一株边缘假单胞菌及其在制备2,5-呋喃二甲酸中的应用
阅读：704发布：2022-10-01
专利汇可以提供一株边缘假单胞菌及其在制备2,5-呋喃二甲酸中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株边缘假单胞菌及其在制备2,5-呋喃二 甲酸 中的应用，所述的边缘假单胞菌，其分类命名为边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)，菌株名为19Z，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年11月28日，保藏编号为CCTCC NO:M 2019984。本发明的优势在于：(1)研究首次采用多细胞序列催化，一锅两步合成FDCA。(2)本发明的合成方法能显著提高FDCA的产量、得率和产率，只需通过简单的细胞培养和序列催化，即可实现HMF至FDCA的高效转化；且不需要昂贵的辅因子，过程简单可控，具有很好的实用性，易于工业化。，下面是一株边缘假单胞菌及其在制备2,5-呋喃二甲酸中的应用专利的具体信息内容。
1.一株边缘假单胞菌，其分类命名为边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)，菌株名为19Z，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年11月28日，保藏编号为CCTCC NO:M 2019984。
2.权利要求1所述的边缘假单胞菌及以边缘假单胞菌为出发菌制备得到的重组边缘假单胞菌在制备2,5-呋喃二甲酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对边缘假单胞菌CCTCC NO:M 2019984进行遗传修饰，得到重组边缘假单胞菌，将由重组边缘假单胞菌制得的种子液接种到培养基中进行培养，得到第一发酵液，分离，收集第一菌体细胞；
(2)利用步骤(1)得到的第一菌体细胞催化5-羟甲基糠醛转化，得到氧化中间产物的转化液；
(3)将边缘假单胞菌CCTCC NO:M 2019984制得的种子液接种到培养基中进行培养，得到第二发酵液，分离，收集第二菌体细胞；
(4)将步骤(3)得到的第二菌体细胞与步骤(2)得到的转化液混合，并加入CaCO3进行催化反应，得到2,5-呋喃二甲酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的遗传修饰为在胞内过表达将5-羟甲基糠醛的羟甲基氧化为醛基的基因。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的培养基包括0.1～10mM的钨酸盐的LB培养基。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，按照0.5～10v/v％的接种量将种子液接入到培养基；所述的培养为在25～40℃，100～200r/min条件下培养至对数中期后的8～14h；
其中，在培养至对数中期时添加终浓度为1mM异丙基硫代半乳糖苷。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述5-羟甲基糠醛为含有5-羟甲基糠醛的缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值为5.0～9.0；所述的缓冲溶液中5-羟甲基糠醛的含量为10～300mM；所述第一菌体细胞与缓冲溶液的质量体积比为3～50g干细胞/L；反应条件为15～50℃，50～300r/min，反应10min～12h。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，按照0.5～10v/v％的接种量将种子液接入到培养基；所述的培养为在25～40℃，100～200r/min的条件下培养至对数中期后的6～12h。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在培养至对数中期时，添加诱导剂；其中，所述的诱导剂为5-羟甲基糠醛、糠醛、2,5-呋喃二甲酸和糠醇中的任意一种；控制诱导剂的添加量使其浓度为0.5～6mM。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述第二菌体细胞与步骤(2)得到产物的质量体积比为3～50g干细胞/L转化液；碳酸钙的添加量为2～8g/L转化液；所述催化反应的条件为15～50℃，50～300r/min反应10min～12h。
一株边缘假单胞菌及其在制备2,5-呋喃二甲酸中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 随着化石资源的日益匮乏及全球变暖的加剧，生物基能源和平台化合物的开发利用在全球范围内引起重视。生物质是一种来源丰富，价格低廉的可再生碳源，实现其高值化利用是未来生物质发展的重要方向。5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，HMF) 是一种重要的生物基平台化合物，可由淀粉、纤维素等生物质经水解、脱水等反应制得。 HMF生物氧化的下游产物众多，其中，2,5-呋喃二甲酸(FDCA)因具有替代石油基大宗化学品对苯二甲酸的潜力，受到研究者的格外关注。
