技术领域
[0001] 本
发明涉及天然活性物质提取技术领域，具体涉及一种花青苷标准品的制备方法。
背景技术
[0002] 作为一种天然色素，花青素是
水溶性的，并赋予许多鲜花和水果紫色、蓝色和红色等
颜色，同时它还能够促进
授粉和
种子的分布。很多调查都证实天然花青素能够保护
植物免受
生物和
非生物胁迫。例如，花青素可以提供植物抗病性增强对一些
真菌疾病和虫害的抵抗
力。此外，花青素还能够保护植物免受寒冷损伤和紫外线照射。除了对植物的生理影响，富含花青素的健康饮食也有多种显著的促进健康作用。花青素能够防止某些慢性疾病包括高血糖和抑制
肿瘤细胞的生长等作用，同时也能改善视力。由于这些好处，花青素的应用变得越来越商业化并且被用于许多人类疾病的
治疗。
[0003] 龙葵作为一种草本植物属于茄科植物家族。它原产于亚洲等热带和温暖的温带地区。在中国人们主要利用它的一些解热、利尿效果来治疗一些
炎症。在台湾地区夏天时人们也会用它来制作饮料来解渴降暑。此外，龙葵具有强大的生存能力以及很高的果实繁殖率，让它能够在野生情况下到处繁殖无处不在，因此可以被作为花青素提取的重要原材料。
[0004] 目前，无矮牵
牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-
葡萄糖苷（Petunidin-3-(trans-p-coumaroyl) -rutinoside-5-glucoside）花青苷标准品的制备的信息，而从龙葵中获得矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷（Petunidin-3-(trans-p-coumaroyl) -rutinoside-5-glucoside）标准品的相关消息也未见报道。
发明内容
[0005] 为了降低花青苷标准品的提取纯
化成本以及提高其纯度，本发明提供了一种花青苷标准品矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的制备方法。
[0006] 本发明一种花青苷标准品矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的制备方法，包括葡聚糖凝胶
树脂和制备型液相提取纯化步骤，包括如下步骤：
[0007] （1）取花青素粉末溶解于酸后，经
滤纸过滤去除不溶性固体杂质；
[0008] （2）将过滤后的花青素溶液通过萃取处理以去除黄
酮类杂质；
[0009] （3）将上述被萃取除去黄酮类杂质的花青素样品上凝胶柱
吸附处理，分段洗脱后收集洗脱液；
[0010] （4）将不同分段洗脱液分别进行高效液相色谱分析，观察色谱峰图，选择包含矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷最多且其余花青素吸收峰最少的分段洗脱液进行二次上凝胶柱吸附及洗脱收集；
[0011] （5）将二次洗脱液进行分段收集并再次进行高效液相色谱分析，再次选择包含矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷最多且其余花青素组分吸收峰最少的分段洗脱液利用制备型液相继续进行分离纯化，并按照出峰时间进行分离收集；
[0012] （6）经制备型液相按照不同时段收集的花青素组分再经过高效液相色谱仪及质谱进行鉴定分析，即可得到矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷标准品。
[0013] 在上述步骤（1）中，所述的花青素粉末来源于龙葵果实且纯度高于50%，该花青素粉末的制备方法参考名称为《一种高纯度花青素的提取方法》的发明
专利申请（申请号201510948177.9）。
[0014] 上述步骤（1）溶解用的酸优选为3%的
醋酸，且每0.5g花青素粉末所用3%醋酸的体积优选为10ml。
[0015] 在上述步骤（2）中，所述的萃取剂为乙酸乙酯，所述的萃取过程具体为：将花青素溶液与等体积的乙酸乙酯混匀，每隔2小时摇晃一次，避光萃取12小时，且共萃取四次。
[0016] 在上述步骤（3）中，所用的凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱；洗脱液中醋酸与甲醇的体积比优选为1：10。
[0017] 在上述步骤（5）中，所述的制备型液相的分离纯化条件具体为：
[0018] 流动相A组成为87%水、11%乙腈、2%的乙酸，流动相B组成为40%水、58%乙腈、2%的乙酸；
[0019] 洗脱梯度为0 min 4% B， 20 min 20% B， 35 min 40% B， 40 min 60% B， 45 min 90% B， and 55 min 4% B；
[0020] 流速设置为5 mL/min；
[0022] 柱子型号为：填料SinoChrom ODS-BP 10μm。
[0023] 本发明的有益技术效果体现在以下方面：
[0024] （1）花青素提取来源为龙葵果实花青素粗提物，龙葵植株生长及繁殖能力强，果实含丰富花青素且容易获得，且矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷被鉴定为其中含量最丰富的花青素，这使得其粗提物原料提取更高效易得。
[0025] （2）本发明在提取过程中采用葡聚糖凝胶树脂结合制备型液相进行分离纯化收集，能够显著提高分离纯化效率，能够获得纯度大于98%的矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷标准品。
附图说明
[0026] 图1为
实施例中原始高纯度花青素粗提物经过乙酸乙酯萃取去除黄酮类杂质，图中可见上层为乙酸乙酯萃取的黄酮类杂质颜色暗黄，下层为花青素类物质；
[0027] 图2为实施例中原始粗提物经过乙酸乙酯萃取去除黄酮类杂质后的紫外吸收
光谱，图中可见520nm处花青素吸收峰明显升高，同时，320nm处黄酮类物质吸收峰明显降低；
[0028] 图3为实施例中去除黄酮类杂质的花青素在Sephadex LH-20凝胶柱上进行吸附分离。图中可见三个色带，其中a为组分1，b为组分2，c为组分3；
[0029] 图4为实施例中龙葵花青素经过Sephadex LH-20凝胶柱分离后被洗脱产生的三段花青素组分，其中颜色最深的组分2是主要包含矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的组分；
