技术领域
[0001] 本
发明涉及甜菜碱盐酸盐的分析技术领域，特别是涉及同时测定反应液中甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐含量的检测技术。
背景技术
[0002] 甜菜碱盐酸盐为季铵型
生物碱,不仅可作为高效甲基供体
饲料添加剂替代胆碱和蛋
氨酸应用于农牧业，而且，甜菜碱盐酸盐还具备许多优良的药理作用，作为
表面活性剂，具有杀菌、增效、抗静电、抗硬
水、防雾、低刺激、增粘等特性，广泛应用于日化、印染、石油化工等行业。年需量约为十几万吨。目前，甜菜碱盐酸盐的制备方法可归属为两大类：天然甜菜糖蜜提取法和化学合成法，前者收率低能耗高，且原料来源有限，限制了该技术的推广应用；而化学合成法根据碱的种类可以细分为
钙法和钠法两类不同的工艺，主要以氯乙酸和三甲胺为基本原料，基本上都采用了“氯乙酸盐的季铵化反应”的合成策略。
[0003] 目前，甜菜碱和甜菜碱盐酸盐的检测方法主要有：非水滴定法、凯氏定氮法、雷氏盐重量法、比色法、分光光度法、薄层扫描法、微型
电极法、质谱与核磁、毛细管
电泳法、气相色谱法、高效液相色谱法等。其中，非水滴定只能测定非
水体系中的甜菜碱含量，且含氮季胺型化合物干扰测定；凯氏定氮法、雷氏盐重量法、比色法和分光光度法干扰较多，且前处理较繁琐；薄层扫描法在定量测定中不占优势；毛细管电泳和微型电极法由于应用范围较窄，质谱与核磁仪器
费用太高，不利于方法的推广使用；气相色谱法利用甜菜碱在350℃高温裂解生三甲胺，通过测定三甲胺含量反推甜菜碱含量，前处理要求比较高；高效液相色谱由于具有分离优势，不受胆碱、氨基酸等与甜菜碱相似的物质干扰，在测定动物、
植物、饲料添加剂、药物、保健品、血液中的甜菜碱含量中应用较为广泛。文献报道的液相色谱测定方法主要有：反相C18柱、氨基柱、离子交换柱(SCX)、亲水作用色谱柱(HILIC)分离，紫外检测器(UV)、
蒸发光散射检测器(ELSD)检测，或者将甜菜碱衍生后测定。
[0004] 关于季铵盐的测定方法较少，主要有正相高效液相色谱法测定三
乙醇胺单、双、三酯季铵盐，超高液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法测定烷基季铵盐类，分光光度法、毛细管电泳法等。氯乙酸甲酯季铵盐的测定未见文献报道。
[0005] 由于高效液相色谱法应用较为广泛，因此采用高效液相色谱法建立一种简便、快速，并且能够同时测定甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的检测技术对于甜菜碱合成工艺中控制反应
进程具有重要的指导意义。
发明内容
[0006] 本发明的目的是为甜菜碱盐酸盐合成工艺提供一种
质量控制方法，能够快速、准确的测定反应液中甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的含量，以确定反应进程。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案来实现。
[0008] 一种同时检测甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的方法，具体为利用HPLC同时检测甜菜碱盐酸盐合成反应液两者的含量，具体步骤如下：
[0009] (1)标准品溶液的制备：用流动相溶解甜菜碱盐酸盐和精制的氯乙酸甲酯季铵盐定容至一定浓度，混合均匀后过滤0.45μm滤膜，即得甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐混合标准品溶液；
[0010] (2)样品溶液的制备：称取甜菜碱盐酸盐合成反应液，用流动相溶解定容至一定体积，混合均匀后过滤0.45μm滤膜，即得样品溶液；
[0011] (3)标准品溶液的测定：利用高效液相色谱法测定步骤(1)制备的标准品溶液，设定高效液相色谱法的测定条件，开始测定，并记录标准品的峰面积；
[0012] (4)样品溶液的测定：将步骤(2)得到的样品溶液，在步骤(3)的色谱条件下进行高效液相色谱测定，并记录样品的峰面积；
[0013] (5)计算组分含量：将步骤(4)的测定结果根据步骤(3)的结果按照单点外标法计算样品溶液中的甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的含量；
