首页 / 专利库 / 变压器和转换设备 / 传感器 / 用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备方法

用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备方法

阅读:643发布:2020-10-29

专利汇可以提供用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时 荧光 成像 传感器 及其制备方法。更具体地,本发明涉及用于测量细胞器中的谷胱甘肽的新型化合物,制备该新型化合物的方法,用于测量细胞器中的谷胱甘肽的实时成像传感器,所述传感器包含该新型化合物,所述传感器的制备方法,以及一种使用所述成像传感器测量细胞器中谷胱甘肽的方法。包含根据本发明的化合物的组合物的使用使得可以测量活细胞特别是干细胞中的细胞器线粒体或高尔基体的抗 氧 化能 力 ,从而可以基于细胞器的抗氧化能力的测量筛选高活性干细胞。,下面是用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备方法专利的具体信息内容。

1.由以下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐:
[式I]
其中,R1为N或含有一个或多个N原子的3至7元杂环烷基。
2.如权利要求1所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐,其特征在于,所述杂环烷基具有键合至其上的R2取代基,其中,R2为-(C(=O)NH)-(CH2)m-PPh3+Cl-(其中,m为1至+ -
4的整数)、-(CH2)n-PPh3Cl (其中,n为1至6的整数)或-C(NHC(=O)-R3,其中,R3为由以下式II所示的取代基:
[式II]
其中,x为1至5的整数。
3.如权利要求2所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐,其特征在于,所述式I所示的化合物为下述式III至V所示的化合物中的任意一种或多种:
[式III]
[式IV]
[式V]
4.如权利要求1所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐,其特征在于,式I所示的化合物中R1为N,且式I如以下式VI所示:
[式VI]
其中,R4为((CH2)p-(OCH2CH2O)q-(CH2)r或-(CH2CH2)s-,其中,p、q、r和s均为1至5的整数。
5.如权利要求4所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐,其特征在于,R4为(OCH2CH2O)-、-(CH2CH2)-或-(CH2(OCH2CH2)2OCH2)-中的任一种,且所述式1所示的化合物由以下式VII至IX中的任何一个或多个所示:
[式VII]
[式VIII]
[式IX]
6.如权利要求1所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐,其特征在于,所述式I所示的化合物在游离状态下显示最大发射波长为550-680nm,且在与硫醇结合状态下显示最大的发射波长为430-550nm。
7.如权利要求6所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐,其特征在于,所述发射波长处的荧光强度在430nm至680nm的范围内升高或降低。
8.一种用于测量活细胞中抗化活性的组合物,其包含作为活性成分的如权利要求1至7中任一项的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐。
9.如权利要求8所述的组合物,其特征在于,所述抗氧化活性测量是活细胞中硫醇平的测量。
10.如权利要求9所述的组合物,其特征在于,所述硫醇水平的测量是细胞器中硫醇水平的测量。
11.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述细胞细胞器为线粒体或高尔基体。
12.如权利要求11所述的组合物,其特征在于,所述线粒体中的抗氧化活性的测量是使用式III至V中的任一化合物进行的。
13.如权利要求11所述的组合物,其特征在于,所述高尔基体中的抗氧化活性的测量是使用式VII至IX中的任一化合物进行的。
14.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,随着在硫醇水平的测量中硫醇水平的增加,在550-680nm处的荧光强度降低且在430-550nm处的荧光强度增加。
15.如权利要求14所述的组合物,其特征在于,所述硫醇水平的测量是通过获得430-
550nm处的荧光强度与550-680nm处的荧光强度的比率来进行的。
16.如权利要求15所述的组合物,其特征在于,所述比率是430-550nm的荧光强度与
550-680nm的荧光强度之间的关系。
17.如权利要求16所述的组合物,其特征在于,所述关系是430-550nm处的荧光强度与
550-680nm处的荧光强度之间的数学比,其中,所述数学比随着线粒体中的硫醇的量成比例地、可逆地增加或降低,从而实时指示细胞器中硫醇的量。
18.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述硫醇水平的测量是细胞器中硫醇的定量或定性检测。
19.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述硫醇水平的测量是实时定量测量。
20.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述硫醇水平的测量指示所述细胞的氧化应激或氧化程度。
21.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述硫醇水平的测量指示所述细胞的老化程度。
22.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述硫醇包括谷胱甘肽(GSH)、高半胱酸(Hcy)、半胱氨酸(Cys)或蛋白质的半胱氨酸残基中的硫醇。
23.一种在活细胞中筛选硫醇增强剂或抑制剂的方法,包括以下步骤:
(a)将权利要求8的组合物和候选物质同时或以任何顺序加入活细胞中;
(b)获得430-550nm处的荧光强度与550-680nm处的荧光强度的比率,并将所得比率与标准数据进行比较;
(c)确定候选物质为硫醇增强剂或抑制剂;和
(d)当550-680nm的荧光强度与430-550nm的荧光强度的比率降低时,确定候选物质为硫醇增强剂,且当荧光强度的比率升高时,确定候选物质为硫醇抑制剂。
24.如权利要求23所述的方法,其特征在于,所述荧光强度的比率是在作为细胞器的线粒体或高尔基体中测定的。
25.一种用于诊断由氧化应激诱导的疾病试剂盒,其包含如权利要求1至7中任一项所述的化合物或其盐。
26.一种用于测量活细胞中抗氧化活性的方法,包括以下步骤:
(a)实时测量活细胞在430-550nm处的荧光强度与550-680nm处的荧光强度的比率;
(b)向活细胞中加入权利要求8所述的组合物;
(c)向步骤(b)的活细胞中添加氧化剂;和
(d)观察荧光强度的比率的变化。
27.如权利要求26所述的方法,步骤(d)之后还包括步骤:测量用于使荧光强度的比率返回到没有氧化剂的活细胞的荧光强度的比率,或在添加氧化剂之前显示的荧光强度的比率的时间,其中确定时间越短,抗氧化活性越高。
28.如权利要求26的方法,步骤(d)之后还包括步骤,测量未添加氧化剂的活细胞的荧光强度的比率与添加了氧化剂的活细胞的荧光强度的比率之间的积分差值,从添加氧化剂的时间点到荧光强度的比率返回到添加氧化剂之前所示的荧光强度的比率的时间点,其中,确定积分值越小,抗氧化活性越高。
