：TM
16676 。
16676 。
[0055] 葡萄孢菌（Botrytis cinerea Persoon,anamorph）： 11542TM。
[0056] 扩展青霉（Penicillium expansum Link,anamorph）： 7861TM。
[0057] 胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)Sacc.）：参考文献：Machowicz-Stefaniak Z,Zalewska E,Król E(2011)Occurrence,harmfulnees and morphological structures of Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)Sacc.(Teleomorph:glomerella cingulata(Stonem.)Spauld.et Schrenk).Acta Scientiarum Polonorum-Hortorum Cultus10:39-52.。
[0058] 小麦纹枯病菌（Rizoctonia cerealis）：参考文献Hui W,Jingao D,Hongsheng S The bioassay of metabolite of Botrytis cinerea and separation of herbicidal active component.Scientia Agricultura Sinica37（2）：233-237。
[0059] 实施例1、解淀粉芽孢杆菌PG12的分离、鉴定和保藏
[0060] 一、菌株的分离
[0061] 苹果取自全国苹果主产区（山东烟台、山东栖霞、山西运城、河南三门峡、北京昌平和甘肃天水），品种为富士。
[0062] 表面消毒：将在全国各地苹果种植区采的苹果果实、枝条、树叶的表面先用自来水冲洗干净，用1%次氯酸钠消毒8分钟，再用无菌水漂洗4次，取100μl第4次漂洗水涂牛肉膏培养基平板，培养3天，若无菌落出现，表明苹果表面灭菌干净。
[0063] 芽孢杆菌的分离：将表面灭菌的苹果样品大约1g放入已灭菌的研钵中，加少量灭菌的石英砂和3mL无菌水进行充分研磨，取研磨汁液1mL，加入含9mL无菌水的试管中，混合-3 -1 -2 -3均匀后梯度稀释至10 浓度，将10 、10 和10 浓度的稀释液在80℃的水浴中水浴30min以杀死绝大部分非芽孢细菌，取100μl稀释液涂牛肉膏培养基平板，每浓度涂平板3个，
30℃下培养。
30℃下培养。
[0064] 保存：培养3天后，挑取不同的单菌落，进行转管并保存于4℃。
[0065] 获得了一株纯培养的菌株，将其命名为PG12。
[0066] 二、菌株的形态特征鉴定和生理生化鉴定
[0067] 菌株形态照片见图1。
[0068] 形态特征：菌落白色，表面粗糙，有褶皱，边缘整齐，较湿，不产色素。
[0069] 生理生化特征见表1。
[0070] 表1 生理生化特征
[0071]
[0072] 三、分子鉴定
[0074] 菌株PG12的gyrA基因如序列表的序列2所示，gyrA基因的系统发育树见图3。
[0075] 四、菌株的保藏
[0076] 根据步骤二和步骤三的鉴定结果，菌株PG12属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株PG12已于2013年1月14日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮政编码为：100101），保藏编号为CGMCC NO.7132。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PG12CGMCC NO.7132简称解淀粉芽孢杆菌PG12。
[0077] 实施例2、解淀粉芽孢杆菌PG12对各个致病菌的拮抗作用
[0078] 1、在PDA培养基平板上活化致病菌，然后用5mm的打孔器打孔，得到直径为5mm的致病菌菌饼。
[0079] 2、分组处理如下：
[0080] 实验组：在PDA培养基平板中心接种直径为5mm的致病菌菌饼，在距离菌饼边缘3cm处均匀分散接种解淀粉芽孢杆菌PG12（每个接种点接种2μl OD600nm值为0.8的菌液，菌液的溶剂为无菌水），28℃静置培养5天；
[0081] 对照组：在PDA培养基平板中心接种直径为5mm的致病菌菌饼，28℃静置培养5天。