[0003] FDCA是一种生物基芳香族单体，可用于合成高性能聚酯、聚酰胺和环氧树脂，被美国能源部确定为12种最具潜力的生物基平台化合物之一，也被视为“沉睡中的巨人”。目前，FDCA主要通过化学催化5-HMF制备，例如，Pasini等以分子氧为氧化剂，在 Au-Cu/TiO2的共同催化下，HMF实现了高效选择性氧化，生成了99％的FDCA(Green Chemistry,2011,13:2091)。尽管化学法合成FDCA取得了一定的进展，但化学法通常以重金属为催化剂，价格昂贵，反应条件苛刻，环境不友好，违背了绿色化工的发展策略。此外，部分化学催化剂选择性不理想，容易导致活性羟基或醛基的过度氧化，从而产生大量副产物，影响后续目标产物分离纯化。
[0004] 生物催化合成FDCA反应条件温和、选择性高、工艺简单、绿色环保。但该领域还处于起步阶段。Dijkman等报道了一种来源于Methylovorus sp.MP688的HMF氧化酶，该酶能够催化HMF氧化，室温下反应24h，HMF(5mM)可完全转化，FDCA产率达 95％。Carro等耦合芳基醇氧化酶和非特异性的血红素氧化酶一锅两步将HMF(3mM) 转化为FDCA，但该耦合反应效率较低，反应需较长时间(120h)才能获得高FDCA 产率(91％)。目前还没有利用微生物细胞作为催化剂多细胞序列催化合成FDCA的报道。
发明内容
[0005] 发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株边缘假单胞菌及利用边缘假单胞菌多细胞序列催化合成2,5-呋喃二甲酸(FDCA)的方法，以简化生产工艺，提高FDCA的产量、得率和产率。
[0006] 发明思路：图1显示了5-羟甲基糠醛合成2,5-呋喃二甲酸的路径，其中，若HMF 转化为HMFCA，其最后不能转化为FDCA。因为目前没有什么好的生物催化剂可以使得HMFCA快速转化为FFCA以及FDCA。而，本发明中所筛选得到的菌株可以特异性氧化醛基(包括HMF至HMFCA、DFF至FFCA、FFCA至FDCA)，不可以氧化羟甲基(包括HMF至DFF、HMFCA至FFCA)。在本申请中，第一步，通过培养基中添加钨酸盐，使其丧失HMF至HMFCA的氧化能力，同时遗传修饰使其具备HMF至DFF 的能力；第二步，野生菌实现DFF至FDCA。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一株边缘假单胞菌，其分类命名为边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)，菌株名为19Z，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年11月28日，保藏编号为CCTCC NO:M 2019984，保藏地址：中国武汉武汉大学。
[0008] 上述边缘假单胞菌及以边缘假单胞菌为出发菌制备得到的重组边缘假单胞菌在制备 2,5-呋喃二甲酸中的应用也在本发明的保护范围内。
[0009] 其中，所述的应用包括如下步骤：
[0010] (1)对边缘假单胞菌CCTCC NO:M 2019984进行遗传修饰，得到重组边缘假单胞菌，将由重组边缘假单胞菌制得的种子液接种到培养基中进行培养，得到第一发酵液，分离，收集第一菌体细胞；
[0011] (2)利用步骤(1)得到的第一菌体细胞催化5-羟甲基糠醛转化，得到氧化中间产物的转化液；
[0012] (3)将边缘假单胞菌CCTCC NO:M 2019984制得的种子液接种到培养基中进行培养，得到第二发酵液，分离，收集第二菌体细胞；
[0013] (4)将步骤(3)得到的第二菌体细胞与步骤(2)得到的转化液混合，并加入CaCO3进行催化反应，得到2,5-呋喃二甲酸。
[0014] 步骤(1)中，所述的遗传修饰为在胞内过表达将5-羟甲基糠醛的羟甲基氧化为醛基的基因，其使5-羟甲基糠醛的羟甲基氧化为醛基。
[0015] 其中，所述的基因优选半乳糖氧化酶突变体，基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0016] 其中，所述半乳糖氧化酶突变体基因序列的合成方法为按照常规分子生物学方法，使用 -Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(购自全式金)克隆至pBBR1MCS-1 质粒(购自Addgene)中。具体操作如下：
[0017] (i)设计两对引物，分别用于扩增目的基因和质粒。
[0018] (ii)扩增目的基因的引物为：
[0019] 上游引物：TTTTAACAAAATATTAACGCTTACTGGGTCACACGAATGGT
[0020] 下游引物：TTTCACACAGGAAACAGCTATGGCAAGTGCCCCGATTGGT
[0021] (iii)扩增质粒的引物为：
[0022] 上游引物：CATAGCTGTTTCCTGTGTGAAAT
[0023] 下游引物：GCGTTAATATTTTGTTAAAATTC
[0025] (v)将所得重组质粒电转化至边缘假单胞菌感受态细胞。用LB培养基培养边缘假单胞菌至对数中期，离心(4℃，6000rpm，10min)收集细胞并用电转缓冲液(10％甘油、1mM HEPES、0.3M蔗糖，pH＝7.0)洗涤两次，所得细胞为感受态细胞。将10μL 浓度为100ng/μL的质粒与100μL感受态细胞混合后加入到电转杯中(内径2mm)，在 2400V、25μF、200Ω的条件下电击，之后立即加入500μL LB培养液。将电转杯中菌液转移至离心管中，30℃摇床上培养1h进行细胞复苏。复苏后细胞在含有卡纳抗性的 LB固体平板上筛选，即得。
