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携带肿瘤相关基因的神经干细胞及其制备方法与应用

阅读:1046发布:2020-05-28

专利汇可以提供携带肿瘤相关基因的神经干细胞及其制备方法与应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种携带 肿瘤 相关基因的神经干细胞及其制备方法与应用。本发明通过在人多能干细胞内转入KRAS基因突变体和组合过表达Ras/raf/MAPK 信号 通路上游基因EGFR、下游基因BRAF,以及敲降PTEN基因表达,获取携带肿瘤相关基因的多能干细胞,进一步诱导多能干细胞向神经方向分化,获得神经干细胞,有效模拟肿瘤干细胞转化及肿瘤发生的动态转变过程,为胶质瘤等神经肿瘤的发病机制研究提供了新型、可靠的细胞模型。本技术为从多 角 度动态观察胶质瘤的发生发展过程提供了可能,也将为胶质瘤 治疗 药物筛选及靶向治疗等带来新的研究思路,具有极为重要的科学意义和应用价值。,下面是携带肿瘤相关基因的神经干细胞及其制备方法与应用专利的具体信息内容。

1.一种携带肿瘤相关基因的神经干细胞的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将稳定表达肿瘤相关基因的人多能干细胞培养至细胞密度为95%以上时,将培养基更换为神经诱导培养基进行诱导,更换当天记为诱导的第0天;神经诱导培养基为添加转化生长因子β信号通路抑制剂的N2B27培养基;N2B27培养基的组成如下:DMEM/F12培养基48~49%、神经基础培养基48.5~49.5%、N2添加剂0.4~0.6%、B27添加剂0.9~1.1%、细胞培养添加剂Gluta MAX 0.4~0.6%、非必须基酸NEAA 0.4~0.6%;
(2)在诱导第8天消化传代,传代时先用DMEM/F12洗细胞,然后加入传代培养基,传代培养基为添加Rho激酶抑制剂的N2B27培养基;将细胞刮成大细胞团,尽量保持细胞团块完整,转移至使用100×基质胶预先包被好的培养板中;
(3)传代的第2天,全部换液,所换的培养基为N2B27培养基;隔天换液;
(4)在诱导出现神经花环样结构的细胞形态后的第4天,将培养基吸出,每孔加入传代培养基,沿着神经花环边缘将花环样细胞团挑出,转移至使用100×基质胶预先包被好的培养板中;
(5)隔天全换液,使用的培养基为细胞扩增培养基,扩增传代得到携带肿瘤相关基因的神经干细胞。
2.根据权利要求1中所述的携带肿瘤相关基因的神经干细胞的制备方法,其特征在于:
所述的稳定表达肿瘤相关基因的人多能干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到:
(a)将肿瘤相关基因克隆至慢病毒载体,得到重组载体;
(b)将步骤(a)得到的重组载体和包装质粒一起转染慢病毒包装细胞,得到重组细胞;
(c)培养所述的重组细胞,收集培养上清,离心获得病毒颗粒;
(d)用所述的病毒颗粒感染人多能干细胞,获得稳定表达肿瘤相关基因的多能干细胞。
3.根据权利要求2中所述的携带肿瘤相关基因的神经干细胞的制备方法,其特征在于:
步骤(a)中所述的慢病毒载体为psin-puro和PLKO.1-TRC中的一种或两种;
步骤(a)中所述的肿瘤相关基因为Ras/raf/MAPK信号通路的相关基因;为KRAS基因、KRAS基因突变体、EGFR基因、BRAF基因和PTEN基因中的至少一种;
步骤(b)中所述的慢病毒包装细胞为人胚胎肾细胞293细胞;
所述的人多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
4.根据权利要求3中所述的携带肿瘤相关基因的神经干细胞的制备方法,其特征在于:
所述的KRAS基因突变体为突变位点为G13D或G12V的KRAS基因突变体。
5.根据权利要求1中所述的携带肿瘤相关基因的神经干细胞的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的转化生长因子β信号通路抑制剂为Smad2抑制剂和AMP依赖的蛋白激酶抑制剂中的一种或两种;
步骤(2)中所述的Rho激酶抑制剂为Thiazovivin;
步骤(5)中所述的细胞扩增培养基为添加生长因子的N2B27培养基。
6.根据权利要求5中所述的携带肿瘤相关基因的神经干细胞的制备方法,其特征在于:
所述的Smad2抑制剂为SB431542;
所述的AMP依赖的蛋白激酶抑制剂为6-[4-[2-(1-哌啶基)乙基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-A]嘧啶;