[0082] 培养5天后，对照组的致病菌长满整个培养皿。
[0083] 抑制率=（培养皿的内部半径-致病菌菌饼中心至芽孢杆菌PG12产生的拮抗圈边缘的最短距离）/培养皿的内部半径×100％。
[0084] 致病菌为葡萄座腔菌时，对峙培养5天后的照片见图4，A为实验组，B为对照组。
[0085] 解淀粉芽孢杆菌PG12对各个致病菌的抑制率结果见表2（进行三次重复实验，每次重复实验中设置三个重复样本，结果取平均值）。结果表明，解淀粉芽孢杆菌PG12对多种致病菌均具有较强的拮抗活性，可用于苹果、梨、桃、辣椒、马铃薯、甜菜、小麦等多种植物的病害防治。
[0086] 表2 解淀粉芽孢杆菌PG12对多种致病菌的抑制率
[0087]病原菌 抑制效果 抑制率（%）
葡萄座腔菌 ++ 62.9
苹果斑点落叶病菌 + 43.2
苹果黑腐皮壳菌 ++ 60.3
粉红单端孢 +++ 78.2
链格孢 + 48.8
果生链核盘菌 +++ 75.7
葡萄孢菌 + 34.4
扩展青霉 + 35.7
胶孢炭疽菌 + 49.2
贝伦格葡萄座腔菌 + 47.4
茶藨子葡萄座腔菌 ++ 66.1
正美澳型核果褐腐病+++ 82.3
菌
致病疫霉 ++ 55.7
辣椒疫霉 ++ 61.2
尖孢镰刀菌 ++ 63.6
尖镰孢菌辣椒专化型++ 60.1
小麦纹枯病菌 ++ 65.4
葡萄座腔菌 ++ 62.9
苹果斑点落叶病菌 + 43.2
苹果黑腐皮壳菌 ++ 60.3
粉红单端孢 +++ 78.2
链格孢 + 48.8
果生链核盘菌 +++ 75.7
葡萄孢菌 + 34.4
扩展青霉 + 35.7
胶孢炭疽菌 + 49.2
贝伦格葡萄座腔菌 + 47.4
茶藨子葡萄座腔菌 ++ 66.1
正美澳型核果褐腐病+++ 82.3
菌
致病疫霉 ++ 55.7
辣椒疫霉 ++ 61.2
尖孢镰刀菌 ++ 63.6
尖镰孢菌辣椒专化型++ 60.1
小麦纹枯病菌 ++ 65.4
[0088] 实施例3、解淀粉芽孢杆菌PG12对苹果轮纹病的生防效果（苹果果实实验）[0089] 一、菌丝接种
[0090] 1、在液体NA培养基中30℃培养解淀粉芽孢杆菌PG12，得到浓度为108CFU/mL的菌悬液。
[0091] 2、取洗净的无伤口的大小基本一致的短枝富士苹果，在步骤1得到的菌悬液中室温浸泡1小时，然后从菌悬液中取出苹果，室温放置24小时（自然晾干苹果表面）。
[0092] 3、在PDA培养基平板上培养葡萄座腔菌4-5天，然后用打孔器打孔，得到直径为4mm的菌饼。
[0093] 4、将步骤3得到的菌饼均匀分散的贴在步骤2得到的苹果上，每个苹果贴15个菌饼，置于密闭容器中，28℃、90%以上湿度放置。
[0094] 设置不进行步骤2的对照组处理。
[0095] 在密闭容器中放置48小时后的苹果照片见见图5，A为对照处理，B为实验处理。
[0096] 发病率（%）=导致出现病斑的菌饼数/调查的总菌饼数×100%。
[0097] 从置于密闭容器中开始计时，每24小时为1天，第7天（即第24×7小时后，其它依次类推）、第9天、第11天、第13天和第15天统计发病率。
[0098] 发病率（进行三次重复实验，每次重复实验中设置三个重复样本，结果取平均值）随时间的变化见图6。
[0099] 二、孢子接种
[0100] 1、在液体NA培养基中30℃培养解淀粉芽孢杆菌PG12，得到浓度为108CFU/mL的菌悬液。
[0101] 2、取洗净的无伤口的大小基本一致的短枝富士苹果，在步骤1得到的菌悬液中室温浸泡1小时，然后从菌悬液中取出苹果，室温放置24小时（自然晾干苹果表面）。
[0102] 3、取葡萄座腔菌孢子，用无菌水制备浓度为1×105个孢子/mL的孢子悬液。
[0103] 4、将步骤3得到的孢子悬液均匀喷洒至步骤2得到的苹果上，每个苹果喷洒5毫升，置于密闭容器中，28℃、90%以上湿度放置。
[0104] 设置不进行步骤2的对照组处理。
[0105] 在密闭容器中放置48小时后的苹果照片见图7，A为对照处理，B为实验处理。
[0106] 从置于密闭容器中开始计时，第12天、第14天、第16天、第18天、第20天、第22天、第24天、第26天和第28天统计每个苹果上的病斑个数。
[0107] 每个苹果上的病斑个数（进行三次重复实验，每次重复实验中设置三个重复样本，结果取平均值）见图8。
[0108] 三、接种不同浓度的解淀粉芽孢杆菌PG12对苹果轮纹病的防治效果
[0109] 1、在液体NA培养基中30℃培养解淀粉芽孢杆菌PG12，分别得到得到浓度为8 7 6 5