29.如权利要求26所述的方法,步骤(d)之后还包括步骤:确定氧化剂的最小浓度的步骤,在所述最小浓度下,添加了氧化剂的活细胞的荧光强的比率开始降低,其中,确定最低浓度越高,抗氧化活性越高。
30.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述测量是针对作为细胞器的线粒体或高尔基体进行的。

说明书全文

用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备

方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备方法。更具体地,本发明涉及一种用于测量细胞器中谷胱甘肽的新型化合物,制备该化合物的方法,包括该新型化合物的用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器,成像传感器的制备方法,以及通过使用成像传感器测量细胞器中谷胱甘肽的方法。【背景技术】
[0002] 人体通过抗化剂系统的活性适当消除活性氧(ROS)来维持体内平衡。但是,当ROS的产生与抗氧化剂系统的活性之间的平衡被打破时,氧化应激会增加,由于它是衰老、与年龄有关的变性疾病(如变性关节炎、白内障、阿尔茨海默氏病等)各种癌症、纤维化疾病和代谢综合症(例如糖尿病)、肥胖症、心血管疾病等发展的主要共同原因而引起人们的关注。所述的ROS是不稳定的高反应性分子,其氧化生物分子以引起生化和生理损伤,这是衰老的主要机制之一。因此,不仅人体的氧化程度,而且抗氧化或抗氧化活性的程度也可以用作测量生物年龄的主要生物标记。
[0003] 同时,间充质干细胞是源自各种成年细胞的多能干细胞,例如骨髓细胞()、脐带血细胞、胎盘细胞(或胎盘组织细胞)、脂肪细胞(或脂肪组织细胞)等。例如,源自骨髓的间充质干细胞具有分化为脂肪组织、骨/软骨组织和肌肉组织的多能性,因此已经进行了关于使用间充质干细胞开发细胞治疗剂的各种研究。
[0004] 然而,作为细胞治疗剂主要成分的干细胞在分离后的培养过程中往往会失去其多能性和组织再生能并老化,并且当这些细胞经过数次传代而获得大量的细胞(相当于治疗有效量)时,这种险变得更大。另外,从组织获得的干细胞的数量非常少,并且这些干细胞使用时需要大量,因此需要进行培养增加干细胞的数量。近年来,随着通过测量干细胞的抗氧化活性来管理干细胞质量的方法的出现,细胞内抗氧化活性的测量方法也被公开(韩国专利号10-1575846;韩国专利申请公开号2004-0030701);Liu Hongyan等人,细胞疗法(Cytotherapy),14(2);162-172,2012)。
[0005] 然而,对于通过测量干细胞的抗氧化活性来筛选具有高活性的高质量干细胞的方法的研究仍然不足。因此,干细胞是具有高稀缺价值的细胞治疗资源,为了提高干细胞的利用效率,需要开发用于抗氧化活性测量的组合物,这是筛选高活性干细胞所必需的。
[0006] 此外,如上所述,在测定细胞(包括干细胞)的抗氧化活性时,生物样品中含硫醇化合物的检测和鉴定是非常重要的。因此,已经开发了有效检测活细胞中的硫醇而不破坏细胞的荧光方法。然而,需要通过测量细胞中各种来源的硫醇来测量抗氧化活性的化合物。
[0007] 【公开】
[0008] 【技术问题】
[0009] 本发明人发现,根据本发明的MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂)或GolgiFreSH-示踪剂(高尔基体荧光实时SH基-示踪剂)的荧光强度根据线粒体或高尔基体中硫醇的量持续地、成比例地和可逆地增加或降低,使得MitoFreSH-示踪剂或GolgiFreSH-示踪剂作为高灵敏度生物传感器有效地实时定量或定性检测活细胞中线粒体或高尔基体中硫醇的量,从而完成了本发明。
[0010] 因此,本发明的目的是提供由以下式III至V中的任何一个或多个所示的MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂)或由以下式VII至IX中的任何一个或多个所示的GolgiFreSH-示踪剂(高尔基体荧光实时SH基-示踪剂)。
[0011] 本发明的另一个目的是提供一种用于检测线粒体硫醇的组合物,其包含MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂),或用于检测高尔基体中硫醇的组合物,其包含GolgiFreSH示踪剂(高尔基体荧光实时SH基-示踪剂)。
[0012] 本发明的又一目的是提供通过使用MitoFreSH-示踪剂或GolgiFreSH-示踪剂,在活细胞的线粒体或高尔基体中筛选硫醇增强剂或抑制剂的方法。
[0013] 通过以下对本发明的详细描述和所附权利要求,本发明的这些和其他目的和优点将变得更加明显。
[0014] 然而,本发明要实现的目的不限于上述目的,本领域技术人员将从以下描述中清楚地理解本发明的其他目的。
[0015] 【技术方案】
[0016] 在下文中,本文描述的各种实施例参考附图进行描述。在下面的描述中,阐述了许多具体细节,例如具体的结构、组合和制备方法等,以便于对本发明透彻理解。然而,可以在没有一个或多个这些具体细节或与其他已知方法和结构相结合的情况下实现某些实施例。在其他情况下,没有特别详细地描述已知的方法和制备工艺,以免不必要地混淆本发明。在整个说明书中,参考“一个实施方案”或“一实施方案”是指与该实施方案描述相关的特定特征、结构、组成或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此,在整个说明书中各处出现的短语“在一个实施方案中”或“一实施方案”不一定是指本发明的相同实施例。另外,在一个或多个实施方案中,可以以任何合适的方式组合特定的特征、结构、组合或特性。
[0017] 除非说明书中另有说明,否则说明书中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的相同含义。
[0018] 如本文所用,术语“比率(ratiometric)”是指输出与输入成正比。具体地,在本发明的一个实施方案中,术语“比率”是指本发明组合物的荧光强度或荧光强度的比例的增加或降低与硫醇的输入成正比。
[0019] 如本文所用,术语“检测”是指测量样品中化学种类或生物物质的存在或平。
[0020] 如本文所用,术语“可逆的”是指化学反应中反应物和产物的混合物产生平衡混合物的状态,更具体地,术语“可逆的”是指本文中由式I所示的化合物可以与硫醇以平衡状态在正向或反向上与硫醇可逆地反应,这取决于硫醇的量。
[0021] 如本文所用,术语“硫醇”是指含有键合巯基的有机化合物。术语“硫醇(thiol)基”与术语“巯基(sulfhydryl)”可互换使用。
[0022] 根据本发明的一个方面,本发明提供了一种用于检测线粒体中硫醇的组合物,其包含由下式I所示的化合物或其盐:
[0023] 式I
[0024]
[0025] 其中,R1为含有一个或多个N原子的3至7元杂环烷基,其中,杂环烷基具有与其键合的R2取代基,其中,R2为-(C(=O)NH)-(CH2)m-PPh3+Cl-(其中,m为1到4的整数)、-(CH2)n-PPh3+Cl-(其中,n为1到6的整数)或-(C(=O)-(CH2)p-R3(其中p为1-4的整数),其中,R3为-C(NHC(=O)-R4),其中,R4为由以下式II所示的取代基:
[0026] 式II
[0027]
[0028] 其中,x为1至4的整数。
[0029] 本发明人做了大量的努力,开发了用于定量或定性地实时检测细胞中线粒体中硫醇的量的高灵敏度生物传感器。结果,本发明人发现,根据本发明的由式I所示的MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂)的荧光强度根据细胞线粒体中硫醇的量持续地、成比例地和可逆地增加或降低,使得MitoFreSH-示踪剂作为高灵敏度生物传感器有效地实时定量或定性检测活细胞线粒体中硫醇的量,从而完成了本发明。