所述的Thiazovivin在所述的传代培养基的浓度为0.4~0.6μM;
所述的生长因子为bFGF和EGF中的一种或两种;
所述的bFGF在所述的细胞扩增培养基的浓度为18~22ng/ml;
所述的EGF在所述的细胞扩增培养基的浓度为18~22ng/ml。
7.根据权利要求1中所述的携带肿瘤相关基因的神经干细胞的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的神经诱导培养基为添加9~11μM SB431542和4~6μM 6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-A]嘧啶的N2B27培养基;
步骤(1)中所述的诱导的过程中每20~60h换一次液;
步骤(2)中所述的将细胞刮成大块细胞团为通过使用巴氏吸管或1ml大枪头进行;
步骤(2)中所述的培养板为6孔板;
步骤(4)中所述的出现的时间为诱导第11~13天;
步骤(4)中所述的将花环样细胞团挑出为通过使用消毒处理后的玻璃针进行。
8.一种携带肿瘤相关基因的人类神经干细胞,其特征在于:通过权利要求1~7任一项所述的制备方法得到。
9.权利要求8所述的携带肿瘤相关基因的人类神经干细胞在制备肿瘤细胞模型或药物筛选中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:
所述的肿瘤细胞模型为脑胶质瘤细胞模型;
所述的药物为靶向脑胶质瘤干细胞的药物。

说明书全文

携带肿瘤相关基因的神经干细胞及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域,具体涉及一种携带肿瘤相关基因的神经干细胞及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 神经系统肿瘤严重危害人类的健康。脑胶质瘤发生于神经外胚层,是最常见的中枢神经系统肿瘤,其发病率占所有颅内原发肿瘤的40-50%。因其具有高度增殖和侵袭的生物学特性,不仅手术切除难度大,而且对放化疗不敏感,因而普遍存在肿瘤的复发,目前尚缺乏有效的治疗手段。因此寻找更为有效的治疗方法成为当前迫切的任务,而深入阐明脑胶质瘤发病机制,是确定关键治疗靶点及发现、鉴别诊断和确定预后评估分子标志物必须解决的关键问题。
[0003] 长期以来,肿瘤细胞的起源与增生一直备受关注。一般认为正常细胞内基因变异不断积累而最终转化发展为肿瘤。而组成肿瘤的细胞并不是均质的,它们在形态、增殖能以及成瘤能力上存在差异。近年来一些研究表明,在肿瘤组织中存在一群具有自我更新、增殖和分化潜能等干细胞样特性的肿瘤干细胞。肿瘤干细胞理论的提出使人们对肿瘤的发生、转移及耐药等相关特性有了深入的认识。研究显示不仅包括肿瘤的增殖、转移,而且对肿瘤微环境、免疫的调控及放化疗抵抗均与肿瘤干细胞有关。随着对神经干细胞不断的深入研究,以及脑胶质瘤干细胞(GSCs)的分离与鉴定成功,为脑胶质瘤的研究提供了新的切入点,为揭示胶质瘤发生、发展的分子机制及研发诊疗新技术打开了新视野,已成为当今胶质瘤研究的热点领域。
[0004] 脑胶质瘤干细胞与神经干细胞(NSCs)在基因表型及生长特性等方面具有极高的相似性。许多学者从胶质瘤组织中成功分离培养出了能在神经干细胞培养条件下形成神经球样干细胞克隆,并表达巢蛋白(nestin)、CD133等干细胞标记物的细胞。目前有观点认为胶质瘤细胞起源于神经干/前体细胞的恶性转化,在多种致瘤因素的影响下,神经干细胞的基因表达逐渐发生了改变,导致其无限增殖和分化。
[0005] 随着对神经胶质瘤发生发展分子机制的深入研究,我们可以通过建立胶质瘤细胞模型模拟靶向调控关键的信号通路来抑制胶质瘤的发生,建立一种新颖并且可行的治疗方法,从而达到治愈胶质瘤的目的。这些研究多是在现有的肿瘤细胞系或组织中分离具有类似干细胞特性的细胞群体,比较这些胶质瘤干细胞与非干细胞群体的差别,或者比较胶质瘤干细胞与神经干细胞的基因表达和蛋白表达等的差别来进行研究。还有的研究是结合了转基因小鼠的动物模型来进行。随着细胞重编程技术的发展和应用,近年来有研究通过细胞重编程的方式将已经分化的胶质瘤细胞去分化转变为胶质瘤干细胞,进一步研究了胶质瘤干细胞的基因表达及表观调控网络,这种方法为肿瘤干细胞的研究提供了新的思路。但是与以往大量肿瘤相关的研究工作类似,这些工作都是以原发的胶质瘤或肿瘤细胞系为研究对象,针对已经形成了的肿瘤细胞群体进行研究,因而并不能有效地模拟肿瘤的发生,难以具体阐明肿瘤干细胞究竟是肿瘤的起始细胞还是在肿瘤进展中形成的可不断增殖成瘤的细胞群,从而不能深入地研究肿瘤的发生机制。因此建立人体神经干细胞恶性转化为胶质瘤干细胞的模型,将为胶质瘤的发病机制研究开辟新的途径,也必将推动胶质瘤的精准治疗手段开发与应用。