[0014] 计算公式如下：
[0015]
[0016] 其中：wi-样品中甜菜碱盐酸盐或氯乙酸甲酯季铵盐的质量分数，单位为％；Ai-样品峰面积；As-标准品峰面积；mi-样品质量，单位为g；ms-标准品质量，单位为g；Ps-标准品纯度，单位为％。
[0017] 所述的甜菜碱盐酸盐合成反应液中甜菜碱盐酸盐的含量为：50％～85％，氯乙酸甲酯季铵盐的含量为：1％～20％。
[0018] 进一步地，步骤(1)中，混合标准品溶液中甜菜碱盐酸盐标准溶液浓度为5mg/mL～15mg/mL，氯乙酸甲酯季铵盐标准溶液浓度为0.5mg/mL～2mg/mL；以保证最大峰峰高不超过
300mV，且标准溶液中甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐含量与样品溶液中含量尽量接近。
进一步地，步骤(2)中，所述的甜菜碱盐酸盐合成反应液的称样量为1g～2g，定容体积为
100mL。以确保标准溶液和样品溶液中甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐含量尽量接近。
[0019] 进一步地，步骤(3)、(4)中，所述离子对色谱法测定条件如下：
[0020] 色谱柱：耐纯水的AQ C18柱(150mm×4.6mm,5μm)；
[0021] 流动相：以甲醇和离子对
试剂为流动相A和流动相B，流动相A和流动相B的体积比例为(5～10):(95～90)；
[0022] 所述的流动相B为离子对试剂为每500mL超纯水中加入2.5mL 40％四丁基氢
氧化铵，用
磷酸水溶液调节pH为2.00～2.40；
[0023] 流速：0.3mL/min；
[0024] 洗脱模式：等度洗脱；
[0025] 检测器：紫外检测器，
[0027] 柱温：20℃～40℃；
[0028] 进样量：5μL；
[0029] 进一步地，优选的流动相条件为流动相pH为2.00～2.20，流动相A：流动相B＝(5～7)：(95～93)。
[0030] 进一步地，该技术向反应母液中加入甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐，再用本发明的检测技术进行测定，得到甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的含量，与实际添加甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的量进行比较，以验证本发明检测技术的准确性。
[0031] 更进一步地，得到甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的加标回收率分别为97.22％～102.04％和95.63％～105.19％。
[0032] 本发明的有益效果为：由于本发明流动相中水相比例较高，通过筛选色谱柱类型，选择耐纯水的AQ C18色谱柱能有效延长色谱柱寿命；通过在流动相中添加离子对试剂、调节流动相pH等手段，改善了甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的峰形和分离度，实现目标物和杂质的基线分离；使用单点外标法时，尽量控制标准溶液和样品溶液中待测物的含量一致，且最大峰峰高不超过300mV，能够减小积分带来的误差，因此加标回收率较好，方法准确度高；本方法分析时间较短，能够应用于甜菜碱盐酸盐合成工艺中控分析，实现快速、准确分析。
附图说明：
[0033] 图1：
实施例1标准品色谱图(端值1)；
[0034] 图2：实施例2标准品色谱图(端值2)；
[0035] 图3：对比例1标准品色谱图(对比试验：流动相pH＝2.50)；
[0036] 图4：对比例2标准品色谱图(对比试验：离子对试剂为庚烷磺酸钠)；
[0037] 图5：对比例3标准品色谱图(对比试验：HILIC色谱柱)；
[0038] 图6：对比例4标准品色谱图(对比试验：氨基柱)。
[0039] 附图标记
[0040] 1-氯乙酸甲酯季铵盐，2-甜菜碱盐酸盐具体实施方式：
[0041] 为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