[0030] 如本文所用,术语“MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂)是指由式I所示的化合物,其是具有氰基丙烯酰胺亲电体的香豆素衍生物,并且用作根据本发明检测线粒体中硫醇的荧光物质。
[0031] 在本发明的一个实施方案中,本发明所述的线粒体在活细胞中。本发明的组合物的特征在于其不仅可以测量离体细胞的线粒体中的硫醇水平,而且可以测量细胞中所包含的线粒体中的硫醇水平。特别是,它可以特异性检测活细胞线粒体中的硫醇的水平。
[0032] 在本发明的一个实施方案中,本发明中的R1是含有1或2个N原子的6元杂环烷基。如本文所用,“6元杂环烷基”中包括的术语“6元”指的不是多环化合物(例如双环化合物或螺环化合物),而是指单环6元化合物,并且术语“杂环烷基”是指其中环中包含的至少一个碳原子被杂原子(例如氮、氧或硫)取代的非芳族环状烷基。在一个实施方案中,R1是在环中含有一个1或2个氮原子的6元杂环烷基。
[0033] 在本发明的一个实施方案中,根据本发明的由式I所示的化合物是由以下式III至V所示的化合物中的任何一种或多种:
[0034] 式III
[0035]
[0036] 式IV
[0037]
[0038] 式V
[0039]
[0040] 根据本发明,与由式III至V中的任何一种或多种所示的化合物(MitoFreSH-示踪剂)结合的硫醇的量随着活细胞中线粒体中硫醇的量增加而增加。因此,化合物以游离态显示的在550-680nm的荧光强度降低,并且以与硫醇结合态显示的在430-550nm的荧光强度增加。荧光强度根据硫醇的含量成比例地和可逆地增加或降低。
[0041] 根据本发明的一个方面,本发明提供了一种用于检测高尔基体中硫醇的组合物,其包含由下式VI所示的化合物或其盐:
[0042] 式VI
[0043]
[0044] 其中,R4为(CH2)p-(OCH2CH2O)q-(CH2)r或-(CH2CH2)s-的化合物,其中,p、q、r和s分别为1至5的整数。更具体地,式VI中,R4为(OCH2CH2O)-、-(CH2CH2)-和-(CH2(OCH2CH2)2OCH2)-中的任意一种。
[0045] 本发明人做了大量的努力,开发了用于定量或定性地实时检测细胞高尔基体中硫醇的量地高灵敏度生物传感器。结果,本发明人发现,根据本发明的由式VI所示的GolgiFreSH-示踪剂(高尔基体荧光实时SH基-示踪剂)的荧光强度根据细胞高尔基中硫醇的量持续地、成比例地和可逆地增加或降低,使得GolgiFreSH-示踪剂作为高灵敏度生物传感器有效地实时定量或定性检测活细胞高尔基中硫醇的量,从而完成了本发明。
[0046] 如本文所用,根据本发明术语“GolgiFreSH-示踪剂(高尔基体荧光实时SH基-示踪剂)是指由式VI所示的化合物,其是具有氰基丙烯酰胺亲电体的香豆素衍生物,并且用作检测高尔基体中硫醇的荧光物质。
[0047] 根据本发明,与式VI所示的化合物(MitoFreSH-示踪剂)结合的硫醇的量随着活细胞高尔基体中硫醇的量增加而增加。因此,化合物以游离态显示的在550-680nm处的荧光强度降低,并且以与硫醇结合态显示的在430-550nm处的荧光强度增加。荧光强度根据硫醇的含量成比例和可逆地升高或降低。
[0048] 在本发明的一个实施方案中,根据本发明的由式VI所示的化合物是由以下式VII至IX所示的化合物中的任何一种或多种:
[0049] [式VII]
[0050]
[0051] [式VIII]
[0052]
[0053] [式IX]
[0054]
[0055] 当使用包含根据本发明化合物的组合物时,其可以测量包括干细胞在内的所有细胞类型的细胞器(线粒体或高尔基体)的抗氧化活性,从而准确地测量与抗氧化活性相关的细胞活性并筛选高活性细胞。通过使用本发明的组合物的细胞活性的测量包括但不限于抗氧化活性的测量。
[0056] 在本发明的一个实施方案中,提供了一种用于测量细胞器抗氧化活性的组合物,其包含作为活性成分的由式I或VI所示的化合物或其外消旋物、对映异构体、非对映异构体、对映异构体混合物或非对映异构体混合物,或其药学上可接受的盐。
[0057] 根据本发明的一个实施方案,由式I或VI所示的化合物在游离状态(即,非硫醇键合状态)下,显示最大发射波长在550-680nm处,并且在硫醇键合状态下显示最大发射波长为430-550nm。根据本发明的另一实施方案,根据本发明的由式I或VI所示的化合物在游离状态下,显示的最大发射波长在550-650、550-620、550-600、570-590或580nm处。
[0058] 根据本发明的又一实施方案,根据本发明的由式I或VI所示的化合物在硫醇键合状态下,显示的最大发射波长在450-550、470-550、470-530、490-530、500-520或510nm处。
[0059] 根据本发明的一个实施方案,根据本发明的式I或VI的化合物在发射波长处的荧光强度随着线粒体中硫醇的量的增加而连续地且可逆地增加或降低。根据一个更具体的实施方案,荧光强度在430nm至680nm发射波长的范围内增加或降低。
[0060] 根据本发明的一个实施方案,根据本发明的由式I或VI所示的化合物随着线粒体中硫醇含量的增加,显示在550-680nm处荧光强度降低和在430-550nm处荧光强度提高。
[0061] 根据本发明的一个实施方案,本发明硫醇的检测通过获得430-550nm处的荧光强度与550-680nm处的荧光强度的比率来进行。
[0062] 根据本发明的一个实施方案,本发明所述的比率为430-550nm处的荧光强度与550-680nm处的荧光强度之间的关系。
[0063] 根据本发明的一个实施方案,本发明所述的关系为430-550nm处的荧光强度与550-680nm处的荧光强度之间的数学比,并且所述数学比根据活细胞中硫醇的量成比例地可逆地增加或降低,从而实时指示细胞器中硫醇的量。
[0064] 根据本发明的一个实施方案,本发明所述的检测是定量或定性检测细胞器线粒体、高尔基体或细胞核中的硫醇。
[0065] 根据本发明的一个实施方案,本发明所述的检测是实时定量检测。
[0066] 根据本发明的一个实施方案,在本发明中线粒体、高尔基体或细胞核中的硫醇的检测指示细胞的氧化应激或氧化程度。
[0067] 根据本发明的一个实施方案,在本发明中对线粒体、高尔基体或细胞核中硫醇的检测指示细胞的老化程度。
[0068] 根据本发明的一个实施方案,本发明中硫醇包括但不限于谷胱甘肽(GSH)、高半胱酸(Hcy)、半胱氨酸(Cys)或存在于蛋白质半胱氨酸残基中的任何硫醇。
[0069] 根据本发明的又一方面,提供了一种用于诊断氧化应激诱导的疾病的试剂盒,其包含本发明的组合物。如本文所用,术语“氧化应激诱导的疾病”是指由氧化应激引起的疾病,并且具有与术语“活性氧(ROS)相关的疾病”具有相同的含义。
[0070] 根据本发明的一个实施方案,本发明中由氧化应激诱导的疾病为衰老、退行性关节炎、白内障、阿尔茨海默氏病、癌症、纤维化疾病、糖尿病、肥胖症、局部缺血、局部缺血再灌注损伤、炎症、系统性红斑狼疮、心肌梗塞、血栓性中风、出血性中风、出血、脊髓损伤、唐氏综合症、克罗恩病、类风湿性关节炎、葡萄膜炎,气肿、胃溃疡、氧中毒、肿瘤或放射综合症。
[0071] 【有益效果】
[0072] 当使用包含根据本发明的化合物的组合物时,其可以测量活细胞特别是干细胞中的细胞器线粒体或高尔基体的抗氧化活性,并且可以基于通过测量细胞器的抗氧化活性获得的结果筛选高活性干细胞。
[0073] 【附图简要说明】
[0074] 图1示出了MitoFreSH-示踪剂的结构。