发明内容

[0006] 本发明的首要目的在于提供一种携带肿瘤相关基因的人类神经干细胞的制备方法。
[0007] 本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的携带肿瘤相关基因的人类神经干细胞。
[0008] 本发明的再一目的在于提供上述携带肿瘤相关基因的人类神经干细胞的应用。一方面用于作为胶质瘤干细胞转化模型,从而研究胶质瘤发病机制;另一方面还可用于靶向胶质瘤干细胞的药物筛选。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0010] 一种携带肿瘤相关基因的神经干细胞的制备方法,包括如下步骤:
[0011] (1)将稳定表达肿瘤相关基因的人多能干细胞培养至细胞密度为95%以上时,将培养基更换为神经诱导培养基进行诱导,更换当天记为诱导的第0天;神经诱导培养基为添加转化生长因子β信号通路抑制剂的N2B27培养基;
[0012] (2)在诱导第8天消化传代,传代时先用DMEM/F12洗细胞,然后加入传代培养基,传代培养基为添加Rho激酶(ROCK)抑制剂的N2B27培养基;将细胞刮成大细胞团,切勿吹打细胞,尽量保持细胞团块完整,转移至使用100×基质胶(Matrigel)预先包被好的培养板中;
[0013] (3)传代的第2天(即诱导第9天),全部换液,所换的培养基为N2B27培养基;隔天换液;
[0014] (4)在诱导出现神经花环样结构的细胞形态后的第4天,将培养基吸出,每孔加入传代培养基,沿着神经花环边缘将花环样细胞团挑出,转移至使用100×Matrigel预先包被好的培养板中;
[0015] (5)隔天全换液,使用的培养基为细胞扩增培养基,扩增传代得到携带肿瘤相关基因的神经干细胞。
[0016] 步骤(1)中所述的稳定表达肿瘤相关基因的人多能干细胞可以通过基因工程技术和/或病毒感染引入外源性肿瘤相关基因实现。
[0017] 所述的稳定表达肿瘤相关基因的人多能干细胞优选通过慢病毒感染实现。
[0018] 所述的稳定表达肿瘤相关基因的人多能干细胞,优选通过包括如下步骤的方法制备得到:
[0019] (a)将肿瘤相关基因克隆至慢病毒载体,得到重组载体;
[0020] (b)将步骤(a)得到的重组载体和包装质粒一起转染慢病毒包装细胞,得到重组细胞;
[0021] (c)培养所述的重组细胞,收集培养上清,离心获得病毒颗粒;
[0022] (d)用所述的病毒颗粒感染人多能干细胞,获得稳定表达肿瘤相关基因的多能干细胞。
[0023] 步骤(a)中所述的慢病毒载体优选为psin-puro和PLKO.1-TRC中的一种或两种。
[0024] 步骤(a)中所述的肿瘤相关基因优选为Ras/raf/MAPK信号通路的相关基因;更优选为KRAS基因、KRAS基因突变体、EGFR基因、BRAF基因和PTEN基因中的至少一种。
[0025] 所述的KRAS基因突变体优选为突变位点为G13D或G12V的KRAS基因突变体。
[0026] 步骤(b)中所述的慢病毒包装细胞优选为人胚胎肾细胞293细胞(HEK293)。
[0027] 所述的人多能干细胞为胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。
[0028] 步骤(1)中所述的转化生长因子β信号通路抑制剂优选为Smad2抑制剂和AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)抑制剂中的一种或两种。
[0029] 所述的Smad2抑制剂优选为SB431542。
[0030] 所述的AMP依赖的蛋白激酶抑制剂优选为6-[4-[2-(1-哌啶基)乙基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-A]嘧啶(Dorsomorphin)。
[0031] 步骤(1)中所述的神经诱导培养基优选为添加9~11μM SB431542和4~6μM 6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-A]嘧啶(Dorsomorphin)的N2B27培养基。
[0032] 所述的SB431542在所述的神经诱导培养基的浓度优选为10μM。
[0033] 所述的6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-A]嘧啶在所述的神经诱导培养基的浓度优选为5μM。