[0030] 图5 为实施例中从组分2中经过制备型液相分离得到的矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的制备型液相检测图谱，图中可见矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷在25 min时产生吸收峰，因此收集器收集时间设置为23-27 min；
[0031] 图6为实施例中从组分2中经过制备型液相分离得到的矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷经分析型高效液相色谱（HPLC）检测色谱图，图中可见矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷在32 min处出现最高吸收峰；
[0032] 图7为实施例中从组分2中经过制备型液相分离得到的矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的质谱鉴定图（HPLC-MS/MS），在正离子模式下经过质谱鉴定获得了矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的母离子分子量（m/z 933）以及子离子（m/z 771，m/z 479，m/z 317）的二级质谱图。
具体实施方式
[0033] 下面提供的本发明的具体实施方式，可以更好地理解本发明，但本发明实施不局限于以下实施方式，在不脱离本发明原理的前提下可以对本发明做出若干改进，但是这些改进也应视为本发明的保护范围。
[0034] 实施例
[0035] 本实施例的一种花青苷标准品矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的制备方法，其包括下列步骤：
[0036] （1）参考名称为《一种高纯度花青素的提取方法》的发明专利申请（申请号201510948177.9）的方法获得的纯度高于50%的龙葵花青素粉末，取500mg花青素粉末经过
10ml的3%的醋酸充分溶解后，经滤纸过滤去除不溶性固体杂质。
[0037] （2）过滤后的花青素溶液再与等体积的乙酸乙酯摇晃混匀，每隔2小时摇晃一次，避光萃取12小时，每次萃取完毕丢弃上层乙酸乙酯层，然后重复4次，充分萃取其中的黄酮类杂质。如图1所示，上层为乙酸乙酯萃取的黄酮类杂质颜色暗黄，下层深紫色为花青素类物质。并且如图2所示，紫外吸收图谱显示在经过乙酸乙酯萃取之后花青素在520nm处的吸收峰明显提高，而在325nm处黄酮类物质的吸收峰则明显降低，表明黄酮类杂质得到有效去除。
[0038] （3）将上述被萃取除去黄酮类杂质的花青素样品缓慢加入到150g Sephadex LH-20凝胶柱上，上样过程保持缓慢，防止柱子被冲垮。样品被充分吸附后如图3所示，产生了三个色带， a为组分1，b为组分2，c为组分3。
[0039] （4）待样品被完全吸附到凝胶柱之后，用30%甲醇（含3%的醋酸）溶液进行洗脱，并且分段收集洗脱液，分别收集到3段洗脱液，a为组分1，b为组分2，c为组分3。如图4所示，其中颜色最深的组分2是主要包含矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的组分。
[0040] （5）将以上不同分段洗脱液分别进行高效液相色谱分析，观察色谱峰图，选择包含矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷最多且其余花青素吸收峰最少的分段洗脱液即组分2进行二次上柱吸附及洗脱收集。
[0041] （6）将二次洗脱液进行分段收集并再次进行高效液相色谱分析，再次选择包含矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷最多且其余花青素组分吸收峰最少的分段洗脱液利用制备型液相继续进行分离纯化。制备型液相分离收集条件如下：流动相A组成为87%水、11%乙腈、2%的乙酸，流动相B组成为40%水、58%乙腈、2%的乙酸；洗脱梯度为0 min 4% B， 20 min 20% B， 35 min 40% B， 40 min 60% B， 45 min 90% B， and 55 min 4% B；流速设置为5 mL/min；检测波长为520nm；柱子型号为：填料SinoChrom ODS-BP 10μm。如图5所示，组分2中经过制备型液相分离得到的矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的制备型液相检测图谱，在25 min处产生吸收峰。
[0042] （7）设置制备型液相收集器时间为峰起始时间到峰结束时间，对矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷（Petunidin-3-(trans-p-coumaroyl)-rutinoside-5-glucoside）经制备型液相柱子进行分离后收集。如图5所示，组分2中经过制备型液相分离得到的矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷在25 min处产生吸收峰，因此收集器时间设置为23-27 min。
[0043] （8）经过制备型液相收集的花青素组分再分别经过高效液相色谱及质谱进行组分及纯度分析，得到其中包含单一矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷的组分即纯度为98.2%的矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷标准品。如图6，7所示，矮牵牛素-3-反式对香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷经在分析型高效液相色谱（HPLC）检测在32 min处出现最高吸收峰，在正离子模式下经过质谱鉴定获得了其母离子分子量（m/z 933）以及子离子（m/z 771，m/z 479，m/z 317）的二级质谱图。
[0044] 尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和
修改，其所产生的功能作用仍未超出
说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。