[0075] 图2示出了实验结果,表明MitoFreSH-示踪剂与还原型谷胱甘肽可逆地快速反应(a.u.:任意单位;Ex:最大激发波长;Em:最大发射波长)。图2A示出了MitoFreSH-示踪剂的可逆反应。图2B示出了通过用各种浓度的谷胱甘肽([GSH]0=0-100mM)与MitoFreSH-示踪剂平衡20分钟,然后测量它们之间的反应而获得的结果。图2B的上方示出了通过紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱测量MitoFreSH示踪剂的可逆反应的结果,图2B下方示出了MitoFreSH-示踪剂的荧光发射光谱,其是通过在430nm(图2B的左下方)和520nm(图2B的右下方)处激发产生的。图2C示出了分别监测510nm(F510)和580nm(F580)处的荧光发射光谱的结果图。图2D示出了F510/F580比率与谷胱甘肽浓度增加的函数。
[0076] 图3示出了在MTT测定中,用各种浓度的MitoFreSH-示踪剂处理HeLa细胞后24小时,分析细胞活力的结果。
[0077] 图4表明可以使用MitoFreSH-示踪剂对活细胞线粒体中的谷胱甘肽水平进行成像。图4A示出了负载有MitoFreSH-示踪剂的细胞的共聚焦显微镜荧光图像(F510=Ex403-Em525/25;F580=Ex488-Em595/25;比例尺=10μm),和图4B显示了负载有MitoFreSH示踪剂的细胞的共聚焦显微镜荧光图像,在显微镜观察开始后3分钟用0.5mM二酰胺(DA)处理细胞培养物后获得(F510=Ex403-Em525/25;F580=Ex488-Em595/25;比例尺=10μm),和图4C示出了通过测量3种细胞中的每种细胞的荧光强度比(图4A中的箭头)而获得的结果。
[0078] 图5表明活细胞线粒体中的谷胱甘肽水平由于线粒体中产生的活性氧而降低,从而可以用MitoFreSH-示踪剂成像。图5A示出了用抗霉素A处理细胞培养物14小时后,获得的负载有MitoFreSH-示踪剂的细胞的共聚焦显微镜荧光图像(F510=Ex403-Em525/25;F580=Ex488-Em595/25;比例尺=10μm),和图5B示出了通过测量每种细胞的荧光强度比得到的结果。
[0079] 图6示出了MitoFreSH-示踪剂的结构。
[0080] 图7示出了分析HeLa细胞高尔基体中是否分布有高尔基体示踪剂的结果(F510=Ex403-Em525/25;F580=Ex488-Em595/25;比例尺=10μm)。
[0081] 图8表明活细胞高尔基体中谷胱甘肽的水平可以用GolgiFreSH-示踪剂成像。图8A示出了负载有GolgiFreSH-示踪剂的细胞的共聚焦显微镜荧光图像(F510=Ex403-Em525/25;BODIPY TR C5-神经酰胺,高尔基体染料;比例尺=10μm),和图8B示出了在图8A的图像中测量的荧光强度比的结果。
[0082] 图9表明活细胞高尔基体中谷胱甘肽的水平可以用GolgiFreSH-示踪剂定量。
[0083] 【最佳实施方式】
[0084] 当使用包含根据本发明的化合物的组合物时,其可以测量活细胞特别是干细胞中的细胞器线粒体或高尔基体的抗氧化活性,并且可以基于通过测量细胞器的抗氧化活性获得的结果筛选高活性干细胞。
[0085] 【发明方式】
[0086] 此后,将参考实施例更详细地描述本发明。然而,这些实施例仅用于说明性目的,并不旨在限制如所附权利要求书所限定的本发明的范围,对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0087] 制备实施例1:用于测量线粒体抗氧化活性的化合物的合成
[0088] 用于测量细胞器线粒体的抗氧化活性的化合物(MitoFreSH-PPh3、MitoFreSH-哌嗪和MitoFreSH-Cl)的制备方法如下。
[0089] 1-1.MitoFreSH-PPh3(式III)的制备方法
[0090]
[0091] 化合物1
[0092]
[0093] 将(2-溴乙基)胺氢溴酸盐(8.6g,42mmol)和三苯基膦(10g,38mmol)溶解在50mL CH3CN中,并将溶液加热并回流18小时,然后冷却至室温。通过减压蒸馏除去溶剂,并将剩余的混合物溶解在蒸馏水中,并通过加入饱和的K2CO3水溶液将pH调节至11。混合物用CHCl3萃取,萃取物用Na2SO4干燥,然后过滤。减压蒸馏滤液以除去溶剂。剩余的固体用Et2O洗涤,然后在减压干燥以获得化合物1(10g,68%)。
[0094] 1H NMR(400MHz,CDCl3):a(ppm)=7.66-7.87(m,15H),4.01-4.08(m,2H),3.15-3.21(m,2H),2.67(s,2H).31P NMR(121MHz,CDCl3):a(ppm)=24.60.
[0095] 化合物2
[0096]
[0097] 1-(叔丁氧基羰基)-4-哌啶羧酸(0.15g,0.65mmol)、氧化苦参(oxyma)(0.10g,0.71mmol)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA;0.33mL,1.9mmol),1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDCI;0.12g,0.71mmol)和化合物1(0.21g,0.54mmol)溶解在3mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,并将溶液在室温下搅拌11小时。通过减压蒸馏除去溶剂,并将剩余的混合物通过SiO2柱色谱法(MeOH/CH2Cl2 6/94)纯化,得到黄色固体化合物2(0.21g,63%)。
[0098] 1H NMR(400MHz,CDCl3):a(ppm)=8.90-8.93(t,J=5.7Hz,1H),7.69-7.85(m,15H),4.07(br s,2H),3.69-3.80(m,4H),2.73(br s,2H),2.34-2.42(m,1H),1.75-1.78(d,J=11.6Hz,1H),1.51-1.55(m,1H),1.44(s,9H).
[0099] 化合物3
[0100]
[0101] 将化合物2(0.14g,0.23mmol)溶解在4M HCl/二恶烷溶液中,然后在室温下搅拌1小时。通过减压蒸馏除去溶剂,剩余的化合物无需纯化即可用于下一步反应。
[0102] 1H NMR(400MHz,CDCl3):a(ppm)=9.66(br s,1H),9.17(br s,1H),9.00(br s,2H),7.73-7.85(m,15H),3.74-3.79(m,2H),3.63-3.67(m,2H),3.38(br s,2H),2.96(br s,
2H),2.49(br s,1H),2.28(br s,2H),2.06(br s,2H).
[0103] 将上述化合物、氰基乙酸(21mg,0.25mmol)、氧化苦参碱(35mg,0.25mmol)、DIEA(0.15mL,0.83mmol)和EDCI(47mg,0.25mmol)溶解在1mL DMF中,并将溶液在室温搅拌14小时。通过减压蒸馏除去溶剂,并将剩余的混合物通过柱色谱法纯化(MeOH/CH2Cl2 8/92),得到黄色固体化合物3(49mg,45%)。
[0104] 1H NMR(400MHz,CDCl3):a(ppm)=9.47-9.49(t,J=5.8Hz,1H),7.70-7.86(m,15H),4.43-4.56(d,J=13.3Hz,1H),3.66-3.82(m,4H),3.51(s,2H),3.16-3.23(m,1H),
2.71-2.78(m,1H),2.54-2.62(m,1H),1.94-1.97(d,J=14.4Hz,1H),1.82-1.85(d,J=
11.2Hz,1H),1.64-1.75(m,1H),1.52-1.62(m,1H),1.43-1.47(m,1H).