[0026] 步骤(1)中，所述的种子液为将重组边缘假单胞菌接种于LB培养基(NaCl：10g/L；胰蛋白胨：10g/L；酵母浸粉：5g/L，溶剂为水)中，在25～40℃及100～200r/min下，活化8～
14h后制得的种子液。
14h后制得的种子液。
[0027] 步骤(1)中，所述的培养基包括0.1～10mM的钨酸盐的LB培养基。
[0028] 步骤(1)中，按照0.5～10v/v％的接种量将种子液接入到LB培养基；所述的培养为在25～40℃，100～200r/min条件下培养至对数中期后的8～14h；
[0029] 其中，在培养至对数中期时，添加终浓度为1mM异丙基硫代半乳糖苷。
[0030] 步骤(2)中，所述5-羟甲基糠醛为含有5-羟甲基糠醛的缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值为5.0～9.0，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液，柠檬酸盐缓冲液和乙酸盐缓冲液中的任意一种；缓冲溶液中5-羟甲基糠醛的含量为10～300mM；所述第一菌体细胞与缓冲溶液的质量体积比为3～50g干细胞/L；同时，向第一菌体细胞与缓冲溶液的混合2+ 2+
物中添加Cu 、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu 的浓度为 0.5～1mM、辣根过氧化物酶浓度为5～15U/mL、过氧化氢酶浓度为50～100U/mL；反应条件为15～50℃，50～300r/min，反应10min～12h。
物中添加Cu 、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu 的浓度为 0.5～1mM、辣根过氧化物酶浓度为5～15U/mL、过氧化氢酶浓度为50～100U/mL；反应条件为15～50℃，50～300r/min，反应10min～12h。
[0031] 辣根过氧化物购自Sigma公司，按照说明书进行酶活测定。具体酶活测定条件：反应体系为3mL，磷酸钾缓冲液(14mM，pH＝6.0)，H2O2(0.027％(v/v))，连苯三酚(0.5％ (w/v))，适量辣根过氧化物酶，在420nm处监测吸光值的变化。酶活定义：在pH＝6.0， 25℃下，每20s氧化1μmol连苯三酚的所需要的酶量定义为1U。
[0032] 过氧化氢酶购自Sigma公司，按照说明书进行酶活测定。具体酶活测定条件：反应体系为3mL，磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝7.0)，H2O2(0.036％(w/w))，适量过氧化氢酶，在240nm处监测吸光值的变化。酶活定义：在pH＝7.0，25℃下，每分钟分解1 μmol H2O2所需要的酶量定义为1U。
[0033] 步骤(3)中，所述的种子液为将边缘假单胞菌CCTCC NO:M 2019984接种于LB 培养基(NaCl：10g/L；胰蛋白胨：10g/L；酵母浸粉：5g/L)中，在25～40℃及100～200 r/min下，活化8～14h制得的种子液。
[0034] 步骤(3)中，按照0.5～10v/v％的接种量将种子液接入到LB培养基；所述的培养为在25～40℃，100～200r/min的条件下培养至对数中期后的6～12h。
[0035] 其中，在培养至对数中期时，添加诱导剂；其中，所述的诱导剂为5-羟甲基糠醛、糠醛、2,5-呋喃二甲酸和糠醇中的任意一种；添加诱导剂使其浓度为0.5～6mM。
[0036] 步骤(4)中，所述第二菌体细胞与步骤(2)得到产物的质量体积比为3～50g干细胞/L转化液；碳酸钙的添加量为2～8g/L转化液；所述催化反应的条件为15～50℃， 50～300r/min反应10min～12h，实时监测和控制反应体系的pH不低于4.5，得到含有 FDCA的转化液。
[0037] 其中，在步骤(4)反应前，可以除去第一菌体细胞，也可以不除去第一菌体细胞。
[0038] 其中，在步骤(4)反应结束后，将得到的含有FDCA的转化液以离心方式去除步骤(4)中加入的第二菌体细胞，所得清液稀释适当倍数后进行HPLC检测；其中，若在步骤(4)反应前，没有除去第一菌体细胞，需要在该步骤除去。
[0039] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优势在于：
[0040] (1)单纯的化学途径生产FDCA，通常在高温高压条件下进行，且需要使用贵金属催化剂及有毒溶剂，而生物催化虽然环境友好，但其研究尚处于起步阶段，生产方法还不完善。目前有少数多酶耦合生产FDCA的研究报道，而本研究首次采用多细胞序列催化，一锅两步合成FDCA。
[0041] (2)本发明的合成方法能显著提高FDCA的产量、得率和产率，只需通过简单的细胞培养和序列催化，即可实现HMF至FDCA的高效转化。
[0043] 图1为HMF合成FDCA的路径。
[0044] 图2为多细胞序列催化合成FDCA的过程示意图。
[0045] 图3为多细胞序列催化50mM的HMF合成FDCA的过程过程中，各物质组分的变化曲线。
具体实施方式
[0047] 本发明中，各英文缩写的中文含义为：
[0048] HMF：5-羟甲基糠醛
[0049] BHMF：2,5-二羟甲基呋喃
[0050] DFF：2,5-呋喃二甲醛