[0034] 步骤(1)中所述的N2B27培养基的组成如下:DMEM/F12培养基48~49%、神经基础培养基(Neurobasal)48.5~49.5%、N2添加剂(N2supplement)0.4~0.6%、B27添加剂0.9~1.1%、细胞培养添加剂Gluta MAX TM0.4~0.6%、非必须基酸NEAA 0.4~0.6%;更优选如下:DMEM/F12培养基48.5%、神经基础培养基49%、N2添加剂(N2supplement)0.5%、B27添加剂1%、细胞培养添加剂Gluta MAX TM 0.5%、非必须氨基酸NEAA 0.5%;%为体积百分比。
[0035] 步骤(1)中所述的诱导的过程中每20~60h换一次液;优选为隔天换液。
[0036] 步骤(2)中所述的Rho激酶抑制剂优选为Thiazovivin。
[0037] 所述的Thiazovivin在所述的传代培养基的浓度优选为0.4~0.6μM;更优选为0.5μM。
[0038] 步骤(2)中所述的将细胞刮成大块细胞团优选通过使用巴氏吸管或1ml大枪头进行。
[0039] 步骤(2)中所述的培养板优选为6孔板。
[0040] 步骤(2)和步骤(4)中所述的包被的具体步骤优选如下:将100×Matrigel放入培养板中过夜。
[0041] 所述的培养板优选为6孔板。
[0042] 所述的放入的量优选按1000μL/孔计算。
[0043] 步骤(4)中所述的出现的时间为诱导第11~13天;优选为12天。
[0044] 步骤(4)中所述的将花环样细胞团挑出优选通过使用消毒处理后的玻璃针进行。
[0045] 步骤(5)中所述的细胞扩增培养基为添加生长因子的N2B27培养基。
[0046] 所述的生长因子优选为bFGF和EGF中的一种或两种。
[0047] 所述的bFGF在所述的细胞扩增培养基的浓度为18~22ng/ml;更优选浓度为20ng/ml。
[0048] 所述的EGF在所述的细胞扩增培养基的浓度为18~22ng/ml;更优选浓度为20ng/ml。
[0049] 一种携带肿瘤相关基因的人类神经干细胞,通过上述制备方法得到。
[0050] 上述携带肿瘤相关基因的人类神经干细胞在制备肿瘤细胞模型中的应用。
[0051] 所述的肿瘤细胞模型为脑胶质瘤细胞模型。
[0052] 上述的携带肿瘤相关基因的人类神经干细胞在药物筛选中的应用。
[0053] 所述的药物为靶向脑胶质瘤干细胞的药物。
[0054] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0055] 本发明通过在人多能干细胞内转入KRAS基因突变体和组合过表达Ras/raf/MAPK信号通路上游基因EGFR、下游基因BRAF,以及敲降PTEN基因表达,获取携带肿瘤相关基因的多能干细胞,进一步诱导多能干细胞向神经方向分化,获得神经干细胞,有效模拟肿瘤干细胞转化及肿瘤发生的动态转变过程,为胶质瘤等神经肿瘤的发病机制研究提供了新型、可靠的细胞模型。本技术为从多度的动态观察胶质瘤的发生发展过程提供了可能,也将为胶质瘤治疗药物筛选及靶向治疗等带来新的研究思路,具有极为重要的科学意义和应用价值。附图说明
[0056] 图1是荧光定量PCR检测多能干细胞中所调控肿瘤相关基因的表达平结果图。
[0057] 图2是免疫荧光染色鉴定多能干细胞中多能性蛋白Nanog的表达水平结果图。
[0058] 图3是诱导多能干细胞神经方向分化的流程图
[0059] 图4是诱导多能干细胞神经方向分化第2、8、16天的细胞形态图。
[0060] 图5是免疫荧光染色鉴定神经干细胞中神经干性因子PAX6、SOX2蛋白的表达水平结果图。
[0061] 图6是荧光定量PCR检测携带肿瘤相关基因KRASG13D的神经干细胞中神经干细胞及多能干细胞相关基因的表达水平结果图。
[0062] 图7是CCK-8实验检测结果图。
[0063] 图8是Transwell实验测定结果图。
[0064] 图9是克隆形成实验检测结果图。

具体实施方式

[0065] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
[0066] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0067] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0068] 下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明,均为37℃、5%CO2。
[0069] 实施例1携带肿瘤相关基因的多能干细胞系的建立及其鉴定