[0105] MitoFreSH-PPh3(式III)
[0106]
[0107] 10-氧代-2,3,5,6-四氢-1H,4H,10H-11-氧杂-3a-氮杂苯并[de][蒽]-9-甲(36mg,0.13mmol)、化合物3(70mg,0.13mmol)和哌啶(13μL,0.13mmol)溶于1mL 2-丙醇中,将溶液在60℃加热1小时,然后冷却至室温。通过减压蒸馏除去溶剂,并将剩余混合物通过SiO2柱色谱法(MeOH/CH2Cl2 5/95)纯化,得到红色固体化合物(MitoFreSH-PPh3)(36mg,36%)。
[0108] 1H NMR(400MHz,CDCl3):a(ppm)=9.44(br s,1H),9.36(br s,1H),8.63(s,1H),7.89(s,1H),7.71-7.84(m,15H),7.50(s,1H),6.99(s,1H),6.84(s,1H),3.62-3.88(m,4H),
3.32-3.38(m,4H),2.84-2.88(m,2H),2.75-2.78(m,2H),2.53-2.60(m,1H),1.96-2.04(m,
4H),1.88-1.95(m,4H),1.62-1.71(m,4H).
[0109] 1-2.合成MitoFreSH-哌嗪(式IV)
[0110]
[0111] 化合物4
[0112]
[0113] 将哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.0g,5.3mmol)和氰基乙酸(0.54g,1.2eq.)溶于10mL DMF,并将DIEA(3.28mL,3.5eq.)和EDCI(将1.56g,1.5eq.)加入溶液中。在室温下,搅拌12小时后,通过减压蒸馏除去溶剂。剩余的混合物通过SiO2柱色谱法纯化,得到白色固体化合物4(1.13g,84%)。
[0114] 1H NMR(400MHz,CDCl3):a(ppm)=3.603.64(m,2H),3.503.55(m,2H),3.51(s,2H),3.433.48(m,4H),1.47(s,9H);HRMS(m/z):[M+H]+254.1496.
[0115] 化合物5
[0116]
[0117] 将化合物4(0.30g,1.2mmol)溶解于5mL 4M HCl/二恶烷溶液中,然后在室温下搅拌1小时。通过减压蒸馏除去溶剂,剩余的化合物5无需纯化即可用于下一反应。
[0118] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):a(ppm)=9.54(br s,2H),4.12(s,2H),3.673.70(m,2H),3.583.61(m,2H),3.043.12(m,4H).
[0119] 化合物6
[0120]
[0121] 将化合物5(0.15mmol)和(4-溴丁基)三苯基溴化膦(0.15g,0.30mmol)溶解在1mL乙腈(CH3CN)中,并将碳酸氢钠(NaHCO3,64mg,0.7545mmol)加入溶液中。在50℃下搅拌20小时后,通过减压蒸馏除去溶剂。剩余的混合物通过SiO2柱色谱法(MeOH/CH2Cl2 15/85)纯化,得到白色固体化合物6(71mg,71%)。
[0122] 1H NMR(400MHz,CDCl3):a(ppm)=7.69-7.88(m,15H),3.78-3.86(m,2H),3.71(s,2H),3.51-3.53(t,J=4.7Hz,2H),3.47-3.49(t,J=4.7Hz,2H),2.54-2.56(t,J=4.1Hz,
2H),2.46-2.49(t,J=6.5Hz,2H),2.38-2.40(t,J=5.1Hz,2H),1.85-1.91(m,2H),1.66-
1.74(m,2H).
[0123] MitoFreSH-哌嗪(式IV)
[0124]
[0125] 10-氧代-2,3,5,6-四氢-1H,4H,10H-11-氧杂-3a-氮杂苯并[de][蒽]-9-甲醛(35mg,0.13mmol)、化合物6(64mg,0.12mmol)和哌啶(12μL,0.12mmol)溶解在1mL 2-丙醇中,所得溶液在60℃下搅拌1小时,然后冷却至室温。通过减压蒸馏除去溶剂,并将剩余的混合物通过SiO2柱色谱法(MeOH/CH2Cl2 6/94)纯化,获得红色固体化合物MitoFreSH-哌嗪(61mg,66%)。
[0126] 1H NMR(400MHz,CDCl3):a(ppm)=8.61(s,1H),7.69-7.91(m,15H),7.45(s,1H),7.00(s,1H),6.86(s,1H),3.56(br s,4H),3.35-3.39(q,J=5.9Hz,4H),2.84-2.88(t,J=
6.5Hz,2H),2.75-2.78(t,J=6.3Hz,2H),2.41-2.49(m,4H),1.84-2.04(m,12H).[0127] 1-3.合成MitoFreSH-Cl(式Ⅴ)
[0128]
[0129] 化合物7
[0130] 5-苄基N-(叔-丁氧基羰基)-L-谷氨酸(0.10g,0.29mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt,80mg,2.0eq.)和DIEA(0.18mL,3.5当量)溶解于1mL DMF中,并将EDCI(0.11g,2.0eq.)和化合物1(00.13g,1.2eq.)添加至溶液。在室温搅拌16小时后,将溶液用乙酸乙酯(EtOAc)稀释,然后用0.5M柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液(NaHCO3)和饱和氯化钠(NaCl)水溶液洗涤。分离有机层,用硫酸钠(Na2SO4)干燥,然后过滤,并在减压下蒸馏滤液以除去溶剂。剩余的混合物通过SiO2柱色谱法纯化,得到白色固体化合物4(0.16g,76%)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)=9.49(brs,1H),7.687.83(m,15H),7.277.35(m,5H),5.87(d,J=9.2Hz,
1H),5.08(s,2H),4.184.23(m,1H),3.613.87(m,4H),2.432.47(m,2H),2.122.22(m,1H),
1.942.01(m,1H),1.43(s,9H);13CNMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)=172.8,172.7,155.2,
135.8,135.3(d,4JCP=3.0Hz),133.4(d,3JCP=10.4Hz),130.5(d,2JCP=12.7Hz),128.4,
128.1,128.0,117.4(d,1JCP=85.9Hz),79.2,66.1,53.9,33.3,30.4,28.4,28.3,22.2(d,
1 31 +
JCP=49.7Hz);P NMR(121MHz,CDCl3):δ(ppm)=22.1;HRMS(m/z):[M]625.2826.6.[0131] 化合物8
[0132] 将化合物7(1.2g,1.7mmol)溶解于5mL甲醇(CH3OH)和5mL蒸馏水中,向该溶液中添加10%Pd-C(0.12g),然后在H2气(1个大气压)的氛围下反应12小时。通过藻土过滤溶液,并在减压下蒸馏滤液以除去溶剂。剩余的化合物8(1.04g,99%)无需纯化即可用于下一反应。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)=8.95(br s,1H),7.707.82(m,15H),5.97(br s,1H),4.16(br s,1H),3.603.90(m,4H),2.352.45(m,2H),1.952.05(m,2H),1.37(s,9H);31PNMR(121MHz,CDCl3):δ(ppm)=22.1.