[0051] FFCA：5-甲酰基糠酸
[0052] FDCA：2,5-呋喃二甲酸。
[0053] 实施例1：边缘假单胞菌的筛选和保存
[0054] 从南京林业大学后山等地采集土样，1g混合土样与9mL无菌生理盐水混合均匀后，取500微升接种至50mL含有10mM DFF的LB培养基中，在30℃、200r/min条件下培养24小时。取500微升培养液接种至50mL含有20mM DFF的LB培养基中，在30℃、 200r/min条件下培养
24小时。将培养液以10-2、10-3、10-4三个稀释度涂布在含有20mM DFF的固体LB培养基上，30℃培养直至出现微生物菌落。挑取单菌落，接种至50mL 新鲜LB培养基中，2小时后加入3mM HMF，继续培养12小时。离心收集菌体并将其重悬在pH为6.0的100mM磷酸盐缓冲液中，与
50mM DFF混合后，30℃、200r/min 条件下催化3小时，通过反应混合液的pH初步判断产物产量，确定阳性初筛菌株。然后利用HPLC测定初筛菌株催化所产FDCA的含量，挑选其中FDCA产量最高的菌株保存备用。该菌株可将50mM DFF全部转化为FDCA。
24小时。将培养液以10-2、10-3、10-4三个稀释度涂布在含有20mM DFF的固体LB培养基上，30℃培养直至出现微生物菌落。挑取单菌落，接种至50mL 新鲜LB培养基中，2小时后加入3mM HMF，继续培养12小时。离心收集菌体并将其重悬在pH为6.0的100mM磷酸盐缓冲液中，与
50mM DFF混合后，30℃、200r/min 条件下催化3小时，通过反应混合液的pH初步判断产物产量，确定阳性初筛菌株。然后利用HPLC测定初筛菌株催化所产FDCA的含量，挑选其中FDCA产量最高的菌株保存备用。该菌株可将50mM DFF全部转化为FDCA。
[0055] 菌种鉴定结果表明，上述发明菌株为边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)19Z，该菌已于2019年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，其保藏号为：CCTCC NO:M 2019984。该菌株即为本发明所述的生物催化剂B。
[0056] 实施例2：边缘假单胞菌的遗传修饰
[0057] 化学合成半乳糖氧化酶突变体基因序列，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。并按照常规分子生物学方法，使用 -Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(购自全式金)克隆至pBBR1MCS-1质粒(购自Addgene)中。具体操作如下：
[0058] (1)设计两对引物，分别用于扩增目的基因和质粒。
[0059] (2)扩增目的基因的引物为：
[0060] 上游引物：TTTTAACAAAATATTAACGCTTACTGGGTCACACGAATGGT
[0061] 下游引物：TTTCACACAGGAAACAGCTATGGCAAGTGCCCCGATTGGT
[0062] (3)扩增质粒的引物为：
[0063] 上游引物：CATAGCTGTTTCCTGTGTGAAAT
[0064] 下游引物：GCGTTAATATTTTGTTAAAATTC
[0065] (4)PCR所得产物用纯化试剂盒纯化，随后按照 -Uni Seamless Cloning and Assembly Kit操作手册将目的片段和质粒连接起来。
[0066] (5)将所得重组质粒电转化至边缘假单胞菌感受态细胞。用LB培养基培养边缘假单胞菌至对数中期，离心(4℃，6000rpm，10min)收集细胞并用电转缓冲液(10％甘油、1mM HEPES、0.3M蔗糖，pH＝7.0)洗涤两次，所得细胞为感受态细胞。将10μL 浓度为100ng/μL的质粒与100μL感受态细胞混合后加入到电转杯中(内径2mm)，在 2400V、25μF、200Ω的条件下电击，之后立即加入500μL LB培养液。将电转杯中菌液转移至离心管中，30℃摇床上培养1h进行细胞复苏。复苏后细胞在含有卡纳抗性的 LB固体平板上筛选，所得菌株即为本发明所述的生物催化剂A。
[0067] 实施例3：利用生物催化剂A氧化HMF
[0068] (1)从保存生物催化剂A的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，200r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0069] (2)将活化种子液按体积百分比2％接入到含有1mM钨酸钠的LB培养基中，在 30℃，200r/min条件下培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养12h，以增值细胞；
[0070] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0071] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂A与含有HMF的磷酸盐缓冲液(100mM， pH 6.0)混合，并使得混合物中HMF的浓度为50mM，生物催化剂浓度为10g干细胞 /L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为1mM、辣根过氧化物酶浓度为10U/mL、过氧化氢酶浓度为80U/mL，于30℃，200r/min条件下反应80min，得到转化液；