[0042] 实施例1
[0043] 采用岛津LC 2030C型号高效液相色谱仪、Anasil AQ-C18(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱。
[0044] 流动相：甲醇：水(每500mL超纯水中加入2.5mL 40％四丁基
氢氧化铵，用磷酸水溶液调节pH为2.00)＝5：95；
[0045] 流速：0.3mL/min；
[0046] 洗脱模式：等度洗脱；
[0047] 检测器：紫外检测器，
[0048] 检测波长：214nm；
[0049] 柱温：30℃；
[0050] 进样量：5μL。
[0051] 称取0.5033g甜菜碱盐酸盐和0.1109g精制的氯乙酸甲酯季铵盐，用流动相溶解定容至100mL，摇匀，过滤0.45μm滤膜，配成5.033mg/mL甜菜碱盐酸盐和1.109mg/mL氯乙酸甲酯季铵盐混合标准溶液。
[0052] 称取1.5210g甜菜碱盐酸盐合成反应液，用流动相溶解定容至100mL，摇匀，过滤0.45μm滤膜，配制样品溶液。
[0053] 按照上述色谱条件，待仪器基线稳定后，分别取5μL混合标准品溶液和样品溶液，注入色谱仪，记录二组分色谱图，标准品色谱图见图1。
[0054] 图1中，氯乙酸甲酯季铵盐和甜菜碱盐酸盐的保留时间分别为3.954min和4.990min，分离度为2.587，满足基线分离要求。
[0055] 根据计算公式计算得，甜菜碱盐酸盐合成反应液中甜菜碱盐酸盐含量为79.52％，氯乙酸甲酯季铵盐含量为18.05％。
[0056] 实施例2
[0057] 采用岛津LC 2030C型号高效液相色谱仪、Anasil AQ-C18(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱。
[0058] 流动相：甲醇：水(每500mL超纯水中加入2.5mL 40％四丁基氢氧化铵，用磷酸水溶液调节pH为2.40)＝10：90；
[0059] 流速：0.3mL/min；
[0060] 洗脱模式：等度洗脱；
[0061] 检测器：紫外检测器，
[0062] 检测波长：214nm；
[0063] 柱温：40℃；
[0064] 进样量：5μL。
[0065] 称取0.5988g甜菜碱盐酸盐和0.1227g精制的氯乙酸甲酯季铵盐，用流动相溶解定容至100mL，摇匀，过滤0.45μm滤膜，配成5.988mg/mL甜菜碱盐酸盐和1.227mg/mL氯乙酸甲酯季铵盐混合标准溶液。
[0066] 称取1.9811g甜菜碱盐酸盐合成反应液，用流动相溶解定容至100mL，摇匀，过滤0.45μm滤膜，配制样品溶液。
[0067] 按照上述色谱条件，待仪器基线稳定后，分别取5μL混合标准品溶液和样品溶液，注入色谱仪，记录二组分色谱图，标准品色谱图见图2。
[0068] 图2中，氯乙酸甲酯季铵盐和甜菜碱盐酸盐的保留时间分别为2.342min和3.077min，分离度为1.660，满足基线分离要求。
[0069] 根据计算公式计算得，甜菜碱盐酸盐合成反应液中甜菜碱盐酸盐含量为70.63％，氯乙酸甲酯季铵盐含量为10.20％。
[0070] 实施例3
[0071] (1)标准品溶液的制备：称取0.6052g甜菜碱盐酸盐和0.1036g精制的氯乙酸甲酯季铵盐，用流动相溶解定容至100mL，配成6.052mg/mL甜菜碱盐酸盐和1.036g氯乙酸甲酯季铵盐配制甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐混合标准溶液。
[0072] (2)样品溶液的制备：分别称取1.1564g、1.0783g、1.0029g、1.0924g、1.1066g、1.0872g、1.0090g反应母液，用流动相溶解定容至100mL，混合均匀后过滤0.45μm滤膜。
[0073] (3)标准品溶液的测定：待仪器稳定后，将步骤(1)得到的溶液进行高效液相色谱测定。
[0074] (4)样品溶液的测定：将步骤(2)得到的溶液进行高效液相色谱测定。
[0075] (5)将步骤(4)的测定结果根据步骤(3)的结果按照单点外标法计算样品溶液中的甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的含量。分别测得样品中甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的含量如下表：