[0133] 化合物9
[0134] 将化合物8(0.15g,0.24mmol)、化合物5(49mg,1.05eq.)和DIEA(0.15mL,3.5eq.)溶解在2mL DMF中,并将HOBt(3mg,0.1eq.)和EDCI(95mg,2.0eq.)添加到溶液中。室温搅拌4小时后,在减压下通过蒸馏除去溶剂,并将剩余的混合物通过SiO2柱色谱法纯化,得到黄色固体化合物9(0.14g,78%)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)=(主要构象异构体)9.46(br s 1H),7.727.84(m,15H),5.79(d,J=7.8Hz,1H),4.154.21(m,1H),3.473.79(m,14H),
2.502.60(m,2H),2.122.15(m,1H),2.00-2.04(m,1H),1.42(s,9H);13CNMR(100MHz,CDCl3):
δ(ppm)=(*主要构象异构体;**次要构象异构体)172.8**,172.7*,171.2**,171.0*,
161.1,155.2,135.3,133.4(d,3JCP=10.3Hz),130.5(d,2JCP=12.7Hz),117.4(d,1JCP=
85.8Hz),114.5,79.2,54.0.46.3*,45.8**,45.3*,44.7**,42.2**,41.9*,41.2**,40.8*,
33.3,30.0**,29.5*,29.2*,28.9**,28.3,25.4,22.2(d,1JCP=49.8Hz);31P NMR(121MHz,+
CDCl3):δ(ppm)=22.1;HRMS(m/z):[M]670.3157.
[0135] 化合物10
[0136] 将化合物9(0.23g,0.31mmol)溶解于3mL 4M HCl/二恶烷溶液中,然后在室温下搅拌1小时。减压蒸馏除去溶剂,剩余的化合物10无需纯化即可用于下一步反应。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)=9.44(d,J=6.1Hz,1H),8.49(brs,3H),7.767.94(m,15H),4.094.11(m,1H),3.803.84(m,2H),3.333.50(m,12H),2.502.55(m,2H),1.941.98(m,2H);
31P NMR(121MHz,DMSO-d6):δ(ppm)=22.4.
[0137] 化合物11
[0138] 将化合物10(0.10g,0.15mmol)和3-(氯甲基)苯甲酰氯(25μL,1.05eq.)溶解在1mL CH2Cl2中,并向溶液中加入DIEA(58μL,2.0eq.)。在室温下搅拌1小时后,在减压下通过蒸馏除去溶剂,并将剩余的混合物通过SiO2柱色谱法纯化,得到白色固体化合物11(0.10g,85%)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)=(主要构象异构体)9.65(br s,1H),8.33(d,J=
8.3Hz,1H),8.13(s,1H),8.05(d,J=7.8Hz,1H),7.697.82(m,15H),7.52(d,J=7.9Hz,1H),
7.427.46(m,1H),4.744.79(m,1H),4.65(s,2H),3.353.74(m,14H),2.532.60(m,2H),
2.252.30(m,2H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)=(*主要构象异构体;**次要构象异构体)173.1**,173.0*,171.3*,171.2**,166.4,160.9,137.7,135.5,134.1,133.5(d,3JCP=
10.3Hz),131.7,130.6(d,2JCP=12.7Hz),128.9,128.3*,128.2**,127.8*,127.7**,117.5(d,1JCP=85.9Hz),114.5,54.2,46.3*,45.9,45.8**,45.3*,44.8**,42.1**,42.0*,
41.3**,41.0*,30.2**,29.7*,28.3*,28.0**,25.3,22.3(d,1JCP=49.8Hz);31P NMR(121MHz,CDCl3):δ(ppm)=22.2;HRMS(m/z):[M]+722.2662.
[0139] MitoFreSH-Cl(式V)
[0140] 化合物11(0.12g,0.16mmol)和10-氧代-2,3,5,6-四氢-1H,4H,10H-11-氧杂-3a-氮杂苯并[de]-蒽-9-甲醛(46mg,1.1eq.)溶于1mL DMF中,并向该溶液中添加氯三甲基硅烷(60μL,3.0eq.),然后在130℃下搅拌5个小时。冷却至室温后,通过减压蒸馏除去溶剂,并将剩余的混合物通过SiO2柱色谱法纯化,得到红色固体的化合物MitoFreSH-Cl(7.9mg,1
50%)。H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)=(主要构象异构体)9.58(br s,1H),8.63(s,1H),
8.40(d,J=7.4Hz,1H),7.728.21(m,18H),7.51(d,J=7.0Hz,1H),7.427.45(m,1H),7.00(s,1H),4.744.80(m,1H),4.60(s,2H),3.583.73(m,12H),3.333.38(m,4H),2.832.87(m,
2H),2.722.78(m,2H),2.552.58(m,2H),2.27-2.31(m,2H),1.972.04(m,4H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)=(主要构象异构体)172.9,171.1,166.2,163.9,161.3,152.5,
149.0,145.9,142.8,137.6,135.4,134.0,133.4(d,3JCP=10.3Hz),131.6,130.6(d,2JCP=
12.7Hz),128.8,128.2,127.7,127.5,119.9,117.4(d,1JCP=85.9Hz),117.1,109.7,108.2,
106.0,100.4,54.2,50.4,49.9,45.9,45.1(br),41.2(br),33.4,29.9,28.0,27.2,22.2(d,1JCP=50.0Hz),20.9,19.9,19.8;31P NMR(121MHz,CDCl3):δ(ppm)=22.2;HRMS(m/z):[M]+
973.3616.
[0141] 制备实施例2:用于测量高尔基体抗氧化活性的化合物的合成
[0142] 用于测量细胞器高尔基体抗氧化活性的化合物的制备方法(GolgiFreSH-示踪剂;GolgiFreSH-A/B/C)如下:
[0143]
[0144] 通过R4将GolgiFreSH-A/B/C化合物分类,如下表1所示。
[0145] [表1]
[0146] R4 化合物A 式VII(GolgiFreSH-示踪剂1)
B 式VIII(GolgiFreSH-示踪剂2)
C 式IX(GolgiFreSH-示踪剂3)
[0147] GolgiFreSH-示踪剂1至3的结构如下。
[0148] [GolgiFreSH-示踪剂1,式VII]
[0149]
[0150] [GolgiFreSH-示踪剂2,式VIII]
[0151]
[0152] [GolgiFreSH-示踪剂3,式IX]
[0153]
[0154] 化合物2
[0155]
[0156] 化合物1、氰基乙酸(1.2eq.)、1-羟基苯并三唑(HOBt;1.5eq.)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA;2.0eq.)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺(EDCI;2.5eq.)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,并将所得溶液在室温下搅拌15至20小时。减压蒸馏除去溶剂,剩余的混合物用乙酸乙酯(EtOAc)稀释,然后用饱和氯化钠(NaCl)水溶液洗涤。分离有机层,用硫酸钠(Na2SO4)干燥,然后过滤,并在减压下蒸馏滤液以除去溶剂。剩余的混合物通过SiO2柱色谱纯化,得到化合物2。
[0157] 化合物2A 1H NMR(500MHz,CDCl3):a(ppm)=6.73(br,1H),4.96(br,1H),3.57-3.69(m,8H),3.51(m,2H),3.41(s,2H),3.34(m,2H),1.45(s,9H).
[0158] 化合物2B 1H NMR(500MHz,DMSO-d6):a(ppm)=8.19(t,J=5.2Hz,1H),6.79(t,J=5.6Hz,1H),3.59(s,2H),3.04(m,2H),2.88(m,2H),1.37(s,9H),1.33-1.39(m,4H),1.22-1.24(m,4H).