[0072] (5)将步骤(4)的转化液以6000r/min离心30min，去除步骤(4)中加入的生物催化剂，所得清液稀释20倍后进行HPLC检测。
[0073] (6)转化液中产物的检测
[0074] 经HPLC检测，转化液中无HMF剩余，产物包括DFF和FFCA，二者比例为9:1。
[0075] 实施例4：利用生物催化剂A氧化HMF
[0076] (1)从保存生物催化剂A的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在25℃，200r/min条件下培养14h，以活化菌种；
[0077] (2)将活化种子液按体积百分比10％接入到含有0.1mM钨酸钠的LB培养基中，在25℃，200r/min条件下，培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养 14h，以增值细胞；
[0078] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0079] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂A与含有HMF的磷酸盐缓冲液(100mM， pH 7.0)混合，并使得混合物中HMF的浓度为10mM，生物催化剂浓度为3g干细胞/L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为1mM、辣根过氧化物酶浓度为15U/mL、过氧化氢酶浓度为100U/mL，于25℃，200r/min条件下反应20min，得到转化液；
[0080] (5)将步骤(4)的转化液以6000r/min离心30min，去除步骤(4)中加入的生物催化剂，所得清液稀释2倍进行HPLC检测。
[0081] (6)转化液中产物的检测
[0082] 经HPLC检测，转化液中无HMF剩余，产物包括DFF和FFCA，二者比例为8:1。
[0083] 实施例5：利用生物催化剂A氧化HMF
[0084] (1)从保存生物催化剂A的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在40℃，100r/min条件下培养10h，以活化菌种；
[0085] (2)将活化种子液按体积百分比1％接入到含有10mM钨酸钠的LB培养基中，在 40℃，100r/min条件下，培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养10 h，以增值细胞；
[0086] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0087] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂A与含有HMF的Tris-HCl缓冲液(100mM， pH 7.5)混合，并使得混合物中HMF的浓度为20mM，生物催化剂浓度为5g干细胞/L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为0.5mM、辣根过氧化物酶浓度为
5U/mL、过氧化氢酶浓度为50U/mL，于40℃，100r/min条件下反应20min，得到转化液；
5U/mL、过氧化氢酶浓度为50U/mL，于40℃，100r/min条件下反应20min，得到转化液；
[0088] (5)将步骤(4)的转化液以6000r/min离心30min，去除步骤(4)中加入的生物催化剂，所得清液稀释10倍进行HPLC检测。
[0089] (6)转化液中产物的检测
[0090] 经HPLC检测，转化液中无HMF剩余，产物包括DFF和FFCA，二者比例为8.5:1。
[0091] 实施例6：多细胞序列催化合成FDCA，图2显示了本发明多细胞序列催化合成 FDCA的过程。
[0092] (1)从保存生物催化剂A的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在37℃，150r/min条件下培养10h，以活化菌种；
[0093] (2)将活化种子液按体积百分比1％接入到含有2mM钨酸钠的LB培养基中，在 37℃，150r/min条件下，培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养10 h，以增值细胞；
[0094] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0095] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂A与含有HMF的磷酸盐缓冲液(100mM， pH 6.5)混合，并使得混合物中HMF的浓度为300mM，生物催化剂浓度为50g干细胞/L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为1mM、辣根过氧化物酶浓度为15U/mL、过氧化氢酶浓度为100U/mL，于37℃，150r/min条件下反应6h，得到转化液；
[0096] (5)从保存生物催化剂B的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB培养基，在 37℃，150r/min条件下培养10h，以活化菌种；