[0070] 本发明涉及在人类胚胎干细胞(hESCs)中通过诱导原癌基因KRAS突变激活KRAS表达、过表达RAS信号通路上游基因EGFR、下游基因BRAF,以及敲降PTEN基因表达。本发明首先设计并通过分子克隆方法分别构建包含人类KRAS基因(含突变位点G13D)、人类BRAF基因和EGFR基因片段的慢病毒质粒载体,构建PTEN基因敲降表达的shRNA慢病毒质粒载体,重组载体中均包含用于阳性克隆筛选的Puro抗性基因,然后将质粒包装为慢病毒,通过慢病毒感染的方法将外源基因KRASG13D、BRAF、EGFR过表达,将PTEN基因敲降表达,同时以不同的基因操作单独或组合转入人类胚胎干细胞,建立了携带不同基因改变的稳定胚胎干细胞系。后续经过Puro抗性筛选,并通过RT-PCR检测基因表达水平确认,最终获得携带肿瘤相关基因的多能干细胞系,即H1-KRASG13D、H1-shPTEN、H1-BRAF-shPTEN、H1-KRASG13D-shPTEN、H1-BRAF-EGFR-shPTEN。
[0071] 具体方法如下:
[0072] 1、慢病毒的制备
[0073] (1)利用分子克隆方法构建携带激活突变的KRAS基因、BRAF基因及EGFR基因片段的重组质粒。具体操作过程为:提取人胶质瘤细胞U251(ATCC)的总RNA,通过逆转录获取cDNA,并以表1的引物序列通过PCR扩增技术获得KRAS基因、BRAF基因及EGFR基因片段。通过内切酶PmeI和AgeI(Thermo Fisher Scientific)对PCR产物以及过表达载体psin-puro(该质粒已在文献“Wang L,Li X,Huang W,Zhou T,Wang H,Lin A,et al.TGFbeta signaling regulates  the  choice  between pluripotent and neural fates during reprogramming of human urine derived cells[J].Scientific reports.2016;6:22484.”中公开)进行酶切后回收。建立pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit重组体系(Transgen),所得重组质粒命名为Psin-KRAS、Psin-BRAF及Psin-EGFR质粒。进一步通过具有点突变功能的定点突变试剂盒(XL Site-Directed Mutagenesis Kit,QuikChange)将Psin-KRAS突变成Psin-KRASG13D,所用引物见表2。
[0074] (2)利用分子克隆方法构建含针对于PTEN基因的shRNA质粒(命名为shPTEN)。具体操作过程为:设计合成针对于PTEN基因的shRNA(如表3所示),退火形成双链片段,用内切酶EcorI和AgeI对载体PLKO-TRC(Sigma)进行酶切,通过连接,转化鉴定,得到的重组载体命名为shPTEN质粒。
[0075] (3)将构建得到的重组载体Psin-KRASG13D、Psin-BRAF、Psin-EGFR及shPTEN质粒纯化,与包装质粒psPAX2(Addgene)和pMD2.G(Addgene)一起按常规磷酸转染方法(参见Sambrook,Fritsch和Maniatis,分子克隆实验指南,第4版(2017))转染人胚胎肾细胞293系细胞(HEK293),2.5ml转染体系中所用目的基因质粒和包装质粒psPAX2、pMD2.G的量分别为8μg、6μg和2μg。培养经过如上转染和感染处理的细胞,收集培养上清,25000rpm离心2h,得到纯化的慢病毒颗粒。
[0076] 表1 PCR获取KRAS、BRAF及EGFR基因片段的引物序列
[0077]目的基因 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’)
BRAF ATGAGCGATCGCATGGCGGCGCTGAGCGGT GAGGCCATCGATGTTTAAACTCAGTGGACKRAS ATGACTGAATATAAACTTGTGGT TTACATAATTACACACTTTGTCTTT
EGFR ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGG TCATGCTCCAATAAATTCACTGCTTTGT
[0078] 表2构建KRAS突变体的引物序列
[0079]
[0080] 表3构建shPTEN的序列
[0081]
[0082] 2、慢病毒感染人类胚胎干细胞