[0159] 化合物2C 1H NMR(500MHz,CDCl3):a(ppm)=7.18(br,1H),4.90(br,1H),3.62-3.69(m,8H),3.60(m,2H),3.53(t,J=6.0Hz,2H),3.45(m,2H),3.37(s,2H),3.22(m,2H),
1.82(m,2H),1.76(m,2H),1.44(s,9H).
[0160] 化合物3
[0161]
[0162] 将10-氧代-2,3,5,6-四氢-1H,4H,10H-11-氧杂-3a-氮杂苯并[de][蒽]-9-甲醛、化合物2(1.0当量)和哌啶(1.0eq.)溶解在2-丙醇中,并将该溶液在60℃加热2-4小时,然后冷却至室温。通过减压蒸馏除去溶剂,并将剩余的混合物通过SiO2柱色谱法纯化,得到化合物3。
[0163] 化合物3A 1H NMR(500MHz,CDCl3):a(ppm)=8.62(s,1H),8.55(s,1H),7.00(s,1H),6.67(br,1H),5.08(br,1H),3.62-3.65(m,5H),3.57(t,J=5.2Hz,2H),3.34-3.39(m,
6H),2.87(t,J=6.5Hz,2H),2.76(t,J=6.2Hz,2H),1.96-2.00(m,4H),1.44(s,9H).[0164] 化合物3B 1H NMR(500MHz,CDCl3):a(ppm)=8.60(s,1H),8.56(s,1H),7.00(s,
1H),6.22(br,1H),4.53(br,1H),3.35-3.40(m,6H),3.11(m,2H),2.87(t,J=6.2Hz,2H),
2.76(t,J=6.1Hz,2H),1.96-2.00(m,4H),1.44(s,9H),1.44-1.50(m,4H),1.35-1.38(m,
4H).
[0165] 化合物3C 1H NMR(500MHz,CDCl3):a(ppm)=8.60(s,1H),8.53(s,1H),6.99(s,1H),6.97(br,1H),5.01(br,1H),3.72(m,2H),3.63-3.67(m,6H),3.59(m,2H),3.52-3.56(m,4H),3.35-3.39(m,4H),3.22(m,2H),2.87(t,J=6.4Hz,2H),2.76(t,J=6.2Hz,2H),
1.96-2.00(m,4H),1.88(m,2H),1.75(m,2H),1.43(s,9H).
[0166] GogiFreSH
[0167]
[0168] 将化合物3溶于三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(1/1)的溶液中,然后在室温下搅拌1-2小时。通过减压蒸馏除去溶剂,并将剩余的化合物、吲哚美辛(1.1eq.)、HOBt(2.5eq.)、DIEA(3.0eq.)和EDCI(2.5eq.)溶解在DMF中,并将溶液在室温下搅拌7至8小时。通过减压蒸馏除去溶剂,并将剩余的混合物用EtOAc稀释,然后用饱和NaCl水溶液洗涤。分离有机层,用Na2SO4干燥,然后过滤,并在减压下蒸馏滤液以除去溶剂。剩余的混合物通过SiO2柱色谱法纯化得到GolgiFreSH。
[0169] GolgiFreSH-A(式VII)1H NMR(500MHz,CDCl3):a(ppm)=8.52(s,1H),8.49(s,1H),7.64(d,J=8.6Hz,2H),7.46(d,J=8.6Hz,2H),6.93(d,J=2.3Hz,1H),6.89(s,1H),6.80(d,J=9.1Hz,1H),6.61-6.63(m,2H),6.39(t,J=5.6Hz,1H),3.80(s,3H),3.65(s,2H),
3.48-3.55(m,10H),3.44(m,2H),3.35-3.39(m,4H),2.86(t,J=6.2Hz,2H),2.72(t,J=
6.5Hz,2H),2.40(s,3H),1.95-1.99(m,4H).
[0170] GolgiFreSH-B(式VIII)1H NMR(500MHz,CDCl3):a(ppm)=8.57(s,1H),8.50(s,1H),7.66(m,2H),7.48(m,2H),6.98(s,1H),6.90(d,J=2.4Hz,1H),6.87(d,J=9.1Hz,1H),
6.69(dd,3J=9.1Hz,4J=2.4Hz,1H),6.23(t,J=5.7Hz,1H),5.78(t,J=5.8Hz,1H),3.82(s,3H),3.65(s,2H),3.28-3.39(m,6H),3.20(m,2H),2.86(t,J=6.4Hz,2H),2.76(t,J=
6.2Hz,2H),2.39(s,3H),1.95-2.00(m,4H),1.50(m,2H),1.42(m,2H),1.22-1.31(m,4H);
HRMS(m/z):[M+Na]+769.2772。
[0171] GolgiFreSH-C(式IX)1H NMR(500MHz,CDCl3):a(ppm)=8.55(s,1H),8.48(s,1H),7.67(d,J=8.0Hz,2H),7.47(d,J=8.0Hz,2H),6.98(t,J=4.9Hz,1H),6.96(s,1H),6.92(s,1H),6.87(d,J=9.0Hz,1H),6.66(d,J=9.0Hz,1H),6.34(t,J=4.9Hz,1H),3.81(s,
3H),3.57-3.63(m,8H),3.42-3.51(m,8H),3.31-3.38(m,6H),2.85(t,J=6.2Hz,2H),2.75(t,J=5.9Hz,2H),2.37(s,3H),1.95-1.99(m,4H),1.84(m,2H),1.71(m,2H);HRMS(m/z):[M+Na]+900.3390.