[0097] (6)将活化种子液按体积百分比1％接入到新鲜LB液体培养基中，在37℃，150 r/min条件下，培养至对数中期，加入浓度为2mM的糠醛，继续培养10h，以增值细胞；
[0098] (7)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0099] (8)将步骤(7)中制得的生物催化剂B与步骤(4)中所得转化液混合，并使得混合物中生物催化剂B浓度为50g干细胞/L，并添加30g/L碳酸钙，于37℃，150r/min 条件下反应4h，得到含有FDCA的转化液。
[0100] (9)将步骤(8)的转化液以12000r/min离心5min，去除步骤(8)中加入的生物催化剂和剩余碳酸钙，所得清液稀释80倍进行HPLC检测。
[0101] (10)转化液中产物的检测
[0102] 经HPLC检测，HMF的转化率为84.5％，产物全部为FDCA。
[0103] 实施例7：多细胞序列催化合成FDCA
[0104] (1)从保存生物催化剂A的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在35℃，150r/min条件下培养8h，以活化菌种；
[0105] (2)将活化种子液按体积百分比3％接入到含有1.5mM钨酸钠的LB培养基中，在35℃，150r/min条件下，培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养 11h，以增值细胞；
[0106] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0107] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂A与含有HMF的乙酸盐缓冲液(100mM， pH 6.0)混合，并使得混合物中HMF的浓度为100mM，生物催化剂浓度为10g干细胞/L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为1mM、辣根过氧化物酶浓度为10U/mL、过氧化氢酶浓度为80U/mL，于35℃，150r/min条件下反应3h，得到转化液；
[0108] (5)将步骤(4)的转化液以10000r/min离心5min，去除步骤(4)中加入的生物催化剂A；
[0109] (6)从保存生物催化剂B的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在35℃，150r/min条件下培养8h，以活化菌种；
[0110] (7)将活化种子液按体积百分比3％接入到新鲜LB培养基中，在35℃，150r/min 条件下，培养至对数中期，加入浓度为3mM的HMF，继续培养11h，以增值细胞；
[0111] (8)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0112] (9)将步骤(8)中制得的生物催化剂B与步骤(5)中所得转化液混合，并使得混合物中生物催化剂B浓度为10g干细胞/L，并添加10g/L碳酸钙，于35℃，150r/min 条件下反应1h，得到含有FDCA的转化液。
[0113] (10)将步骤(9)的转化液以12000r/min离心5min，去除步骤(9)中加入的生物催化剂和剩余碳酸钙，所得清液稀释30倍进行HPLC检测。
[0114] (10)转化液中产物的检测
[0115] 经HPLC检测，HMF的转化率为100％，产物全部为FDCA。
[0116] 实施例8：多细胞序列催化合成FDCA
[0117] (1)从保存生物催化剂A的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0118] (2)将活化种子液按体积百分比1％接入到含有1mM钨酸钠的LB培养基中，在 30℃，150r/min条件下，培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养9h，以增值细胞；
[0119] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0120] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂A与含有HMF的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.0)混合，并使得混合物中HMF的浓度为50mM，生物催化剂浓度为5g干细胞/L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为0.8mM、辣根过氧化物酶浓度为12U/mL、过氧化氢酶浓度为80U/mL，于35℃，150r/min条件下反应80min，得到转化液；
[0121] (5)将步骤(4)的转化液以8000r/min离心5min，去除步骤(4)中加入的生物催化剂A；
[0122] (6)从保存生物催化剂B的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0123] (7)将活化种子液按体积百分比1％接入到新鲜LB培养基中，在30℃，150r/min 条件下，培养至对数中期，加入浓度为3mM的HMF，继续培养9h，以增值细胞；