[0083] 利用步骤1获得的慢病毒感染人类胚胎干细胞H1细胞系(hESCs H1,WiCell)。设计如下试验组:Psin-KRASG13D、shPTEN包装病毒分别感染H1细胞系,Psin-KRASG13D+shPTEN包装病毒感染H1细胞系,Psin-BRAF+shPTEN包装病毒感染H1细胞系,Psin-BRAF+Psin-EGFR+shPTEN包装病毒感染H1细胞系;对照组:H1细胞系。取6孔板,每个孔加入相当于5ml病毒原液的病毒量,如果是复合组,不同的病毒是按1:1的比例混合,病毒总量不变。感染后第2-4天,加入嘌呤霉素(Puromycin)进行阳性的筛选(病毒感染具体方法参见Sambrook,Fritsch和Maniatis,分子克隆实验指南,第4版(2017))。
[0084] 将所得的细胞传代。一方面,以GAPDH为内参基因,通过RT-PCR方法进行肿瘤相关基因的鉴定,引物序列见表4,检测结果如图1所示,结果表明胚胎干细胞H1中转入KRASG13D、BRAF、EGFR基因后相应的基因表达水平升高,敲降shPTEN基因后其表达水平下降。另一方面,通过免疫荧光检测经过改造的人胚胎干细胞的干细胞特性。免疫荧光染色具体操作过程如下:
[0085] 1)吸走24孔板内细胞培养基,1×PBS(500μL/孔)洗两遍,接着用4%多聚甲(PFA)常温固定20min(24孔板500μL/孔)。
[0086] 2)固定结束,1×PBS洗三遍,每次3-5min,用一抗稀释液(1×PBS+10%血清/BSA+0.3%Triton X-100)稀释一抗(Nanog)后滴加在孔内(24孔板200μL/孔),在4℃过夜孵育(12h-16h)。
[0087] 3)PBS洗三遍,每次5min。
[0088] 4)向经过洗涤的细胞中添加相应的标记有Alexa 568或488的二抗(invitrigen),然后于室温下进行避光孵育1h。
[0089] 5)用PBS将经过避光孵育的细胞洗涤3次,每次5min。
[0090] 6)向上步获得的经过洗涤的细胞中添加DAPI(sigma),然后于室温下进行避光孵育3min用。
[0091] 7)PBS将上步获得的经过避光孵育的细胞洗涤3次,每次5min。
[0092] 8)然后进行封片,并对样品进行观察照相,结果如图2所示。
[0093] 该结果显示调控肿瘤相关基因表达后,不影响人类胚胎干细胞中干细胞标志蛋白Nanog的表达,说明成功构建了携带肿瘤相关基因的胚胎干细胞。
[0094] 表4 RT-PCR鉴定肿瘤相关基因表达的引物序列
[0095]
[0096]
[0097] 实施例2、携带肿瘤相关基因的ESC经体外定向分化产生神经干细胞(NPC)[0098] 将实施例1中获得的H1-KRASG13D、H1-shPTEN、H1-BRAF-shPTEN、H1-shPTEN-KRASG13D、H1-BRAF-EGFR-shPTEN细胞,按照图3所示的诱导多能干细胞神经方向分化流程图,进一步体外定向分化为神经干细胞,具体方法如下:
[0099] 1、神经干细胞的定向诱导分化
[0100] 1)在6孔板中培养hESCs,培养到细胞融合度达到90%或以上。在细胞传代前一天用100×基质胶(Matrigel)包被12孔培养板(500μL/孔)过夜,将hESC传代,6孔板一个孔的细胞传到12孔板的一个孔,以确保传代第二天细胞密度达到95%以上(最好达到100%),所用细胞培养基为mTeSR1(STEMCELL)。
[0101] 2)细胞传代第二天细胞密度达到要求后,更换神经诱导培养基,记为诱导的第0天(D0)。神经诱导培养基为添加10μM SB431542(Selleck)和5μM 6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-A]嘧啶(Dorsomorphin,Selleck)的N2B27培养基。N2B27培养基(500mL)组成如下表5所示。配制过程中,先将DMEM/F12培养基与N2supplement混合得混合液A,神经基础培养基与B27混合得混合液B,再将混合液A和混合液B按体积比约
1:1混合,最后加入NEAA和GlutaMAX,即得到N2B27培养基。
[0102] 表5 N2B27培养基组成
[0103]神经基础培养基(NeuroBasal,Gibco) 245mL
DMEM/F12培养基(Gibco) 242.5mL
N2supplement(100×,Gibco) 2.5mL
B27(50×,Gibco) 5mL
Gluta MAX(Gibco) 2.5mL
NEAA(Gibco) 2.5mL
[0104] 3)诱导细胞隔天全换液。