[0076] 表1反应液中甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的含量
[0077]样品编号 甜菜碱盐酸盐，％ 氯乙酸甲酯季铵盐，％
1 83.09 15.06
2 83.41 15.02
3 83.39 15.27
4 83.25 15.11
5 83.10 15.39
6 83.29 15.09
7 83.40 15.17
平均值 83.28 15.16
RSD 0.14 0.13
[0078] 以反应液中甜菜碱盐酸盐含量为83.28％、氯乙酸甲酯盐酸盐含量为15.16％计算，称取约1g反应液，将甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯盐酸盐标准溶液按照样品中二组分含量的25％、50％、100％加入到称取的反应液中，测定加标回收率，结果见表2：
[0079] 表2加标回收率
[0080]
[0081] 从上表可看出，甜菜碱盐酸盐的加标回收率在97.22％～102.04％之间，氯乙酸甲酯季铵盐的加标回收率在95.63％～105.19％之间，满足一般样品测定加标回收率在90％～110％的范围，表明该方法测定结果准确可靠。
[0082] 对比例1
[0083] 采用岛津LC 2030C型号高效液相色谱仪、Anasil AQ-C18(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱，标准品色谱图见图3。
[0084] 流动相：甲醇：水(每500mL超纯水中加入2.5mL 40％四丁基氢氧化铵，用磷酸水溶液调节pH为2.50)＝10：90；
[0085] 流速：0.3mL/min；
[0086] 洗脱模式：等度洗脱；
[0087] 检测器：紫外检测器，
[0088] 检测波长：214nm；
[0089] 柱温：30℃；
[0090] 进样量：5μL。
[0091] 图3中，由于甜菜碱盐酸盐为
离子化合物，在适当的pH下才能与离子对结合形成疏水化合物在C18色谱柱上保留，pH不合适时会出现色谱峰分叉，由图中可以看出，在pH＝2.50时，色谱条件不能满足要求。
[0092] 对比例2
[0093] 采用岛津LC 2030C型号高效液相色谱仪，考察文献报道过的使用庚烷磺酸钠流动相体系-C18色谱柱分离二组分，标准品色谱图见图4。
[0094] 色谱柱：Anasil AQ-C18(150mm×4.6mm，5μm)；
[0095] 流动相：甲醇：水(10mmol/L庚烷磺酸钠)＝10：90；其他条件同实施例1。
[0096] 从图4可以看出：以庚烷磺酸钠为离子对试剂时甜菜碱盐酸盐出峰正常，但是氯乙酸甲酯季铵盐峰前面连着一个倒峰，致使不能正常积分。
[0097] 对比例3
[0098] 采用岛津LC 2030C型号高效液相色谱仪、考察文献报道过的使用HILIC色谱柱分离二组分，标准品色谱图见图5。
[0099] 色谱柱：HILIC(150mm×4.6mm，5μm)；
[0100] 流动相：乙腈：水＝50：50；其他条件同实施例1。
[0101] 从图5可以看出：使用HILIC色谱柱时，甜菜碱盐酸盐出峰正常，但是氯乙酸甲酯季铵盐峰前展严重，通过调节流动相比例、流动相pH、加入乙酸铵或者磷酸二氢
钾等改进剂均不能解决峰前展的问题。
[0102] 对比例4
[0103] 采用岛津LC 2030C型号高效液相色谱仪、考察文献报道过的使用氨基柱分离二组分，标准品色谱图见图6。
[0104] 色谱柱：氨基柱(150mm×4.6mm，5μm)；
[0105] 流动相：乙腈：水(20mmol/L乙酸铵)＝80：20；其他条件同实施例1。
[0106] 从图6可以看出：使用氨基柱时，甜菜碱盐酸盐出峰正常，但是氯乙酸甲酯季铵盐峰分叉，调节流动相pH改善不佳。
[0107] 对比例2～对比例4，通过对比不同色谱柱和流动相条件，考察二组分色谱峰峰形、分离度，文献报道的色谱条件均不适用于甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的同时测定。