[0124] (8)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0125] (9)将步骤(8)中制得的生物催化剂B与步骤(5)中所得转化液混合，并使得混合物中生物催化剂B浓度为5g干细胞/L，并添加5g/L碳酸钙，于35℃，150r/min 条件下反应60min，得到含有FDCA的转化液。
[0126] (10)将步骤(9)的转化液以8000r/min离心5min，去除步骤(9)中加入的生物催化剂和剩余碳酸钙，所得清液稀释20倍进行HPLC检测。
[0127] (11)转化液过程中物质的检测
[0128] 该多细胞序列催化过程包括两部分，第一部分为步骤(4)的80min，第二部分为步骤(9)的60min。整个过程持续140min，中间每隔20min取样检测物质浓度变化，过程曲线如图3所示。最终，HMF的转化率为100％，产物全部为FDCA。
[0129] 对比例1：生物催化剂A的培养基中不添加钨酸盐
[0130] (1)从保存生物催化剂A的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0131] (2)将活化种子液按体积百分比1％接入到LB培养基中，在30℃，150r/min条件下，培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养9h，以增值细胞；
[0132] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0133] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂A与含有HMF的磷酸盐缓冲液(100mM， pH 6.0)混合，并使得混合物中HMF的浓度为50mM，生物催化剂浓度为5g干细胞/L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为0.8mM、辣根过氧化物酶浓度为12U/mL、过氧化氢酶浓度为80U/mL，于35℃，150r/min条件下反应80min，得到转化液；
[0134] (5)将步骤(4)的转化液以8000r/min离心5min，去除步骤(4)中加入的生物催化剂A；
[0135] (6)从保存生物催化剂B的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0136] (7)将活化种子液按体积百分比1％接入到新鲜LB培养基中，在30℃，150r/min 条件下，培养至对数中期，加入浓度为3mM的HMF，继续培养9h，以增值细胞；
[0137] (8)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0138] (9)将步骤(8)中制得的生物催化剂与步骤(5)中所得转化液混合，并使得混合物中生物催化剂B浓度为5g干细胞/L，并添加5g/L碳酸钙，于35℃，150r/min条件下反应60min，得到最终转化液。
[0139] (10)将步骤(9)的转化液以8000r/min离心5min，去除步骤(9)中加入的生物催化剂和剩余碳酸钙，所得清液稀释20倍进行HPLC检测。
[0140] (11)转化液过程中物质的检测
[0141] 经HPLC检测，HMF的转化率为100％，产物为HMFCA和FDCA的混合物，二者比例为49:1。
[0142] 对比例2：生物催化剂A的培养基中添加高锰酸盐
[0143] (1)从保存生物催化剂A的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0144] (2)将活化种子液按体积百分比1％接入到含有1mM高锰酸钾的LB培养基中，在30℃，150r/min条件下，培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养 9h，以增值细胞；
[0145] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0146] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂A与含有HMF的磷酸盐缓冲液(100mM， pH 6.0)混合，并使得混合物中HMF的浓度为50mM，生物催化剂浓度为5g干细胞/L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为0.8mM、辣根过氧化物酶浓度为12U/mL、过氧化氢酶浓度为80U/mL，于35℃，150r/min条件下反应80min，得到转化液；
[0147] (5)将步骤(4)的转化液以8,000r/min离心5min，去除步骤(4)中加入的生物催化剂A；
[0148] (6)从保存生物催化剂B的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0149] (7)将活化种子液按体积百分比1％接入到新鲜LB培养基中，在30℃，150r/min 条件下，培养至对数中期，加入浓度为3mM的HMF，继续培养9h，以增值细胞；
[0150] (8)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0151] (9)将步骤(8)中制得的生物催化剂与步骤(5)中所得转化液混合，并使得混合物中生物催化剂B浓度为5g干细胞/L，并添加5g/L碳酸钙，于35℃，150r/min条件下反应60min，得到最终转化液。
[0152] (10)将步骤(9)的转化液以8,000r/min离心5min，去除步骤(9)中加入的生物催化剂和剩余碳酸钙，所得清液稀释20倍进行HPLC检测。