10CFU/mL、10CFU/mL、10CFU/mL或10CFU/mL的菌悬液。
10CFU/mL、10CFU/mL、10CFU/mL或10CFU/mL的菌悬液。
[0110] 2、取洗净的无伤口的大小基本一致的短枝富士苹果，在步骤1得到的菌悬液中室温浸泡1小时，然后从菌悬液中取出苹果，室温放置24小时（自然晾干苹果表面）。
[0111] 3、取葡萄座腔菌孢子，用无菌水制备浓度为105个孢子／mL的孢子悬液，将10微升孢子悬液滴于直径为5mm的灭菌后滤纸片上。
[0112] 4、将步骤3得到的滤纸片均匀分散的贴在步骤2得到的苹果上，每个苹果贴10个滤纸片，置于密闭容器中，27℃、90%以上湿度放置。
[0113] 设置不进行步骤2的对照组处理（CK）。
[0114] 发病率=导致出现病斑的滤纸片数/调查的总滤纸片数×100%。
[0115] 防治效果（%）=（对照组发病率－实验组发病率）/对照组发病率×100%。
[0116] 从置于密闭容器中开始计时，第20天、第24天、第28天、第30天、第32天、第34天和第36天统计防治效果。
[0117] 防治效果（进行三次重复实验，每次重复实验中设置三个重复样本，结果取平均值）随时间的变化见图9。
[0118] 以上结果表明，解淀粉芽孢杆菌PG12对苹果果实发生苹果轮纹病具有良好的生防效果。
[0119] 实施例4、解淀粉芽孢杆菌PG12对苹果轮纹病的生防效果（田间试验）[0120] 实验地点：北京市昌平区南口镇北流村北流果园，该果园常年种植苹果，苹果轮纹病发病相对比较严重，选树龄在十年左右盛果期的果树；选择短枝富士苹果品种；每个处理选树势大小、结果量基本一致的4株树。
[0121] 1、在液体NA培养基中30℃培养解淀粉芽孢杆菌PG12，得到浓度为108CFU/mL的菌悬液。
[0122] 2、用无菌水将步骤1得到的菌悬液稀释至500倍体积。
[0123] 3、将步骤2得到的菌液用喷雾器均匀的喷到果树树体上，滴水为度；分别在落花后（5月11日）、幼果期（6月5日）、果实膨大期（6月30日）、采摘前（9月20日）各喷洒一次，共喷4次。
[0124] 设置用无菌水代替步骤2得到的菌液进行相同流程的喷洒的阴性对照组。
[0125] 设置用无菌水8000倍稀释的福星溶液代替步骤2得到的菌液进行相同流程的喷洒的阳性对照组。
[0126] 9月30日从树上摘取苹果，置于储藏箱中，22℃放置。每隔15天调查一次，计算发病率。
[0127] 发病率（%）=具有苹果轮纹病发病表征的苹果数/调查的苹果总数×100%。
[0128] 结果见图10。
[0129] 以上结果表明，解淀粉芽孢杆菌PG12对苹果树及苹果果实发生苹果轮纹病具有良好的生防效果。
[0130] 实施例5、解淀粉芽孢杆菌PG12对储藏期苹果对苹果轮纹病的生防效果[0131] 1、在液体NA培养基中30℃培养解淀粉芽孢杆菌PG12，得到浓度为108CFU/mL的菌悬液。
[0132] 2、用无菌水将步骤1得到的菌悬液稀释至500倍体积。
[0133] 3、取洗净的无伤口的大小基本一致的短枝富士苹果，在步骤2得到的菌液中室温浸泡1-2分钟，然后从菌液中取出苹果，室温放置24小时（自然晾干苹果表面）。
[0134] 4、取步骤3得到的苹果，置于密闭容器中，27℃、90%以上湿度放置。
[0135] 设置用无菌水代替步骤2得到的菌液进行相同的浸泡处理的阴性对照组。
[0136] 设置用无菌水8000倍稀释的福星溶液代替步骤2得到的菌液进行相同的浸泡处理的阳性对照组。
[0137] 从置于密闭容器中开始计时，每隔15天调查一次，统计苹果的发病率。
[0138] 发病率（%）=具有苹果轮纹病发病表征的苹果数/调查的苹果总数×100%。
[0139] 发病率（进行三次重复实验，每次重复实验中设置三个重复样本，结果取平均值）的结果见图11。
[0140] 以上结果表明，解淀粉芽孢杆菌PG12对贮藏期的苹果果实发生苹果轮纹病具有良好的生防效果。
[0141] 实施例6、解淀粉芽孢杆菌PG12的发酵上清对病原菌孢子萌发的影响
[0142] 1、将解淀粉芽孢杆菌PG12接种至LB液体培养基，30℃、160r/min振荡培养至OD600nm=3.7，10000r/min离心20min，收集上清液，采用0.22μm滤膜过滤，得到无菌的发酵上清。