[0105] 4)在诱导第八天(D8)细胞已失去多能性,消化传代。传代前一天用100×Matrigel包被6孔板(1000μL/孔)过夜。传代时首先将细胞用DMEM/F12洗一次,然后加入添加0.5μM ROCK抑制剂Thiazovivin(Selleck)的N2B27培养基,使用巴氏吸管或1ml大枪头轻刮细胞,刮成大块细胞团,切勿吹打细胞,尽量保持细胞团块完整,轻轻转移至包被好的6孔板中,12孔板一个孔的细胞传到6孔板的两个孔。
[0106] 5)传代第二天(诱导第九天,D9)全部换液,所换培养基为N2B27培养基(注意不添加Thiazovivin,SB431542,Dorsomorphin)。
[0107] 6)诱导细胞隔天换液,约在诱导第十二天(D12)细胞形态明显改变,开始出现神经花环样结构。
[0108] 7)诱导第16天(D16)收取神经花环样结构细胞。收取前一天用100×Matrigel包被6孔板(1000μL/孔)过夜。将诱导细胞的培养基吸出,每孔加入1mL添加0.5μM Thiazovivin(Selleck)的N2B27培养基,用消毒处理后的玻璃针沿着神经花环边缘将花环样细胞团轻轻挑出,接种到已包被的6孔板上。
[0109] 8)细胞隔天全换液,扩增传代得到神经干细胞,细胞可进一步采用细胞贴壁传代或者悬浮培养方式培养。细胞扩增培养基为添加20ng/ml bFGF(Invitrogen)和20ng/ml EGF(R&D Systems)的N2B27培养基。
[0110] 诱导多能干细胞神经方向分化过程细胞形态如图4所示,可见不同携带肿瘤相关基因的多能干细胞虽然在分化过程中细胞形态存在轻度差异,但均可分化为神经干细胞。
[0111] 2、携带肿瘤相关基因的NPC细胞的神经干细胞特征鉴定
[0112] 2.1免疫荧光染色检测携带肿瘤相关基因的NPC神经干细胞标记物表达[0113] 1)吸走24孔板内细胞培养基,500μL/孔的1×PBS洗两遍,接着用4%多聚甲醛(PFA)常温固定20min(24孔板500μL/孔)。
[0114] 2)固定结束,1×PBS洗三遍,每次3-5min,使用一抗稀释液(1×PBS+10%血清/BSA+0.3%Triton X-100)稀释一抗(Pax6、Sox2)后滴加在孔内(24孔板200μL/孔),在4℃过夜孵育(12h-16h)。
[0115] 3)PBS洗三遍,每次5min。
[0116] 4)向经过洗涤的细胞中添加相应的标记有Alexa 568或488的二抗(invitrigen),然后于室温下进行避光孵育1h。
[0117] 5)用PBS将经过避光孵育的细胞洗涤3次,每次5min
[0118] 6)向上步获得的经过洗涤的细胞中添加DAPI(sigma),然后于室温下进行避光孵育3min用
[0119] 7)PBS将上步获得的经过避光孵育的细胞洗涤3次,每次5min
[0120] 8)然后进行封片,并对样品进行观察照相,结果见图5,显示所分化产生的携带肿瘤相关基因的神经干细胞表达神经干细胞标记蛋白Pax6和Sox2。
[0121] 2.2荧光定量PCR检测携带肿瘤相关基因KRASG13D的神经干细胞(NPC-KRASG13D)特征性基因表达
[0122] 首先,使用Trizol(Takara公司)试剂,按照制造商说明,提取携带肿瘤相关基因的NPC-KRASG13D细胞的总RNA。然后,用M-MLV(Takara公司)试剂盒对提取的总RNA进行逆转录,TM获得cDNA,并使用 Premix Ex Taq 试剂盒(Takara公司)和ABI 7300荧光定量PCR仪(ABI公司)对cDNA进行Real-Time PCR,以便鉴定神经干细胞标志基因的表达。荧光定量PCR检测神经干细胞特征性基因表达,代表性结果见图6,显示NPC表达神经干细胞特征基因PAX6、SOX1、SOX2,不表达多能干细胞特征基因OCT4和NANOG,引物序列见表6。
[0123] 表6 RT-PCR鉴定神经干细胞(NPC-KRASG13D)特征性基因表达的引物序列[0124]
[0125] 3、NPC细胞具有肿瘤干细胞样细胞特征
[0126] 获取的肿瘤性质神经干细胞(诱导性胶质瘤干细胞)的特征鉴定,包括细胞的增殖能力检测,细胞迁移能力检测,体外克隆形成检测,小鼠体内成瘤能力检测等。
[0127] 3.1CCK-8实验检测细胞的增殖能力
[0128] 1)往96孔板加入100×Matrigel,每孔100μl,包被2h或以上,每个细胞设置5个复孔。
[0129] 2)取对照组与实验组细胞,用细胞消化液Accutase消化重悬后计数,往包被好的96孔板加入细胞1×104个/孔,约100μl/孔,放置于37℃、5%CO2细胞培养箱24h。
[0130] 3)各孔加入10μl细胞增殖检测溶液(提前在加在培养基中混匀)。