[0153] (11)转化液过程中物质的检测
[0154] 经HPLC检测，产物为HMFCA和FDCA的混合物，二者比例为49:1。
[0155] 对比例3：生物催化剂A的培养基中添加钼酸盐
[0156] (1)从保存生物催化剂A的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0157] (2)将活化种子液按体积百分比1％接入到含有1mM钼酸钠的LB培养基中，在30℃，150r/min条件下，培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养9h，以增值细胞；
[0158] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0159] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂A与含有HMF的磷酸盐缓冲液(100mM， pH 6.0)混合，并使得混合物中HMF的浓度为50mM，生物催化剂浓度为5g干细胞/L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为0.8mM、辣根过氧化物酶浓度为12U/mL、过氧化氢酶浓度为80U/mL，于35℃，150r/min条件下反应80min，得到转化液；
[0160] (5)将步骤(4)的转化液以8,000r/min离心5min，去除步骤(4)中加入的生物催化剂A；
[0161] (6)从保存生物催化剂B的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0162] (7)将活化种子液按体积百分比1％接入到新鲜LB培养基中，在30℃，150r/min 条件下，培养至对数中期，加入浓度为3mM的HMF，继续培养9h，以增值细胞；
[0163] (8)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0164] (9)将步骤(8)中制得的生物催化剂与步骤(5)中所得转化液混合，并使得混合物中生物催化剂B浓度为5g干细胞/L，并添加5g/L碳酸钙，于35℃，150r/min条件下反应60min，得到最终转化液。
[0165] (10)将步骤(9)的转化液以8000r/min离心5min，去除步骤(9)中加入的生物催化剂和剩余碳酸钙，所得清液稀释20倍进行HPLC检测。
[0166] (11)转化液过程中物质的检测
[0167] 经HPLC检测，产物为HMFCA和FDCA的混合物，二者比例为49:1。
[0168] 对比例4：
[0169] (1)从保存野生型边缘假单胞菌的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0170] (2)将活化种子液按体积百分比1％接入到含有1mM钨酸钠的LB培养基中，在 30℃，150r/min条件下，培养至对数中期，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养9h，以增值细胞；
[0171] (3)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0172] (4)将步骤(3)中收集的生物催化剂与含有HMF的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.0)混合，并使得混合物中HMF的浓度为50mM，生物催化剂浓度为5g干细胞/L，同时，向混合物中添加Cu2+、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶，使Cu2+浓度为0.8mM、辣根过氧化物酶浓度为12U/mL、过氧化氢酶浓度为80U/mL，于35℃，150r/min条件下反应80min，得到转化液；
[0173] (5)将步骤(4)的转化液以8,000r/min离心5min，去除步骤(4)中加入的生物催化剂；
[0174] (6)从保存生物催化剂B的琼脂斜面培养基上取一环菌体接种至LB液体培养基，在30℃，150r/min条件下培养12h，以活化菌种；
[0175] (7)将活化种子液按体积百分比1％接入到新鲜LB培养基中，在30℃，150r/min 条件下，培养至对数中期，加入浓度为3mM的HMF，继续培养9h，以增值细胞；
[0176] (8)离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞；
[0177] (9)将步骤(8)中制得的生物催化剂与步骤(5)中所得转化液混合，并使得混合物中生物催化剂B浓度为5g干细胞/L，并添加5g/L碳酸钙，于35℃，150r/min条件下反应60min，得到最终转化液。
[0178] (10)将步骤(9)的转化液以8000r/min离心5min，去除步骤(9)中加入的生物催化剂和剩余碳酸钙，所得清液稀释20倍进行HPLC检测。
[0179] (11)转化液过程中物质的检测
[0180] 经HPLC检测，HMF没有转化。
[0181] 本发明提供了一种多细胞序列催化合成FDCA的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
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