[0143] 2、将步骤1得到的无菌的发酵上清命名为PG12--0溶液；将PG12--0溶液用无菌水稀释至5倍体积，命名为PG12--5溶液；将PG12--0溶液用无菌水稀释至10倍体积，命名为PG12--10溶液；将PG12--0溶液用无菌水稀释至40倍体积，命名为PG12--40溶液；将PG12--0溶液用无菌水稀释至100倍体积，命名为PG12--100溶液；将无菌水命名为CK溶液。
[0144] 3、取葡萄座腔菌孢子，用无菌水制备浓度为105个孢子／mL的孢子悬液。
[0145] 4、将150μL步骤2制备的溶液与150μL步骤3得到的孢子悬液混合，在细胞培养板中28℃培养，每隔4小时取样，在显微镜下观察，统计孢子萌发率及致畸率。
[0146] 设置用无菌水代替步骤2得到的溶液进行相同处理的阴性对照组（CK）。
[0147] 结果见图12（进行三次重复实验，每次重复实验中设置三个重复样本，结果取平均值）。
[0148] PG12--0溶液对病原菌孢子萌发的抑制作用达到100%，可以完全抑制病原菌孢子的萌发。PG12--5溶液4h时对病原菌孢子萌发的抑制率为35%左右，8h时对病原菌孢子萌发的抑制率为17%左右。PG12--10溶液4h时对孢子萌发的抑制率为28%左右，8h时对病原菌孢子萌发的抑制率为11%左右。
[0149] PG12--5溶液和PG12--10溶液处理4h时对病原菌孢子萌发的致畸作用最强，孢子畸形生长，芽管膨大成为球状，甚至部分发生溢裂，12h左右致畸率达到100%，24h时PG12--5溶液的致畸率仍然最高为100%，PG12--10溶液的致畸率有所下降。
[0150] 实施例7、解淀粉芽孢杆菌PG12的次生代谢产物
[0151] 1、经PCR鉴定，解淀粉芽孢杆菌PG12含有如下抗生素合成相关基因：bamD/bamC、bacAB/bacD、ituD/ituC和fenB，这些基因主要属于脂肽类抗生素家族（伊枯草素和丰原素）。
[0152] 2、将解淀粉芽孢杆菌PG12在5ml LB液体培养基中30℃、160r/min培养至OD600nm=3.0，取500μl接种至50ml Landy培养基，30℃、160r/min振荡培养48小时，10000r/min离心20min，收集上清液，采用0.22μm滤膜过滤，得到无菌的发酵上清。
[0153] 3、将10ml步骤2得到的无菌发酵上清上样于6g吸附树脂XAD16(SigmaAmberlite)，先用50mL无菌水洗涤柱子，然后用7ml甲醇进行洗脱，收集过柱后的洗脱液，旋转蒸发得到干物质，然后将干物质溶于1ml甲醇，即为甲醇提取物。
[0154] 4、在混有4×107CFU/ml葡萄座腔菌孢子悬液的PDA培养基平板上打两个直径为5mm的孔，每个孔中加入15微升步骤3得到的甲醇提取物，28℃培养48小时，观察并拍照，照片见图13，上图为用无菌水代替甲醇提取物的对照处理，下图为实验处理。结果表明，解淀粉芽孢杆菌PG12生产的脂肽类抗生素对葡萄座腔菌菌丝生长具有显著的抑制作用，抑制率在85%以上。
[0155] 5、将 步 骤3得 到 的甲 醇 提取 物 进行 薄 层层 析。 采 用TLC silica gel60F254(Merck,Germany)薄层层析硅胶板。展开系统：氯仿:甲醇：水＝65:25:4（体积比)。Rf值=0.4。
[0156] 6、将目的组分从硅胶板上刮下，用100%甲醇洗脱，得到的甲醇样品用5μm Waters Symmetry C18column(150×4.6mm)柱子的半制备高效反相液相色谱semipreparative reverse phase HPLC(RP-HPLC)检测。流动相由等体积的溶液甲和溶液乙组成，溶液甲为含有0.1%（体积比）甲酸的水溶液，溶液乙为含有0.1%（体积比）甲酸的乙腈溶液。洗脱流速为15ml/min，用215nm的吸收光波长检测，收集保留时间峰值为3.38min的峰对应的过柱后洗脱液。
[0157] 7、将步骤6收集的组分通过电喷射离子化四级飞行时间质谱/质谱（ESI-Q-TOF MS/MS）分析，在50至2200m/z范围内，阳离子模式，毛细管电压为4000V，接触气体为氮气，碎片能量为55eV。质谱数据利用DataAnalysis4.1SP3软件、BioTools 3.2和Bruker MolWeightToFormula分析最终得到分子量为1043.55Da的活性物质为伊枯草菌素A，化学式为C14H27NO。质谱图见图14。
[0158] 伊枯草菌素A的化学结构式见式（Ⅰ）。
[0160] 式（Ⅰ）。
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