[0172] 实施例1:实验材料与方法
[0173] 1-1.试剂
[0174] 二酰胺和抗霉素A购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。BODIPY TR C5-神经酰胺购自赛默飞世尔科技。
[0175] 1-2.FreSH-示踪剂(荧光实时SH基-示踪剂)化合物与硫醇化合物的体外反应[0176] 制备含有谷胱甘肽化合物(0-100mM)和FreSH-示踪剂化合物V(10μM)的混合物的缓冲液(10mM磷酸盐,150mM NaCl,pH 7.4,H2O:DMSO=98:2),分别用SCINCO S-3100分光光度计和Hitachi F-7000分光光度计测量缓冲液随时间的UV-Vis吸收光谱和荧光发射光谱(见图2)。
[0177] 1-3.测量硫醇化合物的Kd值
[0178] 在体外反应中,谷胱甘肽化合物(0-100mM)和FreSH-示踪剂衍生的化合物之间形成化学平衡之后,测量用波长430nm的光激发的荧光发射光谱。通过非线性回归分析了最大发射波长(580nm)处的荧光强度与硫醇化合物浓度之间的关系,从而确定了硫醇化合物和FreSH-示踪剂之间的化学平衡常数(Kd,1-5mM)。
[0179] 1-4.细胞毒性测定(MTT测定)
[0180] 将HeLa细胞(5x 103细胞/孔)在96孔培养皿中培养18小时,然后用二甲基亚砜(DMSO)、MitoFreSH-示踪剂(式III至V)或GolgiFreSH-示踪剂(式VII至IX)处理24小时。用PBS洗涤后,将细胞在甲基噻唑基二苯基-四唑溴化物(MTT)溶液(500μg/mL培养基)中孵育3至4小时。除去MTT溶液后,将甲瓒晶体溶解在DMSO中,然后测量其在570nm处的吸光度。使用Graphpad 5.0软件计算LD50(50%致死剂量)(见图3)。
[0181] 1-5.活细胞实时成像
[0182] 将HeLa细胞在DMEM(含有10%热灭活的FBS(胎血清)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素硫酸盐和2mM谷氨酰胺,不含酚红)中培养。将HeLa细胞接种到35mm盖玻片底皿(SPL生命科学)中,然后在37℃和5%CO2的条件下培养指定的时间。在使用荧光显微镜观察之前,将HeLa细胞与2mL含有10μM的FreSH-示踪剂衍生化合物的培养基孵育0.5至1.5小时。用PBS洗涤两次后,使用尼康A1激光扫描共聚焦显微镜获取细胞的实时图像。将细胞置于装有CFI平场复消色差60X和1.40数值孔径(NA)物镜的尼康ECLIPSE Ti倒置显微镜的箱内,在37℃和5%CO2条件下孵育,同时进行成像测试。用403nm和488nm的激光束激发FreSH-示踪剂衍生化合物,并分别通过滤光片检测带宽为500-550nm和570-620nm的示踪剂衍生化合物的荧光。使用NIS-Elements Ar软件,分析实验数据并成像荧光比率(参见图4和5)。
[0183] 1-6.高通量细胞成像
[0184] 将HeLa细胞在DMEM(含有10%热灭活的FBS(胎牛血清)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素硫酸盐和2mM谷氨酰胺,不含酚红)中培养。将HeLa细胞接种到葛莱娜(Greiner)96孔培养皿(西格玛奥德里奇)中,然后在37℃和5%CO2的条件下培养指定的时间。在使用荧光显微镜观察之前,将HeLa细胞与含有10μM的GolgiFreSH-示踪剂的培养基孵育0.5到1.5小时。用汉克斯(Hank's)平衡盐溶液洗涤两次后,使用Operetta高内涵成像系统(珀金埃尔默(PerkinElmer)).获取细胞的实时图像。将细胞置于显微镜的培养箱中,在37℃和5%CO2的条件下孵育,同时进行成像测试。用410-430nm和490-510nm的LED光激发GolgiFreSH示踪剂,并通过滤光片检测示踪剂的带宽为460-540nm和560-630nm处的荧光。用560-580nm的LED光激发BODIPY TR C5神经酰胺,通过滤光片检测带宽为590-640nm处的荧光。使用和谐(Harmony)软件,对实验数据进行了分析(见图4、5和8)。
[0185] 实施例2:细胞器线粒体抗氧化活性的测量
[0186] 2-1.观察与GSH成比例地、可逆地和快速反应的MitoFreSH-示踪剂的性质[0187] 在MitoFreSH-示踪剂中添加谷胱甘肽时,随着谷胱甘肽的浓度增加,示踪剂对在Emax=430nm处紫外和可见光的吸光度增加,而在Emax=520nm处的吸光度降低(图2B),示踪剂的荧光发射强度在约510nmm(F 580,Eex=520nm;Eem=580nm)(F510,Eex=430nm;Eem=510nm)处增加,并在约580n处下降(Kd=1.3mM,图2B和2C)。本发明人已经发现,MitoFreSH-示踪剂的F510的荧光发射强度与F580的荧光发射强度(F510/F580)之比与GSH在宽的浓度范围成比例地变化(图2D)。这表明示踪剂可以用作辐射传感器。从荧光强度比获得的回归曲线表明,在比细胞内的谷胱甘肽浓度更宽的浓度范围(0-20mM)中呈线性(R2=0.9836)(图2D插图)。
[0188] 以上数据表明,MitoFreSH-示踪剂具有最合适的传感器特性,可监测细胞内谷胱甘肽水平。
[0189] 2-2.通过MitoFreSH-示踪剂的比率分析可视化活细胞中线粒体谷胱甘肽水平的变化
[0190] 本发明人已经研究了MitoFreSH-示踪剂在检查活细胞中线粒体谷胱甘肽水平变化中的适用性。在补充了10μM无毒的MitoFreSH-示踪剂的HeLa细胞中培养至少24小时后,基于在HeLa细胞培养过程中通过共聚焦显微镜测量的荧光强度比率,本发明人可以将典型的线粒体染色图案描述为假彩色图像(图4A)。在本发明中,为了检查传感器是否响应线粒体谷胱甘肽的氧化/还原条件,用0.5mM二酰胺(DA)处理负载有传感器的活细胞以氧化细胞内谷胱甘肽。已经发现,当将二酰胺添加到培养基中时,在活细胞中诱导了即时的传感器反应(图4B和4C)。通过用二酰胺处理降低了根据活细胞图像计算出的传感器荧光强度比(图4B和4C)。
[0191] 接下来,本发明人研究了线粒体中产生活性氧的条件下的MitoFreSH-示踪剂的荧光变化。可以肯定的是,当用通过干扰线粒体中的电子传递链来增加活性氧的生成的抗霉素A处理细胞75分钟后,随着抗霉素A的浓度(增加),MitoFreSH示踪剂的荧光强度比降低(图5A和5B)。
[0192] 因此,基于上述实验结果,本发明人证明了MitoFreSH-示踪剂可用于实时监测活细胞线粒体中GSH水平的变化。
[0193] 实施例3:细胞器高尔基体抗氧化活性的测量
[0194] 3-1.通过GolgiFreSH-示踪剂的放射分析,分析活细胞中的谷胱甘肽水平[0195] 本发明人研究了GolgiFreSH-示踪剂是否能够在细胞中保持,并用于研究活细胞的高尔基体中谷胱甘肽水平的变化。将GolgiFreSH-示踪剂添加至细胞培养基后,观察细胞中荧光强度的变化和细胞中的荧光强度的比率。通过对负载有GolgiFreSH-示踪剂和高尔基体标记物BODIPY TR C5-神经酰胺的HeLa细胞的高通量细胞成像测量荧光位置,结果发现GolgiFreSH-示踪剂的F510大部分与BODIPY TR C5-神经酰胺的荧光重叠,表明GolgiFreSH示踪剂位于高尔基体中(图7)。为了检查传感器是否响应细胞内谷胱甘肽的氧化/还原条件,本发明人通过用1mM二酰胺处理负载传感器的活细胞来氧化细胞内谷胱甘肽。已经发现,当将二酰胺添加到培养基中时,在活细胞中诱导了传感器反应(图8A)。通过用二酰胺处理降低了根据活细胞图像计算出的传感器荧光强度比(图8B)。接下来,用各种浓度的二酰胺处理活细胞并进行分析,结果,可以看出,GolgiFreSH-示踪剂的荧光强度比率随着二酰胺的浓度(增加)而降低(图9)。因此,基于上述实验结果,本发明人证明了GolgiFreSH-示踪剂可用于实时监测活细胞高尔基体中GSH水平的变化。
[0196] 根据本发明的化合物或组合物的用途,可以测量活细胞中细胞器线粒体或高尔基体的抗氧化活性。当将该化合物或组合物应用于干细胞时,可以基于测量干细胞中抗氧化活性的结果来筛选高活性干细胞,从而提高细胞治疗剂的效率。
[0197] 本说明书中引用的所有参考文献、文章、出版物、专利和专利申请均以全文嵌入本文。因此,所附权利要求书的精神和范围不应限于在此包含的优选实施例的描述。
[0198] 【工业实用性
[0199] 当使用包含根据本发明的化合物的组合物时,其可以测量活细胞特别是干细胞中的细胞器线粒体或高尔基体的抗氧化活性,并且可以基于测量细胞器的抗氧化活性的结果筛选高活性干细胞。
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