[0131] 4)于37℃、5%CO2细胞培养箱2h。
[0132] 5)酶标仪检测450nm波长的光密度值。
[0133] 6)分析结果,细胞存活率=各测试孔OD值/本底OD值×100%
[0134] 3.2Transwell实验检测细胞侵袭能力
[0135] 1)将Matrigel与DMEM/F12在盒上按体积比1:10的比例混匀,然后加入60μL到Transwell小室的上室中,静置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养2h。
[0136] 2)取对照组与实验组细胞,Accutase消化重悬后计数,调整细胞密度至5×104个/ml。
[0137] 3)取100μl细胞悬液接种于Transwell小室的上室,下室加入600μl相应的完全培养基,静置于37℃,5%CO2细胞培养箱培养24h。
[0138] 4)24h后观察下室是否有细胞,密切注意,下室有细胞再进行下一步实验。
[0139] 5)将上室夹出,倒立放置去除培养基,取24孔板往一个孔加入600μL浓度为体积百分比4%的多聚甲醛,将上室的上面用签轻轻吸干,放在24孔板内,固定20min。
[0140] 6)清洗上室,用水边冲洗边用棉签旋转擦拭上室面,注意避免冲洗到小室的下面侧。
[0141] 7)4孔板往一个孔加入600μL结晶紫染色剂,把小室放在里面20min,PBS洗两遍,3min,晾干。
[0142] 8)倒置显微镜下进行观察,细胞计数(随机选取5个高倍镜视野计数)。
[0143] 3.3克隆形成实验检测细胞体外增殖及成瘤能力
[0144] 1)取对照组与实验组细胞,用Accutase酶消化重悬后,细胞计数。
[0145] 2)取4000细胞/孔接种在提前用100×Matrigel包被的六孔板上,放置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养3周,隔三天换一次液。
[0146] 3)丢弃培养基,PBS洗一遍,加入1ml 4%多聚甲醛/孔固定20min,PBS洗一遍,3min,晾干。
[0147] 4)加入1ml/孔的结晶紫染色剂,染色20min,然后用PBS洗两遍,3min,晾干。
[0148] 5)倒置显微镜下拍照观察,计算细胞克隆形成率,克隆形成率=(实验组克隆数/对照组细胞克隆数)×100%。
[0149] 3.4NPC-KRASG13D细胞移植检测体内成瘤能力
[0150] 1)NOD-SCID小鼠(4周龄,雄性,体重18-20g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司)称重、麻醉、备皮,碘伏消毒。
[0151] 2)剪开表皮露颅骨,定位需要移植的位置,颅骨钻在上方孔钻透颅骨,以便显微射针扎入。
[0152] 3)将显微注射针固定在定位仪上,吸取要移植的细胞,小心将针头下降至大脑水平面,定为0点,坐标定位设置前后为(Y),侧面水平(X)和垂直水平(Z)(以mm为单位),对纹状体坐标设置为X+0.5,Y+2,Z-1.5。流速设定为0.5μL/min。根据需要调整进针深度。
[0153] 5)注射完成后,停留3min,然后缓慢把针头拔出,缝合皮肤
[0154] 6)移植8周后取小鼠脑组织,固定、切片及染色观察。
[0155] CCK-8实验检测结果图7所示,Transwell检测结果如图8所示,细胞克隆形成实验结果如图9所示,结果证实NPC-KRASG13D细胞具有最强的增殖能力、侵袭迁移能力及体外增殖能力及成瘤能力。另外,NPC-KRASG13D细胞移植至裸鼠脑组织内后3个月可见肿瘤性增殖。
[0156] 通过相关鉴定及比较,我们发现不同肿瘤相关基因单独或组合改变的多能性干细胞,如H1-KRASG13D、H1-shPTEN、H1-BRAF-shPTEN、H1-KRASG13D-shPTEN、H1-BRAF-EGFR-shPTEN,在细胞增殖能力、细胞迁移侵袭能力方面具有一定的差别。这些细胞比正常多能干细胞分化产生的神经干细胞,均表现出较强的能力,其中包含有KRAS基因突变体的细胞增殖及侵袭能力更强。在胶质瘤中KRAS基因的突变发生率并不像癌等其他肿瘤那样的高发,更是低于PTEN、BRAF、EGFR基因改变的发生率。但本研究中,我们发现KRAS基因的突变体在驱动神经干细胞肿瘤性转化过程中发挥至关重要的作用。
[0157] 上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
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